Способ получения химерных животных и "чистых линий" животных


 


Владельцы патента RU 2620935:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова Российской академии наук (ИХФ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам слияния эмбриональных клеток. Описан способ получения химерной бластоцисты. Первоначально действием ультракороткого лазерного импульса выполняют слияние двух бластомеров эмбриона путем облучения участка естественного контакта, затем несколькими импульсами диодного лазера выполняют прокол размером 10-12 мкм блестящей оболочки эмбриона в области максимально удаленной от бластомеров, посредством действия ИК-лазера, в полученный прокол действием ИК-лазера помещают предварительно модифицированные эмбриональные стволовые клетки. Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа за счет одновременного использования трех лазеров, обеспечивает возможность быстрого и технологичного введения стволовых клеток с модифицированным геномом в эмбрион мыши на различных стадиях развития и с разной плоидностью бластомеров в один этап, что обеспечивает получение сразу чистых линий с более высокой эффективностью, без потери времени и затрат на последующее скрещивание химер для выведения чистых линий. Изобретение может быть использовано для повышения эффективности реконструирования эмбрионов. 4 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам слияния эмбриональных клеток, конкретно к лазерному слиянию бластомеров, и может быть использовано для повышения эффективности реконструирования эмбрионов.

Многие болезни человека определяются наследственностью. На современном уровне развития медицины диагностика и лечение подобных заболеваний требует создания и изучения моделей таких болезней. Создание моделей болезни позволит понять механизм возникновения и развития патологии, выявить роль различных генов в этом процессе. Для разработки моделей болезни требуются модельные животные. Наиболее подходит для этих целей лабораторная мышь. Поэтому разработка эффективных технологий получения чистых линий генетически модифицированных мышей является сегодня крайне актуальной проблемой биомедицины.

В настоящее время широко известно несколько способов слияния клеток. Первоначально при реконструировании животных клеток использовали химический способ слияния клеток - путем воздействия либо полиэтиленгликолем (Eglitis М.А. Formation of tetraploidmouseblastocysts following blastomere fusion with polyethyleneglycol. J. Exp. Zool. 1980, 213(2), 309-313; Spindle A. Polyethylene glycol induced fusion of two-cell mouse embryo blastomeres. Exp. Cell. Res. 1981, 131(2), 465-470), либо инактивированным вирусом Сендай (O'Neill G.T., Speirs S., Kaufman M.H. Sex-chromosome constitution of postimplantation tetraploid mouse embryos. Cytogenet Cell Genet. 1990, 53(4), 191-195). Этот способ имел существенные недостатки, поэтому велись поиски новых более приемлемых способов слияния клеток.

В настоящее время широко известно несколько способов слияния клеток. Первоначально при реконструировании животных клеток использовали химический способ слияния клеток - путем воздействия либо полиэтиленгликолем (Eglitis М.А. Formation of tetraploid mouse blastocysts following blastomere fusion with polyethylene glycol. J. Exp. Zool. 1980, 213(2), 309-313; Spindle A. Polyethylene glycol induced fusion of two-cell mouse embryo blastomeres. Exp. Cell. Res. 1981, 131(2), 465-470), либо инактивированным вирусом Сендай (O'Neill G.T., Speirs S., Kaufman M.H. Sex-chromosome constitution of postimplantation tetraploid mouse embryos. Cytogenet Cell Genet. 1990, 53(4), 191-195). Этот способ имел существенные недостатки, поэтому велись поиски новых более приемлемых способов слияния клеток.

Наименее травматичным вмешательством в клетку являются оптические способы воздействия. Одним из первых это предложил и осуществил с помощью сфокусированного ультрафиолетового излучения известный биофизик С.С. Чахотин (Чахотин С.С. Цитология. 1959. T. 1, N.6, с. 614-626). С появлением лазеров оптические приемы воздействия на клетку получили дальнейшее развитие (Сахаров В.Н. Успехи соврем, биологии. 1972. Т. 73, N.2, с. 231-249; Liov L. et al. Hum. Reprod. 1996. V. 11, p. 1273-1280). Однако для слияния эмбриональных клеток лазерные технологии начали применяться лишь недавно. Получены данные успешного лазерного слияния мышиных ооцитов с соматическими кумулюсными клетками (А.К. Шахбазян, А.В. Карменян и др. ДАН, Клет. Биол. 2009, том 429, N. 4, с. 550-553) и позднее бластомеров двухклеточного партеногенетического эмбриона свиней (Kuetemeyer К. et al. J. Biomed. Opt. 2011, 16(8), 088001).

Недостатком известного технического решения следует признать отсутствие технологии получения химерных животных и «чистых линий» животных.

Указанное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в обеспечении возможности получения чистых линий генетически модифицированных животных и химерных животных.

Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа за счет одновременного использования трех лазеров обеспечивает возможность быстрого и технологичного введения стволовых клеток с модифицированным геномом в эмбрион мыши на различных стадиях развития и с разной плоидностью бластомеров в один этап, что обеспечивает получение сразу чистых линий с более высокой эффективностью, без потери времени и затрат на последующее скрещивание химер для выведения чистых линий.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ получения химерных животных и «чистых линий» животных Согласно разработанному способу первоначально действием ультракоротких лазерных импульсов выполняют слияние двух бластомеров эмбриона путем облучения участка естественного контакта, затем несколькими импульсами диодного лазера выполняют прокол размером 10-12 мкм блестящей оболочки эмбриона в области максимально удаленной от бластомеров, посредством действия ИК-лазера, в полученный прокол действием ИК-лазера помещают предварительно модифицированные эмбриональные стволовые клетки.

Все указанные операции преимущественно выполняют под микроскопом.

Слияние бластомеров эмбриона предпочтительно осуществляют действием ультракоротких лазерных импульсов при длительности импульса 100 фс, частоте повторения 80 МГц, длине волны 800 нм, энергии 1,5 нДж при времени экспозиции 20 мс.

Прокол блестящей оболочки эмбриона обычно осуществляют диодным лазером с длиной волны 1,48 мкм при мощности в предметной плоскости 80 мВт и длительности экспозиции 15 мс.

Оптический захват модифицированных стволовых клеток и введение их под блестящую оболочку эмбриона преимущественно осуществляют действием ИК-лазера с длиной волны 790 нм при мощности в предметной плоскости 10-15 мВт.

Как следует из опыта работы, выше приведенные режимы обработки не являются единственно возможными.

Предлагаемый способ на примере мышиных эмбрионов осуществляют следующим образом.

Мышиные эмбрионы на стадии 4-х клеток либо непосредственно доставали из яйцевода, либо культивировали in vitro до стадии 4-х клеток из зиготы или из двухклеточных эмбрионов. Четырехклеточные мышиные эмбрионы помещали в экспериментальную камеру, составленную из двух покровных стекол.

Воздействие ультракоротких лазерных импульсов (длительность 100 фс, длина волны 780 нм, частота следования импульсов 80 МГц) с модой Гаусса фокусировали объективом 60х, NA=0,7 в пятно, размеры которого характеризуются следующими параметрами: перетяжка лазерного пучка W0=0.61λ/NA=0.68 мкм и параметром Релея = 1.86 мкм (k=2p/l0 волновое число). Изменение морфологии объекта после лазерного воздействия регистрировали в виде видеофайла с использованием камеры Sony Exwave HAD. Быстрые временные изменения размера области возмущения, создаваемые ультракороткими лазерными импульсами, измеряли по уровню потерь света лазерного диода (405 нм, 100 мкВт), сфокусированного в область перетяжки фемтосекундного лазера с использованием фотоумножителя и цифрового осциллографа Wave Surfer MSO 64MXs-BLecRoy. Локализация лазерного воздействия обусловлена тем, что длина волны 780 нм попадает в область прозрачности биологической ткани и линейное поглощение света пренебрежимо мало. При энергиях фемтосекундного импульса от 0.5 нДж до 2 нДж интенсивность лазерного света можно оценить, как интенсивность от 3.4×1011 до 13.6×1011 Вт/см2 соответственно. При такой интенсивности прозрачный на длине волны 780 нм ооцит поглощает n квантов света с вероятностью PnnIn где n≥2, σnсечение поглощения для n-фотонного процесса. Поглощение энергии лазерного импульса наибольшее в области максимальной интенсивности, т.е. вблизи фокуса объектива от 3.4 1011 Вт/см2 и выше. Порог пробоя воды фемтосекундным импульсом лежит в диапазоне от 6.6 до 9.0 1012 Вт/см2. Изображение одного из эмбрионов вывели на экран монитора и нашли визуально область наиболее плотного контакта двух или трех бластомеров внутри эмбриона, для чего с использованием лазерного пинцета эмбрион поворачивали и перемещали. Для лазерного облучения визуально выбрали точку по возможности ближе к середине линии плотного контакта бластомеров. Для слияния двух или трех бластомеров внутри 4-х клеточного эмбриона достаточно однократного облучения выбранной точки последовательностью фемтосекундных лазерных импульсов с длиной волны 800 нм при частоте повторения 80 МГц с мощностью 0,06-0,12 Вт и длительностью последовательности 10-30 мс. Все манипуляции проводили в среде M2.

В данной работе в мультиплексном лазерном манипуляторе использовали инвертированный оптический микроскоп (O1ympusIX71). В поле микроскопа через объектив с высокой числовой апертурой заводили лазерное излучение от двух лазеров. Использовали объективы ЛОМО МФЛЮАР 100×/1.3 или OlympusLCAchN 40x/0.55 Ph2. Сфокусированное излучение титан-сапфирового непрерывного лазера 790 нм в предметной плоскости, где находится исследуемый образец, выполняло роль "оптического пинцета". Пространственные манипуляции над клетками проводили путем их перемещения относительно фокального пятна при движении предметного столика. Перемещение предметного столика осуществляли либо "вручную" либо с использованием позиционных пьезодвигателей, причем, в последнем случае, обеспечивалась точность перемещений, близкая к десяти нанометрам. Визуальный контроль осуществляли с использованием видеокамеры (Sony Exwave HAD). Установка также была оснащена спектрометром с фотоприемниками для регистрации спектров флуоресценции объекта исследования.

Непрерывный диодный лазер с контролируемой экспозицией, длина волны 1.48 мкм, мощность в поле микроскопа 80 мВт использовали для проведения микрохирургических операций с блестящей оболочкой эмбриона и получения отверстия с таким расчетом, чтобы возможно было в образовавшееся отверстие ввести стволовые клетки диаметром порядка 10 мкм. Параметры лазерного пучка в поле микроскопа были оценены в рамках теории распространения гауссовского пучка: перетяжка 2w0=1.22 λ/NA, где NA числовая апертура; z0=(πw0)2/λ. Для апертуры NA=1.3 параметры пучка составляли w0=0.69 мкм, z0=1.02 мкм, при NA=0.55-w0=1.64 мкм, z0=5.7 мкм. Коэффициент поглощения воды для длины волны 1.48 мкм составляет 0.003 см-1. Оценка температуры разогрева в области перетяжки дает величину близкую к 75°C. Экспериментально показано, что при этих параметрах воздействия эффективно происходит перфорация блестящей оболочки эмбриона и существенно отрицательного воздействия на эмбрион операция перфорации не оказывает.

На следующем этапе с использованием непрерывного титан-сапфирового лазера 790 нм выполняли оптический захват модифицированных эмбриональных стволовых клеток и их перемещение под блестящую оболочку эмбриона через полученное ранее отверстие. Параметры гауссовского пучка в поле микроскопа при NA=1.3 w0=0.37 мкм, z0=0.55 мкм и при NA=0.55 w0=0.88 мкм, z0=3.1 мкм. Коэффициент поглощения воды для этой длины волны пренебрежимо мал и составляет порядка 10-9 см-1.

Далее эти эмбрионы культивировали в CO2 инкубаторе в среде до стадии вылупляющейся бластоцисты. Успешность эксперимента подтверждалась путем окрашивания ядерной ДНК витальным красителем Хекст 33342 и наблюдением флуоресценции в УФ-свете. Жизнеспособность экспериментальных эмбрионов оценивали культивированием in vitro до стадии бластоцисты.

1. Способ получения химерной бластоцисты, включающий слияние двух бластомеров эмбриона, исключая эмбрион человека, действием ультракороткого лазерного импульса на участок естественного контакта, выполнение прокола размером 10-12 мкм блестящей оболочки эмбриона, в области максимально удаленной от бластомеров, несколькими импульсами диодного лазера, в полученный прокол действием ИК-лазера помещают предварительно модифицированные эмбриональные стволовые клетки, исключая эмбриональные клетки человека, культивированные до стадии вылупляющейся бластоциты.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что его осуществляют под микроскопом.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что слияние бластомеров эмбриона осуществляют действием ультракороткого лазерного импульса при длительности импульса 100 фс, частоте повторения 80 МГц, длине волны 800 нм, энергии 1,5 нДж при времени экспозиции 20 мс.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что прокол блестящей оболочки эмбриона осуществляют диодным лазером с длиной волны 1,48 мкм при мощности в предметной плоскости 80 мВт и длительности экспозиции 15 мс.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оптический захват модифицированных стволовых клеток и введение их под блестящую оболочку эмбриона осуществляют действием ИК-лазера с длиной волны 790 нм при мощности в предметной плоскости 10-15 мВт.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области клеточной технологии. Предложено устройство для выделения стромально-васкулярной фракции из тканей человека и животных, способ выделения клеточных фракций с использованием данного устройства, стромально-васкулярная фракция жировой ткани для создания тканеинженерных конструкций и для использования в качестве клеточного аутотрансплантата, а также способ лечения, репарации или замещения ткани с использованием стромально-васкулярной фракции жировой ткани.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточной инженерии, и может быть использовано для определения биологической активности IFN-γ. Получают линию клеток меланомы человека PiGAS с регистрационным номером ВКПМ Н-161 путем трансфекции родительской линии клеток меланомы человека MelP плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, кодирующей репортерную конструкцию 6xGAS-Luc, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 1, включающую 6 повторов сайта связывания транскрипционного фактора STAT-1, минимального промотора SV-40 и гена люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc), а также последовательности SEQ ID NO: 2, включающую ген устойчивости Neo к селективному антибиотику G418 под контролем своего конститутивного промотора PGK-1.

Изобретение относится к области иммунологии, и может быть использовано в медицине. Получен слитый белок, имеющий (a) домен связывания с АПК или домен связывания с рецептором CD91, расположенный на N-конце слитого белка, (b) транслокационный пептид длиной от 34 до 112 аминокислотных остатков, расположенный на С-конце домена связывания с АПК или домена связывания с рецептором CD91; (c) антиген патогена; (d) сигнал ядерного экспорта и (e) последовательность, обеспечивающую удержание в эндоплазматическом ретикулуме, расположенную на С-конце слитого белка, где сигнал ядерного экспорта находится между антигеном и последовательностью, обеспечивающей удержание в эндоплазматическом ретикулуме, или между транслокационным пептидом и антигеном.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано для получения противоопухолевых ЦТЛ. Способ предусматривает антигенную активацию полученных зрелых ДК с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместное культивирование с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции всех клеток неприлипающей фракции МНК, с последующим выделением из совместной культуры ДК и МНК специфичных к указанным эпитопам ЦТЛ методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ дифференциации плюрипотентных стволовых клеток (PSC) в клетки сосудистого русла.

Изобретения касаются способа приготовления экспрессионного вектора, кодирующего адаптированную рекомбиназу, которая способна к рекомбинации асимметричных последовательностей-мишеней в пределах длинного концевого повтора (LTR) провирусной ДНК множества штаммов ВИЧ-1, встроенных в геном клетки-хозяина, а также к полученному экспрессионному вектору, клетке, трансфецированной этим вектором, экспрессированной рекомбиназе и фармацевтической композиции, включающей экспрессионный вектор, клетку и/или рекомбиназу.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен биорезорбируемый микроноситель для доставки клеток в область повреждения ткани кожи для заживления и регенерации ран.

Изобретения касаются способа снижения гетерогенности заряда целевого антитела, способа выработки целевого антитела со сниженной гетерогенностью заряда и способов приготовления лекарственного препарата для лечения злокачественных новообразований, содержащего антитело против глипикана 3 или антитело против IL-31RA.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан 3D in vitro двухфазный костно-хрящевой «органоид», содержащий слой искусственной хрящевой ткани/агрегатов хондрогенных клеток и слой искусственной костной ткани, где искусственная костная ткань содержит придающий структуру каркас и структуру костного мозга; где структура костного мозга в искусственной костной ткани получена путем посева мезенхимальных стволовых клеток на придающий структуру каркас и где слой искусственной хрящевой ткани/агрегатов хондрогенных клеток контактирует по меньшей мере с одной поверхностью слоя искусственной костной ткани, и способы его получения и применения.

Изобретения касаются способов (варианты) формирования и дифференциации популяции клеток, в которой более 80% клеток популяции экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Способ включает дифференциацию популяции эмбриональных стволовых клеток человека в среде DMEM или MCDB-131, содержащей активин А и лиганд Wnt, или GDF-8 и 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он, где концентрация глюкозы не превышает 10,5 ммоль/л, где эмбриональные стволовые клетки человека представляют собой клетки стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека, клетки стабильных линий эмбриональных зародышевых клеток человека, такие как клетки H1, клетки Н7, клетки Н9 или клетки BG01V. Изобретения могут быть использованы в лабораторной практике для создания in vitro функциональной экспрессирующей инсулин клетки, которая была бы более близка к β-клетке. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточным технологиям и медицине. Описано биосинтетическое устройство проксимального канальца. Устройство создано с помощью приготовления лишенной клеток биологической матрицы, засева биологической матрицы клетками, выделенными из почек млекопитающих, и, дополнительно, эндотелиальными клетками млекопитающих. Затем устройство может культивироваться в статических условиях или созревать с помощью культивирования в биореакторе, чтобы обеспечить дифференцировку почечных клеток в функционирующие клетки проксимальных канальцев. Устройство способно выполнять функции проксимального канальца. Также описаны различные способы изготовления устройств проксимального канальца и способы применения биосинтетических устройств проксимального канальца в исследованиях, например, в условиях in vitro переноса клетками канальцев, токсического действия различных соединений или в скрининговых исследованиях лекарственных соединений. Предложенная группа изобретений может быть использована в фармацевтике. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 16 ил., 9 табл., 17 пр.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а именно к получению культуры мезенхимных стволовых клеток человека (МСК) из периваскулярного пространства пупочного канатика. Способ включает вырезание фрагмента пупочного канатика, заполнение его 0,2% раствором коллагеназы, закрывание обоих его концов и выдерживание в течение 20-40 минут при температуре 37°С с последующим промыванием сбалансированным солевым раствором, заполнением новой порцией 0,2% раствора коллагеназы, закрыванием обоих его концов и выдерживанием в течение 30-60 минут при температуре 37°С. После второго выдерживания упомянутую пупочную вену промывают сбалансированным солевым раствором, полученную при промывке жидкость центрифугируют и культивируют полученный осадок на селективных средах. Изобретение позволяет повысить выход и чистоту получаемой культуры МСК и в ряде случаев уменьшить время получения МСК. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Согласно изобретению композиция для регенерации кожи и слизистых оболочек включает в себя культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток человека при многократных циклах культивирования на стадиях фазы ускоренного роста и логарифмической фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток человека, а также костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека с концентрацией от 102 клеток/мл до 107 клеток/мл и/или дифференцирующий фактор, представляющий собой полностью транс-ретиноевую кислоту и/или гиалуроновую кислоту в виде гиалуроната натрия и/или диметилсульфоксид. Культуральная питательная среда каждого последующего цикла культивирования представляет собой кондиционированную среду, полученную на предыдущем цикле культивирования. Композиция включает в себя факторы роста с молекулярной массой от 6 кДа до 80 кДа, биологически активные соединения на основе цитокинов с молекулярной массой от 5 кДа до 50 кДа, низкомолекулярные пептиды длиной от 20 до 140 аминокислотных остатков и стероидные гормоны с молекулярной массой от 280 Да до 370 Да. При этом мезенхимальные стволовые клетки человека, продуктами которых кондиционирована питательная культуральная среда, входящие в состав композиции для регенерации кожи и слизистых оболочек, получены при заборе аутологичных клеток костного мозга. Изобретение позволяет уменьшить длительность технологического процесса создания композиции и повысить показатели эффективности лечебного действия. 9 з.п. ф-лы. 4 ил., 9 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полимерной белковой структуры, способной к селективному взаимодействию с органической мишенью, и может быть использовано в медицине. Белковая полимерная структура содержит в качестве повторяющегося структурного элемента рекомбинантный слитый белок, содержащий части B, REP и CT. Изобретение позволяет получить белковую структуру, пригодную в качестве аффинной среды и каркасного материала для клеток. 13 н. и 28 з.п. ф-лы, 34 ил., 5 табл., 28 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и трансплантологии. Описана искусственная живая трехмерная конструкция печеночной ткани. Конструкция содержит один или несколько слоев, в которой каждый слой содержит один или несколько типов печеночных клеток и один или несколько слоев объединены между собой с образованием живой трехмерной конструкции печеночной ткани. В некоторых вариантах такие конструкции характеризуются тем, что имеют по меньшей мере один слой, включающий клетки многих типов, клетки разных типов пространственно расположены друг относительно друга таким образом, что они образуют плоскую структуру; причем среди этих слоев по меньшей мере один слой композиционно и архитектурно отличается по меньшей мере от одного из других слоев с образованием плоской структуры. Также описаны матриксы и способы их изготовления. Данное изобретение также предлагает искусственную живую трехмерную конструкцию печеночной ткани для применения с целью улучшения одной или нескольких функций печени путем введения in vivo ткани или применения ткани в экстракорпоральном устройстве. Предложенное изобретение может быть использовано в медицине. 7 н. и 27 з.п. ф-лы, 37 ил., 9 пр.
Наверх