Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты)



Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты)
Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты)
G01N1/30 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2620559:

федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)" (RU)

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается вариантов способа окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии. Предложенные способы позволяют окрашивать препараты образцов биологических тканей молодых и взрослых животных целиком, без предварительного секционирования. Использование предлагаемых способов окрашивания позволяет сохранять морфологию образцов и высокоспецифично выявлять этинильную группу даже в толще крупных препаратов (не менее 5 мм) биологической ткани. Изобретение значительно облегчает и ускоряет процесс визуализации и анализа препаратов за счет использования методов трехмерной микроскопии и томографии. Препараты образцов, окрашенные предлагаемыми способами, обладают высоким соотношением сигнал : фон и специфичностью окраски, что позволяет использовать их для проведения автоматизированного количественного и качественного анализа выявленных меток. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 ил.

 

Предлагаемая группа изобретений относится к области экспериментальной биологии и медицины, где необходимо приготовление препаратов цельных биологических тканей и органов для оптической проекционной, блок-фэйс и серийной двухфотонной томографии, конфокальной, мультифотонной и светоплоскостной микроскопии с целью получения трехмерных карт гистологической локализации популяций клеток, меченных этинильным маркером. Изобретения могут быть использованы для предклинических испытаний фармакологических препаратов и оценки физиологических воздействий на организм, а также для работы с материалом биопсий в диагностических и исследовательских целях.

В последние годы в связи с развитием методов трехмерной микроскопии и оптической томографии возникла потребность в новых методах детекции различных популяций клеток в цельных (несекционированных) биологических образцах. В настоящий момент с этой целью используют иммуногистохимические техники. Несмотря на достоинства иммуногистохимии, ее использование для окрашивания крупных образцов ткани затруднено ограниченной проницаемостью высокомолекулярных соединений, таких как антитела, вглубь биологического образца. Это обуславливает длительность процесса иммуногистохимического окрашивания цельных образцов.

В последние годы в качестве альтернативы иммуногистохимической реакции стали использовать клик-реакции, в частности реакцию [3+2] алкил-азидного циклоприсоединения. Для этого животному вводят в качестве экзогенного маркера алкильную (обычно этинильную) группу, которую детектируют затем при помощи флуоресцентно меченного азида. Несмотря на то, что молекулы азида почти 1/500 раз меньше молекулы антител, благодаря чему они имеют гораздо более высокую скорость диффузии внутрь ткани, данный метод для окрашивания цельных образцов биологической ткани до сих пор практически не использовался.

Известен способ клик-гистохимического окрашивания цельных образцов биологической ткани, в котором использовали нефиксированные образцы тонкого кишечника толщиной 1-2 см, для чего у мышей маркировали пролиферирующие клетки внутрибрюшинным введением 100-200 мкг 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU), забирали образцы через 24, 48 или 96 ч после инъекции, отмывали их фосфатным буфером, а затем инкубировали в течение 30 мин в свежеприготовленном растворе, содержащем 100 мМ Tris (pH 8.5), 0.5-1 мМ CuSO4, 100 мкМ азида, конъюгированного с TMR, 50-100 мМ аскорбиновой кислоты, после чего образцы отмывали буфером, фиксировали формальдегидом и несколько раз промывали фосфатным буфером с 0.2% Triton Х-100 [Salic A., Mitchison Т.J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2008. - V. 105. - №7. - Р. 2415-2420].

Однако описанный в данной работе способ применялся к нефиксированным образцам ткани взрослых животных, в то время как фиксированная ткань обладает большей гидрофобностью в сравнение с нефиксированной и, как следствие, худшей проницаемостью для реагентов. Оценка глубины окрашивания не производилась. Реакционная смесь, применяемая в данной работе, не позволяет проводить клик-реакцию в течение длительного времени, необходимого для окрашивания крупных образцов, вследствие быстрого снижения ее реакционной способности.

Известен способ клик-гистохимического окрашивания цельных эмбрионов курицы (до 18 стадии), которых маркировали 500 мкМ - 2 мМ EdU в течение 4 ч, фиксировали в растворе 4% параформальдегида в течение ночи при 4°С, отмывали 3 раза по 3 мин в фосфатном буфере, затем 3 мин в воде, 2 раза по 3 мин в 3% БСА на фосфатном буфере, затем пермеабилизировали в растворе 0.5% Triton Х-100 в течение 20 мин, инкубировали 2 раза по 3 мин 3% БСА на фосфатном буфере при комнтаной температуре, затем проводили клик-реакцию с азидом, конъюгированным с AlexaFluor488 при помощи Click-iT™ Kit (Invitrogen, США) в течение 30 мин в темноте и отмывали в 3% БСА на фосфатном буфере [Warren М., Puskarczyk K., Chapman S.C. Chick embryo proliferation studies using EdU labeling // Dev. Dyn. - 2009. - V. 238. - №4. - P. 944-949].

Однако описанный в данной работе способ применялся к образцам малого размера (толщина до 500 мкм), использовались эмбрионы, а не ткани взрослых животных, в то время как использование гистохимических техник в зрелой ткани, в особенности в нервной системе, в отличие от эмбриональной ткани, сильно затруднено вследствие ее высокой гидрофобности. Образцы эмбрионов старше 72 ч прокрашивались не полностью. Реакционная смесь, применяемая в данной работе, не позволяет проводить клик-реакцию в течение длительного времени, необходимого для окрашивания крупных образцов, вследствие быстрого снижения ее реакционной способности.

Известен способ клик-гистохимического окрашивания цельных хрусталиков взрослых мышей, в котором у мышей маркировали пролиферирующие клетки внутрибрюшинным введением 100-200 мкг EdU за 1 ч до декапитации, изолированные хрусталики фиксировали 10% нейтральным формалином при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего отмывали и пермеабилизировали образцы в растворе 0.5% Triton-X100 на фосфатном буфере в течение 1 ч, а затем проводили клик-реакцию с азидом, конъюгированным с AlexaFluor488 при помощи Click-iT™ Kit (Invitrogen, США) в течение 1 ч в темноте, по окончанию окраски хрусталики отмывали фосфатным буфером с 0.03% азидом натрия в течение 1 ч при 4°С [Wiley L.A., Shui Y.B., Beebe D.C. Visualizing lens epithelial cell proliferation in whole lenses // Mol. Vis. - 2010. - V. 16. - Р. 1253-1259].

Описанный в данной работе способ применялся к небольшим образцам ткани взрослых животных размером до 2 мм, при этом пролиферирующие клетки располагались у поверхности образца, вследствие чего невозможно оценить глубину окрашивания образцов. Реакционная смесь, применяемая в данной работе, не позволяет проводить клик-реакцию в течение длительного времени, необходимого для окрашивания крупных образцов, вследствие быстрого снижения ее реакционной способности.

Техническим результатом предлагаемой группы изобретений является окрашивание методом клик-гистохимии препаратов цельных биологических тканей и органов (в частности, мозга) животных разного возраста толщиной не менее 10 мм с сохранением морфологии образцов, возможностью проведения детализированного качественного и количественного трехмерного анализа выявленных меток за счет высокого соотношения фон - сигнал, а также короткой продолжительностью процесса, в сравнении с иммуногистохимическим окрашиванием.

Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии, включающем фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе для клик-реакции, удаление ионов меди, отмывку, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, постфиксацию сначала проводят 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°С, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°С, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:диметилсульфоксид:30%Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 1-2 ч в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°С, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12.5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы отмывают от метанола сначала фосфатным буфером в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре, после этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте, после клик-реакции ионы Cu (II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, после чего образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при постоянном помешивании.

Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4% раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°С.

Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 1-4% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°С.

Указанный технический результат достигается также тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°С.

Указанный технический результат достигается также тем, что окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°С.

Указанный технический результат достигается тем, что предлагаемый способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии, включающий фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, пермеабилизацию, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе для клик-реакции, удаление ионов меди, отмывку, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, отличается тем, что постфиксацию сначала проводят 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°С, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°С, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:диметилсульфоксид:30%Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 1-2 ч в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°С, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12.5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°С, последующую пермеабилизацию образца проводят в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный сапонин, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 1 ч при 37°С, затем образец отмывают дважды в фосфатном буфере, содержащем 0.01% %-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре, после этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0,2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте, после клик-реакции ионы Сu (II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0.1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, после чего образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при постоянном помешивании.

Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4% раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°С.

Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 1-4% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°С.

Указанный технический результат достигается также тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°С.

Указанный технический результат достигается также тем, что окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°С.

Сущность настоящей группы изобретений поясняется иллюстративным материалом в виде микрофотографий окрашенных по способу образцов биологической ткани на фиг. 1-2, где:

на фиг. 1 - слева представлено изображение среза мозга взрослой мыши (возраст 2 мес) с пролиферирующими клетками, выявленными с помощью заявленного способа окрашивания методом клик-гистохимии цельного мозга, и демонстрирующее полное его прокрашивание; справа представлено трехмерное изображение гиппокампа взрослой мыши в возрасте 2 мес, окрашенного заявленным способом, и увеличенный фрагмент гранулярного слоя зубчатой фасции гиппокампа с флуоресцентно меченными ядрами пролиферирующих клеток, визуализация осуществлена при помощи сканирующей конфокальной микроскопии.

на фиг. 2 - представлено трехмерное изображение цельного мозга новорожденной мыши в возрасте 9 сут, окрашенное заявленным способом, справа представлен оптический срез этого образца, демонстрирующий полное его прокрашивание, визуализация осуществлена при помощи светоплоскостной микроскопии.

Первый вариант заявленного способа иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей осуществляют следующим образом. Образцы биологической ткани (мозг новорожденных и молодых мышей, другие легкоразрушающиеся ткани) фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН7.4, охлажденным до 4-10°С. Далее все операции проводят при постоянном помешивании. Образцы постфиксируют сначала 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°С, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида (ДМСО) в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°С. Ткань также можно фиксировать методом погружения образца в 1-4% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°С, а затем постфиксировать в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле, как описано выше.

Фиксированные образцы ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол : ДМСО : 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°С. На этом этапе дегидратированные образцы можно накапливать и хранить длительное время в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°С. Далее дегидратированные препараты регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, а затем образцы отмывают от метанола сначала фосфатным буфером в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре. После этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте (время инкубации подбирается в зависимости от размера образца, чем крупнее образец - тем дольше инкубация).

После клик-реакции ионы Сu (II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. После этого образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. Окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°С.

Второй вариант заявленного способа иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей осуществляют следующим образом. Образцы биологической ткани (образцы мозга взрослых животных) фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН7.4, охлажденным до 4-10°С. Далее все операции проводят при постоянном помешивании. Образцы постфиксируют сначала 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°С, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида (ДМСО) в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°С. Ткань также можно фиксировать методом погружения образца в 1-4% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°С, а затем постфиксировать в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле, как описано выше.

Фиксированные образцы ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол : ДМСО : 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°С. На этом этапе дегидратированные образцы можно накапливать и хранить длительное время в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70...-80°С. Далее дегидратированные препараты регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, а затем образцы отмывают от метанола сначала фосфатным буфером в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01% %-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре.

Далее осуществляют пермеабилизацию образца в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный сапонин, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 1 ч при 37°С, после чего образец отмывают дважды в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре. После этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте (время инкубации подбирается в зависимости от размера образца, чем крупнее образец - тем дольше инкубация). После клик-реакции ионы Cu (II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. После этого образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. Окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°С.

Ниже приведены конкретные примеры реализации заявленных способов:

Пример 1.

Окрашивали образцы целого головного мозга новорожденных мышей линии NestinCFPnuc в возрасте 9-и постнатальных суток. Мышатам вводили подкожно 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) в дозе 123 мкг на кг веса за 2 ч до декапитации. Мозг извлекали и фиксировали методом погружения образца в 1% раствор параформальдегида в течение 48 ч при 4°С. Далее все операции проводили при помешивании. После трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре образцы постфиксировали в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле в течение 2 ч при температуре 4°С. Фиксированные препараты мозга отбеливали в растворе, содержащем 100%-ный метанол : ДМСО : 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывали 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживали не менее чем на 1 час при -80°С.

Далее препараты регидратировали последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 90 мин в каждом при комнатной температуре, а затем образцы отмывали от метанола сначала фосфатным буфером в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01% %-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 2 ч при комнатной температуре. Последнюю отмывку делали в течение ночи. Далее осуществляли клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере при комнатной температуре и в темноте в течение 18 ч. После клик-реакции ионы Сu (II) удаляли, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. После этого образцы отмывали в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляли в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. Окрашенные препараты дофиксировали 4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН7.4 в течение ночи при 4°С и отмывали в фосфатном буфере сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре.

Окрашенные образцы мозга дегидратировали последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживали сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2 раза по 60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°С в течение 18 ч. На этом этапе окрашенные образцы ткани хранили в 2-бутоксиэтаноле при 4°С. Дегидратированные образцы просветляли при комнатной температуре в течение ночи в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1. Съемку препаратов проводили на светоплоскостном микроскопе, построение трехмерных реконструкций окрашенных образцов осуществляли в Imaris 6.0 (Bitplane AG, Швейцария).

В препаратах, окрашенных по заявленному способу, отчетливо видны ядра пролиферирующих клеток, включивших во время S-фазы клеточного цикла синтетический аналог тимидина - 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU), в структурах с активным нейрогенезом - в обонятельной луковице, субвентрикулярной зоне, ростральном миграционном пути и в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа, мозжечке, а также в ряде других структур (Фиг. 1). Препараты целого новорожденного мозга прокрашены целиком, без затухающего градиента (Фиг. 1, справа). После просветления в растворе Мюррея не наблюдаются потери флуоресцентного сигнала, ядерное разрешение наблюдается по всей глубине образца (Фиг. 1, справа). В окрашенных образцах достигается высокое соотношение сигнал : фон, что делает принципиально возможным осуществление автоматизированного количественного и качественного анализа.

Пример 2.

Окрашивали образцы целого полушария головного мозга и изолированного гиппокампа взрослых мышей линии NestinCFPnuc в возрасте около 60-х постнатальных суток. Мышам вводили внутрибрюшинно 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) в дозе 123 мкг на кг веса за 2 ч до декапитации. Проводили транскардиальную перфузию сначала 0.1М фосфатным буфером при рН 7.4 в объеме 30 мл, а затем охлажденным до 10°С 1%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН 7.4, также в объеме 30 мл. После этого извлекали головной мозг и постфиксировали его 1%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при 4°С в течение 48 ч. После этого мозг либо разрезался пополам, либо из него извлекали гиппокамп. Далее все операции проводили при помешивании. После трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре образцы постфиксировали в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле в течение 2 ч при температуре 4°С. Фиксированные препараты отбеливали в растворе, содержащем 100%-ный метанол:ДМСО: 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывали 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживали не менее чем на 1 час при -80°С.

Далее дегидратированные полушария и гиппокампы регидратировали последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 90 мин в каждом при комнатной температуре, а затем образцы отмывали от метанола сначала фосфатным буфером в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01% %-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 2 ч при комнатной температуре. Последнюю отмывку делали в течение ночи. Далее осуществляли пермеабилизацию образца в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный сапонин, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 1 ч при 37°С, после чего образцы отмывали дважды в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 2 ч при комнатной температуре. После этого проводили клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton X-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере при комнатной температуре и в темноте в течение 4 ч (изолированные гиппокампы) или 18 ч (целые полушария).

После клик-реакции ионы Сu (II) удаляли, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. После этого образцы отмывали в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляли в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. Окрашенные препараты дофиксировали 4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН 7.4 в течение ночи при 4°С и отмывали в фосфатном буфере сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре.

Из окрашенных целиком полушарий мозга при помощи вибратома изготавливали срезы толщиной 50 мкм, помещали их на предметные стекла и покрывали средой Fluoromount (Sigma, США). Окрашенные препараты изолированных гиппокампов дегидратировали последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживали сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2 раза по 60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°С в течение 18 ч. На этом этапе окрашенные образцы ткани хранили в 2-бутоксиэтаноле при 4°С. Дегидратированные образцы просветляли при комнатной температуре в течение 4 ч в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1. Анализ и съемку образцов осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Olympus FluoView 1000, Япония). Послойное панорамное сшивание и построение трехмерных реконструкций окрашенных гиппокампов осуществляли в Imaris 6.0 (Bitplane AG, Швейцария).

В препаратах, окрашенных по заявленному способу, отчетливо видны ядра пролиферирующих клеток, включивших во время S-фазы клеточного цикла синтетический аналог тимидина - 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU), в нейрогенных структурах зрелого мозга - в обонятельной луковице, субвентрикулярной зоне, ростральном миграционном пути и в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа (Фиг. 2). Препараты целого мозга прокрашены целиком, без затухающего градиента (Фиг. 2, слева). После просветления в растворе Мюррея не наблюдаются потери флуоресцентного сигнала, ядерное разрешение наблюдается по всей глубине образца (Фиг. 2, справа). В окрашенных образцах достигается высокое соотношение сигнал:фон, что делает принципиально возможным осуществление количественного анализа как на отдельных гиппокампах, так и в целиком окрашенных полушариях.

Предлагаемые варианты способа окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии позволяют окрашивать препараты образцов биологических тканей молодых и взрослых животных целиком, без предварительного секционирования. Использование предлагаемых способов окрашивания позволяет сохранять морфологию образцов и высокоспецифично выявлять этинильную группу даже в толще крупных препаратов (не менее 5 мм) биологической ткани. Продолжительность окрашивания с помощью предлагаемого способа составляет от 4 до 6 суток, однако значительно облегчает и ускоряет процесс визуализации и анализа препаратов за счет использования методов трехмерной микроскопии и томографии.

Препараты образцов, окрашенные предлагаемыми способами, обладают высоким соотношением сигнал : фон и специфичностью окраски, что позволяет использовать их для проведения автоматизированного количественного и качественного анализа выявленных меток.

1. Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии, включающий фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе для клик-реакции, удаление ионов меди, отмывку, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата : бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, отличающийся тем, что постфиксацию сначала проводят 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°C, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°C, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол : диметилсульфоксид : 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 1-2 ч в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°C, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12.5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы отмывают от метанола сначала фосфатным буфером в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре, после этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте, после клик-реакции ионы Cu(II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1 М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, после чего образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при постоянном помешивании.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4%-ным раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°C.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 1-4%-ный раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°C.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100%-ном метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°C.

6. Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии, включающий фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, пермеабилизацию, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе для клик-реакции, удаление ионов меди, отмывку, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата : бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, отличающийся тем, что постфиксацию сначала проводят 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°C, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°C, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол : диметилсульфоксид : 30% H2O2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 1-2 ч в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°C, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12.5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, последующую пермеабилизацию образца проводят в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный сапонин, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 1 ч при 37°C, затем образец отмывают дважды в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре, после этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0,2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте, после клик-реакции ионы Cu(II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0.1 М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, после чего образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при постоянном помешивании.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4%-ным раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°C.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 1-4%-ный раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°C.

9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100%-ном метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C.

10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°C.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к нанотехнологии в области биологии, ветеринарии, медицины и может быть использовано в судебно-медицинской практике, хирургии и стоматологии.Способ приготовления препаратов из костной ткани для проведения диагностики патологических процессов, включающий фиксацию препарата, его шлифовку и полировку, отличается тем, что обработку препарата проводят в течение 50-70 минут в водной среде с тонкодисперсным абразивным веществом размером 1 мкм, воздействуя ультразвуком с частотой 20-24 кГц, затем препарат промывают в дистиллированной воде и высушивают при температуре 18-22°C.

Группа изобретений относится к приборостроению в медицинском оборудовании для получения срезов исследуемой ткани. Микротом содержит нож объектодержатель для объекта, защитное устройство для ножа.
Изобретение предназначено для применения в химической промышленности, агропромышленном комплексе, производстве строительных материалов и других отраслях. Способ определения коэффициента неоднородности смеси трудноразделимых сыпучих материалов включает подсчет числа проб, минимально допустимого веса пробы, отбор проб смеси и ее компонентов.
В изобретении раскрыто применение фторсодержащего полимера в получении прозрачного мерзлого грунта, который используется в качестве прозрачного твердого материала при получении прозрачного мерзлого грунта, причем фторсодержащий полимер представлен тефлоном AF 1600 с коэффициентом преломления 1,31 и плотностью 2,1-2,3 г/см3 и имеет вид частиц диаметром 0,25-2,0 мм или частиц диаметром ≤ 0,074 мм с неправильной формой.

Группа изобретений относится к области микроскопического исследования цитологических образцов. Система получения цитологического образца содержит фиксатор для фиксации клеток, модификатор клеточной поверхности для модификации поверхности клеток, первое (103) и второе (105) поддерживающие средства для образца, имеющие каждое по меньшей мере две стороны.

Изобретение относится к системам водоотведения, а именно к способам оценки контроля сбросов сточных вод от выпусков (водоотводов) абонентов в канализацию. Способ содержит регистрацию наличия в воде признаков загрязнителей и анализ пробы сливной воды на превышение предельно допустимых значений загрязнителей в сливной воде.

Группа изобретений относится к активным исследованиям астрономического объекта (АО), например астероида или кометы. Способ включает воздействие на поверхность АО направленным электронным лучом с борта космического аппарата, зависшего над поверхностью этого АО.
Изобретение относится к исследованиям материалов методом проб в условиях космического полета с целью обнаружения микроорганизмов космического происхождения. Способ предусмативает взятие проб с поверхностей орбитальной станции посредством стерилизованного и гермоизолированного на Земле пробозаборника.

Изобретение относится к геофизическим методам исследования процессов разработки месторождений углеводородов, в частности к комплексам микросейсмического контроля разработки континентальных и шельфовых месторождений углеводородов, содержащим, по крайней мере, один телеметрический сейсмический бортовой модуль управления и регистрации, соединенный линиями связи с 32-мя полевыми модулями регистрации микросейсмической эмиссии, возбуждаемой при производстве ГРП, соединенный посредством высокоскоростной сети Ethernet с устройством сбора и обработки - сервером, на котором установлена база данных микросейсмического мониторинга, модуль предварительной обработки данных и модуль специализированной обработки с возможностью параллельного вычисления на кластере карт распределения источников микросейсмической эмиссии.

Изобретение относится к технике контроля запыленности поверхности горных выработок, промышленных помещений на предприятиях угольной, горно-металлургической и других отраслей промышленности и сельскохозяйственного производства, где присутствует взрывчатая пыль: угольная, сульфидная, мучная, пластмассовая и др.

Изобретение относится к способу получения стабилизированных частиц йодида серебра. Способ включает приготовление первого раствора, представляющего собой раствор йодида калия с концентрацией 0,216-3,6 ммоль/л, приготовление второго раствора, образованного из водного раствора нитрата серебра с концентрацией 0,36-6,0 ммоль/л и из раствора полиэлектролитного стабилизатора с концентрацией 1,0-10,0 ммоль/л, смешение обоих растворов при нормальных условиях путем приливания первого раствора ко второму раствору с образованием стабилизированных частиц йодида серебра, имеющих средний размер 1,3-1,9 нм. Заявленный способ обеспечивает получение наномерных частиц йодида серебра с узким распределением по размерам, а также упрощение способа их получения. Cтабилизированные частицы йодида серебра можно применять в качестве каталитических систем в процессах деструкции органических веществ или антимикробных растворов. 2 ил., 4 пр.

Группа изобретений относится к области технологии циклического отбора растительных проб из буртов, ям, траншей, скирд, стогов и других хранилищ в сельском хозяйстве при определении качественных показателей корма и может быть использовано при отборе проб других трудносыпучих материалов, например торф, грунт, снег и прочих. Устройство содержит вращательный механизм 1, приводной вал 2, режущую коронку 5, накопитель 8. Вращательный механизм 1 имеет ударно-импульсный характер вращения. Вал 2 выполнен с цилиндрической частью шнека 3 и конусообразным шнековым наконечником 4. Коронка 5 выполнена с режущими выступами 6 полукруглой формы, размещенными по периметру торцевой окружности, и имеет на внешней поверхности как минимум один закрепленный шнековый виток 7. При этом коронка 5 жестко зафиксирована внутренней поверхностью в зоне основания конусообразного шнекового наконечника 4 как минимум на одном шнековом витке 7. Вырезают пробы из монолита корма вращательным механизмом 1 с заглублением режущей коронки 5. Вращательный механизм 1 создает ударно-импульсное вращение, ударные импульсы которого на коронке 5 уменьшаются или увеличиваются в моменты возникновения сопротивления резанию до величины преодоления усилия этого сопротивления. Реактивный момент, возникающий при ударно-импульсном резании, компенсируется ударно-импульсным вращательным механизмом и не передается оператору. Обеспечивается эффективность отбора и высокая циклическая скорость отбора растительных проб по глубине. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

Группа изобретений относится к области взятия и стабилизации цельной крови или ее компонентов. Устройство для сбора и стабилизации цельной крови или ее компонента содержит первый конец и второй конец и по меньшей мере одну внутреннюю стенку, образующую резервуар. При этом резервуар включает стабилизирующий агент, содержащий ингибитор лизофосфолипазы (LysoPLA), и антикоагулянт. Также раскрывается способ сбора и стабилизации цельной крови или ее компонента, способ диагностирования нарушения метаболизма пациента, способ обнаружения наличия пролекарства и/или его активного метаболита в крови или ее компоненте, способ контролирования лечения пациента с нарушением метаболизма, а также способ определения количества пролекарства и/или его активного метаболита в крови или ее компоненте. Группа изобретений обеспечивает относительно более длительную стабильность крови или ее компонента при хранении для проведения достоверного клинического тестирования. 6 н. и 18 з.п. ф-лы, 3 ил.

Группа изобретений относится к способам измерения толщины слоя нефти над водой и может быть использовано для оценки количества нефти в скважинной продукции с большой долей воды. Отсекают слой нефти вертикальным отсекателем от общей массы нефти над водой. Разбавляют слой нефти внутри отсекателя органическим разбавителем фиксированного объема и переводят полученный раствор в емкость для проведения измерений. Растворитель подают непосредственно в слой нефти с помощью отдельного прозрачного насосного устройства двухстороннего действия. Круговым движением подающей и всасывающей иглы насоса нефть с растворителем на глубину среза иглы перемешивают и затем переводят с помощью насоса из отсекателя в делительную воронку для разделения раствора нефти от попутно отобранной воды. Измеряют объем нефти как разницу между объемами полученной и измеренной смеси и растворителя по формуле: Vн=Vсм-Vр, где Vн - объем нефти, Vсм - объем полученной и измеренной смеси, Vр - объем растворителя. Определяют толщину слоя нефти над водой в исследуемой точке водоема как отношение объема нефти Vн к площади внутреннего сечения F отсекателя по формуле δ=(Vсм-Vр)/F. Подачу растворителя в слой нефти и обратный отбор раствора нефти организуют многократно при значительной величине слоя нефти над водой - в циклическом режиме до полного отсутствия в отсекателе раствора нефти. Насос и отсекатель выполнены как отдельные устройства. Отсекатель имеет с внешней стороны поплавок в форме тора, утяжеленную нижнюю кромку для вертикального вхождения отсекателя в слой нефти и придания устойчивости отсекателя на водной поверхности со слоем нефти. Насос содержит иглу, глубина среза которой выполнена в виде среза на 45° к вертикали. Обеспечивается повышение точности оценки толщины слоя нефти над водой. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

Изобретение относится к технике отбора образцов проб воздуха, отбираемых от компрессора авиационных газотурбинных двигателей (ГТД) для исследования степени загрязнения воздуха продуктами, поступающими вместе с воздухом в систему кондиционирования воздуха (СКВ), а также определения состава вредных примесей, опасных концентраций в воздухе газов и паров. Устройство содержит диффузор с внутренним соплом, ориентированным по направлению потока отбираемого от газотурбинного двигателя воздуха, тройник, электромагнитные клапаны, пробоотборники с встроенными концентраторами и вакуумированные емкости. Сопло диффузора выполнено с одним внутренним выходом, соединенным с плоским тройником, находящимся в одной плоскости с диффузором. Электромагнитные клапаны установлены непосредственно на входные патрубки пробоотборников таким образом, что входной патрубок соответствующего пробоотборника для уменьшения потерь компонентов пробы ввинчен в переходник, закрепленный в корпусе электромагнитного клапана и зафиксирован на выходе к корпусу клапана контргайкой. Внутренний выход переходника выполнен переходящим в седловину для установки электромагнитного клапана непосредственно на входной патрубок соответствующего пробоотборника, а вход контактирует с поршнем клапана, взаимосвязанным с электромагнитом. Корпус электромагнитного клапана выполнен в виде расширительной камеры, в торцах которой установлены подводящее отбираемый воздух от двигателя расширительное сопло и в противоположной стороне корпуса выходной патрубок для сброса избытка воздуха через жиклер. При этом его проходное сечение выполнено с возможностью регулирования температуры внутри расширительной камеры во избежание конденсации примесей в ней. Электромагнитный клапан, установленный на поверхности расширительной камеры, выполнен с возможностью открывать во время отбора воздуха и перекрывать поршнем с резиновым клапаном пробоотборник после отбора воздуха при летных испытаниях авиационных газотурбинных двигателей. Обеспечивается уменьшение габаритов устройства без ухудшения его метрологических характеристик для возможности установки на летающую лабораторию и снижение погрешности измерения концентраций примесей в воздухе ГТД, отбираемого на нужды СКВ летательного аппарата, за счет уменьшения фонового загрязнения. 1 ил.
Изобретение относится к способам определения окислительных показателей растительных масел и может быть использовано в масложировой промышленности при технохимическом контроле в процессе производства и применения растительных масел. Способ контроля показателей окисления растительных масел предусматривает подготовку растительного масла к измерению без замораживания путем его перемешивания в емкости и отбора из ее середины пробы, навеску пробы вносят в пенициллиновый пузырек, затем 20 мл изооктана порциями по 4 мл добавляют в вышеуказанный пузырек, растворенную в изооктане навеску перемешивают путем набора жидкости с последующим сливанием в раствор без доступа воздуха 4 раза, далее добавляют в кварцевую кювету 4 мл изооктана и не менее 4 мл полученной навески, измерение оптической плотности на УФ-спектрофотометре с дейтериевой лампой проводят последовательно при длинах волн 232 нм и 270 нм, для каждого образца проводят два параллельных измерения, в каждом из которых осуществляют 5 последовательных измерений, далее определяют среднее арифметическое значение оптической плотности, а затем определяют индекс окисления (ИО): ИО=2⋅Dcp/m, где Dcp - среднее арифметическое значение оптической плотности для каждого образца при 5 измерениях, m - масса навески, г. 1 з.п. ф-лы, 2 пр.
Изобретение относится к области медицины и касается способа выявления нервных структур в зубочелюстной системе. Сущность способа заключается в том, что проводят фиксацию объекта в течение 3-5 суток в растворе, содержащем концентрированную муравьиную кислоту - 3,5 мл, хлоралгидрат - 3,5 г, дистиллированную воду - 100 мл, причем 2-3 раза в сутки проводят замену фиксирующего раствора. Далее отмытый исследуемый объект, в зависимости от его величины, помещают в смесь спирта с аммиаком на 30-60 минут с дальнейшим промыванием в дистиллированной воде 20-30 минут. Импрегнацию проводят в термостате 5-7 суток в 5% растворе нитрата серебра до приобретения объектом светло-коричневого оттенка, промывая его в дистиллированной воде 10 минут перед восстановлением и 10-15 минут перед проводкой, заливкой, резкой и бальзамированием. Использование способа позволяет с высокой точностью выявлять неравные структуры в зубочелюстной системе.

Изобретение относится к области геофизики, в частности к способам проведения сейсморазведки, и может быть использовано для поиска подводных полезных ископаемых, а также прогнозирования места, силы и времени сейсмического события, например, землетрясения, извержения подводных вулканов. Предложен способ прогнозирования сейсмического события, содержащий выбор, по меньшей мере, одного контролируемого параметра из числа параметров, характеризующих процессы в земной коре, для мониторинга ситуации, по меньшей мере, в одной зоне ожидаемого сейсмического события, принадлежащей исследуемому сейсмоактивному региону; формирование в исследуемом сейсмоактивном регионе, к которому принадлежит, по меньшей мере, эта одна зона ожидаемого сейсмического события, наблюдательной сети из n пунктов измерения, по меньшей мере, этого одного контролируемого параметра, в котором при формировании для исследуемого сейсмоопасного региона пространственно-временной схемы распределения меры согласованности S изменений контролируемых параметров меру согласованности определяют по критерию синхронизации, равному отношению среднеквадратического отклонения разностей между последовательными измерениями для каждого узла регулярной сетки к среднему значению измерений во всех узлах регулярной сетки. Технический результат - повышение достоверности сейсмических исследований.

Группа изобретений относится к прозрачному мерзлому грунту, способу его получения и применению. Прозрачный мерзлый грунт получают из фторсодержащего полимера, кубикового льда и бесцветной поровой жидкости. Количество фторсодержащего полимера, кубикового льда и бесцветной поровой жидкости рассчитывают согласно условиям испытаний и размерам проб. Фторсодержащий полимер, представленный частицами неправильной формы диаметром ≤0,074 мм из тефлона AF 1600 с коэффициентом преломления 1,31 и плотностью 2,1-2,3 г/см3, подвергают очистке от примесей и сушат в сушильном шкафу. Кубиковый лед получают путем раздавливания целого блока льда с диаметром частиц ≤0,074 мм. Бесцветная поровая жидкость представлена водой. Смешивают сначала фторсодержащий полимер и кубиковый лед, равномерно перемешивают в криогенной лаборатории при температуре от -6,0°С до -8,0°С, загружают в форму по 2-3 партии для приготовления пробы и утрамбовывают слой за слоем. Затем в форму добавляют воду, и она заполняет промежутки между частицами фторсодержащего полимера и кубиковым льдом. Устройство вакуумирования используют для удаления остаточных пузырьков в пробе, чтобы она достигла полностью насыщенного состояния. Пробу помещают в плотномер для затвердевания со значением степени переуплотнения 0,8-3 и загружают в криогенный бокс при температуре -20°С, где замораживают на 48 часов, чтобы получить прозрачный мерзлый грунт, имитируя насыщенную мерзлую глину, физические свойства которой следующие: плотность - 1,63-2,1 г/см3, удельная масса - 16-21 кН/м3 и значение степени переуплотнения - 0,8-3; а механические свойства следующие: угол внутреннего трения - 19-22°, связность - 1-3 кПа, модуль упругости - 5-9 МПа и коэффициент Пуассона - 0,2-0,3. Применяют прозрачный мерзлый грунт в модельном испытании направленного взрывания мерзлого грунта, в испытании оползания модели мерзлого грунта дорожной насыпи вследствие оттаивания. Прозрачный мерзлый грунт, полученный по настоящему изобретению, может имитировать свойства естественной прозрачной мерзлой глины, эффективно используется в модельных испытаниях в инженерной геологии, обладая точными результатами измерений, и может наглядно показать внутреннюю деформацию грунтового массива. Он низкозатратен и прост в эксплуатации. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил.

Группа изобретений относится к прозрачному мерзлому грунту, способу его получения и применению. Прозрачный мерзлый грунт получают из фторсодержащего полимера, кубикового льда и бесцветной поровой жидкости. Количество фторсодержащего полимера, кубикового льда и бесцветной поровой жидкости рассчитывают согласно условиям испытаний и размерам проб. Фторсодержащий полимер, представленный частицами неправильной формы диаметром 0,25-2,0 мм из тефлона AF 1600 с коэффициентом преломления 1,31 и плотностью 2,1-2,3 г/см3, подвергают очистке от примесей и сушат в сушильном шкафу. Кубиковый лед получают путем раздавливания целого блока льда с диаметром частиц 0,1-0,5 мм. Бесцветная поровая жидкость представлена водой. Сначала фторсодержащий полимер и кубиковый лед равномерно перемешивают в криогенной лаборатории при температуре от -6,0 до -8,0°С, загружают в форму по 2-3 партии для приготовления пробы и утрамбовывают слой за слоем. Затем в форму добавляют воду, и она заполняет промежутки между частицами фторсодержащего полимера и кубиковым льдом. Устройство вакуумирования используют для удаления остаточных пузырьков в пробе, чтобы она достигла полностью насыщенного состояния. Пробу загружают в криогенный бокс при температуре -20°С и замораживают на 48 часов, чтобы получить прозрачный мерзлый грунт, имитируя насыщенный мерзлый песчаный грунт, физические свойства которого следующие: плотность - 1,53-2,0 г/см3, удельная масса - 15-20 кН/м3 и относительная плотность - 20-80%; а механические свойства следующие: угол внутреннего трения - 30-31°, модуль упругости - 8-61 МПа и коэффициент Пуассона - 0,2-0,4. Применяют прозрачный мерзлый грунт в модельном испытании направленного взрывания мерзлого грунта и в испытании оползания модели мерзлого грунта дорожной насыпи вследствие оттаивания. Прозрачный мерзлый грунт, полученный по настоящему изобретению, может имитировать свойства естественной прозрачной мерзлой глины, эффективно используется в модельных испытаниях в инженерной геологии, обладая точными результатами измерений, и может наглядно показать внутреннюю деформацию грунтового массива. Он низкозатратен и прост в эксплуатации. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается вариантов способа окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии. Предложенные способы позволяют окрашивать препараты образцов биологических тканей молодых и взрослых животных целиком, без предварительного секционирования. Использование предлагаемых способов окрашивания позволяет сохранять морфологию образцов и высокоспецифично выявлять этинильную группу даже в толще крупных препаратов биологической ткани. Изобретение значительно облегчает и ускоряет процесс визуализации и анализа препаратов за счет использования методов трехмерной микроскопии и томографии. Препараты образцов, окрашенные предлагаемыми способами, обладают высоким соотношением сигнал : фон и специфичностью окраски, что позволяет использовать их для проведения автоматизированного количественного и качественного анализа выявленных меток. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 ил.

Наверх