Способ количественного определения мутации g250e киназного домена bcr-abl у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ



Способ количественного определения мутации g250e киназного домена bcr-abl у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ
Способ количественного определения мутации g250e киназного домена bcr-abl у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ
Способ количественного определения мутации g250e киназного домена bcr-abl у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ
Способ количественного определения мутации g250e киназного домена bcr-abl у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ
C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2620076:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к биохимии. Описан способ выявления мутации G250E киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ). Заявляемый способ включает постановку полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием кДНК, полученной способом обратной транскрипции из РНК, выделенной из образцов крови больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к ингибиторам тирозинкиназ первого поколения. В качестве праймеров используют систему, состоящую из прямого праймера SEQ ID NO: 1 и обратного специфического праймера на мутацию SEQ ID NO: 2. Для количественного определения мутации G250E используют специфический зонд, SEQ ID NO: 3. Число копий BCR-ABLG250E в образцах определяют по калибровочной кривой. Для определения общей экспрессии BCR-ABL используют систему, состоящую из прямого праймера, SEQ ID NO: 4, обратного праймера, SEQ ID NO: 5, и специфического зонда SEQ ID NO: 6. Для определения экспрессии контрольного гена ABL используют систему, состоящую из прямого праймера, SEQ ID NO: 7, обратного праймера, SEQ ID NO: 8, и специфического зонда SEQ ID NO: 9. Экспрессию BCR-ABLG250E вычисляют относительно общей экспрессии BCR-ABL и контрольного гена ABL по формуле: (Q BCR-ABLG250E cp./Q ABL ср.) / (Q BCR-ABL cp./Q ABL cp.)*100%. Способ позволяет повысить чувствительность и специфичность определения количества мутантного клона и сократить время исследования. 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике и онкогематологии, и касается способа выявления мутации G250E киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ).

Таргетная терапия ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) способствует существенному увеличению продолжительности и улучшению качества жизни больных. Однако примерно у половины пациентов эта терапия оказывается неэффективной из-за развития резистентности (Овсянникова Е.Г. и др., Мутационный статус резистентных к иматинибу больных хроническим миелолейкозом. Онкогематология, 2012, т. 4, с. 16-23). Основной причиной резистентности больных ХМЛ к терапии ингибиторами тирозинкиназ являются точечные мутации, затрагивающие киназный домен химерного онкогена BCR-ABL между экзонами а3 и a11 гена ABL. В результате мутаций изменяется конформация белка BCR-ABL и молекулы ИТК не могут взаимодействовать с ним с прежней эффективностью. Определение мутационного статуса этого участка является обязательным для больных ХМЛ с недостаточным ответом на терапию иматинибом, а также при переходе на терапию нилотинибом и дазатинибом. Наиболее часто встречающейся мутацией киназного домена BCR-ABL является T315I, при обнаружении которой используется препарат следующего поколения - понатиниб. Количественное определение мутантной формы гена BCR-ABLT315I, в том числе с применением аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в реальном времени, является одним из диагностических критериев, которыми необходимо руководствоваться при ведении пациентов, демонстрирующих недостаточный ответ при стандартной терапии (Абдуллаев А.О. и др., Количественная оценка уровня транскрипта BCR-ABL T315I у больных хроническим миелоидным лейкозом при помоши аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Гематология и трансфузиология, 2014, т. 59, №4, с. 7-11). Следующей по частоте встречаемости мутацией является G250E, которая составляет около 12% от количества всех встречающихся мутаций киназного домена и вызывает резистентность к иматинибу. При этом дазатиниб и нилотиниб могут быть использованы при выявлении этой мутации. В связи с этим представляется важной задачей разработка нового способа своевременного выявления мутации G250E для коррекции применяемой терапии. Количественное определение выявленных мутаций позволяет оперативно определять эффективность применяемой терапии относительно конкретного опухолевого клона, несущего мутацию.

Известно, что идентификацию мутаций киназного домена гена BCR-ABL осуществляют с помощью прямого секвенирования продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР-продуктов). В последнее время с этой целью также используют полноэкзомное секвенирование (Смирнихина С.А., Лавров А.В., Адильгереева Э.П., Туркина А.Г., Куцев С.И. Клиническое значение полноэкзомных исследований миелоидных опухолей методом секвенирования следующего поколения. Клиническая онкогематология, 2013, №1, с. 11-19). Секвенирование является достаточно точным, однако довольно трудоемким и дорогостоящим методом. Метод полимеразной цепной реакци (ПЦР) в отличие от прямого секвенирования характеризуется высокой чувствительностью. Анализ специфичности выявления мутации в гене BCR-ABL методом прямого секвенирования и ПЦР в реальном времени показывает сопоставимые результаты. Выявление экспрессии мутантной формы BCR-ABLG250E у больных ХМЛ может быть использовано для диагностики резистентности к ингибиторам тирозинкиназ первого поколения (ИТК-1), а также для оценки чувствительности к проводимой терапии.

Известен способ определения уровня экспрессии BCR-ABLG250E с помощью ПЦР в реальном времени (Ferri С.et al. Early detection and quantification of mutations in the tyrosine kinase domain of chimerical BCR-ABL 1 gene combining high-resolution melting analysis and mutant-allele specific quantitative polymerase chain reaction, Leukemia & lymphoma, 2012, 54(3): 598-606). Способ включает следующие этапы:

1. Получение РНК из лейкоцитов с помощью реагента TRIzol (Invitrogen).

2. Получение кДНК с помощью смеси случайных гексамеров и обратной транскриптазы (M-MLV) (Invitrogen).

3. Амплификацию фрагмента ДНК 1313 п.о. с помощью праймеров BCR13-Fw и ABL7-Rw . Для постановки ПЦР в реальном времени использовали тысячекратные разведения амплифицированного образца.

4. Анализ образцов и отрицательного контроля с помощью ПЦР в реальном времени в двух повторах для каждой реакции со специфическим праймером на мутацию и с праймером, определяющим «дикий тип». Анализ проводили с помощью прибора Rotor-Gene real-time PCR platform (Qiagen). Общий прямой праймер: P-Fw ; специфический обратный праймер для определения мутации: D G250E-Rw ; специфический обратный праймер для определения «дикого типа»: ND P-Rw . Температурные условия: 50°С - 2 мин, 95°С - 5 мин, 95°С - 10 с 45 циклов, 60°С - 15 с и 72°С - 10 с (прототип).

Недостатками способа являются: наличие двух стадий ПЦР увеличивает время исследования; использование реактива SYBR-Green дает недостаточно специфичный результат; отсутствие калибровочной кривой для определения концентрации BCR-ABLG250E в образце снижает точность получаемых результатов.

Задачей заявляемого изобретения является создание нового способа количественного определения мутации G250E киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ, с более высокой точностью и специфичностью получаемых результатов и с сокращением времени исследования.

Технический результат заявляемого изобретения состоит в том, что создан новый способ количественного определения мутации G250E киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ, который обладает более высокой чувствительностью и специфичностью за более короткое время.

Сущность способа состоит в следующем: способ основан на постановке ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии мутантного гена BCR-ABLG250E с использованием одной стадии ПЦР. Способ содержит аллель-специфический праймер и специфический зонд и включает стандарты с известным числом копий исследуемого гена (плазмида со вставкой участка химерного онкогена BCR-ABLG250E). В качестве объекта исследования использовали кДНК, полученную способом обратной транскрипции из РНК, выделенной из образцов крови больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к ИТК-1. Нуклеотидные последовательности праймеров, используемые для проведения детекции, представлены в Перечне последовательностей. В качестве праймеров для определения экспрессии BCR-ABLG250E использовали систему, состоящую из прямого праймера, SEQ ID NO: 1, и обратного специфического праймера на мутацию, SEQ ID NO: 2. Для количественного определения использовали специфический зонд SEQ ID NO: 3. Число копий BCR-ABLG250E в клинических образцах определяли по калибровочной кривой, которая строится по стандартам с известной концентрацией. Для определения общей экспрессии BCR-ABL использовали систему, состоящую из прямого праймера, SEQ ID NO: 4, обратного праймера, SEQ ID NO: 5, и специфического зонда SEQ ID NO: 6. Для определения экспрессии контрольного гена ABL использовали систему, состоящую из прямого праймера, SEQ ID NO: 7, обратного праймера, SEQ ID NO: 8, и специфического зонда SEQ ID NO: 9. Экспрессию BCR-ABLG250E вычисляли относительно общей экспрессии BCR-ABL и контрольного гена ABL по формуле: (Q BCR-ABLG250E cp./Q ABL ср.) / (Q BCR-ABL cp./Q ABL cp.)*100%.

Способ осуществляется следующим образом:

1. Выделение тотальной РНК из клинических образцов. РНК выделяли из ядерных клеток крови быстрым лизисом в гуанидин-изотиоцианатном буфере с последующей фенольной обработкой [Chomczynski P., Anal Biochem., 1987 Apr, 162(1): 156-9]. Этот способ позволяет получить наибольшее количество РНК из биологического материала.

2. Проведение реакции обратной транскрипции с получением кДНК. Реакционная смесь обратной транскрипции при синтезе кДНК содержит в общем объеме 25 мкл 2,0 мкг РНК, четыре основных dNTP в концентрации 1 мМ по каждому, 10 наномоль смеси случайных гексамеров, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 75 мМ хлорид калия, 3,0 мМ хлорид магния, 10 мМ дитиотреитола, 40 ед. ингибитора РНКаз (предпочтительно RNAsin производства Promega, США), 200 ед. ревертазы M-MLV (предпочтительно производства Promega, США). При составлении реакционной смеси использовали 5х буфер для обратной транскрипции (предпочтительно производства Promega, США). Инкубировали при 37°С в течение 45 мин, затем прогревали 2 мин при 94°С для остановки реакции.

3. Проведение реакции амплификации в режиме реального времени, совмещенной с определением продуктов реакции, для BCR-ABLG250E, BCR-ABL и контрольного (референсного) гена ABL.

Количественное определение экспрессии BCR-ABLG250E проводили с помощью реакции амплификации в режиме реального времени с использованием прибора ABIPrizm 7500 фирма «Applied Biosystems», США (возможно проведение реакции на любом приборе для ПЦР в реальном времени с аналогичными характеристиками). Смесь для ПЦР включала буфер для ПЦР - 12,5 мкл × (N+1); праймеры - 2,5 мкл × (N+1); зонд - 2,5 мкл × (N+1); воду - 2,3 мкл × (N+1); ДНК-полимеразу - 0,2 мкл × (N+1). Общий объем рассчитывался по формуле: 20 мкл × (N+1), где N - число реакций (пробирок, лунок).

Буфер для ПЦР представлял собой водный раствор следующего состава: дезоксинуклеозидтрифосфаты по 4 мМ дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ (производства «Fermentas», Литва, или аналогичные); TrisHCl рН 9,0 40 мМ (производства «Sigma», США, или аналог); KCl 100мМ (производства «AppliChem», Германия, или аналог); MgCl2 4 мМ (производства «AppliChem», Германия, или аналог); меркаптоэтанол-2 (в) 0,1М (производства «AppliChem», Германия, или аналог).

Смесь праймеров для определения BCR-ABLG250E представляла собой 3,5 мкМ водный раствор смеси олигонуклеотидов (производства «ДНК-Синтез», Россия, или аналогичный), SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Зонд BCR-ABLG250E представлял собой 2 мкМ водный раствор олигонуклеотидного зонда, меченного флуоресцентным красителем (производства «ДНК-Синтез», Россия, или аналогичный), SEQ ID NO: 3.

Вода представляла собой деионизованную воду с удельным сопротивлением не менее 18 Мом/см.

ДНК-полимераза представляла собой раствор термостабильной ДНК-полимеразы происхождения Thermus aquaticus, обладающей 5'->3'экзонуклеазной активностью, с ферментативной активностью 5 Ед/мкл в буфере для хранения (производства «Силекс», Россия, или аналогичный).

Положительный контроль включал контрольные пробы, содержащие плазмиду pGEM®-T Easy с вставкой фрагмента кДНК гена BCR-ABLG250E с концентрациями 102, 103, 104, 105 и 106 копий гена в 5 мкл.

Смесь праймеров для определения BCR-ABL представляла собой 3,5 мкМ водный раствор смеси олигонуклеотидов (производства «ДНК-Синтез», Россия, или аналогичный), SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

Зонд BCR-ABL представлял собой 2 мкМ водный раствор олигонуклеотидного зонда, меченного флуоресцентным красителем (производства «ДНК-Синтез», Россия, или аналогичный), SEQ ID NO: 6.

Положительный контроль представлял собой контрольные пробы, содержащие плазмиду pGEM®-T Easy с вставкой фрагмента кДНК гена BCR-ABL р210 с концентрациями 102, 103, 104, 105 и 106 копий гена в 5 мкл.

Смесь праймеров ABL представляла собой 3,5 мкМ водный раствор смеси олигонуклеотидов (производства «ДНК-Синтез», Россия, или аналогичный), SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.

Зонд ABL представлял собой 2 мкМ водный раствор олигонуклеотидного зонда, меченного флуоресцентным красителем (производства «ДНК-Синтез», Россия, или аналогичный), SEQ ID NO: 9.

Положительный контроль представлял собой контрольные пробы, содержащие плазмиду pGEM®-T Easy с вставкой фрагмента кДНК гена ABL с концентрациями 104, 105 и 106 копий гена в 5 мкл.

Температурные условия реакции амплификации: нагрев при температуре 95°С в течение 10 мин, 50 циклов в режиме при температуре 95°С в течение 15 с, затем при 60°С в течение 60 с.

Для построения калибровочной кривой использовали трехкратные повторы разведений положительного контроля, концентрация которых составляла 102, 103, 104, 105 и 106 копий в 5 мкл. По окончании ПЦР-амплификации в режиме реального времени для каждой пробы определяли значение порогового цикла (Ct) - цикла амплификации, в котором кривая флуоресценции данного образца пересекает линию порогового значения. Изобретение иллюстрируется фигурой.

По значениям стандартов с известной концентрацией (положительных контролей) строили калибровочную кривую, по которой, исходя из значения порогового цикла в каждой пробирке/лунке, определяли исходное число копий гена в каждом образце. Для более точного определения числа копий гена каждый образец ставили в трех повторах, для расчетов использовали среднее значение числа копий. Построение калибровочной кривой и определение числа копий гена производили с помощью компьютерных программ, прилагаемых к ПЦР-амплификатору.

Относительную экспрессию генов BCR-ABLG250E и BCR-ABL в образце определяли как среднее число копий определяемого гена, поделенное на среднее число копий контрольного гена и умноженное на 100%. В качестве контрольного гена использовали ген ABL.

Количественную оценку результатов ПЦР определяли по формуле:

(Q BCR-ABLG250E cp./Q ABL ср.) / (Q BCR-ABL cp./Q ABL cp.)*100%.

Выявление экспрессии мутантной формы BCR-ABLG250E у больных ХМЛ может быть использовано для диагностики резистентности к ИТК-1, а также для оценки ответа пациента на проводимую терапию.

Способ количественного определения мутации G250E киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ, включающий выделение тотальной РНК из клинических образцов, проведение реакции обратной транскрипции с получением кДНК, проведение реакции амплификации в режиме реального времени, отличающийся тем, что применяют одну стадию ПЦР для определения экспрессии BCR-ABLG250E; в качестве праймеров используют систему, состоящую из прямого праймера SEQ ID NO: 1 и обратного специфического праймера на мутацию SEQ ID NO: 2, и специфического зонда, SEQ ID NO: 3; для определения экспрессии BCR-ABL используют систему, состоящую из праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 и зонда SEQ ID NO: 6, для определения экспрессии ABL используют систему, состоящую из праймеров SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 и зонда SEQ ID NO: 9; число копий BCR-ABLG250E в образцах определяют по калибровочной кривой, которая строится по стандартам с известной концентрацией, и вычисляют экспрессию BCR-ABLG250E и BCR-ABL относительно контрольного гена ABL по формуле: (Q BCR-ABLG250E cp./Q ABL ср.)/(Q BCR-ABL cp./Q ABL cp.)*100%.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Описаны олигонуклеотиды длиной от 15 до 30 нуклеотидов, которые специфически гибридизуются с природной антисмысловой последовательностью IRS2 и имеют последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку последовательности SEQ ID NO: 3, или имеют последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанные олигонуклеотиды необязательно содержат одну или более модификаций, выбранных из следующих: по меньшей мере один модифицированный фрагмент сахара, по меньшей мере одна модифицированная межнуклеозидная связь, по меньшей мере один модифицированный нуклеотид и их комбинации; и их применение для лечения заболеваний и расстройств, связанных с экспрессией UCP2.

Изобретение относится к биохимии. Описан антисмысловой олигомер, который вызывает пропуск 50-го экзона в гене дистрофина человека, состоящий из нуклеотидной последовательности, комплементарной любой из нуклеотидных последовательностей, состоящих из 106-го - 126-го, 107-го - 127-го, 108-го - 127-го, 108-го - 128-го или 109-го - 129-го нуклеотидов, считая от 5'-конца 50-го экзона гена дистрофина человека.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению березы со способностью раннего цветения в срок до шести лет включительно с момента высадки из условий in vitro в нестерильные или посадки различных частей растения в условия защищенного или открытого грунта по сравнению с аналогом дикого типа, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую глутаминсинтетазу.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа направленного истощения олигонуклеотидных библиотек в отношении водорастворимых белковых мишеней глутатион-S-трансферазы и стрептавидина.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к cтерильному триплоидному трансгенному растению березы пушистой с ускоренными темпами роста по сравнению с нетрансформированным растением, содержащему ген gs1 с SEQ ID NO:1 и полученному путем агробактериального переноса указанного гена gs1 в березу Betula pubescens бп4а.

Изобретение относится к олигонуклеотиду длиной от 15 до 30 нуклеотидов, который специфически гибридизуется с природной антисмысловой последовательностью IRS2 и имеет последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку последовательности SEQ ID NO: 3, или имеет последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный олигонуклеотид необязательно содержит одну или более модификаций, выбранных из следующих: по меньшей мере один модифицированный фрагмент сахара, по меньшей мере одна модифицированная межнуклеозидная связь, по меньшей мере один модифицированный нуклеотид и их комбинации.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к подавлению экспрессии генов цитокинов миРНК, и может быть использовано в медицине. Способ включает интраназальное или ингаляционное введение субъекту эффективного количества средства, содержащего смесь молекул миРНК, подавляющих экспрессию гена IL-13 и IL-4.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммуностимулирующий неметилированный CpG-олигодезоксинуклеотид, вектор экспрессии, его содержащий, вакцина для предотвращения или борьбы с инфекционным заболеванием у птиц, содержащая указанные олигодезоксинуклеотид и/или вектор экспрессии и иммунологическое количество антигенного компонента, выделенного из патогенного для птичьих вируса или микроорганизма, а также применение олигодезоксинуклеотида в качестве лекарственного средства и для предотвращения инфекции у птичьих.

Изобретение относится к биохимии. Описаны антисмысловые олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию ядерного респираторного фактора 1 (NRF1), в частности, путем нацеленного взаимодействия с природными антисмысловыми полинуклеотидами ядерного респираторного фактора 1 (NRF1).

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложена двухцепочечная молекула РНК с тупыми концами длиной 23 пары оснований для обеспечения клетки активностью miR-34a.

Изобретения касаются средства для направленной на ДНК РНК-интерференции (ddRNAi) (варианты) для ингибирования экспрессии РНК-зависимой ДНК полимеразы вируса гепатита В (HBV), кассеты экспрессии для экспрессии средства для ddRNAi, вектора экспрессии для ddRNAi, фармацевтической композиции, содержащей средство для ddRNAi и их применение для лечения инфекции, вызванной гепатитом B, у индивидов. Охарактеризованное средство содержит, в направлении от 5' к 3':первую эффекторную последовательность длиной 18-22 нуклеотида,первую эффекторную комплементарную последовательность,вторую эффекторную последовательность длиной 18-22 нуклеотида ивторую эффекторную комплементарную последовательность;третью эффекторную последовательность длиной 18-22 нуклеотида; итретью эффекторную комплементарную последовательность,где каждая эффекторная последовательность, по существу, комплементарна участку предсказанного транскрипта гена РНК-зависимой ДНК полимеразы. Несколько эффекторов могут нацеливаться на один и тот же участок гена HBV, разные (возможно, перекрывающиеся) участки одного и того же гена и/или разные гены HBV. Изобретения могут быть использованы для целенаправленного воздействия на экспрессию HBV в клетках для лечения инфекции HBV. 9 н. и 7 з.п. ф-лы, 10 ил., 6 табл., 9 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описаны олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию фратаксина (FXN), в частности, посредством нацеленного взаимодействия с природными антисмысловыми полинуклеотидами фратаксина (FXN). Настоящее изобретение также относится к применению указанных олигонуклеотидов для лечения заболеваний и расстройств, связанных с экспрессией фратаксина (FXN). Изобретение расширяет арсенал средств для лечения заболеваний и расстройств, связанных с экспрессией фратаксина (FXN). 9 н. и 35 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм VACΔ6 вируса осповакцины с нарушенными генами C3L, N1L, J2R, A35R, A56R, B8R на основе клонированного вируса осповакцины (штамм Л-ИВП). Предложенный штамм депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» с регистрационным № V-696 и предназначен для получения безлопастной живой культуральной аттенуированной вакцины против вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов, обладающей повышенной иммуногенной и протективной активностью. Предложенный рекомбинантный штамм может быть использован в медицине для получения вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека. 7 ил., 2 табл., 13 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к соединению для снижения экспрессии mRNA аполипопротеина (а) и белка apo(a) у животного, и может быть использовано в медицине. Полученные модифицированные антисмысловые соединения способны специфично ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты apo(a). Изобретение может быть использовано в качестве лекарственного средства при лечении, предотвращении или замедлении прогрессирования заболевания, связанного с повышенным apo(a) или Lp(a), у нуждающегося в этом индивида. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 65 табл., 13 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ, экспрессирующих ген цекропина P1. Изобретение позволяет создавать биобезопасные лекарственные растения каланхоэ с высоким уровнем накопления целевого продукта и в сокращенные по времени сроки. 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 10 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена молекула двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) для ингибирования экспрессии вируса гепатита В (HBV). Также изобретение относится к композициям и способам исследования, диагностики и лечения симптомов, заболеваний и состояний, реагирующих на модуляцию экспрессии генов HBV. Изобретение позволяет эффективно ингибировать экспрессию генов HBV. 11 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 15 табл., 6 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены способы повышения экспрессии гена сиалидазы 4 (NEU4) с использованием олигонуклеотида, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом для гена NEU4. Представлен олигонуклеотид длиной от 10 до 30 нк, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом для гена NEU4. Также представлена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество указанного олигонуклеотида. Группа изобретений позволяет повышать экспрессию гена NEU4, что применимо для лечения или предотвращения заболеваний, ассоциированных с геном NEU4 и/или по меньшей мере одним продуктом, кодируемым указанным геном. 6 н. и 30 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий культивирование дифференцированной клетки в среде для перепрограммирования, содержащей альбумин, где альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, трансфицирование клетки одной или более синтетических молекул РНК, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую один или более факторов перепрограммирования, и где указанное трансфицирование приводит к получению клетки, экспрессирующей один или более факторов перепрограммирования; и повторение стадии (b) по меньшей мере дважды в течение 5 последовательных дней с получением клетки, перепрограммированной в менее дифференцированное состояние. Описана среда для культивирования клеток для перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, содержащая: среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко: питательную среду F-12 (DMEM/F12), 10 мкг/мЛ инсулина, 5,5 мкг/мЛ трансферрина, 6,7 нг/мЛ селенита натрия, 20 нг/мЛ основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 5 мг/мЛ альбумина, где альбумин обработан ионообменной смолой и/или древесным углем. Также представлена среда для культивирования клеток для перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, содержащая среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко: питательную среду F-12 (DMEM/F12), 10 мкг/мЛ инсулина, 5,5 мкг/мЛ трансферрина, 6,7 нг/мЛ селенита натрия, 20 нг/мЛ основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 5 мг/мЛ альбумина, где менее чем 0,65% сухого веса альбумина включает липиды и/или менее чем 0,35% сухого веса альбумина включает свободные жирные кислоты. Изобретение расширяет арсенал способов перевода клетки в менее дифференцированное состояние. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 29 пр.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к одноцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, которая подавляет экспрессию целевого гена. Указанная молекула в порядке от 5’-конца к 3’-концу содержит 5’-концевой участок Xc, линкерный участок Lx, внутренний участок Z, линкерный участок Ly и 3’-концевой участок Yc. При этом внутренний участок Z состоит из внутреннего 5’-концевого участка X, который комплементарен 5’-концевому участку Xc, и внутреннего 3’-концевого участка Y, который комплементарен 3’-концевому участку Yc. При этом Z состоит из 19-30 оснований и содержит последовательность, подавляющую экспрессию целевого гена. Z-(Xc+Yc) от 0 до 4 оснований, Xc от 1 до 11 оснований и Yc от 1 до 11 оснований. Настоящее изобретение также раскрывает способ, применение и композицию для подавления экспрессии целевого гена, способ, применение и фармацевтическую композицию для лечения заболевания, вызванного повышением экспрессии целевого гена, использующие указанную выше молекулу нуклеиновой кислоты и применение такой молекулы для индукции РНК-интерференции. Настоящее изобретение позволяет использовать одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты для лечения пациентов, поскольку таковая не вызывает побочный эффект в виде индукции интерферона. 8 н. и 24 з.п. ф-лы, 32 ил., 7 табл., 25 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, связанного с hsp47, содержащая носитель для лекарственного средства и двухнитиевую молекулу нуклеиновой кислоты, где носитель для лекарственного средства содержит ретиноид и липид, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты содержит структуру:5' (N)x-Z 3' (антисмысловая нить)3' Z'-(N')y-z'' 5' (смысловая нить),где каждый N и N' представляет собой нуклеотид, который является немодифицированным или модифицированным или нестандартной составляющей. Также описан способ применения указанной композиции для лечения заболеваний, связанных с экспрессией hsp47, включая фиброз. Изобретение расширяет арсенал средств, предназначенных для лечения заболеваний, связанных с экспрессией hsp47. 2 н. и 47 з.п. ф-лы, 32 ил., 13 табл., 23 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ выявления мутации G250E киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом. Заявляемый способ включает постановку полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием кДНК, полученной способом обратной транскрипции из РНК, выделенной из образцов крови больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к ингибиторам тирозинкиназ первого поколения. В качестве праймеров используют систему, состоящую из прямого праймера SEQ ID NO: 1 и обратного специфического праймера на мутацию SEQ ID NO: 2. Для количественного определения мутации G250E используют специфический зонд, SEQ ID NO: 3. Число копий BCR-ABLG250E в образцах определяют по калибровочной кривой. Для определения общей экспрессии BCR-ABL используют систему, состоящую из прямого праймера, SEQ ID NO: 4, обратного праймера, SEQ ID NO: 5, и специфического зонда SEQ ID NO: 6. Для определения экспрессии контрольного гена ABL используют систему, состоящую из прямого праймера, SEQ ID NO: 7, обратного праймера, SEQ ID NO: 8, и специфического зонда SEQ ID NO: 9. Экспрессию BCR-ABLG250E вычисляют относительно общей экспрессии BCR-ABL и контрольного гена ABL по формуле: *100. Способ позволяет повысить чувствительность и специфичность определения количества мутантного клона и сократить время исследования. 1 ил.

Наверх