Детекция нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу для детекции нуклеотидных вариаций посредством анализа с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (анализа РТОСЕ), и может быть использовано в медицине. Изобретение предлагает применение PTO-NV, содержащего сайт распознавания нуклеотидной вариации, расположенный на 5’-концевой части 3’-концевого узнающего мишень участка для селективности PTO в отношении конкретной нуклеотидной вариации. 4 н. и 35 з.п. ф-лы, 35 ил., 18 табл., 10 пр.

 

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО).

СВЕДЕНИЯ О РОДСТВЕННОМ УРОВНЕ ТЕХНИКИ

Гибридизация ДНК представляет собой фундаментальный процесс в молекулярной биологии, и на него влияют ионная сила, состав оснований, длина фрагмента, до которого укорочена нуклеиновая кислота, степень ошибочного спаривания и присутствие денатурирующих агентов. Основанные на гибридизации ДНК технологии были бы чрезвычайно полезным средством в определении конкретной нуклеиновокислотной последовательности и были бы, несомненно, необходимы в области клинической диагностики, генетических исследований и лабораторной судебно-медицинской экспертизы.

Однако, в традиционных методах и способах, основанных главным образом на гибридизации, с большой вероятностью получаются ложноположительные результаты вследствие неспецифической гибридизации между зондами и последовательностями, не являющимися мишенями. Ввиду этого, остаются проблемы, которые требуют разрешения с целью повышения надежности этих способов.

Помимо способов с гибридизацией зондов были предложены различные подходы с использованием дополнительных ферментативных реакций, например, способ с применением TaqMan™-зондов.

В способе с применением TaqMan™-зондов меченый зонд, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется под действием 5'-нуклеазной активности ДНК-полимеразы, зависящей от располагающегося "вверх по течению" праймера, генерируя сигнал, указывающий на присутствие последовательности-мишени (патенты США №№5210015, 5538848 и 6326145). Согласно способу с применением TaqMan™-зондов предлагается два подхода для генерирования сигнала: зависящее от полимеризации расщепление и не зависящее от полимеризации расщепление. При зависящем от полимеризации расщеплении удлинение располагающегося "вверх по течению" праймера должно происходить до того, как полимераза нуклеиновых кислот встретится с 5'-концом меченого зонда. По мере продолжения реакции удлинения полимераза постепенно расщепляет 5'-конец меченого зонда. При не зависящем от полимеризации расщеплении располагающийся "вверх по течению" праймер и меченый зонд гибридизуются с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в непосредственной близости, так что связывание полимеразы нуклеиновых кислот с 3'-концом располагающегося "вверх по течению" праймера приводит ее в контакт с 5'-концом меченого зонда, результатом чего является высвобождение метки. Кроме того, в способе с применением TaqMan™-зондов описывается, что меченый зонд, имеющий на своем 5-конце 5'-хвостовой участок, не гибридизующийся с последовательностью-мишенью, также расщепляется с образованием фрагмента, содержащего данный 5'-хвостовой участок.

Сообщалось о некоторых способах, в которых зонд, имеющий 5'-хвостовой участок, некомлементарный последовательности-мишени, расщепляется под действием 5'-нуклеазы с высвобождением фрагмента, содержащего данный 5-хвостовой участок.

Например, в патенте США №5691142 описывается расщепляемая структура, которая должна перевариваться под действием 5'-нуклеазной активности ДНК-полимеразы. Приводится пример данной расщепляемой структуры, в которой олигонуклеотид, содержащий 5'-участок, некомплементарный матрице, и 3'-участок, комплементарный матрице, гибридизуется с данной матрицей, и в непосредственной близости, с этой матрицей гибридизуется располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид. Такая расщепляемая структура расщепляется ДНК-полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, или модифицированной ДНК-полимеразой со сниженной способностью к синтезу с высвобождением 5-участка, некомплементарного данной матрице. Высвободившийся 5'-участок далее гибридизуется с олигонуклеотидом, имеющим шпилечную структуру, с образованием расщепляемой структуры, индуцируя тем самым прогрессирующие реакции расщепления, необходимые для детекции последовательности-мишени.

В патенте США №7381532 описывается способ, в котором расщепляемая структура, содержащая располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид с блокированным 3'-концом, расщепляется ДНК-полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазой FEN (флэп-эндонуклеазой; от англ. Flap EndoNuclease) с высвобождением некомплементарного 5'-концевого одноцепочечного "свисающего" участка (флэпа), и детекцию этого высвободившегося 5'-концевого "свисающего" участка осуществляют, используя анализ по размеру или систему двух взаимодействующих меток. В патенте США №6893819 описывается, что детектируемые высвободившиеся "свисающие" участки получаются в результате применения зависящего от синтеза нуклеиновой кислоты, флэп-опосредованного способа амплификации последовательностей. В этом способе высвободившийся из первой расщепляемой структуры "свисающий" участок опосредует зависящим от синтеза нуклеиновой кислоты образом расщепление второй расщепляемой структуры, что необходимо для высвобождения "свисающего" участка из второй расщепляемой структуры, и высвободившиеся "свисающие" участки детектируют. В патенте США №7309573 описывается способ, включающий образование высвободившегося "свисающего" участка, полученного в результате синтеза нуклеиновой кислоты; удлинение этого высвободившегося "свисающего" участка; расщепление олигонуклеотида в процессе удлинения этого "свисающего" участка и детекцию сигнала, генерируемого в результате расщепления данного олигонуклеотида.

Используя гибридизацию меченных флуоресцентной меткой зондов в жидкой фазе, можно осуществить одновременную детекцию множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с применением флуоресцентной метки даже одного типа путем анализа кривой плавления. Однако, традиционные технологии детекции последовательностей-мишеней с применением 5'-нуклеаза-опосредованного расщепления зондов, содержащих систему двух взаимодействующих меток, требуют наличия флуоресцентных меток различных типов для различных последовательностей-мишеней при детекции множественных мишеней, что ограничивает число детектируемых последовательностей-мишеней ввиду ограниченного количества типов флуоресцентных меток.

В публикации заявки на патент США 2008/0241838 описывается способ детекции мишени с использованием расщепления зонда, содержащего 5'-концевой участок, некомплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и гибридизации зонда захвата. Метка расположена на некомплементарном 5'-концевом участке. Меченый зонд, гибридизованный с последовательностью-мишенью, расщепляется с высвобождением фрагмента, после чего этот фрагмент далее гибридизуется с зондом захвата для детекции присутствия последовательности-мишени. В этом способе необходимо, чтобы нерасщепленный/интактный зонд не гибридизовался с зондом захвата. Для этого зонд захвата, имеющий меньшую длину, должен быть иммобилизован на твердой подложке. Однако такое ограничение приводит к снижению эффективности гибридизации на твердой подложке, а также к затруднениям в оптимизации реакционных условий.

Таким образом, в данной области техники сохраняется давно назревшая необходимость в разработке новых подходов к детекции последовательности-мишени, предпочтительно множественных последовательностей-мишеней, в жидкой фазе и на твердой фазе, не только посредством гибридизации, но также с использованием ферментативных реакций, таких как 5'-нуклеолитическая реакция, более удобным, надежным и воспроизводимым образом. Кроме того, в данной области техники также существует необходимость в новом способе детекции мишени, не ограниченном количеством типов меток (в частности, флуоресцентными метками).

Вместе с тем, нуклеотидные вариации играют важную роль в областях научных и клинических исследований. Среди них однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) наиболее часто встречаются в геноме человека и служат маркерами для связанных с заболеваниями локусов и для фармакогенетики (Landegren и др., 1998; Roses, 2000). SNP обнаружены на уровне приблизительно 1 на 1000 п. о. в геноме человека, и их общее количество оценивается примерно в три миллиона. Для детекции нуклеотидных вариаций, таких как SNP, делеция, вставка и транслокация, предложены различные технологии дискриминации аллелей.

Аллель-специфичный TaqMan-зонд сконструирован так, что он гибридизуется только с идеально сопоставимыми последовательностями-мишенями на стадии удлинения в ПЦР. TaqMan-зонд имеет репортерную молекулу и молекулу-гаситель, способную гасить флуоресцентный сигнал от репортерной молекулы. TaqMan-зонд, гибридизованный с последовательностями-мишенями, расщепляется под действием 5'-нуклеазной активности Taq ДНК-полимеразы, и репортерная молекула и молекула-гаситель разделяются, генерируя сигнал от мишени (target signal). Для дискриминации аллелей используют 13-20-мерные зонды, конъюгированные с малобороздочным лигандом (MGB) (Livak, et al., Genet. Anal. 14: 143-149 (1999)). Поскольку в методе дискриминации аллелей с использованием TaqMan-зонда применяется не только реакция гибридизации, но также и ферментативные реакции с участием 5'-нуклеазной активности, его специфичность повышается. Однако данный метод связан с серьезными затруднениями, например, с проблемами при конструировании аллель-специфичных зондов и оптимизации реакционных условий, которые должны способствовать распознаванию различия, соответствующего одному ошибочному спариванию. Помимо этого, конъюгат с MGB представляет собой одно из средств для устранения недостатков аллель-специфичного TaqMan-зонда.

Таким образом, в данной области сохраняется давно назревшая необходимость в разработке новых подходов к детекции нуклеотидной вариации более удобным, надежным и воспроизводимым образом, свободным от недостатков, присущих традиционным технологиям.

По всей этой заявке сделаны ссылки на различные патенты и публикации, и упоминания о них приведены в круглых скобках. Тем самым описание этих патентов и публикаций во всей их полноте включено в эту заявку посредством ссылок с целью более полного описания данного изобретения и состояния области техники, к которой это изобретение имеет отношение.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых подходов для детекции последовательностей-мишеней, характеризующихся более высокой точностью и удобством, помимо прочего, в режиме множественной детекции. В результате авторы изобретения разработали новые протоколы для детекции последовательностей-мишеней, в которых детекция мишени осуществляется посредством гибридизации зонда, ферментативного расщепления зонда, удлинения и детекции удлиненного дуплекса. Протоколы по настоящему изобретению хорошо адаптированы как к реакциям в жидкой фазе, так и к реакциям на твердой фазе, и это дает возможность осуществлять детекцию множественных последовательностей-мишеней с более высокой точностью и более удобным образом.

Кроме того, авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых подходов для детекции нуклеотидных вариаций, характеризующихся более высокой точностью и удобством, помимо прочего, в режиме множественной детекции. В результате авторы изобретения разработали новые протоколы для детекции нуклеотидных вариаций, в которых детекция нуклеотидной вариации осуществляется посредством гибридизации зондов, ферментативного расщепления зондов, удлинения и детекции удлиненной цепи. В частности, авторы изобретения неожиданно создали сайт расщепления зонда, регулируемый в зависимости от присутствия и отсутствия представляющих интерес нуклеотидных вариаций, при этом фрагменты, высвободившиеся в результате расщепления в разных сайтах, отличаются по их способности к удлинению на искусственной матрице. Протоколы по настоящему изобретению хорошо адаптированы как к реакциям в жидкой фазе, так и к реакциям на твердой фазе, и дают возможность осуществлять детекцию множественных нуклеотидных вариаций с более высокой точностью и более удобно.

Таким образом, данным изобретением решается задача разработки способа детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО).

Другой задачей данного изобретения является разработка способа детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО).

Еще одной задачей данного изобретения является создание набора для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО).

Еще одной задачей данного изобретения является создание набора для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО).

Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего далее подробного описания в сочетании с прилагаемой формулой изобретения и графическими материалами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 схематически показаны структуры РТО (зондирующего и метящего олигонуклеотида - probing и tagging oligonucleotide) и СТО (захватывающего и матричного олигонуклеотида - capturing и templating oligonucleotide), использованных в анализе с расщеплением и удлинением РТО (РТОСЕ-анализе). Предпочтительно, чтобы 3'-концы РТО и СТО были блокированы, чтобы препятствовать их удлинению.

На Фиг. 2 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления. СТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке (templating portion).

На Фиг. 3 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления. СТО содержит репортерную молекулу на своем матричном участке. Репортерная молекула необходима для того, чтобы демонстрировать различную интенсивность сигнала в зависимости от ее присутствия на одноцепочечной форме или двухцепочечной форме.

На Фиг. 4· схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления. СТО содержит остаток изо-dC и репортерную молекулу на своем матричном участке. Структура гаситель-изо-dGTP встраивается в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения.

На Фиг. 5 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления. РТО содержит репортерную молекулу на своем 5'-концевом тегирующем участке (5'-tagging portion), а СТО содержит остаток изо-dC на своем матричном участке. Структура гаситель-изо-dGTP встраивается в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения.

На Фиг. 6 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления. РТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем 5'-концевом тегирующем участке.

На Фиг. 7 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления. РТО содержит репортерную молекулу на своем 5'-концевом тегирующем участке. Репортерная молекула необходима для того, чтобы демонстрировать различную интенсивность сигнала в зависимости от ее присутствия на одноцепочечной форме или двухцепочечной форме.

На Фиг. 8 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления. РТО содержит молекулу-гаситель на своем 5'-концевом тегирующем участке, а СТО содержит репортерную молекулу на своем захватывающем участке (capturing portion).

На Фиг. 9 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию при предварительно заданной температуре. СТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке. СТО иммобилизован на твердой подложке через свой 3'-конец.

На Фиг. 10 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию при предварительно заданной температуре. Меченный репортерной молекулой dATP встраивается в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения. СТО иммобилизован на твердой подложке через свой 3'-конец.

На Фиг. 11 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию при предварительно заданной температуре. СТО содержит остаток изо-dC на своем матричном участке, а структура репортер-изо-dGTP встраивается в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения. СТО иммобилизован на твердой подложке через свой 3'-конец.

На Фиг. 12 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию при предварительно заданной температуре. РТО содержит репортерную молекулу на своем 5'-концевом тегирующем участке. СТО иммобилизован на твердой подложке через свой 5'-конец.

На Фиг. 13 схематически представлен РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию при предварительно заданной температуре с использованием интеркалирующего красителя. СТО иммобилизован на твердой подложке через свой 5'-конец.

На Фиг. 14 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae с использованием РТОСЕ-анализа, включающего в себя анализ плавления. СТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке.

На Фиг. 15 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae с использованием РТОСЕ-анализа, включающего в себя анализ плавления. РТО содержит молекулу-гаситель на своем 5'-конце, а СТО содержит репортерную молекулу на своем 3'-конце.

На Фиг. 16 показаны результаты, свидетельствующие о том, что величины Т_пл для удлиненных дуплексов согласуются с последовательностями СТО.

На Фиг. 17 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae посредством РТОСЕ-анализа с использованием ПЦР-амплификации. СТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке. На Фиг. 17А показаны результаты РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию с использованием ПЦР в режиме реального времени, а на Фиг. 17 В показаны результаты РТОСЕ-анализа, включающего в себя пост-ПЦР анализ плавления.

На Фиг. 18 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae посредством РТОСЕ-анализа с использованием ПЦР-амплификации. СТО содержит остаток изо-dC и репортерную молекулу на своем 5-конце. Структура гаситель-изо-dGTP встраивается в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения. На Фиг. 18А показаны результаты РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию с использованием ПЦР в режиме реального времени, а на Фиг. 18 В показаны результаты РТОСЕ-анализа, включающего в себя пост-ПЦР анализ плавления.

На Фиг. 19 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae посредством РТОСЕ-анализа с использованием ПЦР-амплификации. РТО содержит молекулу-гаситель на своем 5'-конце, а СТО содержит репортерную молекулу на своем 3'-конце. На Фиг. 19А показаны результаты РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию с использованием ПЦР в режиме реального времени, а на Фиг. 19 В показаны результаты РТОСЕ-анализа, включающего в себя пост-ПЦР анализ плавления.

На Фиг. 20 показаны результаты одновременной детекции гена Neisseria gonorrhoeae (NG) и гена Staphylococcus aureus (SA) с использованием РТОСЕ-анализа, включающего в себя пост-ПЦР анализ плавления. СТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке.

На Фиг. 21 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae с использованием РТОСЕ-анализа, включающего в себя анализ плавления на микрочипе. СТО иммобилизован через свой 5-конец. РТО содержит репортерную молекулу на своем 5'-концевом тегирующем участке.

На Фиг. 22 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae с использованием РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре на микрочипе. СТО иммобилизован через свой 5'-конец. РТО содержит репортерную молекула на своем 5'-концевом тегирующем участке.

На Фиг. 23 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae с использованием РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре на микрочипе. СТО иммобилизован через свой 3'-конец и содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке.

На Фиг. 24 показаны результаты детекции одной мишени и множественных мишеней с использованием РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию в режиме конечной точки при предварительно заданной температуре на микрочипе. СТО иммобилизован через свой 5'-конец. РТО содержит репортерную молекулу на своем 5'-концевом тегирующем участке. В качестве нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней использовали ген Neisseria gonorrhoeae (NG) и ген Staphylococcus aureus (SA).

На Фиг. 25 схематически представлен РТОСЕ-анализ для детекции нуклеотидных вариаций. Это приложение называется VD-PTOCE-анализ (детекция вариаций (Variation Detection) посредством расщепления и удлинения РТО). Сайт распознавания нуклеотидной вариации расположен на 5'-конце 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка (3'-targeting portion). Определение присутствия нуклеотидной вариации осуществляется посредством детекции присутствия удлиненной цепи. Сайты расщепления оказываются разными в зависимости от присутствия и отсутствия представляющей интерес нуклеотидной вариации.

На Фиг. 26 схематически представлен пример VD-PTOCE-анализа. Сайт распознавания нуклеотидной вариации расположен на расстоянии 1 нуклеотида от 5'-конца 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка.

На Фиг. 27 схематически представлен пример VD-PTOCE-анализа. Искусственный некомплементарный нуклеотид в качестве группировки, не подходящей для спаривания оснований, (non-base pairing moiety) введен в 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка. Присутствие такой не подходящей для спаривания оснований группировки увеличивает расстояние между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.

На Фиг. 28 схематически представлен пример VD-PTOCE-анализа. Сайт распознавания нуклеотидной вариации расположен 5'-конце 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. СТО имеет репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке для генерирования сигналов.

На Фиг. 29 схематически представлен пример VD-PTOCE-анализа, включающего в себя анализ плавления. Сайт распознавания нуклеотидной вариации расположен на расстоянии 1 нуклеотида от 5'-конца 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. СТО имеет репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке для генерирования сигналов.

На Фиг. 30 схематически представлен пример VD-PTOCE-анализа, включающего в себя анализ плавления. Искусственный некомплементарный нуклеотид в качестве в качестве группировки, не подходящей для спаривания оснований, введен в 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка. СТО имеет репортерную молекулу и молекулу-гаситель на своем матричном участке для генерирования сигналов.

На Фиг. 31 схематически представлен пример VD-PTOCE-анализа, включающего в себя детекцию при предварительно заданной температуре на микрочипе. Сигнал от одиночной флуоресцентной метки детектируют при предварительно заданной температуре.

На Фиг. 32 схематически представлен пример VD-PTOCE-анализа, включающего в себя детекцию при предварительно заданной температуре на микрочипе. Меченный репортерной молекулой ddUTP встраивается в удлиненную цепь во время реакции удлинения. Сигнал от репортерной молекулы детектируют при предварительно заданной температуре.

На Фиг. 33 показаны результаты детекции мутации V600E в гене BRAF с использованием VD-PTOCE-анализа. Исследовали четыре различных типа PTO-NV (РТО для нуклеотидной вариации - РТО for nucleotide variation) с изменением расположения сайта распознавания однонуклеотидной вариации в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка.

На Фиг. 34 показаны результаты детекции мутации V600E в гене BRAF с использованием VD-PTOCE-анализа с PTO-NV, имеющим искусственный некомплементарный нуклеотид в качестве группировки, не подходящей для спаривания оснований. Сайт распознавания однонуклеотидной вариации расположен при четвертом нуклеотиде от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка. Исследовали один PTO-NV, не имеющий никакого искусственного некомплементарного нуклеотида, и три типа PTO-NV, имеющих искусственный некомплементарный нуклеотид в качестве группировки, не подходящей для спаривания оснований.

На Фиг. 35 показаны результаты детекции гена Neisseria gonorrhoeae в РТОСЕ-анализе с использованием 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. На Фиг. 35А показаны результаты РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре без использования располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, а на Фиг. 35В показаны результаты РТОСЕ-анализа, включающего в себя анализ плавления без использования располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в целом относится к новому способу детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО). В частности, настоящее изобретение относится к новому способу детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО) и набору для детекции нуклеотидной вариации в РТОСЕ-анализе.

Настоящее изобретение, предложенное для детекции нуклеотидной вариации, основывается на расщеплении РТО и удлинении фрагмента РТО на СТО, как и в РТОСЕ-анализе; ввиду этого, его подробное описание будет приведено после изложения РТОСЕ-анализа. Для лучшего понимания ниже будет приведено описание РТОСЕ-анализа.

I. Способ детекции мишени в РТОСЕ-анализе, включающем в себя анализ плавления

В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:

(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РТО (зондирующим и метящим олигонуклеотидом); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется, и образуется удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной этого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО;

(e) плавление удлиненного дуплекса в диапазоне температур с получением сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса; при этом сигнал от мишени обеспечивается посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию удлиненного дуплекса путем измерения сигнала от мишени; тем самым присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых подходов для детекции последовательностей-мишеней, характеризующихся более высокой точностью и удобством, помимо прочего, в режиме множественной детекции. В результате авторы изобретения разработали новые протоколы для детекции последовательностей-мишеней, в которых детекция мишени осуществляется посредством гибридизации зонда, ферментативного расщепления зонда, удлинения и детекции удлиненного дуплекса. Протоколы по настоящему изобретению хорошо адаптированы как к реакциям в жидкой фазе, так и к реакциям на твердой фазе, и это дает возможность осуществлять детекцию множественных последовательностей-мишеней с более высокой точностью и более удобным образом.

В настоящем изобретении реализуются поочередные события в такой последовательности: гибридизация зонда; расщепление РТО (зондирующего и метящего олигонуклеотида) и удлинение; образование мишень-зависимого удлиненного дуплекса; и детекция удлиненного дуплекса. Поэтому способ называется анализом с РТОСЕ (с расщеплением и удлинением РТО).

В настоящем изобретении удлиненный дуплекс характеризуется присутствием метки(меток), обеспечивающей(их) получение сигнала, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса, в результате анализа плавления или детекции при предварительно заданной температуре. При этом данный удлиненный дуплекс характеризуется регулируемой величиной Т_пл, что играет решающую роль при детекции множественных мишеней или для того, чтобы провести отличие от сигнала, не относящегося к мишени (non-target signal).

Поскольку удлиненный дуплекс образуется только тогда, когда имеется нуклеиновая кислота-мишень, присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие этой нуклеиновой кислоты-мишени.

РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления, далее будет описан более подробно.

Стадия (а). Гибридизация располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РТО с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью

Согласно настоящему изобретению нуклеиновокислотная последовательность-мишень сначала гибридизуется с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РТО (зондирующим и метящим олигонуклеотидом).

Используемый в данном описании термин "нуклеиновая кислота-мишень", "нуклеиновокислотная последовательность-мишень" или "последовательность-мишень" относится к представляющей интерес для детекции нуклеиновокислотной последовательности, на которой отжигают зонд или праймер, либо которую гибридизуют с зондом или праймером в условиях гибридизации, отжига или амплификации.

Используемый в данном описании термин "зонд" относится к молекуле одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей участок или участки, по существу комплементарный(ые) нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Термин "праймер", как он использован в данном описании, относится к олигонуклеотиду, который способен действовать в качестве точки инициации синтеза в случае его помещения в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты (матрице), т.е. в присутствии нуклеотидов и агента для полимеризации, такого как ДНК-полимераза, и при подходящих значениях температуры и рН.

Предпочтительно, чтобы зонд и праймер представляли собой молекулы одноцепочечных дезоксирибонуклеотидов. Зонды или праймеры, используемые в данном изобретении, могут содержать природный dNMP (т.е. dAMP, dGMP, dCMP и dTMP), модифицированный нуклеотид или неприродный нуклеотид. Зонды или праймеры также могут включать рибонуклеотиды.

Праймер должен иметь достаточную длину, чтобы праймировать синтез продуктов удлинения в присутствии агента для полимеризации. Точная длина праймеров будет зависеть от многих факторов, включая температуру, способ применения и источник праймера. Термин "отжиг" или "праймирование", как он использован в данном описании, относится к присоединению олигодезоксинуклеотида или нуклеиновой кислоты к являющейся матрицей нуклеиновой кислоте, при этом данное присоединение позволяет полимеразе осуществлять полимеризацию нуклеотидов с образованием молекулы нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте, являющейся матрицей, или ее части.

Термин "гибридизация", используемый в данном описании, относится к образованию двухцепочечной нуклеиновой кислоты из комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот. Гибридизация может осуществляться между двумя цепями нуклеиновой кислоты, полностью сопоставимыми или в значительной степени сопоставимыми при некотором количестве ошибочных спариваний. Комплементарность, необходимая для гибридизация, может зависеть от условий гибридизации, в частности от температуры.

Гибридизация нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РТО может быть осуществлена в подходящих условиях гибридизации, определенных в установленном порядке путем оптимизации методик. Такие условия, как температура, концентрация компонентов, продолжительность гибридизации и промывки, компоненты буферов, их рН и ионная сила, могут быть изменены в зависимости от различных факторов, включая длину и GC-состав олигонуклеотида (располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РТО) и нуклеотидной последовательности-мишени. Например, когда используется относительно короткий олигонуклеотид, предпочтительно, чтобы были приняты условия низкой жесткости. Подробные условия гибридизации можно найти в Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); и M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y. (1999).

He предполагается различия между терминами "отжиг" и "гибридизация", и эти термины будут использованы взаимозаменяемо.

Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид и РТО содержат гибридизующиеся нуклеотидные последовательности, комплементарные нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Термин "комплементарный" используется в данном описании для указания на то, что праймеры или зонды являются в достаточной степени комплементарными, чтобы селективно гибридизоваться с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в намеченных условиях отжига или в жестких условиях, охватывая термины "по существу комплементарный" и "полностью комплементарный", предпочтительно "полностью комплементарный".

5'-Концевой тегирующий участок РТО имеет нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Матричный участок СТО (захватывающего и матричного олигонуклеотида) имеет нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО. Термин "некомплементарный" используется в данном описании для указания на то, что праймеры или зонды являются в достаточной степени некомплементарными, чтобы не гибридизоваться селективно с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в намеченных условиях отжига или в жестких условиях, охватывая термины "по существу некомплементарный" и "полностью некомплементарный", предпочтительно "полностью некомплементарный".

Например, термин "некомплементарный" в отношении 5'-концевого тегирующего участка РТО означает, что 5'-концевой тегирующий участок является в достаточной степени некомплементарным, чтобы не гибридизоваться селективно с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в намеченных условиях отжига или в жестких условиях, охватывая термины "по существу некомплементарный" и "полностью некомплементарный", предпочтительно "полностью некомплементарный".

Используемый в данном описании термин "РТО (зондирующий и метящий олигонуклеотид)" означает олигонуклеотид, содержащий (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, служащий в качестве зонда, и (2) 5'-концевой тегирующий участок с нуклеотидной последовательностью, некомплементарной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, который высвобождается в результате нуклеолитической реакции из РТО после гибридизации с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. 5'-Концевой тегирующий участок и 3'-концевой узнающий мишень участок в РТО должны располагаться в направлении 5'→3'. РТО схематически показан на Фиг. 1.

Гибридизацию на стадии (а) предпочтительно проводят в жестких условиях, так что 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью.

Для РТО не предусматривается какой-либо конкретной длины. Например, длина РТО может составлять 15-150 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 20-150 нуклеотидов, 20-100 нуклеотидов, 20-80 нуклеотидов, 20-60 нуклеотидов, 20-50 нуклеотидов, 30-150 нуклеотидов, 30-100 нуклеотидов, 30-80 нуклеотидов, 30-60 нуклеотидов, 30-50 нуклеотидов, 35-100 нуклеотидов, 35-80 нуклеотидов, 35-60 нуклеотидов или 35-50 нуклеотидов. 3'-Концевой узнающий мишень участок РТО может быть любой длины при условии, что он специфически гибридизуется с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями. Например, длина 3'-концевого узнающего мишень участка РТО может составлять 10-100 нуклеотидов, 10-80 нуклеотидов, 10-50 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-50 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов, 20-100 нуклеотидов, 20-80 нуклеотидов, 20-50 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов или 20-30 нуклеотидов. 5'-Концевой тегирующий участок может быть любой длины при условии, что он специфически гибридизуется с матричным участком СТО и далее удлиняется. Например, длина 5'-концевого тегирующего участка РТО может составлять 5-50 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-30 нуклеотидов, 5-20 нуклеотидов, 10-50 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 10-20 нуклеотидов, 15-50 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов или 15-20 нуклеотидов.

На 3'-конце РТО может находиться группа 3'-ОН. Предпочтительно, 3'-конец РТО "блокируют", чтобы не допустить его удлинения.

Блокирование может быть достигнуто традиционными методами. Например, блокирование можно осуществить путем добавления химической группировки, такой как биотин, метки, фосфатная группа, алкильная группа, ненуклеотидный линкер, фосфотионат или алкандиол, к 3'-гидроксильной группе последнего нуклеотида. Альтернативно, блокирование может быть выполнено посредством удаления 3'-гидроксильной группы последнего нуклеотида или путем использования нуклеотида, лишенного 3'-гидроксильной группы, такого как дидезоксинуклеотид.

Альтернативно, РТО может быть сконструирован так, чтобы принимать шпилечную структуру.

Отсутствие гибридизации между 5'-концевым тегирующим участком РТО и нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью означает отсутствие образования из них стабильной двухцепочечной структуры в определенных условиях гибридизации. Согласно предпочтительному воплощению 5'-концевой тегирующий участок РТО, не вовлеченный в гибридизацию с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, образует одноцепочечную структуру.

Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО.

Помимо этого, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь, гибридизованная с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

Индукция расщепления РТО при посредстве располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида может протекать двумя путями: (1) как индукция расщепления, не зависящая от удлинения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида; и (2) как индукция расщепления, зависящая от удлинения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида.

В том случае, когда располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован достаточно близко к РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, тогда фермент, связавшийся с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом, расщепляет РТО без реакции удлинения. В отличие от этого, когда располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован в отдалении от РТО, тогда фермент, обладающий полимеразной активностью, (например, матричная полимераза) катализирует удлинение располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида (например, располагающегося "вверх по течению" праймера), а фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, связавшийся с удлиненным продуктом, расщепляет РТО.

Следовательно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован относительно РТО двумя способами. Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован достаточно близко к РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО не зависящим от удлинения образом. Альтернативно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован достаточно далеко от РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО зависящим от удлинения образом.

Используемый в данном описании термин "расположенный в непосредственной близости" в отношении расположений или локализаций означает, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован вблизи 3'-концевого узнающего мишень участка РТО с образованием "ника" (одноцепочечного разрыва). Кроме того, этот термин означает, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован на расстоянии 1-30 нуклеотидов, 1-20 нуклеотидов или 1-15 нуклеотидов от 3'-концевого узнающего мишень участка РТО.

Используемый в данном описании термин "отдаленный" в отношении расположений или локализаций, включает в себя любые расположения или локализации, достаточные для обеспечения протекания реакций удлинения.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован на достаточном отдалении от РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО зависящим от удлинения образом.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд. Располагающийся "вверх по течению" праймер подходит для индукции не зависящего от удлинения расщепления или для индукции зависящего от удлинения расщепления, а располагающийся "вверх по течению" зонд подходит для индукции не зависящего от удлинения расщепления.

Альтернативно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может иметь последовательность, частично перекрывающуюся с 5'-концевой частью 3'-концевого узнающего мишень участка РТО. Предпочтительно, чтобы длина перекрывающейся последовательности составляла 1-10 нуклеотидов, более предпочтительно 1-5 нуклеотидов, еще более предпочтительно 1-3 нуклеотида. В том случае, когда располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид имеет последовательность, частично перекрывающуюся с 5'-концевой частью 3'-концевого узнающего мишень участка РТО, этот 3'-концевой узнающий мишень участок частично расщепляется вместе с 5'-концевым тегирующим участком в реакции расщепления на стадии (b). Помимо этого, присутствие перекрывающейся последовательности позволяет расщеплять желаемый сайт 3'-концевого узнающего мишень участка.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

В настоящем изобретении могут быть применены традиционные технологии для реакций расщепления с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов при условии, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид индуцирует расщепление РТО, гибридизованного с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, с высвобождением фрагмента, содержащего 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО. Например, в настоящем изобретении могут быть применены патенты США №№5210015, 5487972, 5691142, 5994069 и 7381532 и публикация заявки на патент США №2008/0241838.

Согласно предпочтительному воплощению данный способ осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера. Располагающийся "вниз по течению" праймер дополнительно образует нуклеиновокислотную последовательность-мишень, которая будет гибридизоваться с РТО, повышая чувствительность детекции мишени.

Согласно предпочтительному воплощению, когда используют располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, дополнительно для удлинения этих праймеров применяют матричную полимеразу нуклеиновых кислот.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид (располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд), располагающийся "вниз по течению" праймер и/или 5'-концевой тегирующий участок РТО имеют структуру олигонуклеотида с двойным праймированием (DPO), разработанную авторами настоящего изобретения. Олигонуклеотиды, имеющие структуру DPO, демонстрируют значительно улучшенную специфичность к мишени по сравнению с традиционными праймерами и зондами (см. WO 2006/095981; Chun et. al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses и SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35: 6e40(2007)).

Согласно предпочтительному воплощению 3'-концевой узнающий мишень участок РТО имеет структуру модифицированного олигонуклеотида с двойной специфичностью (mDSO), разработанную авторами настоящего изобретения. Структура модифицированного олигонуклеотида с двойной специфичностью (mDSO) демонстрирует значительно улучшенную специфичность к мишени по сравнению с традиционными зондами (см. WO 2011/028041).

Стадия (b). Высвобождение фрагмента из РТО

Далее, продукт со стадии (а) приводят в контакт с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, высвобождая фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО.

Используемый в данном описании термин "условия для расщепления РТО" означает условия, достаточные для расщепления РТО, гибридизованного с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, такие как температура, рН, ионная сила, буфер, длина и последовательность олигонуклеотидов и ферменты. Например, когда в качестве фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, используют Taq ДНК-полимеразу, условия для расщепления РТО включают трис-HCl буфер, KCl, MgCl₂ и температуру.

Когда РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, его 3'-концевой узнающий мишень участок вовлечен в гибридизацию, а 5'-концевой тегирующий участок образует одноцепочечную структуру без гибридизации с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью (см. Фиг. 2). По существу, олигонуклеотид, содержащий как одноцепочечную, так и двухцепочечную структуры, может быть переварен с использованием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с применением разнообразных технологий, известных специалисту в данной области.

Сайты расщепления РТО варьируют в зависимости от типа располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов (располагающегося "вверх по течению" зонда или располагающегося "вверх по течению" праймера), сайтов гибридизации располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов и условий расщепления (см. патенты США №№5210015, 5487972, 5691142, 5994069 и 7381532 и публикацию заявки на патент США №2008/0241838).

Большое число традиционных технологий может быть применено для проведения реакции расщепления РТО, приводящей к высвобождению фрагмента, содержащего 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка.

Кратко, на стадии (b) могут быть три сайта расщепления. Во-первых, сайтом расщепления является соединительный сайт (junction site) между гибридизующимся участком РТО (3'-концевым узнающим мишень участком) и негибридизующимся участком (5'-концевым тегирующим участком). Второй сайт расщепления представляет собой сайт локализации нескольких нуклеотидов в 3'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО. Второй сайт расщепления локализован в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка РТО. Третий сайт расщепления представляет собой сайт локализации нескольких нуклеотидов в 5'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО.

Согласно предпочтительному воплощению первоначальным сайтом расщепления РТО матричной полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, после удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера является исходная точка двойной цепи между РТО и нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью или сайт на расстоянии 1-3 нуклеотида от этой исходной точки.

В связи с этим, используемый в данном описании термин "фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО" в отношении расщепления РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, применяется для обозначения (1) 5'-концевого тегирующего участка, (2) 5'-концевого тегирующего участка и 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка и (3) части 5'-концевого тегирующего участка. В данной заявке термин "фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО" также можно описать как "фрагмент РТО".

Согласно одному из воплощений РТО имеет блокирующий участок, содержащий блокатор, устойчивый к расщеплению ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, и этот блокирующий участок используют для регулирования начального сайта расщепления и/или последующих расщеплений.

Согласно одному из воплощений РТО имеет блокирующий участок, содержащий в качестве блокатора по меньшей мере один нуклеотид, устойчивый к расщеплению ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

Например, чтобы индуцировать расщепление в соединительном сайте между гибридизующимся участком РТО (3'-концевым узнающим мишень участком) и негибридизующимся участком (5'-концевым тегирующим участком) 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка РТО можно заблокировать блокаторами.

Число блокаторов, содержащихся в блокирующем участке, может быть неограниченным, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 2-10, еще более предпочтительно 3-8, наиболее предпочтительно 3-6 блокаторов. Блокаторы, присутствующие в РТО, могут быть расположены непрерывно или через промежутки, предпочтительно непрерывно. Нуклеотиды, служащие в качестве блокаторов, имеющие остов, устойчивый к 5'→3'-экзонуклеазной активности, включают любые нуклеотиды, известные специалисту в данной области. Например, они содержат различные фосфотиоатные связи, фосфонатные связи, фосфоамидатные связи и модификации по положению 2' углеводной части. Согласно более предпочтительному воплощению нуклеотиды, имеющие остов, устойчивый к 5'→3'-экзонуклеазе, содержат фосфотиоатную связь, алкилфосфотриэфирную связь, арилфосфотриэфирную связь, алкилфосфонатную связь, арилфосфонатную связь, гидрофосфонатную связь, алкилфосфоамидатную связь, арилфосфоамидатную связь, фосфоселенатную связь, модификацию 2'-O-аминопропил, модификацию 2'-O-алкил, модификацию 2'-O-аллил, модификацию 2'-O-бутил, α-аномерный олигодезоксинуклеотид и модификацию 1-(4'-тио-β-D-рибофуранозил).

Согласно одному из воплощений нуклеотид, используемый в качестве блокатора, включает LNA ("закрытая" нуклеиновая кислота).

Термин "часть", используемый в отношении РТО или СТО, как например, часть 5'-концевого тегирующего участка РТО, 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка РТО и 5-'концевой части захватывающего участка СТО, относится к нуклеотидной последовательности, содержащей 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 или 1-5 нуклеотидов, предпочтительно 1, 2, 3 или 4 нуклеотида.

Согласно предпочтительному воплощению фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN, более предпочтительно термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.

Подходящей ДНК-полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, в данном изобретении является термостабильная ДНК-полимераза, полученная из ряда бактериальных видов, включая Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga marítima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga marítima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus и Aquifex aeolieus. Наиболее предпочтительно, чтобы термостабильная ДНК-полимераза представляла собой Taq полимеразу.

Альтернативно, в настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразы, обладающие 5'-нуклеазной активностью, модифицированные с целью уменьшения полимеразной активности.

Используемая нуклеаза FEN (флэп-эндонуклеаза) представляет собой флэп-специфичную 5'-нуклеазу.

Подходящая для настоящего изобретения нуклеаза FEN включает нуклеазы FEN, полученные из ряда бактериальных видов, включая Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidia η us ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix и Archaeaglobus veneficus.

Когда располагающийся "вверх по течению" праймер используют на стадии (а), предпочтительно, чтобы условия для расщепления РТО включали реакцию удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера.

Согласно предпочтительному воплощению на стадии (а) используют располагающийся "вверх по течению" праймер, для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу, и эта матричная полимераза идентична ферменту, обладающему 5'-нуклеазной активностью.

В некоторых случаях на стадии (а) используют располагающийся "вверх по течению" праймер, для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу, и эта матричная полимераза отличается от фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью.

Стадия (с). Гибридизация фрагмента, высвободившегося из РТО. с СТО

Фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом).

СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО.

СТО действует в качестве матрицы для удлинения фрагмента, высвободившегося из РТО. Этот фрагмент, служащий в качестве праймера, гибридизуется с СТО и удлиняется с образованием удлиненного дуплекса.

Матричный участок может содержать любую последовательность при условии, что он некомплементарен 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО. Кроме того, матричный участок может содержать любую последовательность при условии, что он может действовать в качестве матрицы для удлинения фрагмента, высвободившегося из РТО.

Как описано выше, когда фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок РТО, высвобождается, предпочтительно, чтобы захватывающий участок СТО был сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку. Когда фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок и 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка, высвобождается, предпочтительно, чтобы захватывающий участок СТО был сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. Когда фрагмент, содержащий часть 5'-концевого тегирующего участка РТО высвобождается, предпочтительно, чтобы захватывающий участок СТО был сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную части 5'-концевого тегирующего участка.

Кроме того, возможно конструирование захватывающего участка СТО с предполагаемыми сайтами расщепления РТО. Например, если захватывающий участок СТО сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку, тогда либо фрагмент, содержащий часть 5'-концевого тегирующего участка, либо фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок, мог бы гибридизоваться с захватывающим участком и затем удлиняться. Когда фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующего участок и 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка высвобождается, он может гибридизоваться с захватывающим участком СТО, сконструированным так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку, и затем успешно удлиняться, несмотря на присутствие некомплементарных нуклеотидов на 3'-концевом участке фрагмента. Это возможно потому, что праймеры могут удлиняться в зависимости от реакционных условий, несмотря на то, что их 3'-конец содержит некоторое количество некомплементарных нуклеотидов (например, 1-3 некомплементарных нуклеотида).

Когда высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующего участок и 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка, 5'-концевая часть захватывающего участка СТО может быть сконструирована так, чтобы она содержала нуклеотидную последовательность, комплементарную расщепляемой 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, в результате чего преодолеваются проблемы, связанные с некомплементарными нуклеотидами (см. Фиг. 1).

Предпочтительно, нуклеотидная последовательность 5'-концевой части захватывающего участка СТО, комплементарная расщепляемой 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, может быть выбрана в зависимости от предполагаемых сайтов расщепления на 3'-концевом узнающем мишень участке РТО. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность 5'-концевой части захватывающего участка СТО, комплементарная расщепляемой 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, составляла 1-10 нуклеотидов, более предпочтительно 1-5 нуклеотидов, еще более предпочтительно 1-3 нуклеотида.

На 3'-конце СТО могут содержаться дополнительные нуклеотиды, не вовлеченные в гибридизацию с фрагментом. Кроме того, захватывающий участок СТО может содержать нуклеотидную последовательность, комплементарную только части фрагмента (например, части фрагмента, содержащей его 3'-концевой участок), при условии, что она стабильно гибридизуется с этим фрагментом.

Используемый термин "захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка" охватывает в данном описании различные конструкции и составы захватывающего участка СТО, как обсуждалось выше.

СТО может быть сконструирован так, чтобы принимать шпилечную структуру.

Длина СТО может варьировать в широких пределах. Например, длина СТО составляет 7-1000 нуклеотидов, 7-500 нуклеотидов, 7-300 нуклеотидов, 7-100 нуклеотидов, 7-80 нуклеотидов, 7-60 нуклеотидов, 7-40 нуклеотидов, 15-1000 нуклеотидов, 15-500 нуклеотидов, 15-300 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 20-1000 нуклеотидов, 20-500 нуклеотидов, 20-300 нуклеотидов, 20-100 нуклеотидов, 20-80 нуклеотидов, 20-60 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов, 30-1000 нуклеотидов, 30-500 нуклеотидов, 30-300 нуклеотидов, 30-100 нуклеотидов, 30-80 нуклеотидов, 30-60 нуклеотидов или 30-40 нуклеотидов. Захватывающий участок СТО может иметь любую длину при условии, что он специфически гибридизуется с фрагментом, высвободившимся из РТО. Например, длина захватывающего участка СТО составляет 5-100 нуклеотидов, 5-60 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-30 нуклеотидов, 5-20 нуклеотидов, 10-100 нуклеотидов, 10-60 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 10-20 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов или 15-20 нуклеотидов. Матричный участок СТО может иметь любую длину при условии, что он может действовать в качестве матрицы при удлинении фрагмента, высвободившегося из РТО. Например, длина матричного участка СТО составляет 1-900 нуклеотидов, 1-400 нуклеотидов, 1-300 нуклеотидов, 1-100 нуклеотидов, 1-80 нуклеотидов, 1-60 нуклеотидов, 1-40 нуклеотидов, 1-20 нуклеотидов, 2-900 нуклеотидов, 2-400 нуклеотидов, 2-300 нуклеотидов, 2-100 нуклеотидов, 2-80 нуклеотидов, 2-60 нуклеотидов, 2-40 нуклеотидов, 2-20 нуклеотидов, 5-900 нуклеотидов, 5-400 нуклеотидов, 5-300 нуклеотидов, 5-100 нуклеотидов, 5-80 нуклеотидов, 5-60 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-30 нуклеотидов, 10-900 нуклеотидов, 10-400 нуклеотидов, 10-300 нуклеотидов, 15-900 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов или 15-20 нуклеотидов.

На 3'-конце СТО может находиться группа 3'-ОН. Предпочтительно, 3'-конец СТО блокируют, чтобы не допустить его удлинения. Не допускающее удлинения блокирование СТО может быть достигнуто традиционными методами. Например, блокирование можно осуществить путем добавления химической группировки, такой как биотин, метки, фосфатая группа, алкильная группа, ненуклеотидный линкер, фосфотиоат или алкандиол, к 3'-гидроксильной группе последнего нуклеотида СТО. Альтернативно, блокирование может быть выполнено посредством удаления 3'-гидроксильной группы последнего нуклеотида или путем использования нуклеотида, лишенного 3'-гидроксильной группы, такого как дидезоксинуклеотид.

Фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с СТО, в результате чего получается структура, подходящая для удлинения фрагмента. Несмотря на то что нерасщепленный РТО также гибридизуется с захватывающим участком СТО через свой 5'-концевой тегирующий участок, его 3'-концевой узнающий мишень участок не гибридизуется с СТО, что препятствует образованию удлиненного дуплекса.

Гибридизация на стадии (с) может быть описана более подробно со ссылкой на описания, приведенные на стадии (а).

Стадия (d). Удлинение фрагмента

Реакцию удлинения проводят, используя продукт со стадии (с) и матричную полимеразу нуклеиновых кислот. Фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненного дуплекса. В отличие от этого, нерасщепленный РТО, гибридизованный с захватывающим участком СТО, не удлиняется, и в результате этого не образуется удлиненного дуплекса.

Используемый в данном описании термин "удлиненный дуплекс" обозначает дуплекс, образованный путем реакции удлинения, в которой фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с использованием матричного участка СТО в качестве матрицы и матричной полимеразы нуклеиновых кислот.

Удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, отличающуюся от таковой для гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО.

Предпочтительно, чтобы удлиненный дуплекс имел более высокую величину Т_пл, чем гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО.

Величина Т_пл такого удлиненного дуплекса регулируется в зависимости от (1) последовательности и/или длины фрагмента, (2) последовательности и/или длины СТО или (3) последовательности и/или длины фрагмента и последовательности и/или длины СТО.

Поразительным признаком настоящего изобретения является то, что возможность регулировать величину Т_пл удлиненного дуплекса используется для получения сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса, в результате плавления удлиненного дуплекса на стадии (е).

Используемый в данном описании термин "Т_пл" относится к температуре плавления, при которой половина популяции двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты диссоциирует до одноцепочечных молекул. Величина Т_пл определяется длиной и содержанием G/C-nap в гибридизованных нуклеотидах. Величина Т_пл может быть рассчитана традиционными методами, такими как правило Wallace (R.B. Wallace et al., Nucleic Acids Research, 6: 3543-3547(1979)) и метод ближайших соседей (SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35: 3555-3562(1996); Sugimoto Ν., et al., Nucleic Acids Res., 24: 4501-4505(1996)).

Согласно предпочтительному воплощению величина Т_пл относится к фактическим величинам Т_пл в реакционных условиях, реально используемых на практике.

Матричная полимераза нуклеиновых кислот, используемая на стадии (d), может включать любую полимеразу нуклеиновых кислот, например, кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I из Е. coli, термостабильную ДНК-полимеразу и ДНК-полимеразу бактериофага Т7. Предпочтительно, полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, которая может быть получена из ряда бактериальных видов, включая Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga marítima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus и Aquifex aeolieus. Наиболее предпочтительно, матричная полимераза нуклеиновых кислот представляет собой Taq полимеразу.

Согласно предпочтительному воплощению фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, используемый на стадии (b), идентичен матричной полимеразе нуклеиновых кислот, используемой на стадии (d). Более предпочтительно, чтобы фермент, обладающий 5-нуклеазной активностью, используемый на стадии (b), матричная полимераза нуклеиновых кислот, используемая для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера, и матричная полимераза нуклеиновых кислот, используемая на стадии (d), были идентичны друг другу.

Удлиненный дуплекс содержит метку, происходящую из (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом РТО и/или с СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом РТО и/или с СТО, или (4) интеркалирующей метки.

Присутствие удлиненного дуплекса может указывать на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, потому что удлиненный дуплекс образуется, когда присутствует нуклеиновокислотная последовательность-мишень. Чтобы детекцию присутствия удлиненного дуплекса проводить непосредственно, образование удлиненного дуплекса, содержащего метку, обеспечивающую получение детектируемого сигнала, осуществляют на стадии (d). Метка, используемая в удлиненном дуплексе, обеспечивает регистрацию изменения сигнала в зависимости от того, представляет ли удлиненный дуплекс двухцепочечную структуру или одноцепочечную структуру, окончательно предоставляя сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса, в результате плавления этого удлиненного дуплекса.

Стадия (е). Плавление удлиненного дуплекса

По завершении реакции удлинения удлиненный дуплекс подвергают плавлению в диапазоне температур с получением сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса.

Сигнал от мишени обеспечивается посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, или (4) интеркалирующей метки.

Используемый в данном описании термин "сигнал от мишени" означает любой сигнал, способный указать на присутствие удлиненного дуплекса. Например, термин "сигнал от мишени" включает в себя сигнал от меток (генерирование или гашение сигнала), изменение сигнала от меток (усиление или ослабление сигнала), кривую плавления, картину плавления и температуру плавления (или величину Т_пл).

Согласно предпочтительному воплощению сигнал от мишени представляет собой изменение сигнала от метки на удлиненном дуплексе на стадии плавления. Изменение сигнала может быть получено путем измерения сигналов не менее чем при двух различных температурах. Альтернативно, сигнал от мишени представляет собой кривую плавления, картину плавления и температуру плавления (или величину Т_пл), полученные путем измерения сигналов от метки на удлиненном дуплексе в диапазоне температур. Предпочтительно, чтобы диапазон температур представлял собой диапазон температур для анализа кривой плавления или представлял собой температуры вблизи величины Т_пл удлиненного дуплекса.

Удлиненный дуплекс имеет более высокую величину Т_пл, чем гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО. Ввиду этого удлиненный дуплекс и гибрид демонстрируют отличающиеся друг от друга картины плавления. Такие разные картины плавления позволяют провести отличие сигнала от мишени от сигналов, не относящихся к мишени. Иная картина плавления или температура плавления описывает сигнал от мишени совместно с подходящей системой меток.

Подходящие системы меток, используемые в этом изобретении, различаются с точки зрения их типов, расположения и способа генерирования сигнала.

Системы меток, полезные в этом изобретении, будут обсуждены более подробно ниже.

(1) Метка, соединенная с фрагментом и/или СТО

Согласно предпочтительному воплощению получение сигнала от мишени обеспечивается по меньшей мере одной меткой, соединенной с фрагментом и/или СТО. Как только произойдет образование удлиненного дуплекса между фрагментом РТО и СТО, на удлиненном дуплексе появится метка либо от фрагмента РТО, либо от СТО, обеспечивающая сигнал от мишени на стадии плавления.

Такая метка представляет собой систему двух взаимодействующих меток и одиночную метку.

(1-1) Система двух взаимодействующих меток

Система взаимодействующих меток представляет собой генерирующую сигнал систему, в которой происходит передача энергии между донорной молекулой и акцепторной молекулой без участия радиоактивности. В качестве репрезентативной системы взаимодействующих меток система меток при FRET (резонансном переносе энергии флуоресценции) включает флуоресцентную репортерную молекулу (донорную молекулу) и молекулу-гаситель (акцепторную молекулу). При FRET донор энергии является флуоресцентным, а акцептор энергии может быть флуоресцентным или нефлуоресцентным. Для другой формы систем взаимодействующих меток донор энергии является нефлуоресцентным, например, является хромофором, а акцептор энергии является флуоресцентным. Для еще одной формы систем взаимодействующих меток донор энергии является люминесцентным, например биолюминесцентным, хемилюминесцентным, электрохемилюминесцентным, а акцептор является флуоресцентным. Донорная молекула и акцепторная молекула могут быть описаны в настоящем изобретения как репортерная молекула и молекула-гаситель, соответственно.

Предпочтительно, чтобы сигнал, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса (то есть, на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени), генерировался системами взаимодействующих меток, более предпочтительно системой FRET-меток (т.е. системой двух взаимодействующих меток).

Первое воплощение (внутрицепочечная система двух взаимодействующих меток)

В первом воплощении системы двух взаимодействующих меток фрагмент или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом плавление удлиненного дуплекса на стадии (е) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени на стадии (е). Первое воплощение такой системы двух взаимодействующих меток проиллюстрировано на Фиг. 2, 6 и 9. Первое воплощение называется внутрицепочечной системой двух взаимодействующих меток.

Первое воплощение (внутрицепочечная система двух взаимодействующих меток), приведенное на Фиг. 2

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 2. Матричный участок СТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается, высвобождая фрагмент, этот фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО и удлиняется с образованием удлиненного дуплекса.

Если на стадии (d) образуется удлиненный дуплекс, то репортерная молекула и молекула-гаситель на СТО конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы; при этом если на стадии (е) этот удлиненный дуплекс подвергают плавлению, то репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, так что доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Используемое в данном описании выражение "репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно расположены в непосредственной близости друг к другу" означает, что репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно приближены друг к другу благодаря наличию конформационной структуры у фрагмента или СТО, такой как случайная спираль и шпилечная структура.

Используемое в данном описании выражение "репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно разделены" означает, что репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно разделены в результате изменения конформационной структуры фрагмента или СТО после образования двойной цепи.

Предпочтительно, чтобы сигнал от мишени, доставляемый на стадии (е), представлял собой кривую плавления, картину плавления или величину Т_пл, полученную путем измерения изменения сигнала флуоресценции, генерированного на стадии (d).

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель могут быть расположены в любом месте на СТО, при условии, что гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществляется в зависимости от плавления удлиненного дуплекса.

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель обе соединены с матричным участком или с захватывающим участком СТО.

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель расположены на 5'-конце и 3'-конце СТО.

Согласно предпочтительному воплощению одна из молекул на СТО, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 5'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 5'-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации СТО.

Согласно предпочтительному воплощению одна из молекул на СТО, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 3'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 3'-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации СТО.

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель расположены на расстоянии не более 80 нуклеотидов, более предпочтительно не более 60 нуклеотидов, еще более предпочтительно не более 30 нуклеотидов, существенно более предпочтительно не более 25 нуклеотидов друг от друга. Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель разделены по меньшей мере 4 нуклеотидами, более предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидами, еще более предпочтительно по меньшей мере 10 нуклеотидами, существенно более предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотидами.

В настоящем изобретении возможно получение гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО.

Если матричный участок СТО помечен с использованием системы двух взаимодействующих меток, как показано на Фиг. 2, то индукции изменения сигнала от метки на гибриде, образованном нерасщепленным РТО и СТО, не происходит. Ввиду этого гибрид не дает сигнал, не относящийся к мишени.

Если захватывающий участок СТО помечен с использованием системы двух взаимодействующих меток, то гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени, на стадии плавления. В этом случае разница в величинах Т_пл для удлиненного дуплекса и гибрида позволяет отличить относящийся к мишени сигнал от удлиненного дуплекса от не относящегося к мишени сигнала от гибрида.

Первое воплощение (внутрицепочечная система двух взаимодействующих меток), приведенное на Фиг. 6

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 6. 5'-Концевой тегирующий участок РТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается, высвобождая фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок с репортерной молекулой и молекулой-гасителем. Этот фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО.

Если на стадии (d) образуется удлиненный дуплекс, то репортерная молекула и молекула-гаситель на фрагменте конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы; при этом если на стадии (е) этот удлиненный дуплекс подвергают плавлению, то репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, так что доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель могут быть расположены в любом месте на фрагменте, при условии, что гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществляется в зависимости от плавления удлиненного дуплекса.

Согласно предпочтительному воплощению одна из молекул на фрагменте, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 5'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 5'-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации фрагмента.

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель расположены на расстоянии не более 50 нуклеотидов, более предпочтительно не более 40 нуклеотидов, еще более предпочтительно не более 30 нуклеотидов, существенно более предпочтительно не более 20 нуклеотидов друг от друга. Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель разделены по меньшей мере 4 нуклеотидами, более предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидами, еще более предпочтительно по меньшей мере 10 нуклеотидами, существенно более предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотидами.

Как представлено на Фиг. 6, гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени, на стадии плавления. В этом случае разница в величинах Т_пл для удлиненного дуплекса и гибрида позволяет отличить относящийся к мишени сигнал от удлиненного дуплекса от не относящегося к мишени сигнала от гибрида.

Второе воплощение (межцепочечная система двух взаимодействующих меток)

Во втором воплощении системы взаимодействующих меток фрагмент имеет одну из двух взаимодействующих меток, включащих репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую из двух взаимодействующих меток; при этом плавление удлиненного дуплекса на стадии (е) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени на стадии (е).

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 8.

Если на стадии (d) образуется удлиненный дуплекс, то сигнал от репортерной молекулы, соединенной с СТО, гасится молекулой-гасителем, соединенной с РТО. Если на стадии (е) удлиненный дуплекс подвергают плавлению, то репортерная молекула и молекула-гаситель разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, так что доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Предпочтительно, чтобы сигнал от мишени, доставляемый на стадии (е), представлял собой кривую плавления, картину плавления или величину Т_пл, полученную путем измерения изменения сигнала флуоресценции от системы двух взаимодействующих меток.

Репортерная молекула и молекула-гаситель могут быть расположены в любом месте фрагмента РТО и СТО, при условии, что сигнал от репортерной молекулы гасится молекулой-гасителем в удлиненном дуплексе.

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула или молекула-гаситель на фрагменте РТО расположена на 5-конце 5'-концевого тегирующего участка.

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула или молекула-гаситель на СТО расположена на его 3'-конце.

Как представлено на Фиг. 8, гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени, на стадии плавления. В этом случае разница в величинах Т_пл для удлиненного дуплекса и гибрида позволяет отличить относящийся к мишени сигнал от удлиненного дуплекса от не относящегося к мишени сигнала от гибрида.

Репортерная молекула и молекула-гаситель, полезные в настоящем изобретении, могут включать любые молекулы, известные в данной области техники. Примерами их являются: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), кальцеин (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), родамин 110 (520), Oregon Green™ (500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), родамин 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOT01 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), фикоэритрин R&B (575), родамин-фаллоидин (575), Calcium Orange™ (576), пиронин Y (580), родамин В (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), техасский красный (615), нильский красный (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-фикоцианин (642), С-фикоцианин (648), TO-PRO™-3 (660), ТОТО3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), тиадикарбоцианин (671), Cy5.5 (694), HEX (556), ΤΕΤ (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), (520), флуоресцеин (520), флуоресцеин-С3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) и Quasar 705 (610). Числа в скобках представляют собой длину волны, соответствующую максимуму излучения, в нанометрах. Предпочтительно, чтобы репортерная молекула и молекула-гаситель представляли собой JOE, FAM, TAMRA, ROX и другую метку на основе флуоресцеина.

Подходящие пары репортер-гаситель описаны в ряде публикаций, которые приведены ниже: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2^nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6^th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); патенты США №№3996345 и 4351760.

Стоит отметить, что в настоящем изобретении может быть использована нефлуоресцентная "черная" молекула-гаситель, способная гасить флуоресценцию в широком диапазоне длин волн или на конкретной длине волны. Примерами таких гасителей являются BHQ и DABCYL.

Для FRET-меток, адаптированных к СТО, термин "репортер" включает в себя донора FRET, а термин "гаситель" включает в себя другого партнера (акцептора) FRET. Например, в качестве репортера используют краситель на основе флуоресцеина, а в качестве гасителя краситель на основе родамина.

Данные метки могут быть присоединены к СТО или РТО традиционными методами. Предпочтительно, метка присоединена к СТО или РТО через спейсер, содержащий атомы углерода (например, 3-х углеродный спейсер, 6-ти углеродный спейсер или 12-ти углеродный спейсер.

(1-2) Одиночная метка

Настоящее изобретение также превосходно осуществляется с использованием систем с одиночной меткой для получения сигналов, указывающих на присутствие нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно предпочтительному воплощению фрагмент или СТО содержит одиночную метку, и плавление удлиненного дуплекса на стадии (е) индуцирует изменение сигнала от этой одиночной метки с получением сигнала от мишени на стадии (е).

Первое воплощение (система с одиночной меткой), приведенное на Фиг. 3

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 3. Матричный участок СТО содержит одиночную флуоресцентную метку. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается, высвобождая фрагмент. Этот фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО и удлиняется с образованием удлиненного дуплекса. В результате образования удлиненного дуплекса интенсивность флуоресценции от одиночной флуоресцентной метки увеличивается. Если на стадии (е) удлиненный дуплекс подвергают плавлению, то интенсивность флуоресценции от одиночной флуоресцентной метки уменьшается, так что доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Согласно предпочтительному воплощению одиночная метка может быть расположена в любом месте СТО, при условии, что уровень сигнала от одиночной метки изменяется в зависимости от плавления удлиненного дуплекса.

Согласно предпочтительному воплощению одиночная метка соединена с матричным участком или с захватывающим участком СТО.

Если матричный участок СТО помечен одиночной меткой, как показано на Фиг. 3, то индукции изменения сигнала от метки на гибриде, образованном нерасщепленным РТО и СТО, не происходит. Ввиду этого гибрид не дает сигнала, не относящегося к мишени.

Если захватывающий участок СТО помечен одиночной меткой, то гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени, на стадии плавления. В этом случае разница в величинах Т_пл для удлиненного дуплекса и гибрида позволяет отличить относящийся к мишени сигнал от удлиненного дуплекса от не относящегося к мишени сигнала от гибрида.

Второе воплощение (система с одиночной меткой), приведенное на Фиг. 7

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 7. 5'-Концевой тегирующий участок РТО содержит одиночную флуоресцентную метку. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается, высвобождая фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок с одиночной флуоресцентной меткой. В результате гибридизации интенсивность сигнала от одиночной флуоресцентной метки на 5'-концевом тегирующем участке увеличивается. Если на стадии (е) удлиненный дуплекс подвергают плавлению, то интенсивность сигнала от одиночной флуоресцентной метки уменьшается, так что доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Согласно предпочтительному воплощению одиночная метка может быть расположена в любом месте фрагмента РТО, при условии, что уровень сигнала от одиночной метки изменяется в зависимости от плавления удлиненного дуплекса.

Как представлено на Фиг. 7, гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени, на стадии плавления. В этом случае разница в величинах Т_пл для удлиненного дуплекса и гибрида позволяет отличить относящийся к мишени сигнал от удлиненного дуплекса от не относящегося к мишени сигнала от гибрида.

Использование в данном изобретении одиночной метки должно обеспечить получение разных сигналов в зависимости от ее присутствия на двухцепочечной или одноцепочечной структуре. Одиночная метка представляет собой флуоресцентную метку, люминесцентную метку, хемилюминесцентную метку, электрохимическую метку и металлическую метку. Предпочтительно, чтобы одиночная метка представляла собой флуоресцентную метку.

Типы и предпочтительные сайты связывания одиночных флуоресцентных меток, используемых в данном изобретении, описаны в патентах США №№7537886 и 7348141, идеи которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Предпочтительно, чтобы одиночная флуоресцентная метка представляла собой JOE, FAM, TAMRA, ROX и другую метку на основе флуоресцеина. Меченый нуклеотидный остаток предпочтительно расположен в позиции внутреннего нуклеотидного остатка в пределах олигонуклеотида, а не на 5-конце или 3'-конце.

Одиночная метка, используемая в настоящем изобретении, может быть описана со ссылкой на указанные выше описания для репортерной молекулы и молекулы-гасителя.

В частности, если настоящее изобретение осуществляют на твердой фазе с применением одиночной метки, то можно использовать обычную флуоресцентную метку, и не требуется специальной флуоресцентной метки, способной обеспечить получение флуоресцентного сигнала с различными интенсивностями в зависимости от ее присутствия на двухцепочечной или одноцепочечной структуре.

Сигнал от мишени, создаваемый на твердой подложке, измеряют. Такое воплощение системы с одиночной меткой вместе с иммобилизованным СТО проиллюстрировано на Фиг. 12.

В том случае, когда применяют СТО, иммобилизованный на твердой подложке, можно использовать химические метки (например, биотин) или ферментативные метки (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-галактозидазу и β-глюкозидазу).

В системах с меткой, использующих "метку, соединенную с фрагментом и/или СТО", эти метки могут быть расположены таким образом, что если получается гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, то этот гибрид на стадии (е) не дает сигнала, не относящегося к мишени. Альтернативно, метки могут быть расположены таким образом, что если получается гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, то этот гибрид на стадии (е) дает сигнал, не относящийся к мишени; при этом величина Т_пл для удлиненного дуплекса больше таковой для гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО.

В частности, если метки расположены таким образом, что гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, не дает сигнала, не относящегося к мишени, то для выбора величины Т_пл удлиненного дуплекса с целью детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени можно использовать диапазон, включающий в себя величину Т_пл для гибрида.

(2) Метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс

В настоящем изобретении можно применять метку, встраиваемую в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, для получения сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса.

Несмотря на то что фрагмент РТО или СТО не содержит никакой метки, успешно используется метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, что дает возможность сделать удлиненный дуплекс меченным. На Фиг. 10 и 11 проиллюстрировано воплощение, в котором нуклеотид с одиночной меткой встраивается в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения (см. С и D на Фиг. 10 и 11). Это воплощение также применимо к другим воплощениям с использованием анализа плавления.

Согласно предпочтительному воплощению получение сигнала от мишени обеспечивается посредством одиночной метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения; причем встраиваемая одиночная метка соединена с нуклеотидом, встраиваемым во время реакции удлинения; при этом плавление удлиненного дуплекса на стадии (е) индуцирует изменение сигнала от одиночной метки с получением сигнала от мишени на стадии (е).

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 10. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается, высвобождая фрагмент. Этот фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, иммобилизованного на твердой подложке, и удлиняется в присутствии нуклеотидов, меченных одиночной флуоресцентной меткой, с образованием удлиненного дуплекса. Флуоресцентный сигнал от удлиненного дуплекса можно детектировать в пятне на твердой подложке с иммобилизованным СТО. Когда удлиненный дуплекс подвергают плавлению, цепь, содержащая флуоресцентную метку, высвобождается, и флуоресцентный сигнал в этом пятне более не детектируется (на Фиг. 10 не показано). Таким образом, изменение сигнала в пятне может быть получено посредством плавления удлиненного дуплекса. При этом доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Сигнал от мишени, доставляемый на стадии (е), представляет собой кривую плавления, картину плавления или величину Т_пл, полученную путем измерения изменения сигнала флуоресценции в пятне с иммобилизованным СТО.

Согласно предпочтительному воплощению нуклеотид, встраиваемый во время реакции удлинения, представляет собой ddNTP.

Согласно предпочтительному воплощению нуклеотид, встраиваемый во время реакции удлинения, содержит первое неприродное основание, а СТО содержит нуклеотид, содержащий второе неприродное основание с аффинностью специфического связывания (specific binding affinity) с первым неприродным основанием, как показано на Фиг. 11. Нуклеотид, содержащий второе неприродное основание, предпочтительно расположен в любом сайте на матричном участке СТО.

Используемый в данном описании термин "неприродное основание" относится к производным природных оснований, таких как аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U), которые способны к образованию связанных водородными связями пар оснований. Используемый в данном описании термин "неприродное основание" включает в себя основания, характеризующиеся другими картинами образования пар оснований по сравнению с природными основаниями как исходными соединениями (mother compounds), как описано, например, в патентах США №№5432272, 5965364, 6001983 и 6037120. Образование пар оснований между неприродными основаниями заключается в образовании двух или трех водородных связей, как и у природных оснований. Образование пар оснований между неприродными основаниями также происходит с учетом специфичности.

Конкретные примеры неприродных оснований включают следующие основания в комбинациях пар оснований изо-С/изо-G, изо-dC/изо-dG, K/X, H/J и M/N (см. патент США №7422850).

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 11. Фрагмент гибридизуется с СТО, содержащим нуклеотид, имеющий второе неприродное основание (например, изо-dC) с аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием (например, изо-dG). Удлинение осуществляют в присутствии нуклеотида, содержащего первое неприродное основание, меченное одиночной флуоресцентной меткой, с образованием удлиненного дуплекса. В реакции удлинения нуклеотид, содержащий первое неприродное основание, встраивается в сайт, расположенный напротив нуклеотида, содержащего второе неприродное основание.

Флуоресцентный сигнал от удлиненного дуплекса можно детектировать в пятне на твердой подложке с иммобилизованным СТО. Когда удлиненный дуплекс подвергают плавлению, цепь, содержащая флуоресцентную метку, высвобождается, и флуоресцентный сигнал в этом пятне более не детектируется (на Фиг. 11 не показано). Таким образом, изменение сигнала в пятне может быть получено посредством плавления удлиненного дуплекса. При этом доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Если применяется метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, то эта метка не встраивается в гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, поскольку гибрид не удлиняется. Таким образом, данный гибрид не дает сигнала, не относящегося к мишени.

Типы и характеристики используемых одиночных меток могут быть описаны со ссылкой на описания для системы меток, в которой используется "метка, соединенная с фрагментом и/или СТО", как указано выше.

(3) Метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс, и метка, соединенная с фрагментом или СТО

В настоящем изобретении можно применять систему меток, в которой используется совместное действие метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, как показано на Фиг. 4 и 5.

Согласно предпочтительному воплощению получение сигнала от мишени обеспечивается посредством метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, и такая встраиваемая метка соединена с нуклеотидом, встраиваемым во время реакции удлинения; причем эти две метки представляют собой систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом плавление удлиненного дуплекса на стадии (е) индуцирует изменение сигнала от этой системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени на стадии (е).

Более предпочтительно, чтобы нуклеотид, встраиваемый во время реакции удлинения, содержал первое неприродное основание, а СТО содержал нуклеотид, содержащий второе неприродное основание с аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием.

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 4. Фрагмент гибридизуется с СТО, содержащим репортерную молекулу или молекулу-гаситель и нуклеотид, имеющий второе неприродное основание (например, изо-dC) с аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием (например, изо-dG). Удлинение осуществляют в присутствии нуклеотида, содержащего первое неприродное основание, меченное молекулой-гасителем или репортерной молекулой, с образованием удлиненного дуплекса, в котором сигнал от репортерной молекулы гасится молекулой-гасителем. В реакции удлинения нуклеотид, содержащий первое неприродное основание, встраивается в сайт, расположенный напротив нуклеотида, содержащего второе неприродное основание.

Если на стадии (е) удлиненный дуплекс подвергают плавлению, то репортерная молекула и молекула-гаситель разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, так что доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Предпочтительно, чтобы сигнал от мишени, доставляемый на стадии (е), представлял собой кривую плавления, картину плавления или величину Т_пл, полученную путем измерения изменения сигнала от системы двух взаимодействующих меток.

Местоположение метки на СТО и сайта встраивания встраиваемой метки определяется в той мере, в какой эти две метки действуют как система двух взаимодействующих меток для индукции изменения сигнала на стадии плавления.

Еще более предпочтительно, чтобы матричный участок СТО содержал репортерную молекулу или молекулу-гаситель и нуклеотид, имеющий второе неприродное основание. Реакцию удлинения на стадии (d) проводят в присутствии нуклеотида, содержащего молекулу-гаситель или репортерную молекулу и первое неприродное основание с аффинностью специфического связывания со вторым неприродным основание в СТО. Эти два неприродных основания в удлиненном дуплексе на стадии (d) образуют пару оснований, вызывая гашение сигнала от репортерной молекулы посредством молекулы-гасителя, и индуцируя изменение сигнала, в силу чего обеспечивается получение сигнала от мишени. Альтернативно, фрагмент содержит репортерную молекулу или молекулу-гаситель, а матричный участок СТО содержит нуклеотид, имеющий второе неприродное основание. Реакцию удлинения на стадии (d) проводят в присутствии нуклеотида, содержащего молекулу-гаситель или репортерную молекулу и первое неприродное основание с аффинностью специфического связывания со вторым неприродным основанием в СТО. Эти два неприродных основания в удлиненном дуплексе на стадии (d) образуют пару оснований, индуцируя изменение сигнала от репортерной молекулы посредством гашения, в силу чего обеспечивается получение сигнала от мишени.

Другое поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 5. В этом воплощении фрагмент, содержащий репортерную молекулу или молекулу-гаситель, гибридизуется с СТО, содержащим нуклеотид, имеющий второе неприродное основание (например, изо-dC) с аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием (например, изо-dG). Удлинение осуществляют в присутствии нуклеотида, содержащего первое неприродное основание, меченное молекулой-гасителем или репортерной молекулой, с образованием удлиненного дуплекса, в котором сигнал от репортерной молекулы гасится молекулой-гасителем. В реакции удлинения нуклеотид, содержащий первое неприродное основание, встраивается в сайт, расположенный напротив нуклеотида, содержащего второе неприродное основание.

Если на стадии (d) образуется удлиненный дуплекс, то репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы; при этом если на стадии (е) этот удлиненный дуплекс подвергают плавлению, то репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, так что доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Предпочтительно, чтобы сигнал от мишени, доставляемый на стадии (е), представлял собой кривую плавления, картину плавления или величину Т_пл, полученную путем измерения изменения сигнала от системы двух взаимодействующих меток.

Местоположение метки на РТО и сайта встраивания встраиваемой метки определяется в той мере, в какой эти две метки действуют как система двух взаимодействующих меток для индукции изменения сигнала на стадии плавления.

Если применяется метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, то эта метка не встраивается в гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, поскольку гибрид не удлиняется. Таким образом, данный гибрид не дает сигнала, не относящегося к мишени, на стадии плавления.

(4) Интеркалирующая метка

В настоящем изобретении можно применять интеркалирующую метку для получения сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса. Интеркалирующая метка более полезна в реакции на твердой фазе с использованием иммобилизованных СТО, ввиду того, что генерировать сигналы могут двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, присутствующие в образцах.

Примеры интеркалирующих красителей, полезных в данном изобретении, включают SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™43, SYTO™44, SYTO™45, SYTOX™Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PRO™1, TO-PRO™1, SYTO™11, SYTO™13, SYTO™15, SYTO™16, SYTO™20, SYTO™23, TOTO™-3, YOYO™3, GelStar™ и триазоловый оранжевый. Эти интеркалирующие красители специфически интеркалируют в двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, генерируя сигналы.

На Фиг. 13 проиллюстрировано воплощение, в котором интеркалирующие красители интеркалируют между парами оснований удлиненного дуплекса (С и D на Фиг. 13). Данное воплощение также применимо к другому воплощению с использованием анализа плавления.

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 13. Фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, иммобилизованного на твердой подложке. Удлинение осуществляют в присутствии интеркалирующего красителя (например, SYBR™ Green) и получают удлиненный дуплекс с интеркалирующими красителями. Флуоресцентный сигнал от удлиненного дуплекса в пятне на твердой подложке с иммобилизованным СТО можно детектировать с использованием интеркалирующих флуоресцентных красителей. Когда удлиненный дуплекс подвергают плавлению, интеркалирующие флуоресцентные красители высвобождаются, и флуоресцентный сигнал в этом пятне более не детектируется (на Фиг. 13 не показано). При этом доставляется сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса на стадии (е).

Гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени, на стадии плавления. В этом случае разница в величинах Т_пл для удлиненного дуплекса и гибрида позволяет отличить относящийся к мишени сигнал от удлиненного дуплекса от не относящегося к мишени сигнала от гибрида (на Фиг. 13 не показано).

Предпочтительно, чтобы сигнал от мишени, доставляемый на стадии (е), представлял собой кривую плавления, картину плавления или величину Т_пл, полученную путем измерения изменения сигнала флуоресценции, генерированного на стадии (d).

Стадия (f). Детекция сигнала от мишени

Окончательно, детекцию удлиненного дуплекса осуществляют путем измерения сигнала от мишени, доставляемого на стадии (е); тем самым присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Детекция может быть осуществлена различными способами в зависимости от типов сигнала от мишени.

Согласно предпочтительному воплощению детекцию сигнала от мишени осуществляют с использованием анализа плавления.

Используемый в данном описании термин "анализ плавления" означает метод, с использованием которого сигнал от мишени, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса, получают в результате плавления удлиненного дуплекса, включая метод измерения сигналов при двух различных температурах, анализ кривой плавления, анализ картины плавления и анализ пиков плавления. Предпочтительно, анализ плавления представляет собой анализ кривой плавления.

Согласно предпочтительному воплощению детекцию присутствия удлиненной цепи на стадии (е) осуществляют с использованием анализа плавления, в котором удлиненный дуплекс подвергают плавлению в диапазоне температур с получением сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса.

Альтернативно, детекцию присутствия удлиненной цепи на стадии (е) осуществляют с использованием анализа гибридизации. Предпочтительно, детекцию присутствия удлиненной цепи на стадии (е) осуществляют с использованием анализа гибридизации, в котором удлиненный дуплекс подвергают плавлению, и полученный продукт гибридизуется в диапазоне температур с получением сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса.

Согласно предпочтительному воплощению за плавлением, осуществляемым на стадии (е), следует гибридизация с получением сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса. В этом случае детекцию удлиненного дуплекса осуществляют с использованием анализа кривой гибридизации.

Кривая плавления или кривая гибридизации может быть получена с использованием традиционных технологий, например, как описано в патентах США №№6174670 и 5789167, Drobyshev et al., Gene 188: 45 (1997); Kochinsky и Mirzabekov, Human Mutation, 19: 343 (2002); Livehits et al., J. Biomol. Structure Dynam., 11: 783 (1994) и Howell et al., Nature Biotechnology, 17: 87 (1999). Например, кривая плавления или кривая гибридизации может представлять собой графическое изображение или отображение изменения выходного сигнала в зависимости от изменения такого параметра, как жесткость условий гибридизации. Можно построить график зависимости выходного сигнала непосредственно от параметра гибридизации. В типичном случае кривая плавления или кривая гибридизации будут характеризоваться выходным сигналом, например флуоресценцией, который указывает на относительное количество дуплексной структуры (то есть на степень гибридизации), отложенным по оси Y, и параметром гибридизации, отложенным по оси X.

Из графика зависимости первой производной сигнала флуоресценции от температуры, т.е. графика зависимости скорости изменения сигнала флуоресценции от температуры (dF/dT от Т) или (-dF/dT от Т) получают пик плавления.

РТО и СТО могут содержать природные dNMP Альтернативно, РТО и СТО могут содержать модифицированный нуклеотид или неприродный нуклеотид, как например, PNA (пептидо-нуклеиновая кислота, см. публикацию РСТ № WO 92/20702) и LNA ("закрытая" нуклеиновая кислота, см. публикации РСТ №№ WO 98/22489, WO 98/39352 и WO 99/14226). РТО и СТО могут содержать универсальные основания, такие как дезоксиинозин, инозин, 1-(2'-дезокси-бета-D-рибофуранозил)-3-нитропиррол и 5-нитроиндол. Термин "универсальное основание" относится к основанию, способному образовывать пары оснований с каждым из природных оснований ДНК/РНК с небольшим отличием между ними.

Как описано выше, РТО может расщепляться в сайте, локализованном в 3'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО. Этот сайт расщепления может быть расположен в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка РТО. В том случае, когда фрагмент РТО содержит 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка РТО, сайт СТО, гибридизуемый с 5'-концевой частью 3'-концевого узнающего мишень участка, может содержать универсальное основание, вырожденную последовательность или их комбинацию. Например, если РТО расщепляется в сайте, локализованном на расстоянии одного нуклеотида в 3'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО, то выгодно, чтобы 5'-концевая часть захватывающего участка СТО содержала универсальное основание для гибридизации с данным нуклеотидом. Если РТО расщепляется в сайте, локализованном на расстоянии двух нуклеотидов в 3'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО, то выгодно, чтобы 5-конец захватывающего участка СТО содержал вырожденную последовательность, а его смежный в 3'-направлении нуклеотид содержал универсальное основание. Соответственно, в том случае, когда расщепление РТО происходит в различных сайтах 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, использование универсальных оснований и вырожденных последовательностей в СТО является полезным. Помимо этого, когда для скрининга множественных нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней в условиях индукции расщепления, зависящего от удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера, используют РТО, содержащие один и тот же 5'-концевой тегирующий участок, могут быть созданы фрагменты РТО, содержащие различные 5'-концевые части 3'-концевого узнающего мишень участка. В таких случаях полезно использование в СТО универсальных оснований и вырожденных последовательностей. Стратегии с использованием универсальных оснований и вырожденных последовательностей в СТО позволяют применять один тип или минимальное количество типов СТО для скрининга множественных нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно предпочтительному воплощению способ дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (а)-(е) с денатурацией между повторяющимися циклами.

Согласно предпочтительному воплощению способ дополнительно включает повторение стадий (a)-(b), (a)-(d) или (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами, более предпочтительно с использованием располагающегося "вниз по течению" праймера. Это повторение позволяет амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень и/или сигнал от мишени.

Денатурация может быть осуществлена с использованием традиционных методов, включая, но не ограничиваясь этим, нагревание, обработку щелочью, формамидом, мочевиной и глиоксалем, ферментативные методы (например, действие геликазы) и связывание белков. Например, плавления можно достичь посредством нагревания при температуре, изменяющейся в диапазоне от 80°С до 105°С. Общие методы осуществления такой обработки приведены в Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).

Согласно предпочтительному воплощению настоящее изобретение может быть осуществлено путем проведения серии анализов плавления для качественной или количественной детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Более предпочтительно, настоящее изобретение включает (1) повторение стадий (a)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами с образованием удлиненного дуплекса, (2) проведение анализа плавления и (3) повторение стадий (1) и (2) по меньшей мере дважды. При использовании такого подхода анализ плавления повторно осуществляют по меньшей мере дважды через определенный интервал времени.

Согласно предпочтительному воплощению число повторов стадий (a)-(d) возможно можно регулировать. При проведении серии анализов плавления число повторов стадий (a)-(d) для одного акта анализа плавления может быть одинаковым или может отличаться от числа повторов стадий (a)-(d) для другого акта анализа плавления.

Специалисту в данной области будет понятно, что повторение стадий (a)-(d) представляет собой иллюстративный пример образования удлиненного дуплекса. Например, настоящее изобретение можно осуществить путем повторения стадий (a)-(b) и проведения стадий (с) и (d) с образованием удлиненного дуплекса, после чего провести анализ плавления.

Согласно предпочтительному воплощению стадии (a)-(f) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах. Например, стадии (а)-(b), (c)-(d) или (e)-(f) могут быть осуществлены в отдельных реакционных сосудах.

Согласно предпочтительному воплощению стадии (а)-(b) и (c)-(f) могут быть проведены одновременно или по отдельности даже в одном реакционном сосуде в зависимости от реакционных условий (в частности, температуры).

Согласно предпочтительному воплощению проведение в настоящем изобретении по меньшей мере двух анализов плавления позволяет осуществить количественную детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Площадь под пиком плавления и высота пика плавления, полученные в анализе плавления, зависят от количества удлиненного дуплекса, предоставляя информацию относительно исходного количества нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Согласно предпочтительному воплощению настоящее изобретение включает (1) увеличение числа удлиненных дуплексов путем повторения стадий (a)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами, (2) проведение анализа плавления и (3) повторение стадий (1) и (2) по меньшей мере дважды. Количество нуклеиновокислотной последовательности-мишени можно измерить путем определения числа циклов в анализах плавления, при котором достигается предварительно заданная пороговая величина для площадей и/или высот полученных пиков плавления.

Альтернативно, количественное определение нуклеиновокислотной последовательности-мишени может быть осуществлено посредством построения графика зависимости данных анализа плавления (например, площади или высоты пиков) от числа повторения циклов, проводимых для увеличения количества удлиненного дуплекса.

В настоящем изобретении не требуется, чтобы нуклеиновокислотные последовательности-мишени, подлежащие детекции и/или амплификации, имели какую-либо определенную последовательность или длину, включая любые молекулы ДНК (гДНК и кДНК) и РНК.

Если в качестве исходного материала используют мРНК, перед проведением стадии отжига необходима стадия обратной транскрипции, детали которой можно найти в Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); и Noonan, K.F. et al., Nucleic Acids Res., 16: 10366 (1988)). Для обратной транскрипции в качестве праймера можно использовать случайный гексамер или олигонуклеотид dT, способный гибридизоваться с мРНК.

Нуклеиновокислотные последовательности-мишени, которые могут подлежать детекции и/или амплификации, включают любую прокариотическую, эукариотическую (например, из простейших и паразитов, грибов, дрожжей, высших растений, низших и высших животных, в том числе млекопитающих и человека), вирусную (например, из вируса герпеса, ВИЧ, вируса гриппа, вируса Эпштейна-Барр, вируса гепатита, полиовируса и т.д.) или вироидную нуклеиновую кислоту природного происхождения.

Нуклеиновокислотная последовательность-мишень, подлежащая детекции согласно настоящему изобретению включает большое разнообразие нуклеиновокислотных последовательностей, например, последовательности в геноме, искусственно выделенные или фрагментированные последовательности и синтезированные последовательности (например, последовательности кДНК и штрихкодовые последовательности). Например, нуклеиновокислотная последовательность-мишень включает маркерные последовательности для иммуно-ПЦР (иПЦР). В иПЦР применяют конъюгаты, образованные между нуклеиновокислотными маркерными последовательностями и антителами, в сочетании с ПЦР, что широко используется для детекции различных типов мишеней, включая белки (см. Sano et al., Science, 258, pp: 120-122 (1992), патент США №5665539, Niemeyer et al., Trends in Biotechnology, 23, pp: 208-216 (2005), публикацию заявки напатент США №2005/0239108 и Ye et al., Journal of Environmental Science, 22, pp: 796-800 (2010)).

Настоящее изобретение также применяется для детекции нуклеотидной вариации. Предпочтительно, чтобы нуклеиновокислотная последовательность-мишень содержала нуклеотидную вариацию. Термин "нуклеотидная вариация", используемый в данном описании, относится к любым одиночным или множественным нуклеотидным заменам, делециям или вставкам в последовательности ДНК в конкретном положении среди непрерывных сегментов ДНК, которые в других случаях являются одинаковыми в последовательности. Такие непрерывные сегменты ДНК включают ген или любую другую часть хромосомы. Такие нуклеотидные вариации могут быть результатом мутации или представлять собой вариации полиморфных аллелей. Например, нуклеотидная вариация, детектируемая в настоящем изобретении, включает SNP (однонуклеотидный полиморфизм), мутацию, делецию, вставку, замену и транслокацию. Примером нуклеотидной вариации являются многочисленные вариации в геноме человека (например, вариации в гене MTHFR (метилентетрагидрофолат-редуктазы)), вариации, вовлеченные в возникновение лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов, и приводящие к онкогенезу вариации. Термин "нуклеотидная вариация", используемый в данном описании, включает в себя любую вариацию в конкретном положении в нуклеиновокислотной последовательности. Другими словами, термин "нуклеотидная вариация" включает в себя дикий тип и любой его мутантный тип в конкретном положении в нуклеиновокислотной последовательности.

В настоящем изобретении для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в том случае, когда используемые праймеры или зонды имеют последовательность, комплементарную этой нуклеотидной вариации в данной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержащая такую нуклеотидную вариацию, описывается в данном изобретении как сопоставимая матрица (matching или match template). В том случае, когда используемые праймеры или зонды имеют последовательность, некомплементарную этой нуклеотидной вариации в данной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержащая такую нуклеотидную вариацию, описывается в данном изобретении как несопоставимая матрица (mismatching или mismatch template).

Для детекции нуклеотидных вариаций 3'-конец располагающегося "вверх по течению" праймера можно сконструировать таким образом, чтобы он располагался напротив сайта нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Согласно предпочтительному воплощению 3'-конец располагающегося "вверх по течению" праймера имеет последовательность, комплементарную данной нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. 3'-Конец располагающегося "вверх по течению" праймера, имеющего последовательность, комплементарную данной нуклеотидной вариации в этой нуклеиновокислотной последовательности-мишени, отжигают с сопоставимой матрицей и удлиняют, чтобы индуцировать расщепление РТО. Полученный фрагмент РТО гибридизуется с СТО с получением сигнала от мишени. В отличие от этого, когда 3'-конец располагающегося "вверх по течению" праймера не соответствует нуклеотидной вариации в несопоставимой матрице, он не удлиняется в условиях, необходимых для отжига 3'-конца праймеров и являющихся существенными для удлинения, даже когда располагающийся "вверх по течению" праймер гибридизуется с несопоставимой матрицей, ввиду этого никакого сигнала от мишени не генерируется.

Альтернативно, можно использовать расщепление РТО в зависимости от гибридизации РТО, имеющего последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Например, в регулируемых условиях РТО, имеющий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновокислотной последовательности-мишени, гибридизуется с сопоставимой матрицей и затем расщепляется. Полученный фрагмент РТО гибридизуется с СТО с получением сигнала от мишени. Вместе с тем в данных регулируемых условиях РТО не гибридизуется с несопоставимой матрицей, имеющей последовательность, некомплементарную последовательности в месте расположения нуклеотидной вариации, и не расщепляется. В этом случае предпочтительно, чтобы последовательность в РТО, комплементарная последовательности с нуклеотидной вариацией, была расположена в середине 3'-концевого узнающего мишень участка РТО.

Согласно одному из воплощений применение искусственного некомплементарного нуклеотида усиливает способность РТО к распознаванию нуклеотидных вариаций.

Альтернативно, предпочтительно, чтобы 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в РТО была ориентирована по отношению к нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени для детекции этой нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в РТО имела последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Для улучшения эффективности детекции нуклеотидных вариаций настоящее изобретение может быть осуществлено с применением метода "ПЦР-клэмпинга". Репрезентативный пример метода "ПЦР-клэмпинга" с использованием PNA изложен в Henrik et al., Nucleic Acid Research, 21: 5332-5336 (1993) и Luo et al., Nucleic Acid Research, Vol.34, №2, e12 (2006). Например, технология "ПЦР-клэмпинга" с использованием PNA позволяет амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность, имеющую нуклеотидную вариацию мутантного типа, но не амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность, имеющую нуклеотидную вариацию дикого типа, после чего провести РТОСЕ-анализ, обеспечивая более эффективную детекцию нуклеотидных вариаций. В частности, поскольку технология "ПЦР-клэмпинга" позволяет амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность, имеющую нуклеотидную вариацию только конкретного типа, ее сочетание со способом по настоящему изобретению позволит осуществлять детекцию редких вариантов более эффективным образом.

Когда зонд, имеющий на своем 5'-концевом участке сайт распознавания нуклеотидной вариации, гибридизуется с несопоставимой матрицей, его 5'-концевой участок в определенных условиях может образовывать одиночную цепь. Данный зонд может соответствовать РТО. Сигнал может быть получен в РТОСЕ-анализе по настоящему изобретению. Этот подход может быть полезен для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания нуклеотидной вариации в зондах.

Согласно предпочтительному воплощению используемая в настоящем изобретении нуклеиновокислотная последовательность-мишень представляет собой предварительно амплифицированную нуклеиновокислотную последовательность. Использование предварительно амплифицированной нуклеиновокислотной последовательности дает возможность значительно повысить чувствительность и специфичность детекции мишени по настоящему изобретению.

Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.

Преимущества настоящего изобретения могут быть особо отмечены при одновременной (множественной) детекции по меньшей мере двух нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют с целью детекции по меньшей мере двух типов (более предпочтительно по меньшей мере трех типов, еще более предпочтительно по меньшей мере пяти типов) нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют с целью детекции по меньшей мере двух типов (более предпочтительно по меньшей мере трех типов, еще более предпочтительно по меньшей мере пяти типов) нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней; причем располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид включает по меньшей мере два типа (более предпочтительно по меньшей мере три типа, еще более предпочтительно по меньшей мере пять типов) олигонуклеотидов, РТО включает по меньшей мере два типа (более предпочтительно по меньшей мере три типа, еще более предпочтительно по меньшей мере пять типов) РТО, а СТО включает по меньшей мере один тип (предпочтительно, по меньшей мере два типа, более предпочтительно по меньшей мере три типа, еще более предпочтительно по меньшей мере пять типов) СТО; при этом, когда присутствуют по меньшей мере два типа нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, данный способ обеспечивает получение по меньшей мере двух типов сигналов от мишеней, соответствующих по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

5'-Концевые тегирующие участки по меньшей мере двух РТО могут иметь идентичную друг другу последовательность. Например, если настоящее изобретение осуществляют для скрининга нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, то 5'-концевые тегирующие участки РТО могут иметь идентичную последовательность.

Кроме того, один тип СТО можно использовать для детекции множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Например, когда для скрининга нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней применяют РТО, содержащие идентичную последовательность в своих 5'-концевых тегирующих участках, можно использовать один тип СТО.

Согласно предпочтительному воплощению удлиненные дуплексы, соответствующие по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, имеют отличающиеся друг от друга величины Т_пл.

Согласно предпочтительному воплощению по меньшей мере два типа сигналов от мишеней, соответствующие по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, создаются посредством отличающихся друг от друга типов меток.

Согласно предпочтительному воплощению по меньшей мере два типа сигналов от мишеней, соответствующие по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, создаются посредством меток одного и того же типа.

Согласно предпочтительному воплощению по меньшей мере два типа сигналов от мишеней, соответствующие по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, создаются посредством меток одного и того же типа; при этом удлиненные дуплексы, соответствующие по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, имеют отличающиеся друг от друга величины Т_пл.

Используемый в данном описании термин "различные типы меток" относится к меткам с различными характеристиками детектируемых сигналов. Например, FAM и TAMRA как флуоресцентные репортерные метки, рассматриваются как различные типы меток, поскольку длины волн возбуждения и эмиссии для них отличаются друг от друга.

Когда настоящее изобретение осуществляют с целью одновременной детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с использованием анализа кривой плавления и удлиненные дуплексы, соответствующие по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, имеют отличающиеся друг от друга величины Т_пл, можно осуществить детекцию по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с применением метки даже одного типа (например, FAM).

Детекция мишени с использованием СТО, иммобилизованного на твердой фазе

Значительное преимущество настоящего изобретения заключается в эффективной детекции нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней даже на твердой фазе, такой как микрочип.

Согласно предпочтительному воплощению настоящее изобретение осуществляют на твердой фазе, и СТО иммобилизуют на твердой подложке через его 5'-конец или 3'-конец. В случае использования твердой фазы проводят измерение сигнала, создаваемого на твердой подложке.

Когда применяют иммобилизованный СТО, анализ плавления, в котором используются описанные выше системы меток, применим к реакции на твердой фазе по настоящему изобретению.

Согласно предпочтительному воплощению получение сигнала от мишени обеспечивается посредством одиночной метки, соединенной с фрагментом, или посредством одиночной метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения. В частности, если настоящее изобретение осуществляют на твердой фазе с применением одиночной метки, то можно использовать обычную флуоресцентную метку, и не требуется специальной флуоресцентной метки, способной обеспечить флуоресцентные сигналы с различными интенсивностями в зависимости от ее присутствия на двухцепочечной или одноцепочечной структуре.

В том случае, когда применяют СТО, иммобилизованный на твердой подложке, можно использовать химические метки (например, биотин) или ферментативные метки (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-галактозидазу и β-глюкозидазу).

Для проведения реакции на твердой фазе СТО иммобилизуют непосредственно или опосредованно (предпочтительно опосредованно) через его 5'-конец или 3'-конец (предпочтительно 3'-конец) на поверхности твердой подложки. Кроме того, иммобилизацию СТО на поверхности твердой подложки можно проводить ковалентным или нековалентным образом. В тех случаях, когда иммобилизованные СТО представляют собой СТО, иммобилизованные на поверхности твердой подложки опосредованно, используют подходящие линкеры. Линкеры, полезные в данном изобретении, могут включать любые линкеры, используемые для иммобилизации зондов на поверхности твердой подложки. Например, алкильные или арильные соединения с аминной функциональной группой либо алкильные или арильные соединения с тиоловой функциональной группой служат в качестве линкеров для иммобилизации СТО. Помимо этого, в качестве линкеров может служить поли(Т)-хвост или поли(А)-хвост.

Согласно предпочтительному воплощению твердая подложка, используемая в настоящем изобретении, представляет собой микрочип. Микрочип, обеспечивающий соблюдение условий реакции в данном изобретении, может включать любой из микрочипов, которые известны специалисту в данной области. Все процессы в настоящем изобретении, то есть гибридизацию с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями, расщепление, удлинение, плавление и детекцию флуоресценции осуществляют на микрочипе. Иммобилизованные на микрочипе СТО служат в качестве гибридизуемых элементов чипа. Твердая подложка для изготовления микрочипа включает металлы (например, золото, сплав золота и меди, алюминий), оксид металла, стекло, керамику, кварц, кремний, полупроводник, пластинку из Si/SiO₂, германий, арсенид галия, углерод, углеродную нанотрубку, полимеры (например, полистирол, полиэтилен, полипропилен и полиакриламид), сефарозу, агарозу и коллоиды, но этим не ограничивается. Большинство используемых в данном изобретении иммобилизованных СТО может быть иммобилизовано на доступном участке или двух или более доступных участках на твердой подложке, которая может содержать 2-1000000 доступных участков. Чтобы получить микрочип или микрочипы для заданного применения, иммобилизованные СТО могут быть изготовлены с использованием традиционных технологий изготовления, таких как фотолитография, технология струйной печати, механическое точечное нанесение пятен и их производные.

Согласно настоящему изобретению, осуществляемому на твердой фазе, можно проводить одновременную детекцию множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с использованием метки даже одного типа, поскольку метки на иммобилизованных СТО физически отделены друг от друга. В этом отношении, количество подлежащих детекции нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней по настоящему изобретению на твердой фазе является неограниченным.

В настоящем изобретении, в результате расщепления РТО, гибридизованного с нуклеиновой кислотой-мишенью, получают фрагмент РТО и его отжигают с СТО и удлиняют на СТО, что приводит к образованию удлиненной цепи.

Кроме того, для увеличения числа удлиненных цепей возможно получение дополнительных фрагментов, которые могут удлиняться на СТО, посредством применения дополнительной реакции 5'-нуклеазного расщепления с использованием дополнительного РТО, который содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную удлиненной цепи, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную удлиненной цепи, но комплементарную захватывающему участку СТО. Предпочтительно использовать дополнительный располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную удлиненной цепи, который локализован "вверх по течению" относительно этого дополнительного РТО, предназначенного для реакции 5'-нуклеазного расщепления.

Упомянутое выше предпочтительное воплощение имеет ту особенность, что образование дополнительных фрагментов зависит от образования удлиненной цепи.

Альтернативно, дополнительные фрагменты можно получить посредством использования дополнительного РТО, который содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную матричному участку СТО, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную матричному участку СТО, но комплементарную захватывающему участку СТО.

Согласно предпочтительному воплощению, дополнительные удлиненные дуплексы образуются в результате дополнительного получения удлиненных цепей, что способствует усилению сигнала от мишени на твердой подложке.

II. Предпочтительное воплощение с амплификацией нуклеиновокислотной последовательности-мишени

Настоящее изобретение предпочтительно осуществляют одновременно с амплификацией нуклеиновокислотной последовательности-мишени, используя пару праймеров, состоящую из располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, способных участвовать в синтезе данной нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с парой праймеров, содержащей располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, и РТО (зондирующим и метящим олигонуклеотидом); при этом каждый из праймеров, располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; РТО локализован между располагающимся "вверх по течению" праймером и располагающимся "вниз по течению" праймером; при этом РТО блокирован по его 3'-концу, чтобы не допустить его удлинения;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для удлинения праймеров и для расщепления РТО; при этом, когда РТО гибридизуется с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями, располагающийся "вверх по течению" праймер удлиняется, и удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется, и образуется удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной этого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО;

(e) плавление удлиненного дуплекса в диапазоне температур с получением сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса; при этом сигнал от мишени обеспечивается посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию удлиненного дуплекса путем измерения сигнала от мишени; тем самым присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Поскольку в предпочтительном воплощении настоящего изобретения применяются стадии способа по настоящему изобретению, описанного выше, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

Согласно предпочтительному воплощению способ дополнительно включает повторение стадий (a)-(b), (a)-(d) или (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами. Повторение реакций сопровождается амплификацией нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Амплификацию предпочтительно осуществляют в соответствии с ПЦР (полимеразной цепной реакцией), описанной в патентах США №№4683195, 4683202 и 4800159.

Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно предпочтительному воплощению по меньшей мере два типа сигналов от мишеней, соответствующие по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, создаются посредством меток одного и того же типа; при этом удлиненные дуплексы, соответствующие по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, имеют отличающиеся друг от друга величины Т_пл.

III. Способ детекции мишени с использованием РТОСЕ, включающий в себя детекцию при предварительно заданной температуре

Настоящее изобретение может быть модифицировано с целью использования сигнала от мишени, генерированного совместно с образованием удлиненного дуплекса.

Еще в одном аспекте данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РТО (зондирующим и метящим олигонуклеотидом); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется, и образуется удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной этого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки; и

(e) детекцию удлиненного дуплекса путем измерения сигнала от мишени при предварительно заданной температуре, при которой удлиненный дуплекс сохраняет свою двухцепочечную форму; тем самым присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Поскольку в предпочтительном воплощении настоящего изобретения применяются стадии описанного выше способа по настоящему изобретению за исключением стадии плавления, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

В настоящем изобретении, использующем описанный выше анализ плавления, необходима детекция сигналов от меток не менее чем при двух различных температурах, потому что сигнал от мишени получают в виде изменения сигнала, наблюдаемого при плавлении удлиненного дуплекса.

В этом аспекте данного изобретения маловероятно, что удлиненный дуплекс как таковой выдаст сигнал, с помощью которого можно отличить произошло или не произошло образование удлиненного дуплекса, и этот сигнал детектируют при предварительно заданной температуре, при которой удлиненный дуплекс сохраняет свою двухцепочечную форму; тем самым устанавливают присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Настоящее изобретение относится к измерению сигнала от мишени, связанного с образованием удлиненного дуплекса, для детекции присутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

В настоящем изобретении удлиненный дуплекс содержит метку, ввиду чего удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени.

Предпочтительно, сигнал от мишени представляет собой сигнал (генерирование сигнала или гашение сигнала) от метки на удлиненном дуплексе при предварительно заданной температуре.

Введение метки в настоящем изобретении может быть выполнено таким же образом, как и для описанного выше способа с использованием анализа плавления. Этот аспект настоящего изобретения с небольшим изменением в отношении детекции при предварительно заданной температуре может быть проиллюстрирован на Фиг. 2-13.

Рабочий принцип, лежащий в основе получения сигнала от мишени от удлиненного дуплекса, выглядит следующим образом:

(1) удлинение фрагмента индуцирует изменение сигнала от метки, что дает сигнал от мишени; или

(2) гибридизация фрагмента и СТО индуцирует изменение сигнала от метки, что дает сигнал от мишени, и удлиненный дуплекс сохраняет сигнал от мишени.

Поясненное примером воплощение рабочего принципа (1) можно описать со ссылкой на Фиг. 9. Если используют иммобилизованные СТО, то в настоящем изобретении детектируют множество нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней существенно более эффективным образом. Матричный участок иммобилизованного СТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель. Репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы. В том случае, когда этот фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, молекула-гаситель гасит сигнал от репортерной молекулы. В результате образования удлиненного дуплекса репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы. Сигнал от мишени доставляется на стадии удлинения (С и D на Фиг. 9).

Изображенный на Фиг. 9 гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, не образует удлиненного дуплекса. Ввиду этого, молекула-гаситель по-прежнему может гасить сигнал от репортерной молекулы. Этот гибрид не дает сигнала, не относящегося к мишени.

Поясненное примером воплощение рабочего принципа (2) можно описать со ссылкой на Фиг. 6. На данном рисунке проиллюстрирован аспект настоящего изобретения, а также способ с использованием анализа плавления. 5'-концевой тегирующий участок РТО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель. Репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается, высвобождая фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок с репортерной молекулой и молекулой-гасителем, и этот фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО. В результате гибридизации репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы. Сигнал от мишени доставляется на стадии гибридизации фрагмента, и удлиненный дуплекс сохраняет сигнал от мишени (С и D на Фиг. 6).

Изображенный на Фиг. 6 гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, дает сигнал, не относящийся к мишени (С и D на Фиг. 6), и необходимо провести диссоциацию этого гибрида, чтобы исключить сигнал, не относящийся к мишени. Ввиду этого температура для измерения сигнала от мишени определяется температурой, необходимой для диссоциации гибрида. Согласно предпочтительному воплощению далее эту температуру определяют с учетом величины Т_пл для гибрида.

Согласно предпочтительному воплощению детекцию удлиненного дуплекса можно осуществлять при температурах, при которых гибрид диссоциирован частично.

Предварительно заданная температура превышает величину Т_пл для гибрида минус 10°С, предпочтительно превышает величину Т_пл для гибрида минус 5°С, более предпочтительно превышает величину Т_пл для гибрида и еще более предпочтительно превышает величину Т_пл для гибрида плюс 5°С.

Согласно предпочтительному воплощению сигнал от мишени, обеспечиваемый удлиненным дуплексом, доставляется во время стадии удлинения (d); при этом гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, не дает сигнала, не относящегося к мишени, как представлено на Фиг. 2-4 и 9-11.

Согласно предпочтительному воплощению сигнал от мишени обеспечиваемый удлиненным дуплексом, доставляется в результате гибридизации фрагмента и СТО на стадии (с), и образование удлиненного дуплекса сохраняет сигнал от мишени на стадии (d); при этом гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, дает сигнал, не относящийся к мишени; при этом предварительно заданная температура превышает величину Т_пл для гибрида, как представлено на Фиг. 5-8 и 12-13.

Когда гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, дает сигнал, не относящийся к мишени (панель D на Фиг. 6), необходимо провести диссоциацию этого гибрида, чтобы исключить сигнал, не относящийся к мишени. Ввиду этого температура для измерения сигнала от мишени определяется температурой, необходимой для диссоциации гибрида.

Системы меток, полезные в этом изобретении, будут обсуждены более подробно ниже.

(1) Метка, соединенная с фрагментом и/или СТО

(1-1) Система двух взаимодействующих меток

В воплощении, относящемся к системе двух взаимодействующих меток, СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом удлинение фрагмента на стадии (d) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени. Первое воплощение такой системы двух взаимодействующих меток проиллюстрировано на Фиг. 2. Сигнал от мишени доставляется синхронизированно с генерированием сигнала при удлинении.

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель могут быть расположены на матричном участке СТО.

Согласно предпочтительному воплощению одна из молекул на СТО, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 5'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 5-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации СТО.

В воплощении, относящемся к системе двух взаимодействующих меток, СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом гибридизация фрагмента и СТО на стадии (с) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени, и удлиненный дуплекс сохраняет сигнал от мишени.

Согласно предпочтительному воплощению репортерная молекула и молекула-гаситель могут быть расположены на захватывающем участке СТО.

Согласно предпочтительному воплощению одна из молекул на СТО, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 3'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 3'-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации СТО.

В этом воплощении гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, дает сигнал, не относящийся к мишени; причем температуру для измерения сигнала от мишени определяют с учетом величины Т_пл для гибрида.

В воплощении, относящемся к системе двух взаимодействующих меток, фрагмент имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом гибридизация фрагмента и СТО на стадии (с) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени, и удлиненный дуплекс сохраняет сигнал от мишени. Первое воплощение такой системы двух взаимодействующих меток проиллюстрировано на Фиг. 6.

Согласно предпочтительному воплощению одна из молекул на фрагменте, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 5-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от 5-конца фрагмента, а другая расположена так, чтобы гашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации фрагмента.

В этом воплощении гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, дает сигнал, не относящийся к мишени; причем температуру для измерения сигнала от мишени определяют с учетом величины Т_пл для гибрида.

В воплощении, относящемся к системе взаимодействующих меток, фрагмент имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО содержит другую из двух взаимодействующих меток; при этом гибридизация фрагмента и СТО на стадии (с) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени, и удлиненный дуплекс сохраняет сигнал от мишени. Такое воплощение системы двух взаимодействующих меток проиллюстрировано на Фиг. 8.

Репортерная молекула и молекула-гаситель могут быть расположены в любом месте фрагмента РТО и СТО, при условии, что сигнал от репортерной молекулы гасится молекулой-гасителем.

Согласно данному воплощению репортерная молекула или молекула-гаситель на фрагменте РТО расположена предпочтительно на его 5'-конце.

Согласно данному воплощению репортерная молекула или молекула-гаситель на СТО расположена предпочтительно на его 5'-конце.

В этом воплощении гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени; причем температуру для измерения сигнала от мишени определяют с учетом величины Т_пл для гибрида.

(1-2) Одиночная метка

В воплощении, относящемся к системе с одиночной меткой, СТО содержит одиночную метку, и удлинение фрагмента на стадии (d) индуцирует изменение сигнала от этой одиночной метки с получением сигнала от мишени. Такое воплощение системы с одиночной меткой проиллюстрировано на Фиг. 3. Сигнал от мишени доставляется синхронизированно с генерированием сигнала при удлинении.

Согласно данному воплощению матричный участок СТО помечен одиночной меткой.

В воплощении, относящемся к системе с одиночной меткой, СТО содержит одиночную метку, и гибридизация фрагмента и СТО на стадии (с) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени, и удлиненный дуплекс сохраняет сигнал от мишени.

Согласно данному воплощению захватывающий участок СТО помечен одиночной меткой.

В этом воплощении гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени; причем температуру для измерения сигнала от мишени определяют с учетом величины Т_пл для гибрида.

В воплощении, относящемся к системе с одиночной меткой, фрагмент содержит одиночную метку, и гибридизация фрагмента и СТО на стадии (с) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени, и удлиненный дуплекс сохраняет сигнал от мишени. Такое воплощение системы с одиночной меткой проиллюстрировано на Фиг. 12.

В этом воплощении гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, обеспечивает получение сигнала, не относящегося к мишени; причем температуру для измерения сигнала от мишени определяют с учетом величины Т_пл для гибрида.

Использование в данном изобретении одиночной метки должно обеспечить получение разных сигналов в зависимости от ее присутствия на двухцепочечной или одноцепочечной структуре. Одиночная метка представляет собой флуоресцентную метку, люминесцентную метку, хемилюминесцентную метку, электрохимическую метку и металлическую метку. Предпочтительно, чтобы одиночная метка представляла собой флуоресцентную метку. Типы и предпочтительные сайты связывания одиночных флуоресцентных меток, используемых в данном изобретении, описаны в патентах США №№7537886 и 7348141, идеи которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Предпочтительно, чтобы одиночная флуоресцентная метка представляла собой JOE, FAM, TAMRA, ROX и другую метку на основе флуоресцеина. Меченый нуклеотидный остаток предпочтительно расположен на месте внутреннего нуклеотидного остатка в пределах олигонуклеотида, а не на 5'-конце или 3'-конце.

Одиночная флуоресцентная метка, используемая в настоящем изобретении, может быть описана со ссылкой на указанные выше описания для репортерной молекулы и молекулы-гасителя.

В частности, если настоящее изобретение осуществляют на твердой фазе с применением одиночной метки, то можно использовать обычную флуоресцентную метку, и не требуется специальной флуоресцентной метки, способной обеспечить получение флуоресцентных сигналов с различными интенсивностями в зависимости от ее присутствия на двухцепочечной или одноцепочечной структуре.

В том случае, когда применяют СТО, иммобилизованный на твердой подложке, можно использовать химические метки (например, биотин) или ферментативные метки (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-галактозидазу и β-глюкозидазу).

В предпочтительном воплощении метки, соединенные с фрагментом и/или СТО, расположены таким образом, что если получается гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, то этот гибрид не дает сигнала, не относящегося к мишени, на стадии (d), как представлено на Фиг. 2-3 и 9.

Альтернативно, метки могут быть расположены таким образом, что если получается гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, то этот гибрид дает сигнал, не относящийся к мишени, на стадии (d); при этом величина Т_пл для удлиненного дуплекса превышает таковую для гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО, как представлено на Фиг. 6-8 и 12.

(2) Метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс

В частности, когда настоящее изобретение осуществляют на твердой фазе с использованием иммобилизованного СТО, эта система меток более полезна для получения сигнала от мишени, как показано на Фиг. 10 и 11.

Согласно предпочтительному воплощению получение сигнала от мишени обеспечивается посредством одиночной метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения; причем встраиваемая одиночная метка соединена с нуклеотидом, встраиваемым во время реакции удлинения; при этом удлинение фрагмента на стадии (d) индуцирует изменение сигнала от одиночной метки с получением сигнала от мишени на стадии (d).

Согласно предпочтительному воплощению нуклеотид, встраиваемый во время реакции удлинения, представляет собой ddNTP.

Согласно предпочтительному воплощению нуклеотид, встраиваемый во время реакции удлинения, содержит первое неприродное основание, а СТО содержит нуклеотид, содержащий второе неприродное основание с аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием, как показано на Фиг. 11. Нуклеотид, содержащий второе неприродное основание, предпочтительно расположен в любом сайте на матричном участке СТО.

Если применяется метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, то эта метка не встраивается в гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, поскольку гибрид не удлиняется. Таким образом, данный гибрид не дает сигнала, не относящегося к мишени.

(3) Метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс, и метка, соединенная с фрагментом или СТО

В настоящем изобретении можно применять систему меток, в которой используется совместное действие метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, как показано на Фиг. 4 и 5.

Согласно предпочтительному воплощению получение сигнала от мишени обеспечивается посредством метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО; причем встраиваемая метка соединена с нуклеотидом, встраиваемым во время реакции удлинения; причем эти две метки представляют собой систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом удлинение фрагмента на стадии (d) индуцирует изменение сигнала от этой системы двух взаимодействующих меток с получением сигнала от мишени.

Более предпочтительно, чтобы нуклеотид, встраиваемый во время реакции удлинения, содержал первое неприродное основание, а СТО содержал нуклеотид, содержащий второе неприродное основание с аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием.

Предпочтительно, чтобы сигнал от мишени, доставляемый на стадии (е), представлял собой сигнал от системы двух взаимодействующих меток на стадии (d).

Если применяется метка, встраиваемая в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, то эта метка не встраивается в гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, поскольку гибрид не удлиняется. Таким образом, данный гибрид не дает сигнала, не относящегося к мишени.

(4) Интеркалирующая метка

В настоящем изобретении можно применять интеркалирующую метку для получения сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса. Интеркалирующая метка более полезна в реакции на твердой фазе с использованием иммобилизованных СТО ввиду того, что генерировать сигналы могут двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, присутствующие в образцах.

Поясненное примером воплощение описано со ссылкой на Фиг. 13. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается, высвобождая фрагмент. Фрагмент гибридизуется с СТО. Удлинение осуществляют в присутствии интеркалирующего красителя (например, SYBR™ Green), и образуется удлиненный дуплекс с интеркалирующими красителями.

Изображенный на Фиг. 13 гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, дает сигнал, не относящийся к мишени (С и D на Фиг. 13), и необходимо провести диссоциацию этого гибрида, чтобы исключить сигнал, не относящийся к мишени. Ввиду этого температуру для измерения сигнала от мишени определяют с учетом величины Т_пл для гибрида.

Предпочтительно, чтобы сигнал от мишени, доставляемый на стадии (е), представлял собой сигнал от интеркалирующего красителя.

Согласно предпочтительному воплощению РТО и/или СТО блокирован по его 3'-концу, чтобы не допустить его удлинения.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован вблизи РТО таким образом, что этот располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

Согласно предпочтительному воплощению способ дополнительно включает повторение стадий (a)-(b), (a)-(d) или (а)-(е) с денатурацией между повторяющимися циклами.

Согласно предпочтительному воплощению стадии (а)-(b) и (с)-(е) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.

Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют с целью детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней; причем располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид включает по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, РТО включает по меньшей мере два типа РТО, а СТО включает по меньшей мере один тип СТО; при этом, когда присутствуют по меньшей мере два типа нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, данный способ обеспечивает получение по меньшей мере двух типов сигналов от мишеней, соответствующих по меньшей мере двум типам нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот.

Согласно предпочтительному воплощению СТО иммобилизован на твердой подложке через свой 5'-конец или 3'-конец, и сигнал от мишени, создаваемый на твердой подложке, измеряют.

Согласно предпочтительному воплощению получение сигнала от мишени обеспечивается посредством одиночной метки, соединенной с фрагментом, или посредством одиночной метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения.

Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.

Детекция на стадии (е) может быть осуществлена в режиме реального времени, в режиме конечной точки или в режиме предварительно заданного интервала времени. Когда настоящее изобретение дополнительно включает повторение стадий (a)-(b), (a)-(d) или (а)-(е), предпочтительно, чтобы детекция сигналов осуществлялась для каждого цикла такого повторения при предварительно заданной температуре (то есть в режиме реального времени), в конце повторения при предварительно заданной температуре (то есть в режиме конечной точки) или в каждый из предварительно заданных интервалов времени в процессе повторения при предварительно заданной температуре. Предпочтительно, чтобы детекция могла быть осуществлена для каждого цикла повторения в режиме реального времени для улучшения точности и количественной оценки детекции.

IV. Способ детекции мишени в РТОСЕ-анализе, основанном на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида

В следующем аспекте настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с РТО (зондирующим и метящим олигонуклеотидом); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом РТО расщепляется под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется, и образуется удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной этого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО;

(e) плавление удлиненного дуплекса в диапазоне температур с получением сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса; при этом сигнал от мишени обеспечивается посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию удлиненного дуплекса путем измерения сигнала от мишени; тем самым присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

В еще одном аспекте данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с РТО (зондирующим и метящим олигонуклеотидом); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом РТО расщепляется под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется, и образуется удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной этого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; при этом присутствие удлиненного дуплекса обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки; и

(e) детекцию удлиненного дуплекса путем измерения сигнала от мишени при предварительно заданной температуре, при которой удлиненный дуплекс сохраняет свою двухцепочечную форму; тем самым присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Поскольку способ по настоящему изобретению, основанный на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, аналогичен таковому в РТОСЕ-анализе с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов за исключением того, что располагающиеся "вверх по течению" олигонуклеотиды в этом случае не применяются, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

Интересно, что способ по настоящему изобретению, основанный на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, на самом деле обеспечивает получение сигналов от мишени в РТОСЕ-анализе даже без использования располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов (см. Фиг. 35А и 35В).

В способе по настоящему изобретению можно использовать традиционные ферменты, обладающие 5'-нуклеазной активностью, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. Среди матричных полимераз, обладающих 5'-нуклеазной активностью, существуют различные ферменты, обладающие 5'-нуклеазной активностью, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, например Taq ДНК-полимераза.

С учетом амплификации нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней и эффективности расщепления РТО, РТОСЕ-анализ по настоящему изобретению предпочтительно проводят с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов.

V. Способ детекции нуклеотидной вариации в РТОСЕ-анализе В следующем аспекте настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и PTO-NV (зондирующим и метящим олигонуклеотидом для нуклеотидной вариации); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; PTO-NV содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени и расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно PTO-NV; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO-NV; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из PTO-NV, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO-NV; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом, когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО; при этом, когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется; и

(e) детекцию присутствия удлиненной цепи; тем самым присутствие удлиненной цепи указывает на присутствие нуклеотидной вариации, последовательность которой комплементарна сайту распознавания нуклеотида в PTO-NV.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых подходов для детекции нуклеотидных вариаций, характеризующихся более высокой точностью и удобством, помимо прочего, в режиме множественной детекции. В результате авторы изобретения разработали новые протоколы для детекции нуклеотидных вариаций, в которых детекция нуклеотидной вариации осуществляется посредством гибридизации зондов, ферментативного расщепления зондов, удлинения и детекции удлиненной цепи. В частности, авторы изобретения неожиданно создали сайт расщепления зонда, регулируемый в зависимости от присутствия и отсутствия представляющих интерес нуклеотидных вариаций, при этом фрагменты, высвободившиеся в результате расщепления в разных сайтах, отличаются по их способности к удлинению на искусственной матрице. Протоколы по настоящему изобретению хорошо адаптированы как к реакциям в жидкой фазе, так и к реакциям на твердой фазе, и дают возможность осуществлять детекцию множественных нуклеотидных вариаций с более высокой точностью и более удобно.

В настоящем изобретении реализуются поочередные события в такой последовательности: гибридизация зонда; расщепление PTO-NV (зондирующего и метящего олигонуклеотида для нуклеотидной вариации) и удлинение; образование зависящей от нуклеотидной вариации удлиненной цепи; и детекция удлиненной цепи. Поэтому способ называется "Детекция вариаций с расщеплением и удлинением РТО (VD-PTOCE-анализ)".

Согласно предпочтительному воплощению нуклеотидная вариация, детектируемая согласно настоящему изобретению, представляет собой вариацию типа замены, вариацию типа делеции или вариацию типа вставки, более предпочтительно вариацию в результате изменения одного нуклеотида, как например SNP.

В настоящей заявке нуклеиновокислотная последовательность-мишень, имеющая нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации в PTO-NV, также описывается как "сопоставимая матрица". Нуклеиновокислотная последовательность-мишень, имеющая нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации в РТО, также описывается как "несопоставимая матрица".

Согласно предпочтительному воплощению термин "некомплементарный" вместе с фразой "нуклеотидная вариация, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации", используется в данном описании для включения некомплементарности, обусловленной вставкой или делецией.

В VD-PTOCE-анализе по настоящему изобретению используется PTO-NV, имеющий сайт распознавания нуклеотидной вариации, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка для обеспечения селективности РТО в отношении конкретной нуклеотидной вариации. Когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, (т.е. с сопоставимой матрицей), 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с сопоставимой матрицей; однако, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, (т.е. с несопоставимой матрицей), 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с несопоставимой матрицей.

Следует отметить, что такие разные картины гибридизации в случае представляющей интерес нуклеотидной вариации отвечают за различие в начальных сайтах расщепления PTO-NV, в результате чего образуются два типа фрагментов PTO-NV, обуславливая различие в сигналах в зависимости от присутствия представляющей интерес нуклеотидной вариации.

Первый фрагмент получается в результате расщепления ибрида, образованного РТО и сопоставимой матрицей. Второй фрагмент получается в результате расщепления гибрида, образованного РТО и несопоставимой матрицей. По сравнению с первым фрагментом второй фрагмент содержит дополнительные нуклеотиды на своем 3'-концевом участке.

Образование либо первого фрагмента, либо второго фрагмента можно отчетливо обнаружить с использованием реакции удлинения на СТО.

Как правило, гибридизация между 3'-концевой частью праймеров и матрицей является очень критичной для удлинения праймеров в жестких условиях. В настоящем изобретении и первый фрагмент, и второй фрагмент, оба гибридизуются с одним и тем же сайтом СТО. Как описано выше, второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок по сравнению с первым фрагментом. Регулируя условия гибридизации и последовательность СТО, располагающуюся напротив дополнительного 3'-концевого участка второго фрагмента, можно обеспечить удлинение только первого фрагмента.

Согласно предпочтительному воплощению СТО имеет последовательность, выбранную такой, что СТО не гибридизуется с дополнительным 3'-концевым участком второго фрагмента, предотвращая удлинение второго фрагмента при его гибридизации с захватывающим участком СТО.

Согласно предпочтительному воплощению последовательность СТО, располагающаяся напротив дополнительного 3'-концевого участка второго фрагмента, не комплементарна дополнительному 3'-концевому участку.

Образование удлиненной цепи в результате удлинения первого фрагмента можно обнаружить различными способами.

Согласно традиционным технологиям использования 5'-нуклеазной активности для детекции нуклеотидных вариаций гибридизация используемых зондов определяется полной последовательностью зонда или зависит от нее. В таких традиционных технологиях разработка и конструирование зондов и оптимизация реакционных условий вызывают большие затруднения, поскольку гибридизация зондов, зависящая от присутствия нуклеотидных вариаций, вынуждена в основном определяться различием в один нуклеотид.

Согласно VD-PTOCE-анализу сайт распознавания нуклеотидной вариации располагается в 5'-концевой части вовлеченного в гибридизацию участка зондов, что позволяет оптимизировать условия гибридизации в сторону удобства. Помимо этого, в VD-PTOCE-анализе по-разному осуществляется детекция нуклеотидной вариации, скорее по локальному участку зондов, чем по полной последовательности зондов, вследствие чего можно с высокой степенью точности обнаружить различие даже в один нуклеотид, например, SNP.

Специалисту в данной области известно, что последовательность зондов, расположенная в непосредственной близости к последовательности, располагающейся напротив SNP, оказывает очень сильное влияние на гибридизацию зондов. Как правило, традиционные зонды имеют последовательность, располагающуюся напротив SNP в их средней части. В этом смысле традиционные зонды могут не "выбрать" близлежащую последовательность, окружающую SNR, вовлеченный в гибридизацию. Традиционные технологии имеют серьезные ограничения, обусловленные лежащими близко к SNP последовательностями.

В настоящем изобретении, наоборот, получается, что сайт распознавания нуклеотидной вариации, располагающийся напротив SNP, локализован в 5'-концевой части вовлеченного в гибридизацию участка зондов, поэтому становится возможным "подстраивать" последовательность зондов относительно последовательности SNP, расположенной в непосредственной близости к 5'-концу. Поскольку в настоящем изобретении строго регулируется влияние близлежащей последовательности, окружающей SNP, на гибридизацию, данное изобретение становится истинным способом анализа SNP, не обнаруживаемых или почти не обнаруживаемых с использованием традиционных технологий вследствие влияния близлежащей последовательности, окружающей SNP.

VD-PTOCE-анализ по настоящему изобретению будет описан более подробно, как приведено ниже.

Поскольку VD-PTOCE-анализ по настоящему изобретению основан на расщеплении РТО и удлинении фрагмента РТО на СТО, как и в описанном выше РТОСЕ-анализе, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

Стадия (а). Гибридизация располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и PTO-NV с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью

Согласно настоящему изобретению нуклеиновокислотная последовательность-мишень сначала гибридизуется с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и PTO-NV (зондирующим и метящим олигонуклеотидом для нуклеотидной вариации).

Используемый в данном описании термин "PTO-NV (зондирующий и метящий олигонуклеотид для нуклеотидной вариации)" означает олигонуклеотид, содержащий (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, служащий в качестве зонда, (2) 5'-концевой тегирующий участок с нуклеотидной последовательностью, некомплементарной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности данной нуклеотидной вариации в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. 5'-Концевой тегирующий участок в результате нуклеолитической реакции высвобождается из РТО после гибридизации с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. 5'-Концевой тегирующий участок и 3'-концевой узнающий мишень участок в РТО должны располагаться в направлении 5'→3'. PTO-NV схематически показан на Фиг. 25. PTO-NV можно воспринимать как одну из форм РТО, применяемых для детекции нуклеотидных вариаций, которая сконструирована путем введения сайта распознавания нуклеотидной вариации в 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка.

PTO-NV включает в себя сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности данной нуклеотидной вариации, расположенную в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка.

Когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. Когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. Такие разные картины гибридизации в случае представляющей интерес нуклеотидной вариации отвечают за различие в сайтах расщепления PTO-NV, в результате чего образуются два типа фрагментов PTO-NV, обуславливая различие в сигналах в зависимости от присутствия представляющей интерес нуклеотидной вариации. 5'-Концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV также можно описать как "образующий одну цепь 5'-концевой участок" 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV при гибридизации с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации.

Сайт распознавания нуклеотидной вариации, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV, содержит последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидной вариации. Например, когда подлежащая детекции нуклеотидная вариация представляет собой SNP, сайт распознавания нуклеотидной вариации содержит комплементарный данному SNP нуклеотид.

Согласно предпочтительному воплощению сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на расстоянии 10 нуклеотидов, более предпочтительно 8 нуклеотидов, еще более предпочтительно 6 нуклеотидов, еще наиболее предпочтительно 4 нуклеотидов, 3 нуклеотидов, 2 нуклеотидов или 1 нуклеотида от 5-конца 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV. Предпочтительно, сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на 5'-конце 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV.

Локализацию сайта распознавания нуклеотидной вариации можно определить с учетом подлежащих детекции последовательностей, типа нуклеазы и реакционных условий.

Термин "сайт" со ссылкой или на сайт распознавания нуклеотидной вариации в зондах, или на сайт нуклеотидной вариации в последовательностях-мишенях, используется в данном описании для включения не только одного нуклеотида, но также и множества нуклеотидов.

Гибридизацию на стадии (а) предпочтительно проводят в жестких условиях, так что 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью.

Согласно предпочтительному воплощению PTO-NV и/или СТО блокирован по его 3'-концу, чтобы не допустить его удлинения.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован вблизи PTO-NV таким образом, что этот располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид индуцирует расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

Стадия (b). Высвобождение фрагмента из PTO-NV

Далее, продукт со стадии (а) приводят в контакт с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO-NV.

Когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, (т.е. с сопоставимой матрицей) и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент (см. Фиг. 25).

Когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, (т.е. с несопоставимой матрицей) и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента (см. Фиг. 25).

Когда в образце отсутствует нуклеиновокислотная последовательность-мишень, расщепления PTO-NV не происходит.

Соответственно, различия в сайтах расщепления и типах образованных фрагментов PTO-NV приводят к получению разных картин удлинения в зависимости от присутствия и отсутствия представляющей интерес нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени, способствуя дифференцированному обнаружению нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Начальный сайт расщепления PTO-NV зависит от типа 5'-нуклеаз, типа располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов (располагающегося "вверх по течению" зонда или располагающегося "вверх по течению" праймера), сайтов гибридизации располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов и условий расщепления.

Начальный сайт расщепления матричной полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, с удлинением располагающихся "вверх по течению" праймеров обычно локализован в направлении 5'→3' относительно начального нуклеотида двойной цепи (т.е. сайта ветвления) в структурах, включающих одиночную цепь и двойную цепь, или на расстоянии 1-2 нуклеотидов от начального нуклеотида. В результате реакции расщепления образуются фрагменты, содержащие 5'-концевой тегирующий участок и часть 3'-концевого узнающего мишень участка. В том случае, когда настоящее изобретение осуществляют с использованием индукции расщепления, не зависящего от удлинения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, сайт расщепления PTO-NV может быть скорректирован по отношению к месту локализации располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов (например, располагающегося "вверх по течению" зонда).

Используемый в данном описании термин "первый начальный сайт расщепления" в отношении PTO-NV означает сайт расщепления PTO-NV, который расщепляется первым, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной вариации. Используемый в данном описании термин "второй начальный сайт расщепления" в отношении PTO-NV означает сайт расщепления PTO-NV, который расщепляется первым, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной вариации.

Используемый в данном описании термин "первый фрагмент" относится к фрагменту, образуемому в результате расщепления в первом начальном сайте расщепления. Данный термин используется взаимозаменяемо с терминами "первый сегмент" и "первый фрагмент PTO-NV". Термин "второй фрагмент" относится в данном описании к фрагменту, образуемому в результате расщепления во втором начальном сайте расщепления. Данный термин используется взаимозаменяемо с терминами "второй сегмент" и "второй фрагмент PTO-NV.

Предпочтительно, чтобы первый фрагмент и второй фрагмент каждый содержал 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка.

В зависимости от используемых методов расщепления, после расщепления первого начального сайта расщепления (или второго начального сайта расщепления) может происходить последующее расщепление. Например, в том случае, когда для расщепления используется 5'-нуклеазная реакция вместе с удлинением располагающихся "вверх по течению" праймеров, начальный сайт расщепления и следующая за ним последовательность расщепляются. В том случае, когда используется располагающийся "вверх по течению" зонд и реакция расщепления происходит в сайте, находящемся в стороне от места локализации зонда, реакция расщепления может происходить только в данном сайте, и расщепления в следующих за ним сайтах может не происходить.

Согласно предпочтительному воплощению начальный сайт расщепления, зависящий от удлинения располагающихся "вверх по течению" праймеров, может располагаться в направлении 5'→3' относительно начального нуклеотида двойной цепи (т.е. сайта ветвления).

Как показано на Фиг. 25, отображающей пример настоящего изобретения, сайт распознавания нуклеотидной вариации располагается на 5-конце 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. В этом случае первый начальный сайт расщепления располагается в непосредственной близости в направлении 5'→3' по отношению к 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. Другими словами, первый начальный сайт расщепления располагается в непосредственной близости в направлении 3' по отношению к сайту распознавания нуклеотидной вариации. Второй начальный сайт расщепления обычно располагается на расстоянии 1 нуклеотида в направлении 3' от сайта распознавания нуклеотидной вариации.

Как показано на Фиг. 26, отображающей другой пример настоящего изобретения, сайт распознавания нуклеотидной вариации располагается на расстоянии 1 нуклеотида от 5'-конца 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. В этом случае первый начальный сайт расщепления располагается в непосредственной близости в направлении 5' по отношению к сайту распознавания нуклеотидной вариации. Второй начальный сайт расщепления обычно располагается на расстоянии 1 нуклеотида в направлении 3' от сайта распознавания нуклеотидной вариации.

5'-Концевая часть, содержащая сайт распознавания нуклеотидной вариации, может состоять из последовательности, способной к гибридизации с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. Альтернативно, 5'-концевая часть может частично содержать неспособную к гибридизации последовательность (см. Фиг. 27). Введение неспособной к гибридизации последовательности в 5'-концевую часть очень выгодно по сравнению с образованием одиночной цепи 5'-концевой части в тех случаях, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации.

Согласно предпочтительному воплощению 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV содержит группировку, не подходящую для спаривания оснований, локализованную на расстоянии 1-10 нуклеотидов (более предпочтительно 1-5 нуклеотидов) от сайта распознавания нуклеотидной вариации.

Группировка, не подходящая для спаривания оснований, не позволяет 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка образовывать двойную цепь с нуклеотидной последовательностью-мишенью, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной вариации.

Согласно предпочтительному воплощению группировка, не подходящая для спаривания оснований, не ингибирует образования двойной цепи между 5'-концевой частью и нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации.

Согласно одному из воплощений, группировка, не подходящая для спаривания оснований, способствует установлению различий между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления. Например, если сайты расщепления не различаются в случае сопоставимой матрицы и несопоставимой матрицы по разнице в сайте распознавания вариации ввиду отсутствия различий в картинах гибридизации 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка PTO-NV, то использование группировки, не подходящей для спаривания оснований, позволяет сделать картины гибридизации различимыми. Помимо этого, даже если 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV демонстрирует разные картины гибридизации в случае сопоставимой матрицы и несопоставимой матрицы по разнице в сайте распознавания вариации, то использование группировки, не подходящей для спаривания оснований, дает возможность получения более длинного 3'-концевого участка второго фрагмента по сравнению с таковым первого фрагмента, тем самым полностью предотвращая удлинение второго фрагмента на СТО.

Использование группировки, не подходящей для спаривания оснований, повышает эффективность VD-PTOCE-анализа.

Согласно предпочтительному воплощению использование группировки, не подходящей для спаривания оснований, (например, искусственного некомплементарного нуклеотида) усиливает способность PTO-NV к распознаванию нуклеотидных вариаций.

Согласно одному из воплощений распознавание ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, различий между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления улучшается посредством установления различий, обусловленного присутствием группировки, не подходящей для спаривания оснований. Такое установление различий может быть усилено благодаря расстоянию между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления, обусловленному присутствием группировки, не подходящей для спаривания оснований. Согласно предпочтительному воплощению присутствие группировки, не подходящей для спаривания оснований, увеличивает расстояние между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.

Согласно предпочтительному воплощению введение в последовательность группировки, не подходящей для спаривания оснований, дает возможность корректировать второй начальный сайт расщепления.

Предпочтительно, чтобы группировка, не подходящая для спаривания оснований, располагалась "вниз по течению" относительно сайта распознавания нуклеотидной вариации.

Например, если некомплементарный нуклеотид в качестве группировки, не подходящей для спаривания оснований, вводят в положение, находящееся на расстоянии 2 нуклеотидов в направлении 3' от сайта распознавания нуклеотидной вариации, то второй начальный сайт расщепления корректируют к положению, находящемуся на расстоянии 2 нуклеотидов от сайта распознавания нуклеотидной вариации (см. Фиг. 27). В случае, когда некомплементарный нуклеотид не используется, второй начальный сайт расщепления располагается на расстоянии 1 нуклеотида от сайта распознавания нуклеотидной вариации. Таким образом, используя группировку, не подходящую для спаривания оснований, можно увеличивать расстояние между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.

Группировка, не подходящая для спаривания оснований, включает любые группировки, не образующие пары оснований между нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями. Предпочтительно, чтобы группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляла собой (1) нуклеотид, содержащий искусственное некомплементарное основание, основание, не подходящее для спаривания оснований, модифицированное таким образом, что оно не способно образовывать пару оснований, или универсальное основание, (2) нуклеотид, не подходящий для спаривания оснований, модифицированный таким образом, что он не способен образовывать пару оснований, или (3) химическое соединение, не подходящее для спаривания оснований.

Например, группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит алкиленовую группу, рибофуранозил-нафталин, дезоксирибофуранозил-нафталин, метафосфат, фосфотиоатную связь, алкилфосфотриэфирную связь, арилфосфотриэфирную связь, алкилфосфонатную связь, арилфосфонатную связь, гидрофосфонатную связь, алкилфосфоамидатную связь и арилфосфоамидатную связь. В качестве группировок, не подходящих для спаривания оснований, также используют традиционные углеродные спейсеры. Универсальные основания в качестве группировок, не подходящих для спаривания оснований, полезны для корректировки сайтов расщепления в PTO-NV.

Поскольку пары оснований, содержащие универсальные основания, такие как дезоксиинозин, 1-(2'-дезокси-бета-D-рибофуранозил)-3-нитропиррол и 5-нитроиндол, характеризуются меньшей способностью к связыванию по сравнению с природными основаниями, эти универсальные основания можно использовать в качестве группировок, не подходящих для спаривания оснований, в определенных условиях гибридизации.

Группировка, не подходящая для спаривания оснований, введенная в 5'-концевую часть, содержит предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-2 группировки. Ряд группировок, не подходящих для спаривания оснований, могут быть расположены в 5'-концевой части непрерывно или через промежутки. Предпочтительно, группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 2-5 следующих друг за другом группировок.

Предпочтительно, группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляет собой не подходящее для спаривания оснований химическое соединение.

Согласно предпочтительному воплощению сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 10 нуклеотидов (более предпочтительно 8 нуклеотидов, 7 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 5 нуклеотидов, 4 нуклеотидов, 3 нуклеотидов, 2 нуклеотидов или 1 нуклеотида, более предпочтительно 1 нуклеотида) от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка.

Альтернативно, реакция расщепления может быть выполнена только в первом начальном сайте расщепления, но не во втором начальном сайте расщепления. Например, если используется располагающийся "вверх по течению" зонд и реакция расщепления происходит в сайте, находящемся в стороне от места локализации этого зонда, то реакция расщепления может происходить только в первом начальном сайте расщепления в том случае, когда PTO-NV гибридизуется с сопоставимой матрицей. Когда PTO-NV гибридизуется с несопоставимой матрицей, сайт ветвления (второй начальный сайт расщепления) не может быть подвергнут расщеплению ввиду большого расстояния от располагающегося "вверх по течению" зонда.

Согласно предпочтительному воплощению, если PTO-NV гибридизуется с несопоставимой матрицей, то второй начальный сайт расщепления содержит начальный сайт двойной цепи (т.е. сайт ветвления) в структурах, включающих одиночную цепь и двойную цепь.

Согласно одному из воплощений PTO-NV имеет блокирующий участок, содержащий в качестве блокатора по меньшей мере один нуклеотид, устойчивый к расщеплению ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, и этот блокирующий участок расположен так, чтобы регулировать расположение начального сайта расщепления или предотвращать расщепление в каком-либо сайте или каких-либо сайтах.

Стадия (с). Гибридизация фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО

Фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом).

Первый фрагмент и второй фрагмент в большинстве случаев содержат последовательность, способную к гибридизации с захватывающим участком СТО, и поэтому один из них гибридизуется с СТО.

Второй фрагмент, образующийся при гибридизации с несопоставимой матрицей, содержит дополнительный 3'-концевой участок в отличие от первого фрагмента, образующегося при гибридизации с сопоставимой матрицей.

Согласно предпочтительному воплощению СТО имеет последовательность, выбранную такой, что СТО не гибридизуется с дополнительным 3'-концевым участком второго фрагмента, предотвращая удлинение второго фрагмента при его гибридизации с захватывающим участком СТО. Например, последовательность СТО можно выбрать такой, что СТО будет иметь некомплементарный(е) нуклеотид(ы), располагающий(е)ся напротив дополнительного 3'-концевого участка второго фрагмента. Альтернативно, в зависимости от реакционных условий вместо некомплементарного нуклеотида можно использовать универсальные основания.

Первый начальный сайт расщепления (или второй начальный сайт расщепления) может быть не фиксированным, а скорее разным в зависимости от условий. Например, начальные сайты расщепления могут располагаться в направлении 5'→3' относительно начального нуклеотида двойной цепи (т.е. сайта ветвления) в структурах, включающих одиночную цепь и двойную цепь, и на расстоянии 1-2 нуклеотидов от начального нуклеотида. В этом случае предпочтительно, чтобы последовательность СТО была выбрана такой, чтобы самый короткий фрагмент, высвободившийся в результате первого начального расщепления, избирательно удлинялся согласно настоящему изобретению с образованием удлиненной цепи, указывающей на присутствие нуклеотидной вариации.

Стадия (d). Удлинение фрагмента

Когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО. Когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется.

Как правило, удлинение праймеров можно регулировать посредством гибридизации между 3'-концевой частью праймеров и матрицей. Благодаря подбору последовательностей праймеров и реакционных условий (например, температуры отжига), удлинение праймеров, имеющих в своей 3'-концевой части 1-3 некомплементарных нуклеотида, является допустимым. Альтернативно, удлинение праймеров может быть допустимым, только когда они имеют последовательность, полностью комплементарную последовательностям-мишеням.

Согласно предпочтительному воплощению последовательность СТО выбрана такой, что избирательно удлиняется либо первый фрагмент, либо второй фрагмент.

Согласно предпочтительному воплощению удлинение фрагмента осуществляют в таких условиях, что даже тогда, когда имеет место одно ошибочное спаривание в 3'-концевой части фрагмента, удлинения не происходит.

Стадия (е). Детекция удлиненной цепи

После реакции удлинения осуществляют детекцию присутствия удлиненной цепи. Присутствие удлиненной цепи указывает на присутствие нуклеотидной вариации, последовательность которой комплементарна сайту распознавания нуклеотида в PTO-NV.

Согласно предпочтительному воплощению детекцию на стадии (е) осуществляют в соответствии с РТОСЕ-анализом, включающим в себя анализ плавления, или РТОСЕ-анализом, включающим в себя детекцию при предварительно заданной температуре, с использованием сигналов от удлиненного дуплекса, образованного между удлиненной цепью и СТО, описанным выше.

Согласно предпочтительному воплощению удлиненная цепь первого фрагмента и СТО образуют удлиненный дуплекс на стадии (d); причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной первого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной первого фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки; и при этом детекцию присутствия удлиненной цепи осуществляют посредством измерения сигнала от мишени, поступающего от удлиненного дуплекса, в соответствии с анализом плавления или анализом гибридизации для удлиненного дуплекса.

Согласно предпочтительному воплощению удлиненная цепь первого фрагмента и СТО образуют удлиненный дуплекс на стадии (d); причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной первого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной первого фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки; и при этом детекцию присутствия удлиненной цепи осуществляют посредством измерения сигнала от мишени, поступающего от удлиненного дуплекса, при предварительно заданной температуре, достаточной для поддержания двойной цепи удлиненного дуплекса.

Согласно предпочтительному воплощению детекцию присутствия удлиненной цепи первого фрагмента можно осуществить посредством измерения сигналов, генерированных в результате расщепления меченых зондов, гибридизованных с СТО при удлинении первого фрагмента.

Согласно предпочтительному воплощению детекцию присутствия удлиненной цепи первого фрагмента можно осуществить, беря за основу либо размер, либо последовательность удлиненной цепи. Например, детекцию присутствия удлиненной цепи можно осуществить, используя электрофорез или анализ масс (например, масс-спектрометрию с ионизацией электронным ударом (EI), химической ионизацией (CI), десорбцией в электрическом поле (FD), ²⁵²Cf-плазменной десорбцией (PD), десорбционной химической ионизацией (DCI), масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS), с ионизацией путем бомбардировки быстрыми атомами (FAB), ионизацией электрораспылением (ESI), ионизацией посредством лазерной десорбции ионов из матрицы (MALDI) и тандемную масс-спектрометрию).

Согласно предпочтительному воплощению способ по настоящему изобретению дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (а)-(е) с денатурацией между повторяющимися циклами.

Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеотидных вариаций; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, и PTO-NV содержит по меньшей мере два типа PTO-NV.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот; при этом матричная полимераза нуклеиновых кислот идентична ферменту, обладающему 5'-нуклеазной активностью.

Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот; при этом матричная полимераза нуклеиновых кислот отличается от фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью.

Согласно предпочтительному воплощению фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.

Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.

Способ по настоящему изобретению может быть осуществлен с применением метода "ПЦР-клэмпинга" с использованием PNA, при котором используемые PNA и PTO-NV могут быть сконструированы такими, чтобы гибридизоваться с одной и той же цепью двойной цепи ДНК или разными цепями.

Согласно одному из воплощений настоящее изобретение может быть осуществлено без использования располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов. В этом случае можно использовать традиционные ферменты, обладающие 5'-нуклеазной активностью, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. Среди матричных полимераз, обладающих 5'-нуклеазной активностью, существуют различные ферменты, обладающие 5'-нуклеазной активностью, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, например Taq ДНК-полимераза.

С учетом амплификации нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, реакционных условий и 5'-нуклеазной активности, настоящее изобретение предпочтительно осуществляют с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов, более предпочтительно располагающихся "вверх по течению" праймеров.

Способ детекции нуклеотидной вариации в РТОСЕ-анализе, основанном на применении 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, включает:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с PTO-NV (зондирующим и метящим олигонуклеотидом для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени и расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO-NV; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из PTO-NV, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO-NV; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом, когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО; при этом, когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется; и

(e) детекцию присутствия удлиненной цепи; тем самым присутствие удлиненной цепи указывает на присутствие нуклеотидной вариации, последовательность которой комплементарна сайту распознавания нуклеотида в PTO-NV.

Поскольку способ по настоящему изобретению, основанный на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, аналогичен таковому в РТОСЕ-анализе с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов за исключением того, что располагающиеся "вверх по течению" олигонуклеотиды в этом случае не применяются, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

В другом аспекте данного изобретения предложен набор для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), содержащий:

(a) PTO-NV (зондирующий и метящий олигонуклеотид для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно PTO-NV; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;

(c) СТО (захватывающий и матричный олигонуклеотид); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO-NV;

при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент;

при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО.

В следующем аспекте данного изобретения предложен набор для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), основанном на применении 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, содержащий:

(a) PTO-NV (зондирующий и метящий олигонуклеотид для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) СТО (захватывающий и матричный олигонуклеотид); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO-NV;

при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент;

при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО.

Поскольку набор по данному изобретению составлен для осуществления описанного выше способа детекции по настоящему изобретению, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

Признаки и преимущества данного изобретения будут обобщены ниже.

(a) Согласно настоящему изобретению образуется мишень-зависимый удлиненный дуплекс, в котором РТО (зондирующий и метящий олигонуклеотид), гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется с высвобождением фрагмента, и этот фрагмент гибридизуется с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом) с образованием удлиненного дуплекса. Удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала (генерирование или гашение сигнала) или изменение сигнала (усиление или ослабление сигнала), указывающее на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

(b) Присутствие удлиненного дуплекса определяют с использованием ряда методов или способов, таких как анализ кривой плавления и детекция при предварительно заданной температуре (например, в режиме реального времени и в режиме конечной точки).

(c) Настоящее изобретение дает возможность осуществить одновременную детекцию по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней посредством анализа кривой плавления с использованием метки даже одного типа (например, FAM). В отличие от этого, традиционный способ множественной детекции в режиме реального времени, осуществляемый в жидкой фазе, действительно страдает от ограничений, связанных с количеством детектируемых флуоресцентных меток. Настоящее изобретение позволяет успешно преодолеть такие недостатки и расширить область применения способа множественной детекции в режиме реального времени.

(d) Настоящее изобретение может быть осуществлено с использованием большого числа систем меток. Например, метки, соединенные с любым сайтом РТО и/или СТО, можно использовать для получения сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса. Кроме того, в настоящем изобретении могут быть использованы метки, встраиваемые в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения. Помимо этого можно использовать комбинацию таких меток. Разносторонние системы меток, применимые в настоящем изобретении, дают возможность авторам изобретения выбирать подходящую систему меток в зависимости от экспериментальных условий или целей исследования.

(e) Согласно настоящему изобретению образуется мишень-зависимый удлиненный дуплекс, имеющий предварительно заданную величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО или (3) последовательностью и/или длиной фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО.

(f) Традиционный анализ кривой плавления с использованием амплифицированного продукта зависит от последовательности этого амплифицированного продукта, поэтому трудно получить желаемую величину Т_пл для амплифицированного продукта. В отличие от этого, в настоящем изобретении прослеживается зависимость от последовательности удлиненного дуплекса, а не от последовательности амплифицированного продукта, что дает возможность выбора желаемой величины Т_пл для удлиненного дуплекса. Ввиду этого, настоящее изобретение легко может быть адаптировано для детекции множественных последовательностей-мишеней.

(g) В традиционном анализе кривой плавления с использованием непосредственной гибридизации между мечеными зондами и нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями с большой вероятностью получаются ложноположительные сигналы вследствие неспецифической гибридизации зондов. В отличие от этого, в настоящем изобретении применяется не только гибридизация РТО, но также ферментативное расщепление и удлинение, что позволяет полностью преодолеть проблемы, связанные с ложноположительными сигналами.

(h) На величину Т_пл в традиционном анализе кривой плавления влияет вариабельность последовательности в нуклеиновокислотных последовательностях-мишенях. Однако наличие удлиненного дуплекса в настоящем изобретении обеспечивает постоянную величину Т_пл независимо от вариабельности последовательности в нуклеиновокислотных последовательностях-мишенях, позволяя обеспечить исключительную точность в анализе кривой плавления.

(i) Следует отметить, что последовательность 5'-концевого тегирующего участка РТО и последовательность СТО могут быть выбраны без учета нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Это позволяет предварительно конструировать пул последовательностей для 5'-концевого тегирующего участка РТО и СТО. Несмотря на то что 3'-концевой узнающий мишень участок РТО должен быть получен с учетом нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, СТО можно получить стандартным образом без учета или сведений о нуклеиновокислотных последовательностях-мишенях. Такие признаки обеспечивают помимо прочего значительные преимущества при множественной детекции мишеней в анализе на микрочипах с использованием СТО, иммобилизованных на твердой подложке.

(j) Согласно настоящему изобретению для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени, то есть для VD-PTOCE-анализа, зонд (PTO-NV) отчетливо показывает разные картины гибридизации в зависимости от присутствия представляющей интерес нуклеотидной вариации.

(k) Такие разные картины гибридизации в случае представляющей интерес нуклеотидной вариации отвечают за различие в начальных сайтах расщепления PTO-NV, в результате чего образуются два типа фрагментов PTO-NV, обуславливая различие в сигналах в зависимости от присутствия представляющей интерес нуклеотидной вариации.

Теперь настоящее изобретение будет описано более подробно в примерах. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что эти примеры предназначены для более конкретного иллюстрирования, и объем настоящего изобретения, как он изложен в прилагаемой формуле изобретения, не ограничивается данными примерами.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Оценка применимости анализа с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (РТОСЕ)

Проводили оценку применимости нового анализа - анализа с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (РТОСЕ) - в отношении того, может ли удлиненный дуплекс обеспечивать сигнал от мишени, достаточный для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Для проведения этой оценки выполняли РТОСЕ-анализ с детекцией присутствия удлиненного дуплекса посредством анализа плавления (РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления). Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО авторы изобретения использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

Планировалось, чтобы удлиненный дуплекс, образуемый в процессе анализа, содержал систему двух взаимодействующих меток. Наличие системы двух взаимодействующих меток в удлиненном дуплексе обеспечивалось посредством (1) СТО, меченного репортерной молекулой и молекулой-гасителем, (СТО с двумя метками) или (2) РТО, содержащего молекулу-гаситель, и СТО, содержащего репортерную молекулу. РТО и СТО блокируют углеродным спейсером по их 3'-концам. В качестве матрицы-мишени использовали синтетический олигонуклеотид для гена Neisseria gonorrhoeae (NG).

1-1. РТОСЕ-анализ с использованием СТО с двумя метками

РТО не содержит метки. СТО содержит молекулу-гаситель (BHQ-1) и флуоресцентную репортерную молекулу (FAM) в своем матричном участке. Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1) для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 3), 2 пмоль СТО (SEQ ID NO: 4) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С. По окончании реакции получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 35°С, выдерживая при 35°С в течение 30 с и медленно нагревая от 35°С до 90°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показывает Фиг. 14, пик при температуре 76,5°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл удлиненного дуплекса (Таблица 1), детектировали в присутствии матрицы. В отсутствие матрицы никакого пика не детектировали. Поскольку гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, не дает какого-либо сигнала в этом способе мечения, никакого пика, соответствующего гибриду, образованному нерасщепленным РТО и СТО, не отмечено. В случае отсутствия РТО или отсутствия СТО не наблюдали какого-либо пика.

1-2. РТОСЕ-анализ с использованием меченного молекулой-гасителем РТО и меченного репортерной молекулой СТО

РТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-1) по своему 5'-концу. СТО помечен флуоресцентной репортерной молекулой (FAM) по своему 3'-концу.

Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1), для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 5), 2 пмоль СТО (SEQ ID NO: 6) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂) 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С и 30 с при 72°С. По окончании реакции получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 35°С, выдерживая при 35°С в течение 30 с и медленно нагревая от 35°С до 90°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показывает Фиг. 15, пик при температуре 77,0°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл удлиненного дуплекса (Таблица 2), детектировали в присутствии матрицы. Поскольку гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, дает сигнал, не относящийся к мишени, в этом способе мечения, наблюдали пик при температуре 64,0°С~64,5°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО. В случае отсутствия РТО или отсутствия СТО не наблюдали какого-либо пика.

Эти результаты указывают на то, что образуется мишень-зависимый удлиненный дуплекс и что тот удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени, указывающего на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

ПРИМЕР 2. Регулируемость величины Т_пл удлиненного дуплекса

Далее авторы изобретения исследовали, существует ли возможность регуляции величины Т_пл удлиненного дуплекса в зависимости от последовательности СТО в РТОСЕ-анализе.

Для этого исследования авторы изобретения использовали три типа СТО, содержащих разные последовательности на своих матричных участках. РТО не содержит метки. Все три типа СТО содержат молекулу-гаситель (BHQ-1) и флуоресцентную репортерную молекулу (FAM) на своих матричных участках. РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам.

РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления, проводили с каждым из трех типов СТО.

Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1), для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 7), 2 пмоль СТО (SEQ ID NO: 4, 8 или 9) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С. По окончании реакции получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 35°С, выдерживая при 35°С в течение 30 с и медленно нагревая от 35°С до 90°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

(Таблица 3).

Эти результаты указывают на то, что существует возможность регуляции величины Т_пл удлиненного дуплекса в зависимости от последовательности СТО.

ПРИМЕР 3. Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в РТОСЕ-анализе, включающем в себя детекцию в режиме реального времени или анализ плавления

Далее авторы изобретения исследовали, можно ли посредством РТОСЕ-анализа осуществлять детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с использованием ПЦР в режиме реального времени (1) или с использованием пост-ПЦР анализа плавления (2). (1) Расщепление РТО и удлинение фрагмента РТО дополняли амплификацией нуклеиновой кислоты-мишени, используя процесс ПЦР, и детекцию присутствия удлиненного дуплекса осуществляли при предварительно заданной температуре в каждом цикле (РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре); или (2) расщепление РТО и удлинение фрагмента РТО дополняли амплификацией нуклеиновой кислоты-мишени, используя процесс ПЦР, и детекцию присутствия удлиненного дуплекса осуществляли посредством пост-ПЦР анализа плавления (РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления).

Располагающийся "вверх по течению" праймер вовлечен в расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, и также вовлечен в амплификацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с участием располагающегося "вниз по течению" праймера в результате процесса ПЦР. Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

Планировалось, чтобы удлиненный дуплекс содержал систему двух взаимодействующих меток. Наличие системы двух взаимодействующих меток в удлиненном дуплексе обеспечивалось посредством (1) СТО, меченного репортерной молекулой и молекулой-гасителем, (2) структуры гаситель-изо-dGTP, встраиваемой во время реакции удлинения, и СТО, содержащего репортерную молекулу и остаток изо-dC, или (3) РТО, содержащего молекулу-гаситель, и СТО, содержащего репортерную молекулу. РТО и СТО блокируют углеродным спейсером по их 3'-концам.

В качестве нуклеиновой кислоты-мишени использовали геномную ДНК из Neisseria gonorrhoeae (NG).

3-1. РТОСЕ-анализ с использованием СТО с двумя метками

РТО не содержит метки, а СТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-1) и флуоресцентной репортерной молекулой (FAM) в своем матричном участке.

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

3-1-1. РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 10), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 7), 2 пмоль СТО (SEQ ID NO: 4) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 60 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С и 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли при 60°С каждого цикла. Температуру детекции определяли таким образом, чтобы удлиненный дуплекс сохранял двухцепочечную форму.

Как показано на Фиг. 17А, сигнал от мишени (Ct 31,36, Таблица 4) детектировали в присутствии матрицы. В отсутствие матрицы никакого сигнала не детектировали.

3-1-2. РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления

По окончании реакции в примере 3-1-1 получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 35°С, выдерживая при 35°С в течение 30 с и медленно нагревая от 35°С до 90°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 17В, пик при температуре 76,0°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл удлиненного дуплекса (Таблица 5), детектировали в присутствии матрицы. В отсутствие матрицы никакого пика не детектировали. Поскольку гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, не дает какого-либо сигнала в этом способе мечения, не наблюдали никакого пика, соответствующего гибриду, образованному нерасщепленным РТО и СТО.

3-2. РТОСЕ-анализ с использованием структуры гаситель-изо-dGTP и меченного репортерной молекулой СТО, содержащего остаток изо-dC

РТО не содержит метки, СТО содержит флуоресцентную репортерную молекулу (FAM) и остаток изо-dC на своем 5'-конце. Во время реакции удлинения фрагмента РТО, изо-dGTP, меченный молекулой-гасителем (DABCYL), встраивается в положение, комплементарное остатку изо-dC.

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

3-2-1. РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 10), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 3), 2 пмоль СТО (SEQ ID NO: 11) и 10 мкл смеси 2× Plexor® Master Mix (кат. № А4100, Promega, USA); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 60 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 30 с при 72°С и 5 циклам по 30 с при 72°С, 30 с при 55°С. Детекцию сигнала осуществляли при 60°С каждого цикла. Температуру детекции определяли таким образом, чтобы удлиненный дуплекс сохранял двухцепочечную форму.

Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, в составе Plexor® Master Mix.

Как показано на Фиг. 18А, сигнал от мишени (Ct 33,03, Таблица 6) детектировали в присутствии матрицы. В отсутствие матрицы никакого сигнала не детектировали.

3-2-2. РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления

По окончании реакции в примере 3-2-1 получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 35°С, выдерживая при 35°С в течение 30 с и медленно нагревая от 35°С до 90°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 18В, пик при температуре 70,0°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл удлиненного дуплекса (Таблица 7), детектировали в присутствии матрицы. В отсутствие матрицы никакого пика не детектировали. Поскольку гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, не дает какого-либо сигнала в этом способе мечения, не наблюдали никакого пика, соответствующего гибриду, образованному нерасщепленным РТО и СТО.

3-3. РТОСЕ-анализ с использованием меченного гасителем РТО и меченного репортерной молекулой СТО

РТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-1) по своему 5'-концу. СТО помечен флуоресцентной репортерной молекулой (FAM) по своему 3'-концу.

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

3-3-1. РТОСЕ-анализ, включающий в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 10), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 12), 2 пмоль СТО (SEQ ID NO: 6) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 60 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С и 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли при 60°С каждого цикла. Температуру детекции определяли таким образом, чтобы удлиненный дуплекс сохранял двухцепочечную форму, и эта температура превышает величину Т_пл гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО.

Как показано на Фиг. 19А, сигнал от мишени (Ct 29,79, Таблица 8) детектировали в присутствии матрицы. В отсутствие матрицы никакого сигнала не детектировали.

3-3-2. РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления

По окончании реакции в примере 3-3-1 получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 35°С, выдерживая при 35°С в течение 30 с и медленно нагревая от 35°С до 90°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 19B, пик при температуре 76,5°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл удлиненного дуплекса (Таблица 9), детектировали в присутствии матрицы. Поскольку гибрид, образованный нерасщепленным РТО и СТО, дает сигнал, не относящийся к мишени, в этом способе мечения, при 48,0°С в отсутствие матрицы детектировали пик, соответствующий величине Т_пл гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО.

Эти результаты указывают на то, что детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени можно осуществлять в РТОСЕ-анализе, включающем в себя детекцию в режиме реального времени или анализ плавления.

ПРИМЕР 4. Детекция множественных нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней в РТОСЕ-анализе, включающем в себя анализ плавления

Авторы изобретения также исследовали, возможно ли посредством РТОСЕ-анализа, включающего в себя анализ плавления, осуществлять детекцию множественных нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с использованием репортерной молекулы одного и того же типа.

Расщепление РТО и удлинение фрагментов РТО дополняли амплификацией нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, используя процесс ПЦР, и детекцию присутствия удлиненных дуплексов осуществляли посредством пост-ПЦР анализа плавления (РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления).

Планировалось, чтобы удлиненные дуплексы, образуемые в процессе анализа, содержали систему двух взаимодействующих меток. Наличие системы двух взаимодействующих меток в удлиненном дуплексе обеспечивалось посредством СТО, меченного репортерной молекулой и молекулой-гасителем в своем матричном участке. СТО содержат флуоресцентную репортерную молекулу (FAM) одного и того же типа, но имеют различные последовательности для получения разных величин Т_пл удлиненных дуплексов. РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам.

В качестве нуклеиновых кислот-мишеней использовали геномные ДНК из Neisseria gonorrhoeae (NG) и Staphylococcus aureus (SA).

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 100 пг геномной ДНК из SA, по 10 пмоль каждого располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 10 и 13), по 10 пмоль каждого располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2 и 14), по 5 пмоль каждого РТО (SEQ ID NO: 7 и 15), по 2 пмоль каждого СТО (SEQ ID NO: 4 и 16) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 60 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С и 30 с при 72°С. По окончании реакции получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 35°С, выдерживая при 35°С в течение 30 с и медленно нагревая от 35°С до 90°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 20, множественные сигналы от мишеней (Т_пл для NG: 75,5°С; и Т_пл для SA: 63,5°С, Таблица 10) детектировали в присутствии матриц. В отсутствие матриц никакого сигнала не детектировали.

Эти результаты указывают на то, что РТОСЕ-анализ, включающий в себя анализ плавления, дает возможность авторам изобретения осуществлять детекцию множественных нуклеиновых кислот-мишеней с использованием репортерной молекулы одного и того же типа (например, FAM) в условиях, когда удлиненные дуплексы, соответствующие этим нуклеиновым кислотам-мишеням, имеют различные величины Т_пл.

ПРИМЕР 5. Оценка применимости РТОСЕ-анализа, включающего в себя анализ плавления на микрочипе

Далее авторы изобретения исследовали применимость РТОСЕ-анализа, включающего в себя анализ плавления на микрочипе. Расщепление РТО проводили в отдельном сосуде и аликвоту полученного продукта переносили в микрочип с иммобилизованным СТО. По окончании реакции удлинения присутствие удлиненного дуплекса определяли путем детекции в анализе плавления.

Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью. Планировалось, чтобы удлиненный дуплекс, образуемый в процессе анализа, содержал одиночную метку. Наличие одиночной метки в удлиненном дуплексе обеспечивалось посредством РТО, меченного Quasar570 в качестве флуоресцентной репортерной молекулы по своему 5-концу. РТО и СТО блокируют углеродным спейсером по их 3'-концам. СТО содержит поли(Т)₅ в качестве линкерной ножки, и его иммобилизовали на поверхности стеклянной пластинки, используя аминогруппу (аминоС7) на его 5'-конце. Маркерный зонд, содержащий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5'-конце, был иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы на его 3'-конце.

Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, РТО, СТО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

Для изготовления СТО и маркера (SEQ ID NO: 18 и 19) использовали NHS-пластинки (N-гидроксисукцинимид) NSB9 (NSBPOSTECH, Korea). СТО и маркер, растворенные в NSB-буфере для точечного нанесения в конечной концентрации 10 мкм, печатали на NSB9 NHS-пластинках с использованием споттера для микрочипов (microarray spotter) PersonalArrayer™16 (CapitalBio, China). СТО. и маркер наносили в виде пятен по одной линии в формате 2×1 (пятна в двух повторах) и полученный микрочип инкубировали в камере с поддержанием ~85%-ной влажности в течение ночи. Затем пластинки промывали в буферном растворе, содержащем 2× SSPE (0,3 M хлорид натрия; 0,02 M гидрофосфат натрия и 2,0 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)), рН 7,4 и 7,0 мМ SDS (додецилсульфат натрия), при 37°С в течение 30 мин для удаления неспецифически связавшихся СТО и маркера и промывали дистиллированной водой. Затем ДНК-функционализированные пластинки сушили с применением центрифуги для пластинок и хранили в темноте при 4°С до применения.

Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1) для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РТО (SEQ ID NO: 17) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 4 единицы Н-Гад ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 63°С.

30 мкл полученной смеси помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СТО (SEQ ID NO: 18). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (Genepro B4I, China). Для анализа плавления готовили шесть одинаковых пластинок. Реакцию удлинения проводили в течение 20 мин при 55°С. Затем полученные пластинки инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. В конце каждую пластинку промывали дистиллированной водой в течение 1 мин при 44°С, 52°С, 60°С, 68°С, 76°С или 84°С. Получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100А (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.

Как показано на Фиг. 21А и 21В, кривую плавления получали путем измерения интенсивности флуоресценции от пятен, полученных с использованием различных температур промывки. Присутствие удлиненного дуплекса определяли на основании данных кривой плавления.

ПРИМЕР 6. Оценка применимости РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию в режиме реального времени на микрочипе

Далее авторы изобретения исследовали применимость РТОСЕ-анализа, включающего в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре на микрочипе.

Осуществляли повторное расщепление РТО и удлинение фрагмента РТО на микрочипе с иммобилизованным СТО. Присутствие удлиненного дуплекса детектировали при предварительно заданной температуре в нескольких заданных циклах.

Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

Планировалось, чтобы удлиненный дуплекс, образуемый в процессе анализа, содержал одиночную метку или систему двух взаимодействующих меток. Наличие одиночной метки в удлиненном дуплексе обеспечивалось посредством РТО, меченного репортерной молекулой (меченного репортером РТО). Наличие системы двух взаимодействующих меток в удлиненном дуплексе обеспечивалось посредством СТО, меченного репортерной молекулой и молекулой-гасителем, (СТО с двумя метками). РТО и СТО блокируют углеродным спейсером по их 3'-концам.

СТО содержит поли(Т) в качестве линкерной ножки. СТО иммобилизовали на поверхности стеклянной пластинки, используя аминогруппу (аминоС7) на его 5'-конце или его 3'-конце. Маркерный зонд, содержащий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5'-конце, был иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы на его 3'-конце. Интенсивность флуоресценции на стеклянной пластинке измеряли при предварительно заданной температуре. Температуру детекции определяли таким образом, чтобы удлиненный дуплекс сохранял двухцепочечную форму. В качестве матриц использовали синтетический олигонуклеотид для Neisseria gonorrhoeae (NG).

6-1. РТОСЕ-анализ с использованием меченного репортером РТО

РТО содержит Quasar570 в качестве флуоресцентной репортерной молекулы на своем 5'-конце. СТО иммобилизовали через его 5'-конец. В этом способе мечения температуру детекции определяли таким образом, чтобы удлиненный дуплекс сохранял двухцепочечную форму, и эта температура превышает величину Т_пл гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО.

Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, РТО, СТО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5-концевой тегирующий участок РТО).

Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным использованному в Примере 5.

Реакцию с РТОСЕ проводили в конечном объеме 30 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1) для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РТО (SEQ ID NO: 17) и 15 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 2,4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); смесь целиком помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СТО (SEQ ID NO: 18). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (Genepro B4I, China). Для проведения анализа в циклическом режиме готовили пять одинаковых пластинок. Реакцию с РТОСЕ проводили следующим образом: денатурация в течение 15 мин при 95°С и затем 0, 5, 10, 20 или 30 циклов по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 60 с при 55°С. После прохождения соответствующего числа циклов этой реакции пластинки промывали дистиллированной водой при 64°С в течение 1 мин. Получение изображений осуществляли после каждой промывки с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.

Как показано на Фиг. 22А и 22В, интенсивность флуоресценции для нуклеиновокислотной последовательности-мишени увеличивалась в зависимости от числа циклов (0 циклов_RFU: 1304±0,7; 5 циклов_RFU: 18939±1342,1; 10 циклов_RFU: 30619±285,0; 20 циклов_RFU: 56248±2208,3 и 30 циклов_RFU: 64645±1110,2) в присутствии матрицы. Не наблюдали никакого изменения интенсивности флуоресценции в зависимости от числа циклов в отсутствие матрицы.

6-2. РТОСЕ-анализ с использованием СТО с двумя метками

СТО иммобилизовали через его 3'-конец, и он содержит молекулу-гаситель (BHQ-2) и флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) в своем матричном участке.

Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, РТО, СТО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным использованному в Примере 5.

Реакцию с РТОСЕ проводили в конечном объеме 30 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1) для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РТО (SEQ ID NO: 20) и 15 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 2,4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); смесь целиком помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СТО (SEQ ID NO: 21). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (Genepro B4I, China). Для проведения анализа в циклическом режиме готовили пять одинаковых пластинок. Реакцию с РТОСЕ проводили следующим образом: денатурация в течение 15 мин при 95°С и затем 0, 5, 10, 20 или 30 циклов по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 60 с при 50°С. После прохождения соответствующего числа циклов этой реакции осуществляли получение изображений с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.

Как показано на Фиг. 23А и 23 В, интенсивность флуоресценции для нуклеиновокислотной последовательности-мишени увеличивалась в зависимости от числа циклов (0 циклов_RFU: 28078±460,3; 5 циклов_RFU: 35967±555,1; 10 циклов_RFU: 44674±186,0; 20 циклов_RFU: 65423±2,1; и 30 циклов_RFU: 65426±2,8) в присутствии матрицы. Не наблюдали никакого изменения интенсивности флуоресценции в зависимости от числа циклов в отсутствие матрицы.

ПРИМЕР 7. Детекция множественных нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней в РТОСЕ-анализе, включающем в себя детекцию при предварительно заданной температуре в режиме конечной точки на микрочипе

Далее авторы изобретения исследовали детекцию множественных мишеней в РТОСЕ-анализе, включающем в себя детекцию при предварительно заданной температуре в режиме конечной точки на микрочипе.

Расщепление РТО проводили в отдельном сосуде с процессом ПЦР и аликвоту полученного продукта переносили в микрочип с иммобилизованным СТО. По окончании реакции удлинения присутствие удлиненного дуплекса определяли путем детекции в режиме конечной точки при предварительно заданной температуре.

Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

Планировалось, чтобы удлиненный дуплекс, образуемый в процессе анализа, содержал одиночную метку. Наличие одиночной метки в удлиненном дуплексе обеспечивалось посредством РТО, меченного Quasar570 в качестве флуоресцентной репортерной молекулы по своему 5'-концу РТО. РТО и СТО блокируют углеродным спейсером по их 3'-концам.

СТО содержит поли(Т)₅ в качестве линкерной ножки, и его иммобилизовали на поверхности стеклянной пластинки, используя аминогруппу (аминоС7) на его 5'-конце. Маркерный зонд, содержащий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5'-конце, был иммобилизован на стеклянной пластинке с использованием аминогруппы на его 3'-конце.

Интенсивность флуоресценции на стеклянной пластинке измеряли при предварительно заданной температуре. Температуру детекции определяли таким образом, чтобы удлиненный дуплекс сохранял двухцепочечную форму, и эта температура превышает величину Т_пл гибрида, образованного нерасщепленным РТО и СТО. Использовали геномные ДНК Staphylococcus aureus (SA) и Neisseria gonorrhoeae (NG).

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО, СТО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным использованному в Примере 5.

Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем по 100 пг каждой геномной ДНК SA и/или NG, по 10 пмоль каждого располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 10 и/или 13), по 10 пмоль каждого располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2 и/или 22), по 1 пмоль каждого РТО (SEQ ID NO: 17 и/или 23) и 25 мкл смеси 2х Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 4 единицы Н-Tag/ ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 60 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 63°С. 30 мкл полученной смеси помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой были пришиты СТО (SEQ ID NO: 18 и 24). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (Genepro B4I, China). Реакцию удлинения проводили в течение 20 мин при 55°С. Затем пластинки промывали дистиллированной водой при 64°С в течение 1 мин. Получение изображений осуществляли после каждой промывки с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 10 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.

Как показано на Фиг. 24, сигнал от мишени для SA (RFU: 65192±198,7) детектировали в присутствии матрицы SA. Сигнал от мишени для NG (RFU: 65332±1,4) детектировали в присутствии матрицы NG. Детекцию обоих сигналов от мишеней для SA (RFU: 65302±0,7) и NG (RFU: 65302±0,7) осуществляли в присутствии обеих матриц.

ПРИМЕР 8. Детекция однонуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени с использованием анализа с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (РТОСЕ)

Авторы изобретения исследовали, можно ли посредством РТОСЕ-анализа с использованием PTO-NV (РТО для нуклеотидной вариации) различить однонуклеотидную вариацию в нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Расщепление PTO-NV и удлинение фрагмента PTO-NV сопровождали амплификацией нуклеиновой кислоты-мишени, используя метод ПЦР, и детекцию присутствия удлиненного дуплекса проводили, используя пост-ПЦР-анализ плавления (анализ плавления). Располагающийся "вверх по течению" праймер вовлечен в расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью и также вовлечен в амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с располагающимся "вниз по течению" праймером в результате осуществления ПЦР. Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления PTO-NV и удлинения фрагмента PTO-NV использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5-нуклеазной активностью.

PTO-NV и СТО блокируют углеродным спейсером по их 3'-концам. В качестве матриц использовали геномные ДНК человека BRAF (V600E) дикого типа (Т) и мутантного типа (А).

PTO-NV не содержит никакой метки, а сайт распознавания однонуклеотидной вариации в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка имеет нуклеотид, комплементарный матрице мутантного типа (А). Исследовали четыре различных типа PTO-NV с изменением места локализации сайта распознавания однонуклеотидной вариации в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. Сайты распознавания однонуклеотидной вариации локализованы при первом нуклеотиде (SEQ ID NO: 27), при втором нуклеотиде (SEQ ID NO: 28), при третьем нуклеотиде (SEQ ID NO: 29) и при четвертом нуклеотиде (SEQ ID NO: 30), начиная от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка, соответственно.

СТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-2) и флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) в своем матричном участке. Использовали приведенные ниже комбинации PTO-NV и СТО: (1) PTO-NV с SEQ ID NO: 27 и СТО с SEQ ID NO: 31, (2) PTO-NV с SEQ ID NO: 28 и СТО с SEQ ID NO: 32, (3) PTO-NV с SEQ ID NO: 29 и СТО с SEQ ID NO: 31, (4) PTO-NV с SEQ ID NO: 30 и СТО с SEQ ID NO: 33.

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, PTO-NV и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(I: дезоксиинозин).

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок PTO-NV).

(Выделенной жирным шрифтом буквой отмечен сайт распознавания нуклеотидной вариации).

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 10 нг геномной ДНК человека BRAF (V600E) дикого (Т) или мутантного типа (А), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 25), 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 26), 5 пмоль PTO-NV (SEQ ID NO: 27, 28, 29 или 30), 1 пмоль соответствующего СТО (SEQ ID NO 31, 32, 31 или 33) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 55°С, 30 с при 72°С. По окончании реакции получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 55°С, выдерживая при 55°С в течение 30 с и медленно нагревая от 55°С до 85°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 33 и в Таблице 15, для всех PTO-NV (SEQ ID NO: 27, 28, 29 и 30) в присутствии матрицы мутантного типа (А) были обнаружены пики, соответствующие ожидаемой величине Т_пл удлиненных дуплексов.

Для PTO-NV с SEQ ID NO: 27, 28 и 29 в присутствии матрицы дикого типа (Т) никаких пиков обнаружено не было. Даже несмотря на то, что PTO-NV с SEQ ID NO: 30 давал пик небольшой высоты, его можно было отличить от пика, полученного в присутствии матрицы мутантного типа (А). В отсутствие матриц никакого пика обнаружено не было.

Эти результаты указывают на то, что посредством РТОСЕ-анализа с использованием PTO-NV (т.е. VD-PTOCE-анализа) можно различить однонуклеотидную вариацию.

ПРИМЕР 9. Детекция однонуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в РТОСЕ-анализе с использованием PTO-NV, имеющего группировку, не подходящую для спаривания оснований

Далее авторы изобретения изучали, улучшает ли VD-PTOCE-анализ применение не подходящей для спаривания оснований группировки в PTO-NV.

Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления PTO-NV и удлинения фрагмента PTO-NV использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5-нуклеазной активностью.

Планировалось, чтобы удлиненный дуплекс содержал систему двух взаимодействующих меток. Наличие системы двух взаимодействующих меток в удлиненном дуплексе обеспечивалось посредством СТО, меченного репортерной молекулой и молекулой-гасителем. PTO-NV и СТО блокируют углеродным спейсером по их 3'-концам.

В качестве матриц использовали геномную ДНК человека BRAF (V600E) дикого типа (Т) и мутантного типа (А).

PTO-NV не содержит никакой метки, а сайт распознавания однонуклеотидной вариации в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка имеет нуклеотид, комплементарный матрице мутантного типа (А). Сайт распознавания однонуклеотидной вариации локализован при четвертом нуклеотиде в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка.

Готовили PTO-NV трех типов, имеющие искусственный некомплементарный нуклеотид в качестве группировки, не подходящей для спаривания оснований, при втором нуклеотиде (SEQ ID NO: 34), при третьем нуклеотиде (SEQ ID NO: 35) и при четвертом нуклеотиде (SEQ ID NO: 36) в направлении 3' от сайта распознавания однонуклеотидной вариации, соответственно.

СТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-2) и флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) в своем матричном участке (SEQ ID NO: 33).

Для сравнения использовали PTO-NV, не имеющий никакой группировки, не подходящей для спаривания оснований, (SEQ ID NO: 30).

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, PTO-NV и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(I: дезоксиинозин).

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок PTO-NV).

(Выделенной жирным шрифтом буквой отмечен сайт распознавания нуклеотидной вариации).

(Заключенной в рамку буквой отмечен искусственный некомплементарный нуклеотид, работающий в качестве группировки, не подходящей для спаривания оснований).

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 10 нг геномной ДНК человека BRAF (V600E) дикого (Т) или мутантного типа (А), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 25), 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 26), 5 пмоль PTO-NV (SEQ ID NO: 30, 34, 35 или 36), 1 пмоль соответствующего СТО (SEQ ID NO 31, 32, 31 или 33) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 55°С, 30 с при 72°С. По окончании реакции получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 55°С, выдерживая при 55°С в течение 30 с и медленно нагревая от 55°С до 85°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 34 и в Таблице 16, независимо от присутствия и локализации группировки, не подходящей для спаривания оснований, в присутствии матрицы мутантного типа (А) были обнаружены пики, соответствующие ожидаемой величине Т_пл удлиненных дуплексов, и высоты пиков были схожими для всех PTO-NV (SEQ ID NO: 30, 34, 35 и 36).

В присутствии матрицы дикого типа (Т) были обнаружены пики, но высоты пиков для PTO-NV (SEQ ID NO: 34, 35 и 36), содержащих группировки, не подходящие для спаривания оснований, были меньше высоты пика для PTO-NV (SEQ ID NO: 30), не содержащего никакой группировки, не подходящей для спаривания оснований. В отсутствие матриц никакого пика обнаружено не было.

Эти результаты указывают на то, что применение группировки, не подходящей для спаривания оснований, улучшает способность PTO-NV к распознаванию.

ПРИМЕР 10. Оценка применимости РТОСЕ-анализа с использованием, расщепления РТО, не зависящего от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида

Далее исследовали применимость РТОСЕ-анализа для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени без использования располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида при (1) детекции в режиме реального времени при предварительно заданной температуре или (2) с применением анализа плавления.

Для расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

Планировалось, чтобы удлиненный дуплекс, образованный в ходе анализа, содержал систему двух взаимодействующих меток. РТО не содержит никакой метки. СТО содержит молекулу-гаситель (BHQ-1) и флуоресцентную репортерную молекулу (FAM) в своем матричном участке. РТО и СТО блокируют углеродным спейсером по их 3'-концам. В качестве матрицы-мишени использовали синтетический олигонуклеотид для гена Neisseria gonorrhoeae (NG).

Последовательности синтетической матрицы, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

10-1. Детекция в режиме реального времени при предварительно заданной температуре

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1) для гена NG, 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 3), 2 пмоль СТО (SEQ ID NO: 4) и 10 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С. Детекцию генерированного сигнала осуществляли при 60°С каждого цикла. Температуру детекции определяли таким образом, чтобы удлиненный дуплекс сохранял двухцепочечную форму.

Как показано на Фиг. 35А, сигнал флуоресценции (Ct 1,15, Таблица 17) детектировали в присутствии матрицы. В отсутствие матрицы никакого сигнала обнаружено не было.

10-2. Анализ плавления

По окончании реакции в примере 10-1 получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 55°С, выдерживая при 55°С в течение 30 с и медленно нагревая от 55°С до 90°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации двухцепочечных ДНК. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 35В, пик при температуре 76,0°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл удлиненного дуплекса (Таблица 18), детектировали в присутствии матрицы. В отсутствие матрицы никакого пика обнаружено не было.

Основываясь на описании предпочтительного воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что его варианты и модификации, соответствующие сущности изобретения, могут стать очевидными специалистам в данной области, и объем данного изобретения следует определять прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

1. Способ детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (анализ РТОСЕ), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" праймером и PTO-NV (зондирующим и метящим олигонуклеотидом для нуклеотидной вариации); при этом располагающийся "вверх по течению" праймер содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; PTO-NV содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" праймер локализован "вверх по течению" относительно PTO-NV; удлиненная цепь располагающегося "вверх по течению" праймера индуцирует расщепление PTO-NV матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5'-нуклеазной активностью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO-NV; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из PTO-NV, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO-NV; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом, когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО; при этом, когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется; и

(e) детекцию присутствия удлиненной цепи; тем самым присутствие удлиненной цепи указывает на присутствие нуклеотидной вариации, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данного нуклеотида в PTO-NV.

2. Способ по п. 1, где СТО имеет последовательность, выбранную такой, что СТО не гибридизуется с дополнительным 3'-концевым участком второго фрагмента, предотвращая удлинение второго фрагмента при его гибридизации с захватывающим участком СТО.

3. Способ по п. 1, где сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на расстоянии 10 нуклеотидов от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV.

4. Способ по п. 1, где 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV содержит группировку, не подходящую для спаривания оснований, локализованную на расстоянии 1-5 нуклеотидов от сайта распознавания нуклеотидной вариации; при этом группировка, не подходящая для спаривания оснований, способствует установлению различий между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.

5. Способ по п. 4, где присутствие группировки, не подходящей для спаривания оснований, увеличивает расстояние между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.

6. Способ по п. 4, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляет собой (1) нуклеотид, содержащий искусственное некомплементарное основание, основание, не подходящее для спаривания оснований, модифицированное таким образом, что оно не способно образовывать пару оснований, или универсальное основание, (2) нуклеотид, не подходящий для спаривания оснований, модифицированный таким образом, что он не способен образовывать пару оснований, или (3) химическое соединение, не подходящее для спаривания оснований.

7. Способ по п. 4, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 1-5 группировок.

8. Способ по п. 7, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 2-5 следующих друг за другом группировок.

9. Способ по п. 4, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 10 нуклеотидов от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка.

10. Способ по п. 9, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 7 нуклеотидов от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка.

11. Способ по п. 9, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 5 нуклеотидов от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка.

12. Способ по п. 1, где нуклеотидная вариация представляет собой вариацию типа замены, вариацию типа делеции или вариацию типа вставки.

13. Способ по п. 1, где удлиненная цепь первого фрагмента и СТО образуют удлиненный дуплекс на стадии (d); причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной первого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью, и/или длиной первого фрагмента и последовательностью, и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки; и при этом детекцию присутствия удлиненной цепи осуществляют посредством измерения сигнала от мишени, поступающего от удлиненного дуплекса, в соответствии с анализом плавления или анализом гибридизации для удлиненного дуплекса.

14. Способ по п. 1, где удлиненная цепь первого фрагмента и СТО образуют удлиненный дуплекс на стадии (d); причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной первого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью, и/или длиной первого фрагмента и последовательностью, и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки; и при этом детекцию присутствия удлиненной цепи осуществляют посредством измерения сигнала от мишени, поступающего от удлиненного дуплекса, при предварительно заданной температуре, достаточной для поддержания двойной цепи удлиненного дуплекса.

15. Способ по п. 1, где PTO-NV и/или СТО блокирован по его 3'-концу, чтобы не допустить его удлинения.

16. Способ по п. 1, дополнительно включающий повторение всех или некоторых из стадий (а)-(е) с денатурацией между повторяющимися циклами.

17. Способ по п. 1, который осуществляют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеотидных вариаций; при этом располагающийся "вверх по течению" праймер содержит по меньшей мере два типа праймеров и PTO-NV содержит по меньшей мере два типа PTO-NV.

18. Способ по п. 1, где матричная полимераза нуклеиновых кислот, обладающая 5'-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

19. Способ по одному из пп. 1-18, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.

20. Способ детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с PTO-NV (зондирующим и метящим олигонуклеотидом для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO-NV; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из PTO-NV, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO-NV; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом, когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО; при этом, когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется; и

(e) детекцию присутствия удлиненной цепи; тем самым присутствие удлиненной цепи указывает на присутствие нуклеотидной вариации, последовательность которой комплементарна сайту распознавания нуклеотида в PTO-NV.

21. Набор для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО) для применения в осуществлении способа по любому из пп. 1-19, содержащий:

(a) PTO-NV (зондирующий и метящий олигонуклеотид для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'-нуклеазной активностью;

(c) располагающийся "вверх по течению" праймер; при этом располагающийся "вверх по течению" праймер имеет гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом располагающийся "вверх по течению" праймер локализован "вверх по течению" относительно PTO-NV; удлиненная цепь располагающегося "вверх по течению" праймера индуцирует расщепление PTO-NV матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5'-нуклеазной активностью; и

(d) СТО (захватывающий и матричный олигонуклеотид); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO-NV;

при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент;

при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО.

22. Набор по п. 21, при этом, когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО; при этом, когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется.

23. Набор по п. 21, где СТО имеет последовательность, выбранную такой, что СТО не гибридизуется с дополнительным 3'-концевым участком второго фрагмента, предотвращая удлинение второго фрагмента при его гибридизации с захватывающим участком СТО.

24. Набор по п. 21, где сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на расстоянии 10 нуклеотидов от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV.

25. Набор по п. 21, где 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV содержит группировку, не подходящую для спаривания оснований, локализованную на расстоянии 1-5 нуклеотидов от сайта распознавания нуклеотидной вариации; при этом группировка, не подходящая для спаривания оснований, способствует установлению различий между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.

26. Набор по п. 25, где присутствие группировки, не подходящей для спаривания оснований, увеличивает расстояние между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.

27. Набор по п. 25, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляет собой (1) нуклеотид, содержащий искусственное некомплементарное основание, основание, не подходящее для спаривания оснований, модифицированное таким образом, что оно не способно образовывать пару оснований, или универсальное основание, (2) нуклеотид, не подходящий для спаривания оснований, модифицированный таким образом, что он не способен образовывать пару оснований, или (3) химическое соединение, не подходящее для спаривания оснований.

28. Набор по п. 25, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 1-5 группировок.

29. Набор по п. 28, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 2-5 следующих друг за другом группировок.

30. Набор по п. 25, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 10 нуклеотидов от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка.

31. Набор по п. 30, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 7 нуклеотидов от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка.

32. Набор по п. 30, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 5 нуклеотидов от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка.

33. Набор по п. 21, где нуклеотидная вариация представляет собой вариацию типа замены, вариацию типа делеции или вариацию типа вставки.

34. Набор по п. 21, где удлиненная цепь первого фрагмента и СТО образуют удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Т_пл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной первого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью, и/или длиной первого фрагмента и последовательностью, и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки.

35. Набор по п. 21, где PTO-NV и/или СТО блокирован по его 3'-концу, чтобы не допустить его удлинения.

36. Набор по п. 21, который используют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеотидных вариаций; при этом располагающийся "вверх по течению" праймер содержит по меньшей мере два типа располагающихся "вверх по течению" праймеров и PTO-NV содержит по меньшей мере два типа PTO-NV.

37. Набор по п. 22, где матричная полимераза нуклеиновых кислот, обладающая 5'-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

38. Набор по любому из пп. 21-37, дополнительно содержащий расположенный "вниз по течению" праймер.

39. Набор для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО) для применения в осуществлении способа по п. 20, содержащий:

(a) PTO-NV (зондирующий и метящий олигонуклеотид для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) СТО (захватывающий и матричный олигонуклеотид); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO-NV; и

(c) матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'-нуклеазной активностью, где матричная полимераза нуклеиновых кислот, обладающая 5'-нуклеазной активностью, индуцирует расщепление PTO-NV;

при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент;

при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО.