Способ оценки качества децеллюляризированных матриксов для получения биоинженерных трансплантатов

Изобретение относится к области биохимии. Описано изобретение: способ оценки качества децеллюляризованных матриксов для получения биоинженерных трансплантатов, включающий оценку получаемых каркасов. Способ имеет стадии: подтверждение сохранности внеклеточных компонентов матрикса и отсутствие в нем ядерных структур клеток при помощи морфологического метода; подтверждение биосовместимости матрикса калориметрическим методом; определение механическим способом заданной сохранности архитектоники матрикса; оценка биофизическим методом ЭПР-спектроскопии способности матрикса к генерации свободных радикалов, характерных для цепи переноса электронов в митохондриях. Изобретение расширяет арсенал способов оценки качества децеллюляризированных матриксов для биоинженерии. 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в клеточной биологии, биохимии, молекулярной биологии, хирургии для создания качественного децеллюляризированного матрикса в качестве основы для биоинженерного трансплантата для замещения врожденных и/или приобретенных дефектов органов и тканей. Трансплантация донорских органов имеет целый ряд ограничений, обусловленных реакцией иммунного отторжения, пожизненной иммуносупрессивной терапией, постоянным недостатком органов, сложностью подбора подходящего донора, этическими проблемами. Одной из многообещающих стратегий для решения проблем трансплантологии может стать тканевая инженерия, которая находится на стыке биологии, физики, химии, медицины и биотехнологии и направлена на поддержание, замену или восстановление поврежденных органов и тканей. Важнейшей и перспективной тактикой является создание каркаса на основе децеллюляризированного матрикса, воспроизводящего трехмерную структуру нативной ткани с сохранением основных компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), обладающего также соответствующими физическими, химическими и биомеханическими свойствами для обеспечения клеточной адгезии, роста, пролиферации и дифференцировки, что является важным фактором при проведении его рецеллюляризации аутологичными клетками. Кроме того, такой ВКМ должен обладать способностью к интеграции и самостоятельно функционировать в физиологических условиях организма реципиента. Децеллюляризация - это процесс, направленный на удаление клеток из ткани с сохранением ВКМ и трехмерной структуры нативного органа [Badylak S.F. et al. 2011; Ott H.C. et al 2009], с использованием различных методов воздействия на клетки. Подробное рассмотрение данной проблемы показало, что внеклеточные матриксы обладают всеми характеристиками, необходимыми для создания тканеинженерного каркаса [Badylak S.F. 2007].

Для проведения децеллюляризации могут использоваться различные способы: физические, ферментативные и химические [Badylak S.F. et al 2011]. Под физическими подразумеваются: механическое воздействие, заморозка/оттаивание, обработка ультразвуком. При ферментативном - используют трипсин, эндонуклеазы, экзонуклеазы. Как было указано выше, каждый химический агент воздействует на орган определенным образом. Детергенты подразделяются на классы: кислоты и щелочи, ферменты, гипертонические и гипотонические растворы, ионные, неионные и бимодальные детергенты, хелатирующие агенты. Выбор действующего агента и метода децеллюляризации определяют морфологической структурой и свойствами исследуемого органа. При выборе оптимального способа децеллюляризации и временной экспозиции детергентов надо учитывать анатомо-гистологические особенности ткани. Так, неудачно и неправильно выбранный детергент способен привести к разрушению структуры матрикса и потере его механических и биологических свойств. Необходимо учитывать, что любой химический агент повреждает матрикс в той или иной степени, и речь идет только о минимизации последствий. Полученные таким образом каркасы способны стимулировать клеточную пролиферацию, хемотаксис, ответное ремоделирование тканей пациента, однако при этом они не должны содержать продуктов деградации клеток, следов химических детергентов, которыми их обрабатывали [Badylak S.F. 2007; Brown B.N. 2010; Takashi H. et al, 2010].

Общеизвестно, что свободные радикалы и реактивные молекулы участвуют в осуществлении ряда физиологических процессов, в том числе показана их важная роль в обеспечении редокс-регуляции и метаболических процессов на клеточном уровне. В связи с этим оценка интенсивности свободнорадикальных процессов в нативных или децеллюляризированных тканях может служить одним из важнейших критериев качественного и количественного определения в их составе жизнеспособных клеточных структур. Учитывая, что в естественных условиях при жизнедеятельности клеток образуются низкие концентрации свободных радикалов, изучение последних в биологических системах возможно только с использованием современных биофизических методов, например электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектроскопии). При комнатной температуре сигналы ЭПР, которые можно наблюдать у парамагнитных частиц, образующих парамагнитные центры, например при наличии в биологической системе семихинонных или феноксильных радикалов. Прежде всего такие сигналы характерны для семихинонного радикала убихинона (HQ), образующегося в дыхательной цепи митохондрий, функционирование которой также является одним из признаков жизнедеятельности клеток.

Разрабатываемые для оценки качества децеллюляризированных матриксов критерии должны быть комплексными и не ограничиваться только параметрами полного удаления клеток, способных вызвать иммунную реакцию отторжения, но и учитывать степень сохранности структуры ткани, отсутствие токсичности матрикса, возможность восстановления заданных биомеханических характеристик; каркас должен не нарушать клеточной адгезии и полностью воссоздавать трехмерную структуру органа.

Заявителем не выявлено источников информации, кроме приведенного ниже, принятого за ближайший аналог. Изучение процессов децеллюляризации, в которых предложены минимальные критерии оценки качества получаемых децеллюляризированных матриксов [Peter М. Сгаро, Thomas W. Gilbert, Stephen F. Badylak An overview of tissue and whole organ decellularization process. Biomaterials 32 (2011) 3233-3243], включают в себя:

1) выявление наличия <50 нг двухцепочечной ДНК в 1 мг сухого веса внеклеточного матрикса;

2) подтверждение присутствия фрагментов ДНК длиной <200 пар нуклеотидов [Brown B.N. et al 2010; Brown B.N. et al 2009];

3) отсутствие видимого ядерного материала в срезах ткани, окрашенных 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) или гематоксилин-эозином.

Изучение резидуального количества клеточных ядер (см.п. 2) заслуживает огромного внимания, так как от наличия ДНК зависит развитие неблагоприятных реакций со стороны организма [Nagata S. et al, 2010; Zheng M.H. et al, 2005]. Содержание нуклеиновых кислот в ткани легко оценить, на основании чего формируется общее представление об остаточном количестве клеток в ВКМ. Первый и второй перечисленные критерии вычисляют с помощью коммерчески доступных интеркаляторов, таких как PicoGreen [Ahn S.J. et al, 1996], пропидий йодид, бисбензимид или гелевый электрофорез. Третий критерий оценивают путем рутинных морфологических методов исследования, которые служат качественной проверкой первых двух критериев.

Указанные критерии по ближайшему аналогу феноменологического характера были определены на основе многолетнего опыта изучения каркасов тонкого кишечника и мочевого пузыря. В более поздних работах данные критерии были поставлены под сомнение в связи с тем, что менее эффективно децеллюляризированные ткани показывали аналогичные результаты после имплантации при сравнении с эффективно децеллюляризированными тканями. Хотя эти критерии являются полезными при оценке качества каркасов, можно утверждать, что они определяют денуклеаризацию тканей, а не децеллюляризацию. Наличию ДНК уделено большое внимание, поскольку многие децеллюляризированные ткани получены из ксеногенных источников, и есть опасения, что эта ДНК может быть включена в клетки-реципиенты [Zheng М.Н. et al, 2005]. Анализ количества ДНК используют в качестве ориентира концентрации других внутриклеточных или мембранных молекул, который позволяет предположить, что они удалены с той же эффективностью. Внутриклеточные и мембранные компоненты являются антигенами, которые обладают возможностью инициировать иммунное отторжение при трансплантации [Cooper D.K. et al, 1993; Galili U., 2001]. За исключением Gal-эпитопов, сохранение клеточных антигенов в значительной степени является неисследованным. Также было показано, что некоторые клеточно-ассоциированные белки сохраняются и в ВКМ, в том числе такие, как актин, тубулин и миозин [Daly А.В. et al., 2012].

Основным недостатком описываемого способа получения децеллюляризированных матриксов является то, что не применяют комплексного подхода к критериям децеллюляризации, включающим в себя не только морфологический контроль и отсутствие остаточной ДНК, но и биофизические методы, оценивающие различные изменения в получаемом каркасе. Такой подход влечет за собой необъективность оценки и часто вызывает риск получения некачественного материала для создания тканеинженерной конструкции и последующего возможного отторжения биоинженерного трансплантата.

Задачей является разработка комплексной оценки получаемого децеллюляризированного матрикса для создания тканеинженерной конструкции, что повысит качество получаемого материала и в дальнейшем исключит риск отторжения биоинженерного трансплантата.

Техническим результатом создания децеллюляризированного матрикса является его способность поддерживать трехмерность органа или ткани, морфологический контроль сохранности компонентов внеклеточного матрикса и отсутствия клеточных ядер с проведением количественного анализа остатков ДНК, контроль сохранности его биомеханических свойств, определение содержания парамагнитных центров.

Сущностью предложенного способа является то, что осуществляют комплексную оценку матрикса: с помощью морфологического метода подтверждают сохранность его внеклеточных компонентов и отсутствие в нем ядерных структур клеток, при этом количественное значение остатков ДНК в матриксе не должно превышать 25% от исходного уровня, колориметрическим методом подтверждают биосовместимость матрикса, определяют механическим способом заданную сохранность архитектоники матрикса, оценивают биофизическим методом ЭПР-спектроскопии способность матрикса к генерации свободных радикалов, характерных для цепи переноса электронов в митохондриях, причем количество парамагнитных центров с g-фактором от 2.005 до 2.011 должно соответствовать значению менее 1,0⋅10^-8 моль на 1 г лиофилизированной ткани децеллюляризированного матрикса.

Таким образом, для решения технической задачи предлагается способ комплексной оценки эффективности децеллюляризации на примере интраторакальных органов и тканей, включающий не только морфологический контроль и количественную оценку ДНК, но и биомеханическое тестирование получаемых образцов, а также определение свободных радикалов, при этом оценку парамагнитных центров ведут методом ЭПР-спектроскопии с последующим сравнением полученной интегральной интенсивности сигнала ЭПР в исследуемых образцах, вычисленной путем двойного численного интегрирования, с сигналом стандартного образца - 2,2,6,6-Tetramethylpiperidine 1-oxyl (TEMPO). Для определения наличия живых клеточных систем, способных генерировать радикалы, характерные для цепи переноса электронов в митохондриях, необходимо подготовить четыре независимых нативных образца ткани из каждого оцениваемого внеклеточного матрикса. Далее выполнить пробоподготовку, в ходе которой все образцы должны быть подвергнуты лиофилизации в лиофильной сушилке. Затем лиофилизированные образцы необходимо взвесить и измерить сигнал ЭПР в кварцевой ампуле ЭПР-спектрометра в одних и тех же условиях: при температуре 24°С в X диапазоне. Параметры измерения: сверхвысокочастотное излучение мощностью 1 мВт, частота микроволнового излучения - 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции - 0,1 мТл. После этого интегральную интенсивность сигнала ЭПР в исследуемых образцах вычисляют путем двойного численного интегрирования, а концентрацию парамагнитных центров в лиофилизированных образцах определяют путем сравнения полученного сигнала с сигналом стандартного образца - 2,2,6,6-Tetramethylpiperidine 1-oxyl (TEMPO), содержащего в нашем случае 6,4⋅10-7 моль парамагнитных центров.

Данные, подтверждающие эффективность предлагаемого способа.

Использовали 25 нелинейных взрослых крыс-самцов весом 200±50 гр. Все исследования на животных проводили в лаборатории Международного научно-исследовательского клинико-образовательного центра регенеративной медицины на базе Кубанского государственного медицинского университета после одобрения протокола исследования локальным этическим комитетом (протокол №21/1, Краснодар). При подготовке к децеллюляризации сердца выделяют органокомплекс «сердце-легкие», верхнюю и нижнюю полые вены отсекают, аорту канюлируют на расстоянии 2-2,5 см от сердца, ветви дуги аорты: плечеголовной ствол, левую общую сонную и левую подключичную артерии лигируют, легкие отсекают. Для проведения децеллюляризации орган помещают в биореактор (Harvard Apparatus, Массачусетс, США), выполняют ретроградную перфузию жидкости через аорту. Децеллюляризацию сердца проводят детергент-энзиматическим методом по разработанному протоколу [Сотниченко А.С, Губарева Е.А. и др. Децеллюляризированный матрикс сердца крысы как основа для создания тканеинженерного сердца// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - №3 (VIII). - С. 86-94]. Децеллюляризацию легких выполняют детергент-энзиматическим методом путем последовательного воздействия децеллюляризирующих растворов: буфера PBS, дезоксихолата натрия 1%, тритона Х-100 0,1%, свиной панкреатической ДНКазы I, деионизированной водой, с равной продолжительностью воздействия путем перфузии через легочную артерию в течение 24 часов [Куевда Е.В., Губарева Е.А. и др. Детергентно-энзиматический метод децеллюляризации легких крысы. Морфологическая оценка матрикса// Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №3; URL: www.science-education.ru/123-17759]. Кроме того, децеллюляризация проводится на фоне постоянной вентиляции трахеи атмосферным воздухом с помощью системы Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator (Harvard Apparatus, Массачусетс, США). При проведении децеллюляризации диафрагмы применяют стандартный ротационный метод с использованием модифицированного протокола [Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Гилевич И.В., Маккиарини П. Морфологическая оценка качества децеллюляризации сердца и диафрагмы крыс. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. Том VIII, №3, 2012], включающего обработку стерильными растворами: деионизированной водой, дезоксихолат натрием 4%, PBS, свиной панкреатической ДНКазой I, ЭДТА. Предварительно диафрагму очищают от жира и промывают стерильным раствором PBS. Для более щадящей децеллюляризации и уменьшения чрезмерного растяжения при фиксации используют биореактор, который включает в себя сменные емкости для различных детергентов и защищает ткань от повреждения.

Морфологический анализ полученных образцов децеллюляризированных органов и тканей проводят после фиксации в 10% нейтральном забуференном формалине, дегидратации и заключения в парафин по стандартной методике с последующим получением микротомных срезов толщиной 5 мм. Для общегистологической оценки препаратов проводят окраску гематоксилином и эозином и флуорофором DAPI для определения наличия остаточных ядер и сохранности структурных компонентов внеклеточного матрикса. Окрашивания Массон трихроматом и по Ван Гизон используют для изучения структуры и тинкториальных свойств коллагеновых и эластиновых волокон соединительной ткани ВКМ. При анализе результатов гистологических исследований патологических изменений структуры, ориентации волокон, тинкториальных свойств соединительной ткани сердца, легких и диафрагмы обнаружено не было, в то время как клеточные элементы полностью отсутствовали.

Количественную оценку содержания ДНК в нативных и децеллюляризированных органах проводят на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) с использованием стандартных наборов реагентов (DneasyBlood and Tissue Kit, Qiagen, Sweden) по методике фирмы-изготовителя. Анализ результатов количественного определения содержания остаточной ДНК в тканях децеллюляризированного сердца, легких и диафрагмы показал, что элиминация ядерного материала составила соответственно 81%, 92% и 74%.

Сравнительные биомеханические тесты нативных и децеллюляризированных образцов сердца, легких и диафрагмы проводят на универсальных испытательных машинах фирмы Инстрон модель 5965 (датчик 50 Н) и на Lloyd LRX (100 N load cell) путем одноосного растяжения с постоянной скоростью движения зажимов и циклических испытаний на двухосное нагружение. Типичные кривые, полученные при испытании на одноосное растяжение, говорят о том, что деформация образцов нативных и децеллюляризированных органов носит одинаковый характер, основные механические характеристики после децеллюляризации несущественно отличаются от свойств нативных органов.

Измерение спектров ЭПР проводят на спектрометре JES FA 300 («JEOL», Япония) при температуре 24°С в X диапазоне. Параметры измерения: сверхвысокочастотное излучение мощностью 1 мВт, частота микроволнового излучения - 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции - 0,1 мТл [Барышев М.Г., Басов А.А., Болотин С.Н. и др. // Известия РАН. Серия Физическая. 2012. Т. 76. №12. С. 1507-1510]. Образцы предварительно подвергают лиофилизации в сушилке «ЛС-1000» («Проинтех», РФ), после чего взвешивают (весы "Ohaus", Китай, точность ±0,01 мг). Сигнал ЭПР у взвешенного образца измеряют в кварцевой ампуле. Интегральную интенсивность сигнала ЭПР в исследуемых образцах вычисляют путем двойного численного интегрирования [Бахвалов Н.С. Численные методы / Н.С. Бахвалов, Н.П. Жидков, Г.М. Кобельков. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2003. - 636 с.], концентрацию парамагнитных центров в образцах определяют путем сравнения интенсивности полученного сигнала с сигналом стандартного образца (TEMPO), содержащего 6,4⋅10^-7 моль парамагнитных центров. На рис. 1 приложения представлен спектр ЭПР децеллюляризированной диафрагмы, где по оси ординат - первая производная величины высокочастотного излучения к напряженности магнитного поля, поглощенного изучаемым образцом; по оси абсцисс - напряженность магнитного поля. В децеллюляризированной диафрагме парамагнитные центры, соответствующие семихинонному радикалу убихинона (HQ⋅), не выявили, что подтверждается отсутствием сигнала с g-фактором в диапазоне от 2.005 до 2.011, который достоверно отличался бы по интенсивности от нуля. Полученные данные отражают отсутствие системы переносчиков электронов, необходимых для функционирования живых клеток, в децеллюляризированной диафрагме. Спектры ЭПР децеллюляризированных тканей легкого и сердца имеют аналогичный характер, что подтверждает отсутствие жизнеспособных клеток в соответствующих органах после выполнения протокола децеллюляризации. С помощью ЭПР-спектроскопии в нативной диафрагме были выявлены парамагнитные центры с g-фактором 2.007, соответствующие семихинонному радикалу убихинона, концентрация которых составила около 10^-8 моль на грамм лиофилизированной ткани (рис. 2а, где по оси ординат - первая производная величины высокочастотного излучения к напряженности магнитного поля, поглощенного изучаемым образцом, по оси абсцисс - напряженность магнитного поля), что свидетельствует о наличии живых клеточных элементов в изученном образце. Спектры ЭПР нативного легкого (рис. 2б, по оси ординат - первая производная величины высокочастотного излучения к напряженности магнитного поля, поглощенного изучаемым образцом, по оси абсцисс - напряженность магнитного поля) также показали наличие еще большей концентрации парамагнитных центров в изучаемых образцах по сравнению с диафрагмой. Зафиксированные с помощью ЭПР-спектроскопии радикалы со значением g-фактора (2.007) отражают наличие жизнеспособных клеток, при этом интенсивность сигнала соответствует концентрации парамагнитных центров, равной от 4,54⋅10^-8 моль/г до 1,14⋅10^-7 моль/глиофилизированной ткани. Спектры ЭПР нативного сердца (рис. 2в, по оси ординат - первая производная величины высокочастотного излучения к напряженности магнитного поля, поглощенного изучаемым образцом, по оси абсцисс - напряженность магнитного поля) также указывают на содержание семихинонных радикалов со значением g-фактора 2.008. Интенсивность сигнала у образцов нативного сердца соответствует концентрации парамагнитных центров от 2,76⋅10^-7 моль/г до 6,62⋅10^-7 моль/г лиофилизированной ткани и отражает высокую активность свободнорадикальных процессов в митохондриях нативных кардиомиоцитов.

Способ оценки качества децеллюляризированных матриксов для получения биоинженерных трансплантатов, включающий оценку получаемых каркасов, отличающийся тем, что осуществляют комплексную оценку матрикса: с помощью морфологического метода подтверждают сохранность его внеклеточных компонентов и отсутствие в нем ядерных структур клеток, при этом количественное значение остатков ДНК в матриксе не должно превышать 25% от исходного уровня, колориметрическим методом подтверждают биосовместимость матрикса, определяют механическим способом заданную сохранность архитектоники матрикса, оценивают биофизическим методом ЭПР-спектроскопии способность матрикса к генерации свободных радикалов, характерных для цепи переноса электронов в митохондриях, причем количество парамагнитных центров с g-фактором от 2.005 до 2.011 должно соответствовать значению менее 1,0⋅10^-8 моль на 1 г лиофилизированной ткани децеллюляризированного матрикса.