Способ определения о-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-n-метилкарбамата и о-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-n-(дибутиламиносульфенил)-n-метилкарбамата в биологическом материале

Изобретение относится к области аналитической химии, и касается способа определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в биологическом материале. Сущность способа заключается в том, что биологический объект, содержащий O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, измельчают, трижды обрабатывают смесью ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, каждый раз в течение 30 минут. Полученные извлечения объединяют, экстрагент испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном. Ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле. Полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, образующийся водно-ацетонитрильный раствор насыщают хлоридом натрия. Далее дважды экстрагируют этилацетатом, органические экстракты объединяют, упаривают до сухого остатка. Остаток растворяют в ацетоне, вносят в макроколонку сорбента, которым является силикагель КСС №3 80/120 мкм. Процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 8:2 по объему. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле. Далее проводят определение исследуемого вещества хромато-масс-спектрометрическим методом в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм), используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективным детектором, работающим в режиме электронного удара, где начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70 до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200 до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ. Регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество ализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или O-(2,3-дигнщро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика. Использование способа позволяет с высокой точностью определять O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в биологическом материале. 4 табл. 3 пр.

 

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале, заключающийся в том, что биологическую пробу измельчают, обрабатывают хлороформом в течение 20 минут, хлороформную вытяжку отделяют, фильтруют через безводный сульфат натрия, хлороформ из фильтрата испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в воде, полученный раствор экстрагируют дважды хлороформом, экстракты объединяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, фильтрат упаривают при 80°С до незначительного объема, хроматографируют в тонком слое силикагеля на пластинках «Силуфол» с применением подвижной фазы гексан-ацетон в соотношении 3:2 по объему, а полученные хроматограммы проявляют путем последовательной обработки водно-этанольным раствором гидроксида калия и раствором соли диазония (Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т. 1. - М.: Колос, 1992. - С. 402-406).

Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и точностью.

Известен способ определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, неоднократно (дважды) обрабатывают смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 1:1 по объему, каждый раз в течение 30 минут, полученные извлечения объединяют, экстрагент испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор вносят в колонку с сорбентом, в качестве которого используется силикагель, растворитель испаряют, процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу, которой является смесь растворителей гексан-ацетон (9:1), фракции элюата, содержащие O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 5:5 по объему и проводят определение физико-химическим методом, которым является метод ВЭЖХ, в колонке с неподвижной фазой «Новопак С-18» с применением подвижной фазы ацетонитрил-вода в соотношении 5:5 по объему и детектора на основе фотодиодной матрицы (Патент 2269780 Российская Федерация, МПК G01N 33/50 (2006.01) / Способ определения О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале / Шорманов В.К., Коваленко Е.А., Иванов В.П., Королев В.А., Дурицын Е.П., Пистунович Е.В.; заявители и патентообладатели Шорманов В.К., Коваленко Е.А., Иванов В.П., Королев B.A. (RU) - №2004117514/15; Заяв. 08.06.2004; Опуб. 10.02.2006 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2006. - №4. - 9 с).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Наиболее близким является способ определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, неоднократно (трижды) обрабатывают смесью ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 1:1 по объему, каждый раз в течение 30 минут, полученные извлечения объединяют, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, дважды экстрагируют этилацетатом при соотношении объемов водной и органической фаз 1:1 на каждом этапе экстракции, этилацетатные экстракты объединяют, упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в ацетонитриле, к раствору прибавляют воду до достижения объемного соотношения между ацетонитрилом и водой 4:6, полученный раствор вносят в макроколонку сорбента «Силасорб С-18», процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в соотношении 4:6 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,33 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество анализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика (Патент 2548742 Российская Федерация, МПК G01N 33/52 (2006.01) / Способ определения О-(2,3-дигадро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале / Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Терских А.П., Алехина М.И.; заявитель и патентообладатель Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации» (RU). - №2014109737; заяв. 03.12.2014; опуб. 20.04.2015 // Изобретения (Заявки и патенты). - №11. - 12 с.

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект измельчают, неоднократно (трижды) обрабатывают смесью ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, каждый раз в течение 30 минут, полученные извлечения объединяют, экстрагент испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, образующийся водно-ацетонитрильный раствор насыщают хлоридом натрия, дважды экстрагируют этилацетатом, объем которого на каждом этапе экстракции составляет 80% процентов от объема водно-ацетонитрильного раствора, органические экстракты объединяют, упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, вносят в макроколонку сорбента, которым является силикагель КСС №3 80/120 мкм, процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 8:2 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество ализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или O-(23-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика.

Способ осуществляется следующим образом: биологический объект, содержащий O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или О-(2,3-дигадро-2,2-диметилбеюофуранил-7)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, измельчают, неоднократно (трижды) обрабатывают смесью ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, каждый раз в течение 30 минут, полученные извлечения объединяют, экстрагент испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, образующийся водно-ацетонитрильный раствор насыщают хлоридом натрия, дважды экстрагируют этилацетатом, объем которого на каждом этапе экстракции составляет 80% процентов от объема водно-ацетонитрильного раствора, органические экстракты объединяют, упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, вносят в макроколонку сорбента, которым является силикагель КСС №3 80/120 мкм, процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 8:2 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дабутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество ализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензо-фуранил)-N-метилкарбамата в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С.

По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, неоднократно (трижды) обрабатывают смесью ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, каждый раз в течение 30 минут. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях еще дважды. Все полученные извлечения объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, сульфат натрия и фильтр дополнительно промывают 20 г смеси ацетон-этилацетат в соотношении 6:4 по объему, фильтрат и промывную жидкость объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при 18-20°С до полного удаления растворителя.

Остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают при энергичном перемешивании порциями (по 15 г каждая) ацетона, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при температуре 18-20°С.

Остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила, полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, прибавляя 40 мл воды, образующийся водно-ацетонитрильный раствор насыщают хлоридом натрия, дважды экстрагируют порциями этилацетата по 40 мл каждая, обеспечивая условие, при котором объем этилацетата на каждом этапе экстракции составляет 80% процентов от объема водно-ацетонитрильного раствора. Отдельные органические экстракты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-20°С до получения сухого остатка.

Остаток растворяют в 2-3 мл ацетона, смешивают полученный раствор с 1,5 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм, испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха при температуре 18-20°С и вносят данную смесь в стеклянную хроматографическую макроколонку размером 490×11 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 8:2 по объему. Элюат собирают фракциями по 2 мл каждая. Фракции элюата с 8 по 17 включительно, содержащие анализируемое вещество, которым является О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют при 18-20°С вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного удаления растворителя.

Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 4,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 7890 В с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество анализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1,0 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 7,25 мин соответствует O-(2,3-дигадро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метил-карбамату. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 41, 51, 77, 91, 103, 122, 131, 149, 164, 221. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 164, интенсивность которой принимается за 100%. Частица с массовым числом 221 является молекулярным ионом.

O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,01, 0,05, 0,2, 1,0, 2,5, 10,0, 15,0 и 20,0 мл 0,05% раствора O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в метаноле и доводят объем содержимого каждой колбы до метки метанолом.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 7890 В с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество анализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1,0 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 4⋅10^-10-8⋅10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=2705091⋅C+24340,

где S - площадь хроматографического пика; С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензо-фуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С.

По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, неоднократно (трижды) обрабатывают смесью ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, каждый раз в течение 30 минут. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях еще дважды. Все полученные извлечения объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, сульфат натрия и фильтр дополнительно промывают 20 г смеси ацетон-этилацетат в соотношении 6:4 по объему, фильтрат и промывную жидкость объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при 18-20°С до полного удаления растворителя.

Остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают при энергичном перемешивании порциями (по 15 г каждая) ацетона, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при температуре 18-20°С.

Остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила, полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, прибавляя 40 мл воды, образующийся водно-ацетонитрильный раствор насыщают хлоридом натрия, дважды экстрагируют порциями этилацетата по 40 мл каждая, обеспечивая условие, при котором объем этилацетата на каждом этапе экстракции составляет 80% процентов от объема водно-ацетонитрильного раствора. Отдельные органические экстракты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-20°С до получения сухого остатка.

Остаток растворяют в 2-3 мл ацетона, смешивают полученный раствор с 1,5 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм, испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха при температуре 18-20°С и вносят данную смесь в стеклянную хроматографическую макроколонку размером 490×11 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 8:2 по объему. Элюат собирают фракциями по 2 мл каждая. Фракции элюата с 4 по 7 включительно, содержащие анализируемое вещество, которым является О-(2,3-дигадро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют при 18-20°С вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного удаления растворителя.

Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 4,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 7890 В с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество анализируемого вещества, которым является O-(2,3-Дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1,0 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 11,36 мин соответствует O-(2,3-дигадро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамату. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 41, 57, 76, 91, 118, 135, 160, 164, 195, 220, 251, 323, 380. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 160, интенсивность которой принимается за 100%. Частица с массовым числом 380 является молекулярным ионом.

O-(2,3-Дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,005, 0,025, 0,1, 0,5, 2,5, 10,0, 15,0 и 20,0 мл 0,05% раствора O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в метаноле и доводят объем содержимого каждой колбы до метки метанолом.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 7890В с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество анализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1,0 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 2⋅10^-10-8⋅10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=9005357⋅C- 14511,

где S - площадь хроматографического пика; С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в ткани легких представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензо-фуранил)-N-метилкарбамата и О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в ткани печени при совместном присутствии

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют по 10 мг O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществами и оставляют на сутки при температуре 18-20°С.

По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемые вещества, неоднократно (трижды) обрабатывают смесью ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, каждый раз в течение 30 минут. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях еще дважды. Все полученные извлечения объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, сульфат натрия и фильтр дополнительно промывают 20 г смеси ацетон-этилацетат в соотношении 6:4 по объему, фильтрат и промывную жидкость объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при 18-20°С до полного удаления растворителя.

Остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают при энергичном перемешивании порциями (по 15 г каждая) ацетона, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при температуре 18-20°С.

Остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила, полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, прибавляя 40 мл воды, образующийся водно-ацетонитрильный раствор насыщают хлоридом натрия, дважды экстрагируют порциями этилацетата по 40 мл каждая, обеспечивая условие, при котором объем этилацетата на каждом этапе экстракции составляет 80% процентов от объема водно-ацетонитрильного раствора. Отдельные органические экстракты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-20°С до получения сухого остатка.

Остаток растворяют в 2-3 мл ацетона, смешивают полученный раствор с 1,5 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм, испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха при температуре 18-20°С и вносят данную смесь в стеклянную хроматографическую макроколонку размером 490×11 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 8:2 по объему.

Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.

Фракции элюата с 4 по 7 включительно, содержащие анализируемое вещество, которым является O-(2,3-дигадро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют при 18-20°С вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного удаления растворителя.

Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А-1). 2,0 мл раствора Α-1 вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б-1) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл раствора Б-1 вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 7890В с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70 до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200 до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество анализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1,0 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 11,36 мин соответствует O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамату. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 41, 57, 76, 91, 118, 135, 160, 164, 195, 220, 251, 323, 380. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 160, интенсивность которой принимается за 100%. Частица с массовым числом 380 является молекулярным ионом.

O-(2,3-дигадро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание O-(2,3-дигвдро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Схема построения градуировочного графика для определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метил-карбамата приводится выше в примере 2.

Результаты количественного определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в ткани печени при его совместном присутствии с O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбаматом представлены в таблице 3.

Фракции элюата с 8 по 17 включительно, содержащие анализируемое вещество, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют при 18-20°C вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного удаления растворителя.

Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А-2). 4,0 мл раствора А-2 вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б-2) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл раствора Б-2 вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 7890В с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество анализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1,0 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 7,25 мин соответствует O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метил-карбамату. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 41, 51, 77, 91, 103, 122, 131, 149, 164, 221. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 164, интенсивность которой принимается за 100%. Частица с массовым числом 221 является молекулярным ионом.

O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Схема построения градуировочного графика для определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата приводится выше в примере 1.

Результаты количественного определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в ткани печени при его совместном присутствии с O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбаматом представлены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 5 раз повышает чувствительность определения в детектируемой пробе ив 17,5 раза - в биологическом материале.

Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 4.

Способ определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, неоднократно (трижды) обрабатывают смесью ацетона и этилацетата каждый раз в течение 30 минут, полученные извлечения объединяют, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, дважды экстрагируют этилацетатом, экстракты объединяют, упаривают до сухого остатка, остаток растворяют, вносят в макроколонку сорбента, процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя 150°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество анализируемого вещества по площади хроматографического пика, отличающийся тем, что смесь ацетона и этилацетата берут в соотношении 6:4 по объему, после испарения экстрагента остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, перед экстракцией этилацетатом образующийся водно-ацетонитрильный раствор насыщают хлоридом натрия, при экстракции этилацетатом его объем на каждом этапе экстракции составляет 80% процентов от объема водно-ацетонитрильного раствора, после упаривания органических экстрактов до сухого остатка остаток растворяют в ацетоне, сорбентом в макроколонке является силикагель КСС №3 80/120 мкм, в качестве двухкомпонентной подвижной фазы используется гексан-диоксан в соотношении 8:2 по объему, при определении методом хромато-масс-спектрометрии используют капиллярную колонку HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм, газ-носитель гелий подается со скоростью 1,0 мл/мин, начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70 до 200°C со скоростью 40°C в минуту, а затем от 200 до 290°C со скоростью 12,5°C, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура интерфейса детектора составляет 290°C.