Способ криоконсервирования тромбоцитов



Способ криоконсервирования тромбоцитов
Способ криоконсервирования тромбоцитов
Способ криоконсервирования тромбоцитов
Способ криоконсервирования тромбоцитов
Способ криоконсервирования тромбоцитов
A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2623081:

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы (RU)

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансфузиологии, и предназначено для заготовки тромбоцитов длительного хранения. Осуществляют отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК) с концентрацией 1×109/мл-1,5×109/мл, содержащих 40-70% тромбоцитов с гранулами и тромбоциты с адгезивной активностью 40-70%. Разделяют ТК на тромбоцитсодержащую часть и плазму центрифугированием. Готовят комбинированный криопротектор, содержащий 55% ДМСО и 5% декстран 40, разводя криопротектор плазмой до конечной концентрации ДМСО 10-15%. Ресуспендируют тромбоцитсодержащую часть разведенным криопротектором, который вводят в тромбоцитсодержащую часть по 1-3 мл с интервалами 1-3 мин до конечной концентрации ДМСО 5-7%. Замораживают суспензию тромбоцитов и плазму со скоростью 1-3°/мин при минус 80°С-минус 100°С и хранят их при минус 85°С-минус 196°С. Размораживают контейнеры нагреванием при 37-40°С в течение 2-10 мин. Ресуспендируют размороженные тромбоциты плазмой в соотношении 1:9 в течение 10 мин и хранят их при 20-24°С и постоянном перемешивании не более 4 часов до трансфузии. Использование изобретения позволяет повысить качество получаемых после размораживания криоконсервированных тромбоцитов. 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 2 пр.

 

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и может быть использовано для заготовки тромбоцитов длительного хранения (до 24 месяцев), пригодных к трансфузии.

Уровень техники

Известен способ криоконсервации богатой тромбоцитами плазмы без использования криопротекторов [патент РФ на изобретение «Способ криоконсервации богатой тромбоцитами плазмы» авторы Суханов В.А., Трофимов И.М., Левит А.Л., №2138162, 1999], согласно которому плазму помещают в контейнер с жидким азотом, располагают контейнер между двумя металлическими пластинами, после чего последовательно подвергают процессам замораживания, хранения и размораживания, при этом процесс замораживания плазмы ведут при скорости 2-3°С/с, процесс размораживания - при скорости 1,5-2°С/с, до начала таяния, а затем нагревают плазму при температуре 37°С. Однако этот способ не включает оценку параметров структурной полноценности и функциональной активности тромбоцитов человека.

Известен способ криоконсервирования тромбоцитов в присутствии 10% ДМСО, предусматривающий отмывание тромбоцитов от ДМСО и разведение плазмой тромбоцитов после размораживания [Khuri S.F., Healey N., MacGregor H. et al. Comparison of the effects of transfusions of cryopreserved and liquid-preserved platelets on hemostasis and blood loss after cardiopulmonary bypass J Thorac Cardiovasc Surg 1999; 117: 172-84]. Однако данный способ часто приводит к значительному увеличению содержания в концентрате тромбоцитов активированных клеток, что повышает риск развития тромбоэмболических осложнений при их трансфузии.

Наиболее близкой к заявляемому решению является технология криоконсервирования тромбоцитов с ДМСО и хранение клеток при -80°С [С. Robert Valery, Gina Rango, and Shukri Khuri Freezing human platelets with 6 percent dimethyl sulfoxide with removal of the supernatani solution before freezing and storage at -80°C without postthaw processing // Transfusion 2005; 45: 1890-1898]. Исходные тромбоцитные концентраты (ТК) получают путем аппаратного афереза на сепараторах Cobe Spectra и Amicus, общий объем ТК составляет 200-300 мл, содержание тромбоцитов - от 3,5 до 4,0×1011 клеток в 1 дозе (концентрация 1,3-2,0×109 в мл). Оценка качества клеток ТК проводится перед процедурами криоконсервирования и после размораживания ТК и включает следующие параметры: количество тромбоцитов (109/мл); рН тромбоконцентрата, величину R-периода на тромбоэластограмме, агрегационную активность тромбоцитов (индукторы - 50 мкг/мл арахидоновой кислоты и 2 мкМоль/л АДФ); продукцию тромбоксана В2 после стимуляции 50 мкг/мл арахидоновой кислоты и 2 мкМоль/л АДФ; содержание аннексин-положительных тромбоцитов. Процедура подготовки ТК к криоконсервированию включает 4 технологических этапа: внесение криопротектора в дозу ТК; центрифугирование дозы ТК в присутствии криопротектора; удаление избытка криопротектора с бесклеточной плазмой после центрифугирования; ресуспендирование клеток ТК с криопротектором. В качестве криопротектора используют солевой раствор 27% ДМСО (эндоцитарный криопротектор), который добавляют к ТК при постоянном покачивании с частотой 180 колебаний в минуту до конечной концентрации 6% ДМСО в ТК. Затем ТК центрифугируют при 1250 g в течение 10 минут с целью удаления супернатанта, содержащего избыток ДМСО. Весь супернатантный раствор удаляют. Это снижает остаточное количество ДМСО в замороженном ТК как минимум на 95%. Оставшийся осадок объемом 10-15 мл ресуспендируют покачиванием в течение 3-5 минут, контейнер с суспензией тромбоцитов помещают в защитный полимерный пакет, затем в картонную коробку и замораживают на дне механического морозильника при минус 80°С. Размораживание тромбоцитов проводится в водяной бане (Thermogenesis), при температуре 36°С в течение 5 минут. Размороженную суспензию тромбоцитов разводят 10-20 мл 0,9% раствора NaCl с целью уменьшения общей концентрации клеток, увеличения объема ТК, а также для уменьшения концентрации ДМСО в дозе размороженных тромбоцитов. Трансфузия размороженного ТК проводится через фильтр диаметром 170 микрон.

Однако данный метод для определения качества клеток ТК использует параметры агрегометрии, тромбоэластографии и проточной цитометрии, которые не отражают структурную целостность тромбоцитов, что снижает достоверность общего анализа клеток ТК до и после криоконсервирования и не позволяет оценить сохранность (в %) биологически полноценных клеток в ТК после криоконсервирования; использует только эндоцитарный (внутриклеточный) криопротектор ДМСО, который обладает низкой способностью к сохранению наружных мембранных структур клеток при заморозке, что повышает риск повреждения тромбоцитарных рецепторов; процедура подготовки ТК к криоконсервированию включает 4 последовательных технологических этапа, которые в сумме занимают 25-30 мин, что существенно повышает риск токсического действия ДМСО на тромбоциты; для разведения размороженных тромбоцитов используется 0,9% раствор NaCl, не обладающий буферными свойствами, что приводит к образованию в ТК кислой среды (рН=6.5-6.6) и повышает риск повреждения тромбоцитов; разведение размороженных ТК 0,9% раствором NaCl снижает конечную концентрацию ДМСО в ТК только до 3%, что является недостаточным для достижения концентрации, нетоксичной для тромбоцитов человека (0,5%); размороженная доза ТК обладает очень высокой осмолярностью (800-860 мОсмоль/л при физиологической норме 300-380 мОсмоль/л) и повышает риск развития у пациентов пострансфузионных реакций.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка технологии криоконсервирования тромбоцитов человека для получения лечебных доз тромбоцитного концентрата длительного хранения с высокой сохранностью биологически полноценных тромбоцитов, обеспечивающей хранение тромбоцитов после размораживания при температуре 20-24°С и нетоксичных для пациентов.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является повышение качества получаемых после размораживания криоконсервированных тромбоцитов за счет используемого комплекса: технологических операций, качественных и количественных параметров криопротектора и режимов, позволяющих сократить время контакта тромбоцитов с криопротектором, сохранить гораздо большее число биологически полноценных тромбоцитов (в 1,5-1,8 раза по сравнению с технологией по прототипу), хранить размороженные ТК при комнатной температуре в течение 4 часов без угрозы потери структурной или функциональной полноценности тромбоцитов, получить осмолярность дозы ТК, соответствующей физиологической норме, не вызывающей развития у пациентов посттрансфузионных реакций.

Поставленная задача решается тем, что способ криоконсервирования тромбоцитов включает следующие этапы:

- отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК) объемом от 180 до 220 мл с концентрацией тромбоцитов от 1×109/мл 1,5×109/мл, содержащих от 40% до 70% тромбоцитов с гранулами и тромбоциты с адгезивной активностью от 40% до 70%;

- разделение ТК на тромбоцитсодержащую часть (8-12 мл) и плазму (172-208 мл) центрифугированием с последующим отделением плазмы от тромбоцитсодержащей части;

- приготовление комбинированного криопротектора, содержащего 55% ДМСО и 5% декстран 40, путем разведения криопротектора плазмой до конечной концентрации ДМСО от 10 до 15%;

- ресуспендирование тромбоцитсодержащей части разведенным криопротектором, который вводят в тромбоцитсодержащую часть по 1-3 мл с интервалами 1-3 минуты при постоянном перемешивании и доводят объем суспензии тромбоцитов в криопротекторе от 20 до 24 мл до конечной концентрации ДМСО в суспензии тромбоцитов от 5 до 7%;

- замораживание суспензии тромбоцитов и плазмы со скоростью 1-3°/мин в отдельных контейнерах в морозильной камере при температуре от минус 80 до минус 100°С;

- хранение замороженных тромбоцитов и плазмы при температуре от минус 85°С до минус 196°С;

- размораживание контейнеров с замороженными тромбоцитами и плазмой нагреванием при температуре от 37 до 40°С в течение от 2 до 10 минут;

- ресуспендирование размороженных тромбоцитов плазмой, совместимой по системе АВО, в соотношении 1:9, в течение 10 минут;

- хранение размороженных тромбоцитов до трансфузии при температуре от 20 до 24°С и постоянном перемешивании не более 4 часов.

При этом после размораживания измеряют следующие параметры тромбоцитов: количество тромбоцитов, количество тромбоцитов с гранулами и количество адгезивно активных тромбоцитов. Данную информацию наносят на контейнер для последующего выбора контейнера с необходимыми параметрами для транфузии конкретному пациенту в зависимости от его антропометрических характеристик.

Кроме того, разделение ТК на тромбоцитсодержащую часть и плазму может быть реализовано с помощью центрифугирования со скоростью от 1100 g до 1400 g в течение от 7 до 12 минут. В качестве криопротектора может быть использован DIMETYLSULFOXIDE/DEXTRAN 40 SOLUTION (Cryopreservative Solution) 5 ml. Ресуспендирование тромбоцитсодержащей части криопротектором осуществляют в течение от 9 до 12 минут. Размороженные тромбоциты ресуспендируют добавлением от 172 до 208 мл размороженной плазмы по 20 мл через 1-2 минуты в контейнер с 15-25 мл размороженными тромбоцитами. Качество размороженных тромбоцитов определяется следующими параметрами: объем от 180 до 220 мл, сохранность тромбоцитов не менее 75% от исходного, сохранность тромбоцитов с гранулами и тромбоцитов с адгезивной активностью не менее 50% от исходного. Для приготовления комбинированного криопротектора с конечной концентрации ДМСО от 10 до 15% исходный криопротектор разводят плазмой в объемном соотношении 1:9. Ресуспендирование тромбоцитсодержащей части разведенным криопротектором для получения суспензии тромбоцитов с конечной концентрацией ДМСО от 5 до 7% осуществляют в объемном соотношении 1:1.

Таким образом, поставленная задача решается за счет внедрения в процедуру криоконсервирования адекватных методов параллельного анализа структурной целостности и функциональной активности тромбоцитов человека до и после процедур криоконсервирования, использования комбинированного эндоцитарного и экзоцитарного криопротектора, предварительное разделение ТК путем центрифугирования на тромбоцитный концентрат и бедную тромбоцитами плазму с последующим криоконсервированием тромбоцитного концентрата и бедной тромбоцитами плазмы при минус 80°С, хранения криоконсервированного ТК в жидком азоте при минус 196°С не менее 180 суток до 24 месяцев с целью карантинизации тромбоцитов и плазмы, размораживания при 37°С и ресуспендирование криоконсервированного тромбоцитного концентрата до концентрации тромбоцитов 1,5×109/мл и снижения концентрации ДМСО менее 0,5%, оценки сохранности биологически полноценных тромбоцитов.

Использование адекватного метода морфофункционального анализа тромбоцитов человека позволило оптимизировать оценку качества клеток в ТК на разных этапах криоконсервирования. В качестве такого приема был предложен разработанный ранее способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека [Патент РФ на изобретение №2485502 «Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека», авторы Хубутия М.Ш., Макаров М.С., Хватов В.Б., Высочин И.В., Кобзева Е.Н., Боровкова Н.В., Конюшко О.И., 20.06.2013], основанный на витальном (прижизненном) окрашивании тромбоцитов флуорохромным красителем на основе трипафлавина и акридинового оранжевого с последующим их анализом во флуоресцентном микроскопе. Данный метод позволяет параллельно оценить структурную целостность и функциональную активность тромбоцитов независимо от их концентрации в пробе, в том числе - в бесплазменной среде. Таким образом, используя данный метод, появляется возможность оценить общее содержание биологически полноценных тромбоцитов в исследуемом ТК (109/мл), а также оценить сохранность таких клеток после разных процедур криоконсервирования. Проведенные исследования показывают, что биологически полноценными (с нормальной структурой и функциями) являются лишь те тромбоциты, в которых при витальном окрашивании отчетливо выявляются гранулы - не менее 3 гранул диаметром более 300 мкм на клетку во флуоресцентном микроскопе, яркость свечения клетки - не менее 40 фут-кандел (Макаров М.С., Кобзева Е.Н., Высочин И.В., Боровкова Н.В., Хватов В.Б. Морфофункциональный анализ тромбоцитов человека с помощью витального окрашивания // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - №9. - С. 388-391). Следовательно, оценка содержания тромбоцитов с гранулами может быть использована для контроля качества клеток ТК до и после криоконсервирования.

При экспозиции богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) с ДМСО в конечной концентрации от 0,5 до 20% при комнатной температуре было установлено, что в процессе контакта с ДМСО биологическая полноценность клеток БоТП снижается, параллельно с этим уменьшается содержание тромбоцитов с гранулами (табл. 1). Так, при 0,5% ДМСО содержание тромбоцитов с гранулами в БоТП практически не менялось в течение 2 часов при комнатной температуре, через 4 часа снижалось на 7-10%, через 20 часов - на 70%. При концентрации ДМСО от 1 до 20% динамика снижения числа тромбоцитов с гранулами была сходной в течение первых двух часов: через 1 час потеря тромбоцитов с гранулами составила 10-20%, через 2 часа - 40-50%, через 4 часа - от 60 до 80%, через 20 часов тромбоциты с гранулами в БоТП полностью отсутствовали. Еще более выраженной динамика снижения тромбоцитов с гранулами была при 10-20% ДМСО: через 2 часа потеря тромбоцитов с гранулами составила 55-65%, через 4 часа - 90-99%. Стоит особо отметить, что при концентрации ДМСО 5% и выше адгезивная активность тромбоцитов с гранулами падает гораздо быстрее, чем их содержание. Этот эффект становится выражен уже при концентрации ДМСО 2% и выше. При использовании 5% ДМСО после 30 мин экспозиции адгезивная активность тромбоцитов снижалась в среднем в 2 раза (табл.2). Таким образом, уже через 30 мин экспозиции БоТП с 5% ДМСО при комнатной температуре в среднем 50% тромбоцитов с гранулами не проявляли функциональной активности. Это указывает на то, что время контакта тромбоцитов с 5% ДМСО при комнатной температуре должно быть минимизировано. С другой стороны, при концентрации 0,3-0,5% ДМСО биологическая полноценность тромбоцитов практически не нарушается в течение нескольких часов. Следовательно, разведение размороженных ДМСО-содержащих ТК до концентрации 0,3-0,5% ДМСО позволит сохранить их структурную и функциональную полноценность в течение 4-6 часов после разморозки.

В процессе проведения научно-исследовательской работы была разработана процедура криоконсервирования ТК, при которой время контакта тромбоцитов под действием ДМСО было минимизировано. Был выбран комбинированный стерильный криоконсервирующий раствор, содержащий 55% ДМСО (эндоцитарный криопротектор) и 5% декстран (экзоцитарный криопротектор), который позволяет адекватно проводить заморозку клеток и межклеточной среды. Вносить криопротектор в ТК предлагается после его центрифугирования и разделения на тромбоцитсодержащую часть и бесклеточную плазму. Для получения бесклеточной плазмы ТК необходимо подвергнуть центрифугированию при ускорении 1250 g. Проведенные ранее исследования показали, что центрифугирование БоТП и ТК с ускорением от 500 до 2000 g значимо не влияет на содержание клеток с гранулами [Макаров М.С., Кобзева Е.Н., Боровкова Н.В., Хватов В.Б. Влияние центрифугирования на биологическую полноценность тромбоцитов человека // Вестник службы крови России. - 2015. - №1. - С. 41-44], т.е. ускорение в 1250 g является адекватным для отделения тромбоцитсодержащей массы от бесклеточной плазмы и не нарушает биологической полноценности тромбоцитов ТК. Как и в прототипе, объем полученной тромбоцитсодержащей массы составлял 10-15 мл, в которую после ресуспендирования вносили комбинированный криопротектор на основе ДМСО и декстрана, а затем замораживали при минус 80°С. Общая продолжительность этой процедуры составляет 8-12 мин, тогда как в прототипе - от 25 до 30 минут. Таким образом, заявляемая технология в 2,5-3,0 раза сокращает время контакта тромбоцитов с криопротектором.

Было проведено сравнение качества тромбоцитов в криоконсервированных ТК, полученных с помощью технологии-прототипа и с помощью заявляемой технологии (табл. 3). Для оценки эффективности криоконсервирования решено было определять сохранность тромбоцитов с гранулами и сохранность их адгезивной активности. Было установлено, что заявляемая технология позволяет сохранить гораздо большее число биологически полноценных тромбоцитов (в 1,5-1,8 раза), чем технология-прототип. Разведение криконсервированных ТК осуществляли с помощью бесклеточной плазмы того же донора, которую параллельно замораживали (без криопротектора), а затем размораживали. Объем размороженной плазмы составлял 90-100 мл, что позволяло развести тромбоцитсодержащую часть ТК в 10 раз, снижая концентрацию ДМСО в ней до 0,4-0,6%. В то же время в прототипе концентрация ДМСО составляет 2,5-3%, осмолярность - более 800 мОсмоль/л, что является токсичным для тромбоцитов человека, при этом для дилюции ТК используется 0,9% раствор хлорида натрия, не обладающий буферными свойствами и не препятствующий закислению среды. В результате хранение размороженных ТК, полученных по технологии-прототипу, сопровождается выраженным снижением структурной и функциональной полноценности тромбоцитов. Так, через 1 час хранения в размороженных ТК адгезивная активность клеток снижается на 70%, через 2 часа - на 90%, через 4 часа - на 95-98% (см. чертеж). Это указывает на неэффективность хранения ТК (в прототипе) при комнатной температуре. Напротив, при разведении тромбоцитсодержащей части ТК бесклеточной плазмой (предлагаемая технология) адгезивная активность тромбоцитов снижается через 4 часа лишь на 10% (см. чертеж). Таким образом, появляется возможность хранения размороженных ТК при комнатной температуре в течение 4 часов без угрозы потери структурной или функциональной полноценности тромбоцитов. Осмолярность полученной дозы ТК составляет 360-380 мОсмоль/л, что соответствует физиологической норме и не вызывает развития у пациентов посттрансфузионных реакций.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется графиком, на котором представлена динамика изменения адгезивной активности тромбоцитов в размороженных ТК, приготовленных с использованием технологии-прототипа и заявляемой технологии.

Осуществление изобретения

Определение гемокомпонента "криоконсервированные тромбоциты" представлено в Техническом регламенте "Криоконсервированные тромбоциты, полученные методом афереза" (Постановление Правительства РФ от 26 января 2010 г. N 29 "Об утверждении технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии" (с изменениями от 12 октября 2010 г.)).

Ниже представлено подробное описание заявляемого способа получения криоконсервированных тромбоцитов с указанием в некоторых случаях конкретных значений параметров, которые не ограничивают заявляемое изобретение, а представлены лишь для лучшего понимания сущности изобретения. Заявляемый способ включает следующие этапы.

1. Отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК).

Отбор ТК, полученного методом афереза или из дозы крови, проводят по показателям: объем, концентрация и морфофункциональный статус тромбоцитов. Концентрацию тромбоцитов в ТК определяют на геманализаторе. Морфофунциональный статус тромбоцитов (содержание тромбоцитов с гранулами и адгезивно активных тромбоцитов) оценивают методом витального окрашивания. Для этого готовят витальный краситель для тромбоцитов путем разведения 10 мг трипафлавина и 20 мг акридинового оранжевого при комнатной температуре в 100 мл фосфатного буфера (рН - 7,2-7,4), окрашивают пробу ТК из расчета 200 мкл готового красителя на 1 мл пробы в течение 2-5 мин при комнатной температуре, после чего 5 мкл пробы с окрашенными тромбоцитами переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Витально окрашенный препарат анализируют во флуоресцентном микроскопе (объектив ×100, числовая апертура 0.6, λ возбуждения 450-490 нм, λ эмиссии - от 520 нм) в полуавтоматическом режиме. Анализируют изображения 100-200 клеток, определяют содержание тромбоцитов с гранулами (в %) и адгезивную активность тромбоцитов (в баллах). Для криоконсервирования используют ТК: объемом от 180 до 220 мл, содержащих от 1×109/мл до 1,5×109/мл тромбоцитов, имеющих морфофункциональный статус, а именно: тромбоциты с гранулами от 40% до 70% и тромбоциты с адгезивной активностью от 40% до 70%.

2. Фракционирование ТК.

Контейнер, содержащий ТК, центрифугируют со скоростью от 1100 g до 1400 g в течение от 7 до 12 минут. После центрифугирования получают надосадок (плазму бедную тромбоцитами) объемом 172-208 мл и тромбоцитсодержащую часть (объем 8-12 мл).

3. Приготовление (разведение) криопротектора.

Набирают в 10 мл шприц от 1 до 3 мл комбинированного стерильного криопротектора («DIMETYLSULFOXIDE/DEXTRAN 40 SOLUTION (Cryopreservative Solution) 5 ml» содержащего 55% ДМСО и 5% декстран 40. Подсоединяют шприц с криопротектором к контейнеру, содержащему ТК, размещенному в плазмоэкстракторе. Набирают в шприц, содержащий криопротектор, от 10 до 12 мл плазмы. В результате разведения криопротектора концентрация ДМСО снижается в 5 раз.

4. Отделение плазмы от тромбоцитов.

Контейнер, содержащий надосадок (плазму бедную тромбоцитами) и тромбоцитсодержащую часть, помещают в плазмоэкстрактор и удаляют от 160 до 200 мл плазмы, бедную тромбоцитами, в другой контейнер для последующего замораживания.

5. Ресуспендирование тромбоцитов криопротектором.

Тромбоцитсодержащую часть объемом 8 до 12 мл ресуспендируют 10-12 мл разведенного криопротектора. Добавляют криопротектор по 2 мл с интервалами 2 минуты при постоянном перемешивании содержимого мешка. Ресуспендирование тромбоцитов криопротектором проводят в течение 10 минут. Конечная концентрация ДМСО с суспензии тромбоцитов составляет от 5 до 7%.

6. Замораживание и хранение тромбоцитов и плазмы.

Ресуспендированные криопротектором тромбоциты и плазму замораживают со скоростью 1-3°/мин в морозильной камере при температуре от минус 85°С до минус 100°С. Замороженные тромбоциты и плазму хранят при температуре от минус 85°С до минус 196°С.

7. Размораживание тромбоцитов и плазмы.

Контейнеры, содержащие замороженные тромбоциты и плазму, нагревают в программном размораживателе плазмы (например, Barkey Plasmatherm) при температуре от 37 до 40°С в течение от 2 до 10 минут.

8. Ресуспендирование размороженных тромбоцитов плазмой.

Контейнеры с размороженной плазмой и тромбоцитами объединяют в систему методом стерильного соединения трубок этих контейнеров на аппарате CompoDock (Fresenius). Размороженную плазму добавляют по 20 мл через 1-2 минуты к размороженным тромбоцитам. Объем ресуспендированных тромбоцитов составляет от 180 до 220 мл.

9. Контроль качества размороженных тромбоцитов.

Качество размороженных тромбоцитов определяют по параметрам: объем (от 180 до 220 мл), сохранность тромбоцитов не менее 75% от исходного, сохранность тромбоцитов с гранулами и тромбоцитов с адгезивной активностью не менее 50% от исходного.

10. Хранение размороженных тромбоцитов.

Хранят размороженные тромбоциты при температуре от 20 до 24°С и постоянном перемешивании не более 4 часов до трансфузии.

Пример 1.

Для получения криоконсервированных тромбоцитов заготовили тромбоцитный концентрат (ТК) методом афереза на сепараторе крови Trima Accel®. Объем ТК составил 200 мл, содержание тромбоцитов - 218×109/дозе, содержание тромбоцитов с гранулами - 51%, адгезивная активность тромбоцитов - 50%. ТК разделили на две равные части: одну часть (ТК №1) криоконсервировали, используя технологию-прототип, другую (ТК №2) - используя предлагаемую технологию. Параметры качества криоконсервированных тромбоцитов представлены в табл. 4.

Анализ результатов хранения замороженных тромбоцитов показал, что предложенная технология криоконсервирования тромбоцитов по сравнению с прототипом обеспечивает значимо большую сохранность жизнеспособных клеток в размороженных ТК. Так, через 10 минут после размораживания криоконсервированных по предложенной технологии тромбоцитов содержание жизнеспособных клеток было больше, чем в прототипе в 2,5-3 раза, через 4 часа хранения при комнатной температуре - в 40 раз.

Пример 2.

Больной А., 65 лет.

Диагноз: Расслаивающаяся аневризма грудного отдела аорты 2 типа.

Операция с использование аппарата искусственного кровообращения (АИК) - протезирование грудного отдела аорты.

Состояние больного после операции. Кровопотеря за две операции - 2300 мл. После операции в течение первых суток сохраняется геморрагическое отделяемое по дренажам. Тромбоцитопения (концентрация тромбоцитов в крови больного (КТКБ) 59×109. Лейкопения (концентрация лейкоцитов в крови 3,5 тыс/мкл), анемия (гемоглобин 71 г/л и гематокрит 19,5%).

Доля тромбоцитов с гранулами - 5%, адгезивная активность тромбоцитов - 3%, что говорит о низкой биологической полноценности тромбоцитов.

Тактика лечения

С учетом наличия у больного тромбоцитопении и выраженного геморрагического синдрома, развившихся после интраоперационной массивной кровопотери, для коррекции клеточного звена гемостаза проведена лечебная трансфузия тромбоцитного концентрата, размороженного после 9 месяцев криохранения и карантинизации.

Характеристика тромбоконцентрата

Общий объем - 200 мл, общее количество тромбоцитов - 2,4×1011, содержание тромбоцитов с гранулами - 35%, адгезивная активность тромбоцитов - 30%. Трансфузия - лечебная с учетом группы крови и фенотипа О (I) положительный.

Эффективность трансфузии

После переливания ТК геморрагический синдром купирован. В крови больного концентрация тромбоцитов повысилась до 77×109/л через 1 час и до 102×109/л через 24 часа после переливания ТК. Содержание тромбоцитов с гранулами в крови пациента через 1 час составило 15%, через 24 часа - 18%, адгезивная активность тромбоцитов - соответственно 15 и 14%. Скорректированное число прироста тромбоцитов составило через 1 час 16; через 24 часа - 38×109/л, что говорит о высокой эффективности трансфузии ТК. Больной экстубирован, моча светлая, геморрагический синдром купирован.

1. Способ криоконсервирования тромбоцитов, включающий:

отбор исходного тромбоцитного концентрата с концентрацией тромбоцитов от 1×109/мл до 1,5×109/мл, содержащих от 40 до 70% тромбоцитов с гранулами и тромбоциты с адгезивной активностью от 40 до 70%;

разделение ТК на тромбоцитсодержащую часть и плазму с последующим отделением плазмы от тромбоцитсодержащей части;

приготовление комбинированного криопротектора, содержащего 55% ДМСО и 5% декстран 40, путем разведения криопротектора плазмой до конечной концентрации ДМСО от 10 до 15%;

ресуспендирование тромбоцитсодержащей части разведенным криопротектором, который вводят в тромбоцитсодержащую часть по 1-3 мл с интервалами 1-3 минуты при постоянном перемешивании до конечной концентрации ДМСО в суспензии тромбоцитов от 5 до 7%;

замораживание суспензии тромбоцитов и плазмы со скоростью 1-3°/мин в отдельных контейнерах в морозильной камере при температуре от минус 80°С до минус 100°C;

хранение замороженных тромбоцитов и плазмы при температуре от минус 85°C до минус 196°C;

размораживание контейнеров с замороженными тромбоцитами и плазмой нагреванием при температуре от 37 до 40°C в течение от 2 до 10 минут;

ресуспендирование размороженных тромбоцитов плазмой, совместимой по системе АВО, в соотношении 1:9, в течение 10 минут;

хранение размороженных тромбоцитов при температуре от 20 до 24°C и постоянном перемешивании не более 4 часов до трансфузии.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что разделение ТК на тромбоцитсодержащую часть и плазму осуществляют центрифугированием со скоростью от 1100 g до 1400 g в течение от 7 до 12 минут.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве криопротектора используют DIMETYLSULFOXIDE/DEXTRAN 40 SOLUTION (Cryopreservative Solution) 5 ml.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что ресуспендируют тромбоцитсодержащую часть криопротектором в течение от 9 до 12 минут.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что исходный тромбоцитный концентрат отбирают объемом от 180 до 220 мл для приготовления комбинированного криопротектора с конечной концентрацией ДМСО от 10 до 15% исходный криопротектор разводят плазмой в объемном соотношении 1:9, ресуспендирование тромбоцитсодержащей части разведенным криопротектором для получения суспензии тромбоцитов с конечной концентрацией ДМСО от 5 до 7% осуществляют в объемном соотношении 1:1, размороженные тромбоциты ресуспендируют добавлением от 172 до 208 мл размороженной плазмы по 20 мл через 1-2 минуты в контейнер с 15-25 мл размороженными тромбоцитами.

6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что после размораживания измеряют следующие параметры тромбоцитов: количество тромбоцитов, количество тромбоцитов с гранулами и количество адгезивно активных тромбоцитов.

7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что оценивают качество размороженных тромбоцитов по следующим параметрам: объем от 180 до 220 мл, сохранность тромбоцитов - не менее 75% от исходного, сохранность тромбоцитов с гранулами и тромбоцитов с адгезивной активностью - не менее 50% от исходного.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию раствора для консервирования клеточных взвесей. Раствор для консервирования клеточных взвесей содержит пектин каллуса раувольфии змеиной, глицерин, трилон Б и воду для инъекций.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Композиция гербицида содержит водный настой натуральной хны в концентрации от 14 до 18% мас.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способу консервирования биологических материалов. Способ консервации биологических материалов включает иммобилизацию их на сухом носителе с последующим высушиванием.

Изобретение относится к средству для борьбы с грибковыми заболеваниями растений формулы где R1=Me, R2=Ph; R1=R2=Ph; R1=R2=OMe. 1 табл..

Изобретение относится к способу получения 3-[(фенилсульфанил)метил]пентан-2,4-диона формулы (1) Сущность способа заключается во взаимодействии смеси формальдегида и тиофенола с 2,4-пентандиом с участием катализатора NiCl2⋅6H2O при мольном соотношении формальдегид:тиофенол:2,4-пентандион:NiCl2⋅6H2O=1:1:1:(0,03-0,07) в смеси растворителей CHCl3-С2Н5ОН (1:1, об.), при комнатной температуре (~20°C) и атмосферном давлении в течение 6-8 ч.

Изобретение относится к устройствам для витрификации биообъектов. Автономное устройство для витрификации биообъектов с использованием криогенного хладагента имеет коаксиальную конструкцию, включающую цилиндрический корпус, внутри которого установлена цилиндрическая аксиально удлиняемая опора, конец которой соединен с цанговым зажимом, обеспечивающим фиксацию трубки контейнера с биообъектами, пусковую пружину, которая взаимодействует с цилиндрической опорой и обеспечивает перемещение контейнера с биообъектами в сосуд с криогенным хладагентом через его горловину, цилиндрический теплоизоляционный экран с подвижной крышкой, защитный дисковый экран, фиксируемый на наружных выступах цилиндрического корпуса, и расположенную в верхней части устройства управляющую кнопку.

Изобретение относится к криобиологии и медицине. Для получения мультипотентных стромальных клеток (МСК) из криозамороженных тканей фетоплацентарного комплекса (пуповины, плодной части плаценты, амниона) пуповину и плаценту, полученные в ходе операции кесарева сечения, в течение не более 24 часов транспортируют в культуральную лабораторию, где их нарезают на фрагменты толщиной не более 10 мм и выдерживают в течение 20-25 минут в криопротекторной среде на основе аутоплазмы, полученной из пуповинной крови, либо фосфатно-солевого буфера рН=7,4, дополненного тестированным человеческим альбумином до 15 г/л, содержащей 1,5 моль/л пропандиола и 0,1 моль/л сахарозы.
Изобретение относится к области медицины, преимущественно к нормальной и патологической анатомии, зоологии и эмбриологии. Для восстановления ранее фиксированных и бальзамированных анатомических препаратов используют 1-10%-ный раствор бензоата натрия.

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии. Для изготовления анатомического препарата полый орган или его фрагмент выделяют из эвисцерированного комплекса органов, промывают полость проточной водой, препарируют, после чего его полость заполняют универсальным водостойким клеем на основе акриловой водной дисперсии, например клеем «Момент монтаж», до тех пор, пока внешний рельеф полого органа, его консистенция и степень наполнения не будут соответствовать аналогичным прижизненным характеристикам.
Изобретение относится к области медицины, хирургии. Выполняют транзиторный забор комплекса органов брюшной полости и забрюшинного пространства путем эвисцерации с реплантацией в эксперименте на модели больного.

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансфузиологии, и предназначено для заготовки замороженных тромбоцитов. Для замораживания тромбоцитов осуществляют отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК) с концентрацией тромбоцитов от 1×109/мл до 1,5×109/мл, содержащего функционально активные тромбоциты. Разделяют ТК на тромбоцитсодержащую часть и плазму с последующим отделением плазмы от тромбоцитсодержащей части. Приготавливают комбинированный криопротектор, содержащий 55% ДМСО и 5% декстран 40, путем разведения криопротектора плазмой до конечной концентрации ДМСО от 10 до 15%. Ресуспендируют тромбоцитсодержащую часть разведенным криопротектором, который вводят в тромбоцитсодержащую часть по 1-3 мл с интервалами 1-3 минуты при постоянном перемешивании до конечной концентрации ДМСО в суспензии тромбоцитов от 5 до 7%. Замораживают суспензию тромбоцитов и плазму со скоростью 1-3°/мин в отдельных контейнерах в морозильной камере при температуре от минус 80 до минус 100°С. Хранят замороженные тромбоциты и плазму при температуре от минус 85 до минус 196°С. Использование изобретения позволяет повысить качество получаемых после размораживания тромбоцитов. 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и предназначено для заготовки тромбоцитов длительного хранения, пригодных к трансфузии. Для подготовки криоконсервированных тромбоцитов для трансфузии осуществляют следующие этапы. Размораживают контейнеры, содержащие замороженные тромбоциты, нагреванием при температуре от 37 до 40°С в течение от 2 до 4 минут. Определяют концентрацию ДМСО в размороженных криоконсервированных тромбоцитах. Определяют объем плазмы или ресуспендирующего раствора, необходимого для введения в размороженные криоконсервированные тромбоциты для получения конечной концентрации ДМСО не более 0,5%, с последующим ресуспендированием размороженных тромбоцитов данным объемом плазмы, совместимой по системе АВО, или ресуспендирующим раствором при постоянном перемешивании в течение 8-12 минут со скоростью подачи плазмы или раствора 1-3 мл в минуту. Хранят размороженные тромбоциты до трансфузии не более 4 часов при температуре от 20 до 24°С и постоянном перемешивании. Использование изобретения позволяет повысить качество получаемых после размораживания криоконсервированных тромбоцитов. 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине. Криоконсервирование ГСК крови проводят поэтапно. Первоначально проводят смешивание криозащитного 10% раствора криопротектора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке и холодовую адаптацию приготовленной клеточной взвеси в течение 10 мин при температуре 4±1°С, замораживание биообъекта от +4±1°С до -80÷-196°С осуществляют в режиме быстрой двухступенчатой программы. На первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С. Хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно. Предлагаемый способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток обеспечивает повышение стерильности и количества морфологически сохранных ядерных клеток. 1 табл.

Изобретение относится к консервации клеток биологических образцов при помощи криогенного охлаждения. Устройство сверхбыстрого охлаждения биологических образцов до криогенных температур с использованием линейного электропривода возвратно-поступательного движения включает расположенный в зоне с температурой окружающей среды линейный электропривод, содержащий коаксиально расположенные неподвижный индуктор и подвижный якорь, обеспечивающий при помощи направляющего штыря прерываемое паузами перемещение контейнера с биологическим образцом, выполненный из теплоизоляционного материала охлаждающий сосуд, на передней стенке которого выполнено проходное отверстие для контейнера, а внутри расположен патрубок с распылителем на конце, обеспечивающий направленный поток жидкого криогенного хладагента, струи которого воздействуют на контейнер с биологическим образцом, нагревательное устройство, смежно расположенное с охлаждающим сосудом, и герметизируемый сосуд с жидким криогенным хладагентом, в верхней части которого расположены вентиль, стравливающий избыточное давление, и соединенный с охлаждающим сосудом при помощи теплоизолированного патрубка. Изобретение позволяет повысить скорость охлаждения биологического образца. 7 з.п. ф-лы, 30 ил.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Добавка для стимулирования спермы содержит неорганический пирофосфат (PPi) в количестве примерно между 1 мкМ и примерно 200 мкМ. Добавление PPi в среды для оплодотворения in vitro людей/животных (IVF) улучшает долю оплодотворения; добавление PPi в разбавитель семени для искусственного осеменения (AI) сельскохозяйственных животных может улучшить долю забеременевших; кроме того, ооциты млекопитающих, созревающие in vitro в среде, содержащей PPi, приобретают улучшенный потенциал оплодотворения и развития, в то время как эмбрионы, культивируемые в среде, дополненной PPi, имеют улучшенное развитие до бластоцистов. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 25 ил., 10 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и регенеративной медицине. Предложен способ обработки липоаспирата. Способ включает добавление 0,25% раствора кетотифена в дозе 1 мл раствора на 20 мл липоаспирата до стадии отмывки липоаспирата. Изобретение обеспечивает повышение жизнеспособности клеточной фракции жировой ткани. 1 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к буферным жидким композициям, предназначенным для хранения препаратов ДНК в жидком виде, а также для пропитки пористых носителей, используемых для сбора и хранения биологического материала. Композиции включают 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана, 0,04-0,4% NaN3, а также эффективное количество антибактериального препарата и/или фунгицида, который представляет собой дифеноконазол, и воду. Антибактериальный препарат выбран из пефлоксацина, офлоксацина и кларитромицина. Композиции обладают усиленным противомикробным действием, не вызывают потерю композицией ДНК стабилизирующих свойств на протяжении 15, 30 и 60 минут инкубирования при +80°С по сравнению с водными растворами противомикробных препаратов с аналогичной концентрацией. 5 н. и 25 з.п. ф-лы, 5 ил., 8 табл., 4 пр.

Изобретение относится к механической обработке костных образцов in vitro и может быть использовано в научных исследованиях в биологии и медицине при изготовлении биологических имплантатов с возможностью дальнейшего хранения в "тканевых банках". Способ механической обработки костного образца in vitro включает механическую обработку с использованием стерильной рабочей жидкости и последующую стерилизацию и консервацию полученных образцов. Сначала осуществляют стерилизацию костного образца озоновоздушной смесью с концентрацией озона 5÷10 мг/л в течение 10÷12 минут, затем механическую обработку проводят режущими инструментами в рабочей жидкости, в качестве которой используют стерильный, охлажденный до температуры +(4÷6)°С раствор Рингера с содержанием сангвиритрина в концентрации 0,01% в пересчете на активное вещество. После этого полученные образцы повторно стерилизуют озоновоздушной смесью аналогичным образом. Предлагаемый способ механической обработки костных образцов обеспечивает достижение 100% стерилизации костных образцов при сохранении их остеоиндуктивных свойств после механической обработки, сохранность морфологических и биопластических свойств стерилизуемых объектов, сокращение трудоемкости и времени подготовки имплантатов к их клиническому использованию и образцов для различных физико-химических исследований. 2 ил., 2 табл., 7 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу изготовления альгинатного гидрогеля с применением липазы, субстрата, гидролизуемого липазой, альгината и карбоната, высвобождающего двухвалентные катионы. Способ получения альгинатного гидрогеля включает смешивание раствора, содержащего липазу, с раствором, содержащим субстрат, гидролизуемый липазой, представляющий собой соединение формулы I: где R1, R2 и R3 независимо друг от друга являются одинаковыми или различными и представляют собой линейную или разветвленную С1-С12-алкил карбонильную цепь. Причем раствор, содержащий указанную липазу, или раствор, содержащий указанный субстрат, также содержит альгинат и карбонат, высвобождающий двухвалентные катионы. Полученный гидрогель пригоден для иммобилизации биологических материалов, предпочтительно сперматозоидов. Изобретения позволяют лучше контролировать скорость реакции гелеобразования, количество образованной кислоты и, соответственно, конечное значение pH в геле. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к способу консервации донорской крови. При консервации эритроцитов для последующей трансфузии осуществляют этапы: a. получение эритроцитарной массы; b. помещение указанной эритроцитарной массы в контейнер, где указанный контейнер является проницаемым для газов и по существу содержит эритроцитарную массу; c. удаление кислорода из эритроцитарной массы во время нахождения эритроцитарной массы в контейнере, где указанный кислород удаляют из эритроцитарной массы и указанного контейнера путем диффузии указанного кислорода через указанный контейнер; d. воздействие на указанную эритроцитарную массу, находящуюся в контейнере, системой газов путем диффузии указанной системы газов через указанный контейнер и взаимодействия с указанной эритроцитарной массой в указанном контейнере, где указанная система газов включает ксенон, где указанную стадию воздействия на указанную эритроцитарную массу указанной системой газов осуществляют после указанной стадии удаления кислорода из указанной эритроцитарной массы, где указанный ксенон в указанной системе газов находится в концентрации, которая является большей, чем концентрация ксенона, которая встречается в природе в земной атмосфере, и с. поддержание указанной эритроцитарной массы, которую подвергали воздействию системы газов, при температуре, которая является выше точки замерзания указанной эритроцитарной массы и до температуры 30°С, где указанная эритроцитарная масса может содержаться в указанном контейнере в течение по меньшей мере 42 дней без значительной утраты качества эритроцитов таким образом, что указанная эритроцитарная масса в указанном контейнере может быть использована для указанной последующей трансфузии. Изобретение позволяет повысить качество консервируемой эритроцитарной массы. 16 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансфузиологии, и предназначено для заготовки тромбоцитов длительного хранения. Осуществляют отбор исходного тромбоцитного концентрата с концентрацией 1×109мл-1,5×109мл, содержащих 40-70 тромбоцитов с гранулами и тромбоциты с адгезивной активностью 40-70. Разделяют ТК на тромбоцитсодержащую часть и плазму центрифугированием. Готовят комбинированный криопротектор, содержащий 55 ДМСО и 5 декстран 40, разводя криопротектор плазмой до конечной концентрации ДМСО 10-15. Ресуспендируют тромбоцитсодержащую часть разведенным криопротектором, который вводят в тромбоцитсодержащую часть по 1-3 мл с интервалами 1-3 мин до конечной концентрации ДМСО 5-7. Замораживают суспензию тромбоцитов и плазму со скоростью 1-3°мин при минус 80°С-минус 100°С и хранят их при минус 85°С-минус 196°С. Размораживают контейнеры нагреванием при 37-40°С в течение 2-10 мин. Ресуспендируют размороженные тромбоциты плазмой в соотношении 1:9 в течение 10 мин и хранят их при 20-24°С и постоянном перемешивании не более 4 часов до трансфузии. Использование изобретения позволяет повысить качество получаемых после размораживания криоконсервированных тромбоцитов. 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 2 пр.

Наверх