Способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре conium maculatum l. (болиголова пятнистого)


 


Владельцы патента RU 2619182:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга" (RU)
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре болиголова пятнистого (Conium maculatum L), включающий культивирование на питательной среде МС каллусной культуры болиголова пятнистого в присутствии 6-бензиламинопурина в течение 30 суток, сбор биомассы и выделение биологически активных веществ, отличающийся тем, что культивирование ведут при 26±1°С, влажности 70%, в темноте, 6-бензиламинопурин вводят в питательную среду при концентрации 1 - 0,1 мг/л совместно с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой при концентрации в диапазоне 1 - 0,5 мг/л или совместно с α-нафтилуксусной кислотой при концентрации в диапазоне 3 - 0,5 мг/л, а биологически активные вещества выделяют путем кислого и щелочного хлороформного извлечения. Изобретение позволяет получить требуемый объем биомассы каллусной культуры, который содержит БАВ-фуранокумарины и ациклические тритерпеноиды. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в фармацевтической промышленности при получении фуранокумаринов и ациклических тритерпеноидов из клеточной культуры болиголова пятнистого. Наряду с другими биологически активными веществами эти соединения входят в состав болиголова пятнистого. Фуранокумарины оказывают фотосенсибилизирующее (Кузнецова Г.А. Природные кумарины и фурокумарины / Г.А. Кузнецова. - Л.: Наука, 1967. - 248 с.), сосудорасширяющее, бактериостатическое и антигрибковое действие. Так же они обладают противосвертывающей, противоопухолевой активностью, гипогликемизирующим свойством (снижают уровень сахара в крови) (Коновалова О.Ю. Биологические активные вещества лекарственных растений / О.Ю. Коновалова, и др. - М.: Издательско-полиграфический центр «Киевский университет», 2008. - 352 с.).

Ациклические тритерпеноиды, в частности сквален, обладают антиоксидантными свойствами (защищают от перекисного окисления липидов), способностью снижать уровень холестерина, оказывают иммуностимулирующее действие, используются в качестве дополнительной терапии при различных формах рака (Gregory S. Squalene And Its Potential Clinical Uses / S. Gregory, N.D. Kelly // Alternative Medicine Review. - 1999. - Vo.l 4. - №1. P 29-36.). Сквален является цитопротективным средством против вызванной химиотерапией токсичности (Das В. Squalene Selectively Protects Mouse Bone Marrow Progenitors Against Cisplatin and Carboplatin-Induced Cytotoxicity In Vivo Without Protecting Tumor Growth / B. Das, et al. // Neoplasia. - 2008. - Vol 10. - №10. P 1105-1119).

Известен способ получения биологически активных веществ из биомассы культивируемых клеток растений (патент РФ 2039817, опубл. 20.07.1995, МПК C12N 5/04), включающий выращивание клеточной биомассы, ее разрушение, отделение жидкой фракции, концентрирование биологически активных веществ в жидкой фракции и сушку концентрата до получения целевого продукта, отличающийся тем, что выращенную биомассу при разрушении подвергают тепловой обработке при 80-130°С в течение 5-60 мин. Недостатком данного способа является сложность технологического процесса, также для его осуществления необходимо дополнительное оборудование.

Известен способ получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая (патент РФ 2399666, опубл. 20.09.2010, МПК C12N 5/04). Клетки растения стефания гладкая культивируют на жидкой питательной среде при перемешивании и аэрации воздухом в темноте. Добавление в питательную среду в конце экспоненциальной фазы роста культуры метилового эфира жасмоновой кислоты и олеиновой кислоты повышает выход стефарина сульфата, который является субстанцией для получения медицинского препарата стефаглабрина сульфата.

Известен способ получения алкалоидов (патент РФ 2394100, опубл. 10.07.2010, МПК C12N 5/04), который предусматривает выращивание культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth (раувольфии змеиной) штамм К-27 на питательной среде заданного состава в присутствии мелафена (меламиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты) 10-17 пассажей

при концентрации мелафена 1⋅10-3 г/л. После чего полученную культуру ткани Rauwolfia serpentina Benth пересаживают на питательную среду того же состава, но содержащую сверхмалые концентрации мелафена 1⋅10-10-1⋅10-15 г/л, преимущественно при 1⋅10-13 г/л, и выращивают на этой среде в течение 1 пассажа не более 50 суток.

Недостатками известных аналогов является их направленность на культивирование определенных видов растений: стефании гладкой, раувольфии змеиной, а также получение других групп БАВ (биологически активные вещества). Исходя из этого данные способы не подходят для культивирования и получения БАВ из клеточной культуры болиголова пятнистого.

Культивирование стефании производится на жидких средах с добавлением метилового эфира жасмоновой кислоты и олеиновой кислоты, выращивание культуры болиголова пятнистого идет на твердых питательных средах, без добавления иных стимуляторов, кроме гормонов.

Для получения алкалоидов культуры ткани Rauwolfia serpentina Bent дополнительно в среду для культивирования добавляют мелафен, что усложняет технологию культивирования и приготовления питательной среды и увеличивает ее стоимость.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре Atragene speciosa Weinm. (княжик сибирский) (патент РФ 2428473, опубл. 10.09.2011, МПК C12N 5/04).

Клетки растения Atragene speciosa Weinm. (княжик сибирский) культивируют на среде МС при освещении белым светом интенсивностью (2-4)×103 лк с фотопериодом 12-14 час при концентрации 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) 0,6-1,2 мг/л, 6-БАП (6-бензиламинопурин) 0,2-0,6 мг/л, мезоинозита 100-125 мг/л. Введение дополнительно в питательную среду фитогормона 24-эпибрассинолида увеличивает процентное содержание целевого продукта в клетках. Описанный способ принят за прототип изобретения. Недостатками прототипа является более сложная технология выращивания культуры, при которой используется свет определенной интенсивности, для этого необходимо определенное оборудование. Также для увеличения процентного содержание целевого продукта в среду добавляют 24-эпибрассинолид, что увеличивает ее стоимость. Данный способ подходит для регуляции содержания веществ с адаптогенной и ноотропной активностью княжика сибирского, в то время как предлагаемый способ направлен на получение активных веществ болиголова пятнистого. Для выращивания одной из линий культуры болиголова пятнистого в качестве стимуляторов роста используется 2,4-D, как и в прототипе. Однако для культуры болиголова пятнистого необходима более низкая концентрация стимулятора в отличие от прототипа.

Болиголов пятнистый (Conium maculatum L.) - растение семейства зонтичные, содержит значительное количество различных биологически активных веществ, в том числе фуранокумаринов и ациклических тритерпеноидов. Болиголов обладает болеутоляющим, успокаивающим, противосудорожным, противовоспалительным и очень сильным иммуностимулирующим действием, благодаря чему включен в большинство сборов трав для лечения практически всех заболеваний, особенно онкологических.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения биологически активных веществ в клеточной культуре болиголова пятнистого, перспективной в качестве возможного источника БАВ лекарственного действия.

Для решения поставленной задачи разработан способ, включающий культивирование на питательной среде МС в присутствии 6-БАП, сбор биомассы и выделение биологически активных веществ, отличающийся тем, что культивирование ведут при 26±1°С, влажности 70%, в темноте, 6-БАП вводят в питательную среду при концентрации 1 - 0,1 мг/л совместно с 2,4-D при концентрации в диапазоне 1 - 0,5 мг/л или совместно с НУК (α-нафтилуксусной) кислотой при концентрации в диапазоне 3 - 0,5 мг/л, а биологически активные вещества выделяют путем кислого и щелочного хлороформного извлечения.

Питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Сбор биомассы осуществляют на 30 сутки культивирования, культуру отделяют от питательной среды, измельчают в фарфоровой ступке до однородного состояния. Из полученной массы получают водный экстракт, подкисляют насыщенным раствором винной кислоты до получения рН 2 и проводят извлечение хлороформом (кислое извлечение содержит фуранокумарины), затем водный раствор подщелачивают раствором натрия гидроксида до рН 10 и вновь извлекают хлороформом (щелочное извлечение содержит ациклические тритерпеноиды).

Прирост сырой биомассы оценивают по общепринятому показателю - ростовому индексу, определяя средние значения начальной и конечной биомассы. Сухую массу определяют, высушивая клетки при температуре 55-60°С до воздушно-сухого состояния.

Ростовой индекс по массе сырого вещества первой линии каллусной культуры Conium maculatum составляет - 7,58, второй линии - 6,04. Продуктивность каллусной культуры Conium maculatum на 1 литр среды составила для первой линии - 446 г/л, для второй линии - 379 г/л.

Содержание фуранокумаринов в культуре клеток Conium maculatum L линии первой составляет 1,14% и линии второй 2,07%, выращенной по изобретению, значительно выше, чем их количество в надземной части интактного растения (0,13-0,17%). Содержание каллусной культуре Conium maculatum L ациклических тритерпеноидов в первой линии составляет 1,15%, во второй линии 0,43%, что также превышает содержание ациклических тритерпеноидов в надземной части интактного растения (0,17-0,19%). Полученные данные позволяют говорить об эффективности заявленного способа регуляции содержания фуранокумаринов и ациклических тритерпеноидов в клеточной культуре Conium maculatum L и перспективности его применения в промышленных масштабах.

Достигаемый технический результат заключается в получении требуемого объема биомассы каллусной культуры, который содержит БАВ - фуранокумарины и ациклические тритерпеноиды.

Пример 1. Биомассу каллусной культуры болиголова пятнистого получают путем выращивания на питательной среде МС с добавлением 1,5 мг/л 2-4 D и 1 - мг/л 6-БАП.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4×7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводят до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4×4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4×7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4×2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4×5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2×6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4×7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA×2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2×2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2×2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса размещают по культуральным сосудам.

В условиях ламинарного бокса в стерильную питательную среду добавляют 2,4-D (1 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л) и размещают ее по культуральным сосудам.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводят при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

После накопления необходимого количества биомассы на 30 сутки производят отделение ткани от питательной среды и выделение комплекса биологически активных веществ.

Навеску каллусной ткани (100 г) растирают в фарфоровой ступке до кашеобразного состояния, помещают в химический стакан, приливают 120 мл дистиллированной воды, добавляют по каплям насыщенный раствор винной кислоты до получения рН 2 и оставляют на 2 часа, полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр.

Получение кислого хлороформного извлечения. Для выделения фуранокумаринов полученный водный раствор помещают в делительную воронку, приливают 40 мл хлороформа и экстрагируют в течение минуты. Хлороформное извлечение отделяют и повторяют экстракцию еще два раза, добавляя по 30 и 25 мл хлороформа. Полученное кислое извлечение фильтруют через фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривают до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл хлороформа.

Получение щелочного хлороформного извлечения. Для выделения ациклических тритерпеноидов водный остаток подщелачивают раствором 10% NaOH до рН 10, помещают в делительную воронку, добавляют 40 мл хлороформа и экстрагируют в течение минуты. Хлороформное извлечение отделяют и повторяют экстракцию еще три раза, добавляя по 40 и 30 (дважды) мл хлороформа. Готовое щелочное извлечение фильтруют через фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривают до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл хлороформа.

Анализ БАВ кислого и щелочного хлороформного извлечения из каллусной культуры проводят методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС) на приборе Trace DSQ (Thermoelectron corp., США), с программным обеспечением Xcalibur 1.4. В работе используют колонку TR-5MS (30 м·0,25 мм·0,25 мкм).

Пример 2. Биомассу каллусной культуры болиголова пятнистого получают путем выращивания на питательной среде МС с добавлением 0,5 мг/л 2-4 D и 0,1 - мг/л 6-БАП.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4×7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводят до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4×4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4×7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4×2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4×5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2×6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4×7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA×2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2×2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2×2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса размещают по культуральным сосудам.

В условиях ламинарного бокса в стерильную питательную среду добавляют 2,4-D (1 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л) и размещают ее по культуральным сосудам.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводят при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

После накопления необходимого количества биомассы на 30 сутки производят отделение ткани от питательной среды и выделение комплекса биологически активных веществ.

Навеску каллусной ткани (100 г) растирают в фарфоровой ступке до кашеобразного состояния, помещают в химический стакан, приливают 120 мл дистиллированной воды, добавляют по каплям насыщенный раствор винной кислоты до получения рН 2 и оставляют на 2 часа, полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр.

Получение кислого хлороформного извлечения. Для выделения фуранокумаринов полученный водный раствор помещают в делительную воронку, приливают 40 мл хлороформа и экстрагируют в течение минуты. Хлороформное извлечение отделяют и повторяют экстракцию еще два раза, добавляя по 30 и 25 мл хлороформа. Полученное кислое извлечение фильтруют через фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривают до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл хлороформа.

Получение щелочного хлороформного извлечения. Для выделения ациклических тритерпеноидов водный остаток подщелачивают раствором 10% NaOH до рН 10, помещают в делительную воронку, добавляют 40 мл хлороформа и экстрагируют в течение минуты. Хлороформное извлечение отделяют и повторяют экстракцию еще три раза, добавляя по 40 и 30 (дважды) мл хлороформа. Готовое щелочное извлечение фильтруют через фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривают до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл хлороформа.

Анализ БАВ кислого и щелочного хлороформного извлечения из каллусной культуры проводят методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС) на приборе Trace DSQ (Thermoelectron corp., США), с программным обеспечением Xcalibur 1.4. В работе используют колонку TR-5MS (30 м·0,25 мм·0,25 мкм).

Пример 3. Биомассу каллусной культуры болиголова пятнистого получают путем выращивания на питательной среде МС с добавлением 3 мг/л НУК и 1 - мг/л 6-БАП.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4×7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводят до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4×4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4×7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4×2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4×5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2×6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4×7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA×2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2×2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2×2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса размещают по культуральным сосудам.

В условиях ламинарного бокса в стерильную питательную среду добавляют 2,4-D (1 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л) и размещают ее по культуральным сосудам.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводят при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

После накопления необходимого количества биомассы на 30 сутки производят отделение ткани от питательной среды и выделение комплекса биологически активных веществ.

Навеску каллусной ткани (100 г) растирают в фарфоровой ступке до кашеобразного состояния, помещают в химический стакан, приливают 120 мл дистиллированной воды, добавляют по каплям насыщенный раствор винной кислоты до получения рН 2 и оставляют на 2 часа, полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр.

Получение кислого хлороформного извлечения. Для выделения фуранокумаринов полученный водный раствор помещают в делительную воронку, приливают 40 мл хлороформа и экстрагируют в течение минуты. Хлороформное извлечение отделяют и повторяют экстракцию еще два раза, добавляя по 30 и 25 мл хлороформа. Полученное кислое извлечение фильтруют через фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривают до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл хлороформа.

Получение щелочного хлороформного извлечения. Для выделения ациклических тритерпеноидов водный остаток подщелачивают раствором 10% NaOH до рН 10, помещают в делительную воронку, добавляют 40 мл хлороформа и экстрагируют в течение минуты. Хлороформное извлечение отделяют и повторяют экстракцию еще три раза, добавляя по 40 и 30 (дважды) мл хлороформа. Готовое щелочное извлечение фильтруют через фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривают до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл хлороформа.

Анализ БАВ кислого и щелочного хлороформного извлечения из каллусной культуры проводят методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС) на приборе Trace DSQ (Thermoelectron corp., США), с программным обеспечением Xcalibur 1.4. В работе используют колонку TR-5MS (30 м·0,25 мм·0,25 мкм).

Пример 4. Биомассу каллусной культуры болиголова пятнистого получают путем выращивания на питательной среде МС с добавлением 3 мг/л НУК и 0,1 - мг/л БАП.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4×7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводят до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4×4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4×7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4×2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4×5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2×6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4×7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA×2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2×2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2×2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса размещают по культуральным сосудам.

В условиях ламинарного бокса в стерильную питательную среду добавляют 2,4-D (1 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л) и размещают ее по культуральным сосудам.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводят при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

После накопления необходимого количества биомассы на 30 сутки производят отделение ткани от питательной среды и выделение комплекса биологически активных веществ.

Навеску каллусной ткани (100 г) растирают в фарфоровой ступке до кашеобразного состояния, помещают в химический стакан, приливают 120 мл дистиллированной воды, добавляют по каплям насыщенный раствор винной кислоты до получения рН 2 и оставляют на 2 часа, полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр.

Получение кислого хлороформного извлечения. Для выделения фуранокумаринов полученный водный раствор помещают в делительную воронку, приливают 40 мл хлороформа и экстрагируют в течение минуты. Хлороформное извлечение отделяют и повторяют экстракцию еще два раза, добавляя по 30 и 25 мл хлороформа. Полученное кислое извлечение фильтруют через фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривают до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл хлороформа.

Получение щелочного хлороформного извлечения. Для выделения ациклических тритерпеноидов водный остаток подщелачивают раствором 10% NaOH до рН 10, помещают в делительную воронку, добавляют 40 мл хлороформа и экстрагируют в течение минуты. Хлороформное извлечение отделяют и повторяют экстракцию еще три раза, добавляя по 40 и 30 (дважды) мл хлороформа. Готовое щелочное извлечение фильтруют через фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривают до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл хлороформа.

Анализ БАВ кислого и щелочного хлороформного извлечения из каллусной культуры проводят методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС) на приборе Trace DSQ (Thermoelectron corp., США), с программным обеспечением Xcalibur 1.4. В работе используют колонку TR-5MS (30 м·0,25 мм·0,25 мкм).

Технический результат достигается благодаря использованию разработанного способа получения БАВ - фуранокумаринов и ациклических тритерпеноидов, из каллусной культуры Conium maculatum L., что позволит расширить арсенал средств биотехнологического происхождения с повышением терапевтического эффекта.


Способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре болиголова пятнистого (Conium maculatum L), включающий культивирование на питательной среде МС каллусной культуры болиголова пятнистого в присутствии 6-бензиламинопурина в течение 30 суток, сбор биомассы и выделение биологически активных веществ, отличающийся тем, что культивирование ведут при 26±1°С, влажности 70%, в темноте, 6-бензиламинопурин вводят в питательную среду при концентрации 1 - 0,1 мг/л совместно с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой при концентрации в диапазоне 1 - 0,5 мг/л или совместно с α-нафтилуксусной кислотой при концентрации в диапазоне 3 - 0,5 мг/л, а биологически активные вещества выделяют путем кислого и щелочного хлороформного извлечения.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для культивирования каллусной ткани болиголова пятнистого, содержащую компоненты в следующем количестве, мг/л: KNO3 1900; KH2PO4 170; NH4NO3 1650; MgSO4×7H2O 370; CaCl2×2H2O 440; FeSO4×7H2O 37,3; Na2EDTA×2H2O 27,8; KI 0,83; H3BO3 6,2; MnSO4×4H2O 22,3; CoCl2×6Н2О 0,025; CuSO4×5Н2О 0,025; ZnSO4×7H2O 8,6; Na2MoO4×2Н2О 0,25; тиамин-HCl 0,5-1,5; пиридоксин-HCl 0,4-0,6; никотиновая кислота 0,4-0,6; сахароза 30000; агар-агар 10000; НУК 1-3; 6-БАП 0,1-1; вода дистиллированная - остальное.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), содержащему ДНК, кодирующую белок Cry34Ab1, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab1 и ДНК, кодирующую белок Cry3Ba1, его семени и клетке, а также к способу замедления развития устойчивости к белкам Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry3Ba1 у кукурузного корневого жука с его использованием.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L), включающий в себя посадку семян в стерильный грунт, выращивание интактных растений в течение 1-2 месяцев с интенсивностью освещения 150 мкМ квантов/м2с, отбор эксплантов 3-4 недельного возраста, стерилизацию последовательно в 70% спирте 30 с и в 0,1% сулеме 4 мин, помещение кусочков стебля длиной 1,5-2 см на агаризованную среду Мурасиге-Скуга без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности, выделение каллуса и посадку в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста НУК и 6-БАП в условиях ламинарного бокса, при этом каллус высаживают в возрасте 30 суток, а культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности 70% в темноте, после чего проростки переносят на 6 недель на агаризованную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5-2,5 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3-0,8 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ элиминации бактериальной инфекции клеточных культур растений, включающий культивирование суспензионных клеточных культур с использованием антибактериального агента, где в качестве антибактериального агента используют водную суспензию наночастиц серебра диаметром 20-80 нм, которую вносят в суспензионную клеточную культуру до конечной концентрации в культуральной среде 50 мкг/мл, при этом культивирование осуществляют 24 часа в стандартных условиях.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена система контроля фотосинтетического и дыхательного СО2-газообмена в культуре in vitro.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой противомикробную композицию для желудочно-кишечного применения, содержащую смесь водорастворимого экстракта растительной ткани, содержащего полифенол, включающий танин, и экзогенного пероксида водорода; где экстракт оказывает секвестрирующий эффект на пероксид водорода в смеси и композиция уничтожает бактерии при контакте с бактериями.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения в растении или в его части химерных вирусоподобных частиц (VLP).

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения клеточной суспензионной культуры трансгенного табака N.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для лечения и профилактики хронических воспалительных заболеваний носоглотки (ХВЗН) у детей 4-10 лет, проживающих в зоне влияния промышленных предприятий в условиях загрязнения атмосферного воздуха бензолом и формальдегидом.
Группа изобретений относится к медицине и касается мультивалентной иммуногенной композиции, содержащей 13 различных конъюгатов полисахарид-белок вместе с физиологически приемлемой средой, где каждый из конъюгатов полисахарид-белок содержит капсульный полисахарид от отдельного серотипа Streptococcus pneumoniae, конъюгированный с белком-носителем CRM197, и капсульные полисахариды получены от 12 серотипов, выбранных из группы, состоящей из 1, 3, 4, 5, 6А, 6B, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, и серотипа 22F или 33F.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для профилактики иммунодефицита, повышения иммунобиологической реактивности и воспроизводительной функции у телок в период наступления физиологической зрелости.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus paracasei MCC1849, обладающий высокой стимулирующей продуцирование IL-12 активностью.

Изобретение относится к области медицины и фармации, конкретно к фармацевтической композиции, обладающей иммуностимулирующим действием. Фармацевтическая композиция содержит N-{2-[3,4-бис-(4-нитробензоилокси)фенил]этил}-4-нитробензамид (фентрал) в качестве действующего вещества.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для профилактики иммунодефицита у телок. Способ включает использование при выращивании крупного рогатого скота иммуномодулирующего препарата на основе растительного сырья в виде водно-спиртовой настойки.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для повышения неспецифической резистентности организма молодняка сельскохозяйственных животных с целью профилактики и терапии заболеваний органов дыхания и пищеварения и реализации продуктивного потенциала.
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, аллергологии и пульмонологии, и может быть использовано для усиления активности факторов неспецифической защиты у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Изобретение относится к области нанотехнологии, медицины и пищевой промышленности. Способ получения нанокапсул лекарственных растений, обладающих иммуностимулирующим действием, характеризуется тем, что 5 мл настойки эхинацеи добавляют в суспензию конжаковой камеди в гексане, содержащую 3 г или 1 г конжаковой камеди в присутствии 0,01 г препарата Е472с в качестве поверхностно-активного вещества при перемешивании 1300 об/мин, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано в медицине. Композицию, основанную на совместном применении ApoA, интерлейкина 15 и домена Sushi альфа цепи рецептора IL15, используют для стимулирования противоопухолевого иммунного ответа у субъекта.

Изобретение относится к ветеринарной фармации, а именно к препарату для профилактики и лечения свободнорадикальной патологии у животных, содержащему 3,0-5,0 мас.% фенил-трет-бутилнитрона, 1,0-2,0 мас.% β-каротина, 7,5-10,5 мас.% 2,6-дитретбутил-4-нонилфенола, 10,0-15,0 мас.% 2,4,6,8-тетраметил-2,4,6,8-тетраазабицикло-(3,3,0)-октадиселенона-3,7, 5,0-9,0 мас.% солютола HS15, 0,2-0,4 мас.% поливинилпирролидона и воды для инъекций (остальное). Изобретение обеспечивает повышение стрессоустойчивости организма, снижение токсичности и увеличение удобства применения и дозирования. 6 ил., 7 пр.
Наверх