Способ оценки процесса апоптоза в ткани головного мозга лабораторных животных

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к нанотоксикологии, и касается критериев диагностики токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана (нAgAГ). Лабораторным животным опытной группы на протяжении 9 дней внутрижелудочно вводят водный раствор нAgAГ из расчета 100 мкг серебра на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды. Животным контрольной группы на протяжении 9 дней внутрижелудочно вводят 0,5 мл дистиллированной воды. Сразу после окончания воздействия изготавливают срезы тканей головного мозга животных обеих групп. Окрашивают их на антитела к белкам caspase-3 и bcl-2 и проводят обзорную микроскопию полученных препаратов. При этом подсчитывают общее количество клеток в 0,2 мм2, количество патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3, количество патологически измененных нейронов с экспрессией bcl-2, количество нормальных нейронов с экспрессией caspase 3, количество нормальных нейронов с экспрессией bcl-2 в процентах от общего количества клеток в 0.2 мм2. Вычисляют отношения этих показателей на препаратах опытной группы к аналогичным показателям контрольной группы. При увеличении в опытной группе числа патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3 в среднем в 1,6 раза, числа нормальных нейронов с экспрессией caspase 3 в среднем в 2,5 раза, патологически измененных нейронов с экспрессией bcl-2 в среднем в 2,4 раза, числа нормальных нейронов с экспрессией bcl-2 в 1,5 раза делают заключение о наличии процесса апоптоза в тканях головного мозга животных. Предлагаемый способ позволяет оценить функциональное состояние нейронов головного мозга при воздействие нанобиокомпозитов серебра, расширяет арсенал методов оценки действия токсических веществ на организм лабораторных животных. 1 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, общей токсикологии и нанотоксикологии и касается критериев диагностики токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана.

Использование наночастиц серебра в промышленности и медицине приобретает все большее значение и широкий размах. Так, например, на настоящий момент наночастицы серебра используются при изготовлении упаковочного материала [1], в стоматологии [2, 3]. Установлена высокая стабильность наночастиц серебра в окружающей среде, определены их антибактериальная и цитотоксическая активность, а также способность сохранять токсические свойства на протяжении длительного времени [4]. Выяснено, что механизм развития токсичности связан с окислительным стрессом, нарушением функций митохондрий и увеличением проницаемости мембраны [3].

В настоящее время, в связи с необходимостью снижения токсического эффекта, активно идет разработка и испытание различных природных и синтетических полимерных матриц - носителей наночастиц [4]. В наших исследованиях использовался арабиногалактан (АГ), полученный из лиственницы сибирской [5, 6]. Возможность широкого использования подобных нанобиокомпозитов требует расширенного изучения биологического ответа организма на воздействие наночастиц серебра, инкапсулировнных в данные полимерные матрицы.

В подобных исследованиях оценивается в основном биологическое действие наночастиц серебра на органы фильтрации (печень, почки), в то время как воздействие нанокомпозита на головной мозг практически не исследуется.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего судить о наличии в тканях процесса апоптоза клеток головного мозга экспериментальных животных при воздействии нанобиокомпозитов, содержащих наносеребро, расширение арсенала методов оценки патологических нарушений у экспериментальных животных.

Поставленная задача решается путем проведения иммуногистохимического анализа экспрессии проапоптотического белка caspase 3 и антиапоптотического белка bcl-2 в ткани головного мозга белых крыс при воздействия наночастиц серебра, инкапсулированных в полимерную матрицу арабиногалактана (нAgAГ), с последующей морфометрической обработкой и интерпретации полученного результата.

Уровень экспрессии белков является показателем функционального состояния ткани головного мозга при воздействии наночастиц серебра, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана. Данный способ позволяет уточнить причину развития патологического процесса в ткани головного мозга, а также дает более полное представление о течении патологического процесса в клетке и ткани в целом.

Способ осуществляется следующим образом: животные разделяются на две группы: опытную и контрольную. Животных опытной группы подвергают пероральному воздействию нAgAГ в дозировке 100 мг на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды в течение 9 дней. Животным контрольной группы на протяжении 9 дней внутрижелудочно вводят 0,5 мл дистиллированной воды. Сразу после окончания воздействия животные декапитируются. Готовят срезы тканей коры головного мозга животных из всех групп, иммуногистохимически окрашивают их на антитела к белку caspase-3 и bcl-2, при помощи обзорной микроскопии подсчитывают общее количество клеток в 0,2 мм2, определяют по отдельности количество патологически измененных нейронов с экспрессией белков caspase 3 и bcl-2, количество нормальных нейронов с экспрессией этих белков. Вычисляют изменение количества патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3 и bcl-2 в препаратах опытной группы относительно аналогичных показателей в препаратах контрольной группы; изменение нормальных нейронов с экспрессией белков caspase 3 и bcl-2 в препаратах опытной группы по сравнению с аналогичными характеристиками в препаратах контрольной группы. При увеличении числа патологически измененных нейронов с экспрессией белка caspase 3 в среднем в 1,6 раза в опытной группе в сравнении с контрольной группой, увеличении числа нормальных нейронов с экспрессией белка caspase 3 в среднем в 2,5 раза в опытной группе в сравнении с контрольной группой и увеличении патологически измененных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в среднем в 2,4 раза в опытной группе, увеличении числа нормальных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в среднем в 1,5 раза в опытной группе в сравнении с контрольной группой делают заключение о возникновении и развитии патологического процесса с преобладанием повреждений нейронов по типу апоптоза в ткани головного мозга сразу после окончания воздействия нанокомпозита серебра.

Таким образом, совместное использование показателей экспрессии вышеназванных белков позволяет более точно представить и охарактеризовать картину возникновения и развития процесса апоптоза в ткани.

В данном способе предлагаются качественные и количественные критерии морфометрических изменений в нейронах головного мозга, с помощью которых диагностируют поражение ткани головного мозга при воздействии нAgAГ, и дается их сравнительная характеристика.

Заявленное изобретение соответствует критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», так как оно может использоваться в экспериментальной медицине (токсикологии, фармакологии, патологической физиологии, патологической анатомии) для верификации моделирования патологических состояний центральной нервной системы животных. Технология оценки безопасности нанопрепаратов, основанная на морфологическом анализе структурных изменений внутренних органов и тканей организма и молекулярной диагностике экспрессии внутриклеточных белков, позволит не допускать к производству и применению лекарственные формы и диагностические препараты, способные вызывать неблагоприятные последствия воздействия.

Пример осуществления способа

Предлагаемый способ был применен на 40 особях беспородных белых крыс-самцов в трехмесячном возрасте и массой от 240 до 280 грамм. Животным опытной группы (20 особей) внутрижелудочно через зонд на протяжении 9 дней вводили водный раствор АГ с наночастицами серебра (нAgAГ) из расчета 100 мкг серебра на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды. После окончания воздействия животные были декапитированы. Животные контрольной группы (20 особей) получали на протяжении 9 дней внутрижелудочно 0,5 мл дистиллированной воды.

После декапитации головной мозг от каждого исследуемого животного был извлечен и фиксирован в нейтральном буферном растворе формалина (10%), обезвожен этанолом восходящей концентрации (70, 80, 90, 95 и 100%) и помещен в гомогенизированную парафиновую среду для гистологических исследований HistoMix (BioVitrum, Россия). Далее, с помощью микротома НМ 400 (Microm, Германия) изготавливались срезы толщиной 4-5 мкм. Для исследования биологического ответа организма на субклеточном уровне применяли имунногистохимический метод определения активности проапоптотического белка caspase 3 и антиапоптотического белка bcl-2. Полученные на микротоме срезы были помещены на полизиновые стекла (Menzel, Германия) и окрашены на антитела к белку caspase-3 (Monosan, Нидерланды) и bcl-2 в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Дополнительно для визуализации нервных клеток проводили окраску по Нисслю. Окрашенные срезы фиксировались полистиролом и накрывались покровным стеклом. После высыхания полистирола полученные микропрепараты просматривали на светооптическом исследовательском микроскопе. Исследование полученных срезов осуществляли при помощи светооптического исследовательского микроскопа Olympus ВХ 51 (Япония) с вводом микроизображений в компьютер при помощи камеры Olympus.

Далее при помощи системы микроскопии и анализа Image Scope М были проанализированы заранее выбранные параметры полученных фотоматериалов: количество патологически измененных нейронов с экспрессией проапоптотического белка caspase 3 и количество патологически измененных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в процентах от общего количества клеток в 0.2 мм2, количество нормальных нейронов с экспрессией белка caspase 3 и количество нормальных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в процентах от общего количества клеток в 0.2 мм2. Изменение показателя выражалось в отношении количественного показателя образца опытной группы к значению аналогичного показателя из контрольной группы.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0» (Statsoft Inc., США). Статистическую значимость различий в независимых выборках определяли по методу Манна-Уитни. Достигнутый уровень значимости признаков - при р<0,05.

Как видно из таблицы, в опытной группе по сравнению с контролем увеличилось количество патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3 в среднем в 2,5 раза, количество нормальных нейронов с экспрессией белка caspase 3 в среднем в 1,6 раза, также увеличилось по сравнению с контрольной группой количество патологически измененных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в среднем в 2.4 раза, а количество нормальных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в среднем в 1,5 раза. Учитывая полученные результаты, делают заключение о возникновении и развитии патологического процесса с преобладанием повреждений нейронов по типу апоптоза в ткани головного мозга сразу после окончания воздействия нанокомпозита серебра.

Предлагаемый способ позволяет оценить функциональное состояние нейронов головного мозга при воздействие нанобиокомпозитов серебра. Данный метод используется для моделей нейроинтоксикаций у экспериментальных животных. Он расширяет арсенал методов оценки действия токсических веществ на организм лабораторных животных, повышает точность верификации токсической энцефалопатии, позволяет оценивать функциональное состояние, наряду со структурными, благодаря морфометрической характеристике нейронов головного мозга, уточняя механизм развития патологического процесса по типу апоптоза.

Литература

1. Верников В.М., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Наночастицы серебра в природе, промышленности, упаковочных материалах, предназначенных для пищевых продуктов: характеристика возможных рисков / Вопросы питания 2009, №6, стр. 13-20.

2. Садыков М.И., Нестеров A.M., Фесик Е.В. // Изготовление съемных зубных протезов из акриловой пластмассы содержащей наночастицы серебра (лабораторное исследование) / Врач-аспирант, 2011, т. 49 №6.3, стр. 451-456.

3. Sahoo S.K., Parveen S., Panda J.J. // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2007. №3. P. 20-31.

4. Prozorova G.F., Pozdnyakov A.S., Kuznetsova N.P. et al. // International Journal of Nanomedicine, 2014. №9. 1883.

5. Lewinski N., Colvin V., Drezek R. // Small-journal 2008, 4, No. 1, 26-49.

6. Ji J.H. // Inhalation Toxicology 2007. Vol. 19. Iss. 10. P. 857-71.

7. Дубровина В.И., Медведева С.А. и др. Иммуномодулирующие свойства арабиногалактана лиственницы сибирской. - М.: Фармация, 2001. С. 26-27.

Способ оценки процесса апоптоза в ткани головного мозга лабораторных животных при воздействии арабиногалактана с наночастицами серебра (нAgAГ) на лабораторных животных, включающий воздействие на животных опытной группы токсикантом путем внутрижелудочного введения водного раствора нAgAГ из расчета 100 мкг серебра на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды на протяжении 9 дней и внутрижелудочное введение животным контрольной группы 0,5 мл дистиллированной воды на протяжении 9 дней, после чего сразу после окончания воздействия изготовление срезов тканей головного мозга животных обеих групп, окрашивание их на антитела к белкам caspase-3 и bcl-2 и проведение обзорной микроскопии полученных препаратов, при которой подсчитывают общее количество клеток в 0,2 мм2, количество патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3, количество патологически измененных нейронов с экспрессией bcl-2, количество нормальных нейронов с экспрессией caspase 3, количество нормальных нейронов с экспрессией bcl-2 в процентах от общего количества клеток в 0.2 мм2, вычисляют отношения этих показателей на препаратах опытной группы к аналогичным показателям контрольной группы и при увеличении в опытной группе числа патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3 в среднем в 1,6 раза, числа нормальных нейронов с экспрессией caspase 3 в среднем в 2,5 раза, патологически измененных нейронов с экспрессией bcl-2 в среднем в 2,4 раза, числа нормальных нейронов с экспрессией bcl-2 в 1,5 раза делают заключение о наличии процесса апоптоза в тканях головного мозга животных.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и предназначено для создания модели ишемии глаза. Для этого кролику субконъюнктивально вводят 0.1-0.3 мл 1% раствора фенилэфрина.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к фармакологии, и может быть использовано для коррекции окислительного стресса в условиях ультрафиолетового облучения.

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для изучения процесса накопления магнитных наночастиц в заданном участке сосудистой системы под воздействием внешнего магнитного поля.

Изобретение относится к медицине, в частности к стоматологии, и предназначено для применения при демонстрации на моделях возможности прогнозирования возникновения патологических изменений зубочелюстного (зубоальвеолярного) комплекса при использовании ортодонтических конструкций.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной кардиофармакологии, и касается моделирования эндотелиальной дисфункции, ассоциированной с системным воспалением низкой градации и окислительным стрессом.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, хирургии, травматологии и дерматологии. Для моделирования трофической язвы венозной этиологии у кролика линии Шиншилла, интраоперационно на внутренней поверхности бедра проводят оперативный доступ к бедренной вене с последующим прошиванием через центр сосуда проленом 7/0 и перевязкой 1/2 вены до сужения просвета в 2 раза.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и хирургии, и может быть использовано для коррекции ишемии скелетной мышцы. Для этого на фоне моделирования ишемии скелетной мышцы проводят ее коррекцию путем внутрижелудочного введения комбинации варденафила в дозе 0,09 мг/кг и пентоксифиллина 30 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 7 дней.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и хирургии, и может быть использовано для коррекции ишемии скелетной мышцы. Для этого на фоне моделирования ишемии скелетной мышцы проводят ее коррекцию путем внутрижелудочного введения комбинации силденафила в дозе 0,22 мг/кг и пентоксифиллина 30 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 7 дней.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и хирургии, и может быть использовано для коррекции ишемии скелетной мышцы. Для этого на фоне моделирования ишемии скелетной мышцы проводят ее коррекцию путем внутрижелудочного введения комбинации тадалафила в дозе 0,09 мг/кг и пентоксифиллина в дозе 30 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 7 дней.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине и андрологии. Для лечения первичного мужского гипогонадизма в эксперименте проводят трансплантацию аллогенной ткани костного мозга лабораторному животному с первичным мужским гипогонадизмом, смоделированным на основании временной ишемии тестикул.

Группа изобретений относится к медицине. Описаны изделия, включающие первый слой из волокон бамбука или органического хлопка, выполненный с возможностью приведения его в контакт с кожей пользователя, слой из нетканого материала, в центральной области которого расположен элемент, выполненный из волокон полипропилена и термостойких эластомеров с абсорбированным ими турмалиновым порошком с нанометрическим размером частиц, и слой, противолежащий по отношению к первому слою и содержащий в своем составе материалы, обеспечивающие возможность вентиляции изделия и в то же самое время представляющие барьер для протекания влаги.

Изобретение относится к катализатору для гидроизомеризации дизельного топлива, который может быть использован для получения низкозастывающего дизельного топлива с высокими выходом целевого продукта.

Изобретение относится к области химии и технологии получения и переработки полимерных композиций, конкретно к полимерным композициям, сохраняющим длительную работоспособность в наиболее агрессивных средах, преимущественно в растворах фтористоводородной (плавиковой) кислоты.

Изобретение относится к электропроводящим покрытиям, которые могут быть использованы в электротехнике, электронике и химической промышленности. Композиция электропроводящего покрытия содержит пленкообразующую смолу и 0,1-95 мас.% полученных термическим способом частиц графенового углерода в расчете на общее содержание твердых веществ в комбинации с другим типом графеновых частиц, например полученных из терморасширенного графита.

Изобретение относится к области плазменной техники и может быть использовано для выделения пучков электронов из плазмы рабочей среды, создания электрических генераторов на основе энергии электронных пучков, электрореактивных двигателей, электронно-лучевых и ионно-лучевых приборов.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ инкапсуляции препарата методом осаждения нерастворителем, отличающийся тем, что в качестве ядер нанокапсул используются водорастворимые цефалоспориновые антибиотики, в качестве оболочки альбумин человеческий сывороточный при соотношении оболочка:ядро 1:1 или 3:1, при этом водорастворимые цефалоспориновые антибиотики в виде порошка и препарат Е472с в качестве поверхностно-активного вещества добавляют к раствору альбумина, полученную смесь перемешивают и после растворения компонентов медленно по каплям добавляют петролейный эфир, полученную суспензию нанокапсул отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и сушат.

Изобретение относится к области инкапсуляции. Описан способ получения нанокапсул аспирина.

Изобретение относится к области химии, в частности к полимерным эпоксидным композициям холодного отверждения, и может быть использовано для склеивания и ремонта стеклопластиковых конструкций, в том числе и во влажных условиях - при нанесении на влажные и мокрые поверхности.
Изобретение относится к области медицины, фармацевтики и нанотехнологий. Предлагается фармацевтическая композиция, обладающая антимикробной и противогрибковой активностью, содержащая трийодметан, нанесенный на алюмосиликатные нанотрубки с внешним диаметром трубок - 60-160 нм, внутренним диаметром - 10-60 нм и длиной трубок - 100-5000 нм, взятые при следующих соотношениях, масс.%: трийодметан 50, алюмосиликатные нанотрубки 50.

Изобретение относится к промышленности строительных материалов, а именно к способу приготовления дисперсно-армированного строительного раствора для монолитных полов, и может быть использовано при изготовлении монолитных покрытий полов и стяжек на основе цементного раствора.

Изобретение относится к способу получения стабилизированных частиц йодида серебра. Способ включает приготовление первого раствора, представляющего собой раствор йодида калия с концентрацией 0,216-3,6 ммоль/л, приготовление второго раствора, образованного из водного раствора нитрата серебра с концентрацией 0,36-6,0 ммоль/л и из раствора полиэлектролитного стабилизатора с концентрацией 1,0-10,0 ммоль/л, смешение обоих растворов при нормальных условиях путем приливания первого раствора ко второму раствору с образованием стабилизированных частиц йодида серебра, имеющих средний размер 1,3-1,9 нм. Заявленный способ обеспечивает получение наномерных частиц йодида серебра с узким распределением по размерам, а также упрощение способа их получения. Cтабилизированные частицы йодида серебра можно применять в качестве каталитических систем в процессах деструкции органических веществ или антимикробных растворов. 2 ил., 4 пр.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к нанотоксикологии, и касается критериев диагностики токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана. Лабораторным животным опытной группы на протяжении 9 дней внутрижелудочно вводят водный раствор нAgAГ из расчета 100 мкг серебра на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды. Животным контрольной группы на протяжении 9 дней внутрижелудочно вводят 0,5 мл дистиллированной воды. Сразу после окончания воздействия изготавливают срезы тканей головного мозга животных обеих групп. Окрашивают их на антитела к белкам caspase-3 и bcl-2 и проводят обзорную микроскопию полученных препаратов. При этом подсчитывают общее количество клеток в 0,2 мм2, количество патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3, количество патологически измененных нейронов с экспрессией bcl-2, количество нормальных нейронов с экспрессией caspase 3, количество нормальных нейронов с экспрессией bcl-2 в процентах от общего количества клеток в 0.2 мм2. Вычисляют отношения этих показателей на препаратах опытной группы к аналогичным показателям контрольной группы. При увеличении в опытной группе числа патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3 в среднем в 1,6 раза, числа нормальных нейронов с экспрессией caspase 3 в среднем в 2,5 раза, патологически измененных нейронов с экспрессией bcl-2 в среднем в 2,4 раза, числа нормальных нейронов с экспрессией bcl-2 в 1,5 раза делают заключение о наличии процесса апоптоза в тканях головного мозга животных. Предлагаемый способ позволяет оценить функциональное состояние нейронов головного мозга при воздействие нанобиокомпозитов серебра, расширяет арсенал методов оценки действия токсических веществ на организм лабораторных животных. 1 пр., 1 табл.

Наверх