Штамм бактерий rhodococcus jialingiae б-м-1 вкпм ас-1967 - деструктор нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Rhodococcus jialingiae Б-М-1 обладает способностью утилизировать газовый конденсат, бензин, нефть, мазут в течение короткого промежутка времени. Штамм бактерий Rhodococcus jialingiae депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером Ас-1967. Штамм может быть использован для деструкции нефти и нефтепродуктов в диапазоне температуры от 4 до 32°С. Изобретение позволяет повысить эффективность мероприятий по деструкции нефти и нефтепродуктов в диапазоне температуры от 4 до 32°С. 4 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при очистке почвы и воды в случае аварийных разливов нефти и нефтепродуктов (газовый конденсат, бензин, мазут) на стадии проведения биологического этапа рекультивации при температуре окружающей среды от плюс 4 до 32°С.

Проблема загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами в настоящее время становится все более актуальной, в связи с изношенностью оборудования возникают значительные разливы данных продуктов. Наиболее эффективными способами очистки нефтезагрязненных территорий в настоящее время являются биологические методы, основанные на использовании микроорганизмов-нефтедеструкторов. Однако ситуация осложняется тем, что микроорганизмы обладают избирательностью в отношении определенных по составу нефтепродуктов.

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (S4 1493666), которые осуществляют деструкцию нефтепродуктов в ассоциации, что увеличивает трудозатраты на изготовление и стоимость конечного препарата.

Известны штаммы Acinetronacter sp. НВ-1 (RU 2077579); Acinetronacter sp. JN-2 (RU 2064017); Pseudomonas alcaligenes E-7 (RU 2134723); Pseudomonas putida 36 (SU 1076446), пригодные для очистки нефти. Однако данные о нефтедеструкции конкретных нефтепродуктов отсутствуют.

Большая эффективность в условиях низких положительных температур установлена для штаммов Rhodococcus erythropolis Е-17 (RU 2019527) при биодеградации нефти, без результатов утилизации нефтепродуктов.

Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus sp. - деструктор нефтяных углеводородов, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером Ас-2046 (патент РФ №2518349 от 11.04.2013). Недостатком данного штамма является отсутствие информации по нефтеокисляющей способности в отношении легких углеводородов (керосин, газовый конденсат), а также о его активности при низких положительных температурах окружающей среды.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов нефтедеструкторов, обладающих утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам при широком диапазоне температур (от плюс 4 до плюс 32°С).

Полученный штамм характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки

При выращивании на FT-агаре формирует колонии округлые, слизистые, кремового цвета (с возрастом приобретают розовый оттенок), с ровным краем, диаметром 1-3 мм. В тиогликолевой среде и на бульоне Хоттингера наблюдается равномерное помутнение среды со слизистым осадком на 2 сутки, при этом среда приобретает розовый оттенок. При микроскопии мазков, окрашенных по Граму, в молодых культурах (12-16 часов) преобладают грамположительные прямые или слегка изогнутые палочки с закругленными краями, расположенные отдельно или короткими (по 2-3 особи) цепочками, которые с возрастом (18 и более часов) распадаются на кокки.

Физиолого-биохимические признаки

Штаммы обладают способностью к росту при температуре от плюс 4 до 32°С в аэробных условиях, оптимум при температуре 28-32°С и рН 6,0-8,0. Продолжительность культивирования на плотной питательной среде (FT-агар) - 48-72 часа, жидкой питательной среде (минимальная солевая среда Ворошиловой-Диановой) - 96…120 часов. Обладает способностью к росту при рН, равном 9,0, и в присутствии 6% NaCl.

Штамм образует уреазу, фосфатазу, γ-глютамилтрансферазу и β-глюкозидазу.

Штамм не обладает патогенностью для человека и животных согласно классификации, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08.

Поддержание и хранение штамма осуществляется в лиофилизированном состоянии при температуре 2…6°С в течение 12 месяцев. Для поддержания свойств штамма проводится пассаж хранившейся культуры на жидкой минимизированной среде Ворошиловой-Диановой с добавлением нефти и последующем пересеве на аналогичную плотную питательную среду, содержащую в своем составе 2% агара по методу Дригальского. В дальнейшем проводят последовательное накопление микробных клеток, отобранных с отдельных колоний, путем пересевов на плотной питательной среде FT-агар, скошенной в пробирках и матрацах. Культуру, выращенную на скошенной питательной среде в матрацах, смывают средой высушивания и подвергают лиофильной сушке. Полученную сухую культуру закладывают на последующее хранение. При необходимости приготовления микробной массы сухую культуру ресуспендируют физиологическим раствором и полученную суспензию микробных клеток используют для дальнейшего накопления биомассы в соответствии с разработанной технологией.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Выделение штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967

Штамм Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 выделен из почвы Кировской области, загрязненной нефтепродуктами, следующим образом: 1,0 г исследуемого материала разводили в 9,0 см³ стерильного физиологического раствора и высевали на чашки с плотной питательной средой Ворошиловой-Диановой, содержащей 2% агара и 1% нефти. Смесь выросших на чашках с плотной питательной средой культур смывали 10,0 см³ физиологического раствора и засевали в колбы с жидкой питательной средой Ворошиловой- Диановой, содержащей 2% нефти. После инкубирования в течение 120 часов при температуре 32°С полученную культуру высевали на чашки с плотной питательной средой Ворошиловой-Диановой, содержащей 2% агара и 1% нефти. Высев проводили по методу Дригальского на 6 последовательных чашек. В результате проведенных операций была выделена культура Б-М-1, которая характеризовалась выраженной нефтедеструктивной активностью, культурально-морфологическими и биохимическими признаками, присущими роду Rhodococcus. Дальнейшие исследования были проведены совместно со специалистами ФГУП ГосНИИГенетика, в которое были отправлены для проведения токсонометрической идентификации на основании молекулярно-генетического анализа «чистые» агаризованные культуры выделенного изолята. Идентификация штамма Б-М-1 до вида с использованием анализа генов, кодирующих 16SpPHK, показала, что наиболее близкими по исследованному показателю для выделенного изолята являются виды Rhodococcus jialingiae и Rhodococcus gingshengii. Дифференциально-диагностическая оценка была проведена на основании рекомендованных методов оценки культурально-морфологических и физиологических свойств. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Культурально-морфологические и физиологические свойства выделенного штамма Б-М-1

Полученные результаты свидетельствуют о том, что выделенный штамм относится к виду Rhodococcus jialingiae.

Результаты проведенных экспериментальных исследований определили целесообразность депонирования штамма Rhodococcus jialingiae во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Ас-1967.

Пример 2. Приготовление посевного материала и препарата на основе микробных клеток Rhodococcus jialingiae штамма Б-М-1 ВКПМ Ас-1967

Лиофильно выделенную культуру Rhodococcus jialingiae ресуспендируют в 0,9%-ном растворе NaCl и высевают по 0,2 мл на плотную питательную среду FT-агар, скошенную в пробирках, содержащую (г/дм³):

сернокислотный гидролизат рыбной муки	17,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов	5,0
экстракт пекарских дрожжей	2,3
магний сернокислый	0,5
натрия сульфит	0,7
цистеин	0,5
глюкоза	20,0
агар	15,0
дистиллированная вода	1,0 дм3

Посевы выдерживают при температуре 30±2°С в течение 46…50 часов. Выращенную на скошенной плотной питательной среде в пробирках микробную культуру смывают 0,9%-ным раствором NaCl и готовят посевной материал с концентрацией 1⋅10⁹ микробных тел по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Приготовленную бактериальную суспензию вносят в количестве 15 см³ в колбу емкостью 500,0 см³, содержащую 150,0 см³ жидкой питательной среды Ворошиловой-Диановой, включающую (г/дм):

К2НР04	3,8
КН2Р04	1,2;
MgS04	2,0
(NH4)2S04	1,0
СаСl2⋅6Н20	0,01
Fe2(S04)3⋅7Н20	0,0013
нефть	0,5
дистиллированная вода	1,0 дм3

и культивируют в течение 96…120 часов при температуре 30±2°С. Полученную нативную культуру, содержащую не менее 1⋅10⁹ живых микробов в 1 см³, используют в качестве биологического препарата для оценки деструктивной активности в отношении нефти и нефтепродуктов при различных температурных режимах.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти, мазута, бензина и газового конденсата

Для определения биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти, мазута, бензина и газового конденсата готовят минимальную солевую среду Ворошиловой-Диановой по прописи, приведенной в примере 2. Среду разливают в лабораторные колбы емкостью 500,0 см³ по 150,0 см³. Затем в отдельные колбы вносят нефть, газовый конденсат, бензин, мазут в количестве 0,5 г/л среды и нативную культуру штамма Rhodococcus jialingiae (по примеру 2) в количестве, обеспечивающем конечную биологическую концентрацию в смеси 1⋅10⁷ живых микробных клеток. В качестве контроля параллельно ставят аналогичные пробы без внесения микробной культуры. Затем пробы выдерживали на шуттель-аппарате при температуре 18…22°С и постоянном перемешивании 180 об/мин в течение 7 сут. Определение нефтедеструктивной активности проводили с использованием прямого метода оценки снижения концентрации нефти и нефтепродуктов реакционной смеси. Метод заключается в выделении эмульгированных и растворенных нефтяных компонентов из воды экстракцией четыреххлористым углеродом, хроматографическом отделении нефтепродуктов от сопутствующих органических соединений других классов на колонке, заполненной оксидом алюминия, и количественном их определении по интенсивности поглощения С-Н-связей в инфракрасной области спектра (2930±70) см^-1. Измерение количества нефтепродукта проводится с использованием прибора КН-2м в соответствии с ПНДФ.14.1:2:4.168-200.

Биодеградационная активность штамма Rhodococcus jialingiae Ac-1967 рассчитывается по формуле 1:

где БА - биодеградационная активность;

m_н.к. - масса нефтепродуктов в контроле, в мг, после 7 сут;

m_н.п. - масса нефтепродуктов в опыте, в мг, после 7 сут.

Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что углеводородокисляющая активность штамма Rhodococcus jialingiae составляла в отношении, %:

нефти	44
газового конденсата	56,2
мазута	29,8
бензина	54,3

Таблица 2 - Результаты оценки углеводородокисляющей активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов

Пример 4. Определение биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении воды и различных температурных режимах

Для определения биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae ВКПМ Aс-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении воды и различных температурных режимах минимальную солевую среду Ворошиловой-Диановой (пропись среды изложена в примере 2) разливали в стаканы емкостью 500,0 см³ по 150,0 см³. Затем в стаканы вносили нефть в количестве 1 см³/дм³ и нативную культуру штамма Rhodococcus jialingiae (по примеру 2) в количестве, обеспечивающем конечную биологическую концентрацию в смеси 1⋅10⁷ живых микробных клеток в 1 см³. Приготовленные пробы выдерживали в статических условиях с периодическим (2-3 раза в сутки) перемешиванием при температурах плюс 2…6, 18…22, 30 …32°С в течение 7 и 14 сут. Через указанные промежутки времени при выбранных температурных режимах измеряли концентрацию нефтепродуктов в пробах (в соответствии с методом, изложенным в примере 1). Полученные результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты оценки биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении воды и различных температурных режимах

Пример 5. Определение биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении почвы и различных температурных режимах

Определение биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении почвы и различных температурных режимах проводили следующим образом. Исходный материал (почву) доводили до 50-60% остаточной влажности путем внесения физиологического раствора и фасовали по 50,0 г в чашки Петри. Затем вносили нефть и нефтепродукты из расчета 10 г/кг почвы и культуру штамма Rhodococcus jialingiae из расчета конечной концентрации 1⋅10⁷ живых микробов на 1 г загрязненной почвы. Приготовленные пробы выдерживали при температурах плюс 2…6; 18…22; 30…32°С в течение 7 и 14 сут. Остаточную влажность поддерживали орошением физиологическим раствором на протяжении срока наблюдения. Через указанные промежутки времени измеряли концентрацию нефтепродуктов в пробах методом спектрометрии, который заключается в экстракции нефтепродуктов из почвы, их хроматографическом отделении от сопутствующих органических соединений других классов и количественном определении нефтепродуктов по интенсивности поглощения в ИК-области спектра. Измерение количества нефтепродукта проводится с использованием прибора КН-2м в соответствии с «Методикой выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в минеральных, органогенных, органоминеральных почвах и донных отложениях методом спектрометрии» (ПНДФ.16.1:2.2.22-98). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты оценки биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении почвы и различных температурных режимах

Таким образом, заявляемый штамм утилизирует нефть и нефтепродукты (газовый конденсат, бензин, мазут) в воде и почве в широком диапазоне температур (от плюс 2…6 до 30…32°С).

Штамм бактерий Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 - деструктор нефти и нефтепродуктов.