Твердофазный носитель для иммобилизации и/или хранения биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты

Изобретение относится к области хранения образцов биологического материала, а именно к твердофазным носителям иммобилизации и хранения биологических образцов. Твердофазный носитель для иммобилизации и хранения образцов, содержащих нуклеиновые кислоты, представляет собой пористую целлюлозную основу, обработанную композицией, содержащей детергент, слабое основание, хелатообразующий агент и дисахарид. Изобретение обеспечивает увеличение срока хранения образцов при комнатной температуре без разрушения нуклеиновых кислот, а также позволяет осуществить стерилизационную обработку носителя от «примесной» ДНК или РНК без потери свойств носителя. 13 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

 

Область техники:

Настоящее изобретение относится к твердофазному носителю для иммобилизации и последующего длительного хранения в комнатных условиях биологических материалов, содержащих нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), представляющему собой пористую основу, обработанную композицией, содержащей набор реагентов.

Уровень техники:

Использование твердофазных носителей для сохранения образцов биологического материала в целях последующего выделения и анализа биомолекул широко известно с 1960х гг., когда были созданы первые карты такого рода - т.н. карты Гатри [1, 2], предназначенные для скрининга новорожденных с целью выявления генетического заболевания - фенилкетонурии. Впоследствии были разработаны многочисленные варианты таких твердофазных носителей, в частности, носителей на основе целлюлозы, обеспечивающих длительную сохранность образцов биологических материалов, содержащих ДНК или РНК, при комнатной температуре [3, 4], и требования к таким носителям, включая критерии их стандартизации [5].

Известны карты для хранения образцов Whatman® 903 Specimen Collection Paper [6-9], позволяющие в течение длительного времени сохранять ДНК- или РНК-содержащие образцы биологического материала (такие как образцы крови и др.) при температуре -20°С в герметично запаянном контейнере совместно с влагопоглотителем [9].

Известен предлагаемый в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения твердофазный носитель для длительного хранения образцов биологического материала, содержащих ДНК или РНК, в т.ч., образцов генетического материала, выделенных из крови, включающий твердую матрицу, выполненную из твердой целлюлозы (предпочтительно, из фильтровальной бумаги) или из полимера, где указанная матрица содержит соединение или композицию, нанесенные на матрицу или абсорбированные на матрице и защищающие ДНК или РНК от деградации [10]. В качестве соединения, защищающего ДНК или РНК от деградации, твердофазный носитель согласно [10] использует мочевую кислоту совместно со слабым основанием, с получением соли мочевой кислоты - урата и с обеспечением щелочного рН в диапазоне от 8,0 до 9,5.

Дополнительно твердофазный носитель [10] может содержать хелатирующий агент, такой как ЭДТА, анионный детергент, такой как натрий лаурилсульфат (натрий додецилсульфат, SDS), и слабощелочной буфер, такой как трис-ЭДТА буфер. К недостаткам твердофазного носителя [10] относится то, что он требует импрегнирования в полистирол для последующего долгосрочного хранения при комнатной температуре, либо хранения в рефрижераторе при температуре -15°С в присутствии влагопоглотителя и нескольких кристаллов сухого натрия карбоната, что увеличивает себестоимость хранения образцов на таком носителе.

Кроме того, носитель в соответствии с прототипом [10], как и многие другие аналогичные носители, сталкивается с проблемой присутствия контаминирующей ДНК или РНК бактериального, вирусного и др. происхождения. Твердофазный носитель для хранения биологических образцов с целью последующего выделения ДНК или РНК, обладающий оптимальными характеристиками, должен не только обеспечивать возможность долгосрочного хранения ДНК-содержащих биологических образцов, но и предоставлять возможность стерилизационной предобработки с целью разрушения контаминирующей ДНК или РНК.

В связи с указанными недостатками прототипа [10] остается актуальной задача создания твердофазного носителя на основе пористого целлюлозного материала, позволяющего осуществлять длительное хранение биологических образцов, содержащих ДНК или РНК, при комнатной температуре, без использования дополнительных мер средств, который, однако, не утрачивал бы своих свойств в результате стерилизационной предобработки.

В рамках настоящего изобретения неожиданно было показано, что твердофазный носитель на основе пористой целлюлозы, пропитанный или покрытый композицией, содержащей слабое основание, анионный детергент и хелатообразующий агент, отличается тем, что дополнительно содержит дисахарид, эффективно защищает ДНК или РНК, содержащиеся в биологических образцах, от деградации под действием ионизирующего излучения или этиленоксида, в то же время позволяя осуществить стерилизационную обработку носителя от «примесной» ДНК или РНК, в чем и заключается неожиданный технический результат настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте изобретения дисахарид представляет собой трегалозу, сахарозу, мальтозу или их комбинацию; в наиболее предпочтительном воплощении, дисахарид представляет собой комбинацию трегалозы и сахарозы в массовом соотношении от 1:1 до 1:4 или смесь трегалозы и мальтозы в массовом соотношении от 1:1 до 1:4.

В предпочтительном варианте изобретения рН упомянутой композиции составляет от 7,0 до 9,0.

В более предпочтительном варианте изобретения, упомянутая композиция содержит от 0,2 до 0,4% детергента, от 0,1 до 0,2% слабого основания, от 0,02 до 0,04% хелатообразующего агента и от 0,3 до 0,5% дисахарида.

В предпочтительном варианте слабое основание выбрано из группы, включающей трис(гидроксиметил)аминометан, N-(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)глицин, N,N-бис-(2-гидроксиэтил)глицин и натриевую соль 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновой кислоты.

В предпочтительном варианте анионный детергент выбран из гуанидина гидрохлорида, гуанидина изоционата, мочевины, лаурилсульфата натрия (SDS), полиоксиэтилен сорбитан монолаурата (Tween 20 или др.), октилфенокси-полиэтоксиэтанола (Nonidet Р40 или др.) и т-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (Triton Х-100 или др.).

В предпочтительном варианте хелатообразующий агент выбран из группы, включающей тринатриевую соль нитрилтриуксусной кислоты, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, тринатриевую соль N-(гидроксиэтил)этилен-диаминтетрауксусной кислоты и пентатриевую соль диэтилентетраминпентауксусной кислоты.

Твердофазный носитель в соответствии с изобретением обеспечивает возможность длительного хранения биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) при комнатной температуре без использования дополнительных средств (таких, как импрегнирование карт в полистирол, использование рефрижератора и т.п.), а также возможность эффективной стерилизационной предобработки без утраты полезных свойств носителя.

Стерилизационная предобработка может осуществляться ионизирующим излучением [11], например гамма-излучением. Наиболее предпочтительно, стерилизующая доза гамма-излучения составляет от 10 до 25 кГр, В альтернативном варианте стерилизация может осуществляться газовой смесью, содержащей этиленоксид [12]. В наиболее предпочтительном варианте количество этиленоксида в газовой смеси составляет от 5 до 15%, при этом в самом предпочтительном варианте обработку газовой смесью, содержащей этиленоксид, осуществляют по крайней мере на протяжении от 4 до 8 часов.

Ниже приведены примеры осуществления изобретения, наглядно демонстрирующие возможность достижения заявленного технического результата, не ограничивая при этом объема притязаний.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1. Приготовление твердофазного носителя.

40 г лаурилсульфата натрия, 38,8 г трис(гидроксиметил)аминометана и 5,8 г ЭДТА смешали с 50 г смеси трегалоза: сахароза (в массовом соотношении 1:3), растворили в дистиллированной воде, затем добавили при перемешивании концентрированную соляную кислоту до рН 8,5, и затем довели объем полученного раствора до 1 л. Обеззоленную фильтровальную бумагу типа Whatman® 903 пропитали полученной композицией и сушили при температуре 70°С в течение 4 часов. Полученный твердофазный носитель нарезали на карты размером 5,0×5,0 см. Аналогичным образом получили твердофазные носители с использованием 50 г трегалозы, 50 г сахарозы или 50 г мальтозы и 50 г смеси трегалозы и мальтозы в массовом соотношении 1:3 вместо 50 г смеси трегалоза:сахароза в массовом соотношении 1:3.

Аналогичным образом готовили контрольные твердофазные носители, не содержащие дисахарида.

Пример 2. Исследование хранения ДНК на твердофазных носителях.

Для исследования хранения ДНК-карт использовали метод «ускоренного старения».

На исследуемые и контрольные носители, а также на носители сравнения (FTA™ Mini Card производства GE Healthcare, кат. № WB120055) поместили по 85 мкл образца капиллярной крови и сушили при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем часть носителей поместили в сушильный шкаф с постоянной температурой 60°С. Вторую часть носителей оставили при комнатной температуре.

Образцы носителей, хранящихся при температуре 60°С, исследовали через каждые 7 дней хранения, а образцы носителей, хранящихся при комнатной температуре, исследовали через каждый 21 день хранения.

Для этого из носителей с помощью перфоратора вырезали диски диаметром 2 мм. Диски помещали в пробирки типа «Эппендорф» и встряхивали с 0,2 мкл трис-ЭДТА буфером (рН 8,5) на лабораторном шейкере типа «Вортекс» в течение 5 минут, затем трис-ЭДТА буфер удалили декантацией. Процедуру повторили дважды. Диски сушили при 60°С в течение 30 минут и помещали в пробирки для ПЦР. В пробирки добавили по 25 мкл реакционной смеси, приготовленной согласно инструкции для набора реагентов «АмплиСенс® М. hominis-скрин-титр-FL». Пробирки помещали в автоматический амплификатор и проводили амплификацию методом ПЦР в реальном времени по следующей программе (Таблица 1):

Флуоресцентный сигнал детектировали, начиная с шестого цикла. Детекцию вели по каналу для флуорофора JOE (канал детекции для внутреннего контрольного образца, специфичного к ДНК человека).

Результаты представлены в таблице 2, где Т60 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный с использованием трегалозы в качестве дисахарида, хранящийся при температуре 60°С;

S60 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный с использованием сахарозы в качестве дисахарида и хранящийся при 60°С;

М60 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный с использованием мальтозы в качестве дисахарида и хранящийся при 60°С;

TS60 - карта, приготовленная с использованием комбинации трегалозы и сахарозы (в массовом соотношении 1:3) в качестве дисахарида и хранящаяся при 60°С;

ТМ60 - карта, приготовленная с использованием комбинации трегалозы и мальтозы (в массовом соотношении 1:3) в качестве дисахарида и хранящаяся при 60°С;

О60 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный без использования дисахарида и хранящийся при 60°С;

F60 - твердофазный носитель сравнения FTA™ Mini Card, хранящийся при 60°С;

Т25 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный с использованием трегалозы в качестве дисахарида и хранящийся при комнатной температуре (20-25°С);

О25 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный без использования дисахарида и хранящийся при комнатной температуре (20-25°С);

F25 - твердофазный носитель сравнения FTA™ Mini Card, хранящийся при комнатной температуре (20-25°С).

Из Таблицы 2 следует, что при комнатной температуре образцы ДНК одинаково хорошо хранятся на носителях как с дисахаридами, так и без дисахаридов (результаты в опытной группе и в группе сравнения были сопоставимы), однако при повышенной температуре ДНК значительно лучше сохраняется на твердофазных носителях по изобретению; напротив, на картах без дисахарида, в том числе и на носителях сравнения, ДНК подвергалась полной деструкции после 63 дней хранения при 60°С.

Пример 3. Стерилизационная предобработка носителей газовой смесью, содержащей этиленоксид, и гамма-излучением.

С целью имитации контаминации на твердофазные носители по примеру 1, содержащие смесь трегалозы с сахарозой (в массовом соотношении 1:3), а также аналогичные носители без дисахаридов нанесли отмытые лейкоциты крови человека или раствор ДНК, выделенной из лейкоцитов крови человека. Для выделения ДНК из лейкоцитов использовали набор реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп». После нанесения лейкоцитов и раствора ДНК карты сушили в течение 4 часов при комнатной температуре, затем запаковали в бумажные конверты и отправили на обработку. Часть карт обрабатывали смесью 10% этиленоксида и углекислого газа в течение 4 и 8 часов, часть - гамма-облучением (10 и 25 кГр). Контрольные карты оставили запечатанными в конверте без обработки. После обработки карты извлекли из конвертов и из областей, куда были нанесены образцы лейкоцитов и ДНК, панчером вырезали диски диаметром 2 мм. Остаточное содержание ДНК измеряли методом ПЦР в реальном времени согласно примеру 2. Результаты представлены в таблице 3.

где ЭО4-ЛК - образцы с дисахаридами и с нанесенными лейкоцитами, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 4 часов;

ОЭО4-ЛК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 4 часов;

ЭО4-ДНК - образцы с дисахаридами и с нанесенным раствором ДНК, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 4 часов;

ОЭО4-ДНК - образцы без дисахаридов и с нанесенным раствором ДНК, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 4 часов;

ЭО8-ЛК - образцы с дисахаридами и с нанесенными лейкоцитами, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 8 часов;

ОЭО8-ЛК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 8 часов;

ЭО8-ДНК - образцы с дисахаридами и с нанесенным раствором ДНК, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 8 ч;

ОЭО8-ДНК - образцы без дисахаридов и с нанесенным раствором ДНК, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 8 ч;

ГР10-ЛК - образцы дисахаридами и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 10 кГр;

ОГР10-ЛК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 10 кГр;

ГР10-ДНК - образцы с дисахаридами и с нанесенным раствором ДНК, обработанные гамма-радиацией с дозой 10 кГр;

ОГР10-ДНК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 10 кГр;

ГР25-ЛК - образцы с дисахаридами и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 25 кГр;

ОГР25-ЛК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 25 кГр;

ГР25-ДНК - образцы с дисахаридами и с нанесенным раствором ДНК, обработанные ионизирующим излучением (гамма-излучением) с дозой 25 кГр;

ОГР25-ДНК - образцы без дисахаридов и с нанесенным раствором ДНК, обработанные ионизирующим излучением (гамма-излучением) с дозой 25 кГр;

К-ЛК - контрольные образцы с нанесенными лейкоцитами;

К-ДНК - контрольные образцы с нанесенным раствором ДНК.

Пример 4. Хранение ДНК на картах, обработанных газовой смесью, содержащей этиленоксид, и гамма-излучением.

Твердофазные носители по изобретению, приготовленные согласно примеру 1 с использованием смеси трегалозы с сахарозой (1:3) в качестве дисахарида, а также аналогичные носители без дисахаридов, дополнительно обрабатывали смесью 10% этиленоксида в течение 4 часов или гамма-излучением в дозе 25 кГр. Затем на карты нанесли образцы крови по 85 мкл и провели исследование хранения ДНК методом ускоренного старения аналогично примеру 2. В качестве образцов сравнения использовали ДНК-карты с трегалозой и сахарозой (в массовом соотношении 1:3), не обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, или гамма-излучением, а также карты, приготовленные без использования дисахаридов, но обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, или гамма-излучением. Результаты приведены в таблице 4.

где

TS60-ЭО - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный с использованием комбинации трегалозы и сахарозы (в массовом соотношении 1:3), в качестве дисахарида, дополнительно обработанный газовой смесью, содержащей этиленоксид, и хранящийся при 60°С;

TS60-ГР - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный с использованием комбинации трегалозы и сахарозы (в массовом соотношении 1:3), в качестве дисахарида, дополнительно обработанный гамма-излучением и хранящийся при 60°С;

О60-ЭО - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный без использования дисахаридов, дополнительно обработанный газовой смесью, содержащей этиленоксид, и хранящийся при 60°С;

О60-ГР - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный без использования дисахаридов, дополнительно обработанный гамма-излучением и хранящийся при 60°С;

TS60 - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный с использованием комбинации трегалозы и сахарозы (в массовом соотношении 1:3) в качестве дисахарида и хранящийся при 60°С.

Таким образом, предложенный твердофазный носитель для иммобилизации и хранения образцов нуклеиновых кислот, представляющий из себя пористую целлюлозную основу, обработанную композицией, содержащей детергент, слабое основание, хелатообразующий агент и содержащий дисахарид или смесь дисахаридов, обеспечивает неожиданно высокую стабильность иммобилизованных биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты, включая ДНК и РНК, в то же время предоставляя возможность эффективной стерилизующей предобработки с помощью этиленоксида или ионизирующей радиации (без утраты полезных свойств носителя).

Список литературы:

1. R. Guthrie, A. Susi. A simple method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. // Pediatrics 32: 338-343, 1963. Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: http://pediatrics.aappublications.org/content./pediatrics/32/3/338.full.pdf.

2. Julia A. McMillan, Ralph D. Feigin, Catherine DeAngelis, M. Douglas Jones (1 April 2006). Oski's pediatrics: principles & practice. Lippincott Williams & Wilkins. pp. 162. Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: https://books.google.ru/books?id=VbjFQiz8aR0C&pg=PA162&hl=ru#v=onepage&q&f=false.

3. М.С.Kline, D.L. Duewer. Polymerase chain reaction amplification of DNA from aged blood stains: quantitative evaluation of the "suitability for purpose" of four filter papers as archival media. //Analytical Chemistry, 2002, volume 74, №8, 1863-1869.

4. G.S. Makowski, F.L. Nadeau. Single tube multiplex PCR detection of 27 cystic fibrosis mutations and 4 polymorphisms using neonatal blood samples collected on Guthrie cards. // Annals of Clinical and Laboratory Science Journal, volume 33, №3, 243-250 (2003).

5. J.V. Mei, J.R. Alexander, et al. Use of Filter Paper for the Collection and Analysis of Human Whole Blood Specimens. //Journal of Nutrition, May 1, 2001, vol. 131, №5, 1631S-1636S. Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: http://jn.nutrition.org/content/131/5/1631S.full.

6. Pak Yang Chum, Chas Andre. Direct PCR from Blood Preserved on Whatman FTA and 903 Cards using Thermo Scientific Phusion Blood Direct PCR Kit (2013). Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/brands/Documents/1114/app-note-direct-pcr-from-blood-preserved-on-whatman-fta-903-cards.pdf.

7. М.А. Harvey et al. Impregnated 903() Blood Collection Paper: A Tool for DNA Prepartion from Dried Blood Spots for PCR Amplification. // Clinical Chemistry, 1995, volume 41, №6, S108.

8. M.A. Harvey, T.A. King, et al. Impregnated sample collection paper: A tool for preparation of DNA and RNA from dried blood spots for PCR amplification. //Clinical Chemistry, 1995, volume 41, №11, p.1686, abstract #041.

9. Whatman™ Neonatal Screening cards. // GE Healthcare LifeSciences. Опубликовано: 01/2013. Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/136076 4947442/litdoc28984424_20130214002441.pdf.

10. Патент США №5496562 А, опубликован 05.03.1996; МПК C12N 15/10, C12Q 1/68.

11. Aparecida da Silva Aquino. Sterilization by Gamma Irradiation, Gamma Radiation (Edited by Prof. Feriz Adrovic), pp. 171-206. Дата публикации: 2012. Доступно (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: http://www.intechopen.com/books/gamma-radiation/sterilization-by-gamma-irradiation.

12. Патент США №2075845 А, опубликован 06.04.1937; МПК A61L 2/20.

1. Твердофазный носитель для иммобилизации и хранения образцов, содержащих нуклеиновые кислоты, причем упомянутый носитель представляет собой пористую целлюлозную основу, обработанную композицией, содержащей детергент, слабое основание, хелатообразующий агент и дисахарид.

2. Твердофазный носитель по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый детергент выбран из гуанидина гидрохлорида, гуанидина изоцианата, мочевины, лаурилсульфата (додецилсульфата) натрия, полиоксиэтилен сорбитан монолаурата, t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола и октилфеноксиполиэтоксиэтанола.

3. Твердофазный носитель по п. 1, отличающийся тем, что упомянутое слабое основание выбрано из трис(гидроксиметил)аминометана, N-(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)глицина, N,N-бис-(2-гидроксиэтил)глицина и натриевой соли 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновой кислоты.

4. Твердофазный носитель по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый хелатообразующий агент выбран из группы, включающей тринатриевую соль нитрилтриуксусной кислоты, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, тринатриевую соль N-(гидроксиэтил)этилендиаминтетрауксусной кислоты и пентатриевую соль диэтилентетраминпентауксусной кислоты.

5. Твердофазный носитель по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый дисахарид представляет собой трегалозу, сахарозу, мальтозу или их комбинацию.

6. Твердофазный носитель по п. 5, отличающийся тем, что упомянутая комбинация дисахаридов представляет собой смесь трегалозы и сахарозы в массовом соотношении от 1:1 до 1:4.

7. Твердофазный носитель по п. 5, отличающийся тем, что упомянутая комбинация дисахаридов представляет собой смесь трегалозы и мальтозы в массовом соотношении от 1:1 до 1:4.

8. Твердофазный носитель по п. 1, отличающийся тем, что упомянутая композиция имеет значение рН от 7,0 до 9,0.

9. Твердофазный носитель по п. 1, отличающийся тем, что упомянутая композиция содержит от 0,2 до 0,4% детергента, от 0,1 до 0,2% слабого основания, от 0,02 до 0,04% хелатообразующего агента и от 0,3 до 0,5% дисахарида.

10. Твердофазный носитель по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что упомянутый носитель обработан газовой смесью, содержащей этиленоксид.

11. Твердофазный носитель по п. 10, отличающийся тем, что содержание этиленоксида в упомянутой газовой смеси составляет от 5 до 15%.

12. Твердофазный носитель по п. 11, отличающийся тем, что обработку упомянутой газовой смесью осуществляли от 4 до 8 ч.

13. Твердофазный носитель по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что упомянутый носитель обработан гамма-излучением.

14. Твердофазный носитель по п. 13, отличающийся тем, что доза гамма-излучения составляет от 10 до 25 кГр.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для биохимического определения активности протеолитических ферментов в крови.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу диагностики крови на наличие паразитарных заболеваний по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия, включающему: воздействие на образцы крови, помещенные в термостатируемую кювету, бегущей модулированной ультразвуковой волной; обработку образцов крови в абсолютно одинаковых условиях; поддержание постоянной температуры образцов в кюветах с проточным охлаждением и анализ морфологического состояния клеток методами световой микроскопии; при начале гемолиза эритроцитов через 18-30 с, уменьшении количества лимфоцитов в 1,7-3,5 раза, а сегментоядерных нейтрофилов в 1,5-4,0 раза, деформации и разрушении ядер и изменении структуры цитоплазмы, ее вакуолизации, а также при ядерном сдвиге влево диагностируют наличие паразитарного заболевания.

Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования достоверности динамики фиброза печени у пациентов с ХГС, генотипом 1, не ответивших на двухкомпонентную противовирусную терапию пегилированными интерферонами и рибавирином.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы у пациенток с плохим ответом на неоадъювантную химиотерапию, согласно которому осуществляют исследование инфильтративного компонента новообразования на светооптическом уровне, отличающийся тем, что проводят морфологическое исследование строения ткани опухоли и в ходе гистологической оценки инфильтративного компонента новообразования определяют альвеолярные, тубулярные, трабекулярные, солидные структуры и дискретные группы опухолевых клеток, и при наличии альвеолярных структур прогнозируют высокий риск гематогенного метастазирования.

Изобретение относится к области медицины и касается способа оценки тяжести состояния больного и риска летального исхода по уровню фенилмолочной кислоты в крови. Сущность способа заключается в том, что в крови больных количественно определяют концентрацию фенилмолочной кислоты (ФМК).

Изобретение относится к медицине и касается способа комплексной оценки эффективности полихимиотерапии у больных с рецидивной лимфомой Ходжкина, заключающегося в том, что до начала лечения и после проведения трех противорецидивных курсов полихимиотерапии исследуют развернутую протеинограмму в комплексе с оценкой морфоструктуры сыворотки крови методами клиновидной и краевой дегидратации и при появлении дефектных форм сферолитов, нарушении агрегации макро- и микросферолитов, трансформации анизоморфонов злокачественного роста вплоть до скелетирования остаточных структур крупных сферолитов, формировании нормотипов фаций с радиальной и частично радиальной симметрией трещин, восстановлении системы концентрационных волн в краевой зоне фаций, при нормализации показателей белкового обмена режим полихимиотерапии признают эффективным и полихимиотерапию продолжают по той же схеме, в обратном случае выполняют смену схемы лечения с заменой применяемых цитостатиков.

Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки мукозального иммунитета слизистой оболочки носа и носоглотки. В эпителиальных клетках слизистой оболочки полости носа определяют экспрессию генов рецептора врожденного иммунитета (TLR2) и противомикробного пептида (HBD2), и при соотношении показателя HBD2 к TLR2 меньше 0,1 диагностируют нарушение мукозального иммунитета, что является обоснованием хирургического метода лечения.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования плацентарной недостаточности при повреждающем действии цитомегаловирусной инфекции на содержание общего холестерола в третьем триместре гестации.

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения степени риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки. Проводят исследование молекулярных характеристик в опухоли ободочной кишки и в неизмененной ткани: X1 - химотрипсинподобная активность протеасом в опухоли, ⋅103 Ед/мг белка; Х2 - химотрипсинподобная активность протеасом в неизмененной ткани, ⋅10 Ед/мг белка; Х3 - общая кальпаиновая активность в опухоли, ⋅10 Ед/мг белка; Х4 - общая кальпаиновая активность в неизмененной ткани, ⋅10 Ед/мг белка; учитывают Х5 - возраст пациентов, после чего рассчитывают значения Y1 и Y2 по дискриминантным уравнениям:Y1=0,039*X1+0,126*X2+0,775*X3-0,083*X4-0,040*X5-23,51; и Y2=0,015*X1+0,115*X2+0,509*X3-0,026*X4-0,026*X5-13,84, и при Y1>Y2, пациента относят к группе с низким риском развития отдаленных метастазов; при Y1<Y2 - к группе с высоким риском развития отдаленных метастазов рака ободочной кишки.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способа прогнозирования степени вероятности полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии у пациенток с трижды негативным молекулярно-генетическим субтипом рака молочной железы.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному исследованию биологической жидкости (супернатанта, плазмы или сыворотки крови), и может быть использовано для определения оптимального для конкретного больного моноэндоцеллюлярного криоконсерванта для хранения клеток при -80°С. Способ характеризуется проведением сравнительного исследования зональных структур высушенных капель супернатантов с различными криоконсервантами, замороженными до температуры минус 80°С, а также до и спустя определенные интервалы времени после испытания на модели трансфузии in vitro. При аналогичности структуропостроения центральных, срединных и краевых зон контрольного и опытного микробиопрепаратов примененный криоконсервант оценивают как оптимальный для конкретного больного. Способ позволяет проводить индивидуальный скрининг криоконсерванта на раннем доклиническом этапе проявления критического расстройства гомеостаза субъекта криопротекторного генеза. 1 табл.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу оценки фибринолитической активности слезной жидкости. Способ оценки фибринолитической активности слезной жидкости включает отбор слезы из нижнего конъюнктивального свода глаз, титрование анализируемой слезной жидкости путем проведения серии из двукратных разведений с помощью буферного раствора, добавление к полученным образцам латексного реагента, содержащего мышиные моноклональные антитела к Д-димеру фибрина, далее смесь перемешивают, регистрируют реакцию агглютинации в пробе при наибольшей величине разведения и рассчитывают концентрацию Д-димера по формуле:С(Д-димер)=200×d, нг/мл,где С - концентрация Д-димера (нг/мл), d - наибольшая величина разведения, 200 - чувствительность реагента, при этом концентрацию Д-димера 3200 нг/мл считают пороговой для подтверждения повышения активности системы фибринолиза слезной жидкости для оценки фибринолитической активности слезной жидкости с использованием в качестве маркера концентрацию Д-димера в слезной жидкости в слезной жидкости. Вышеописанный способ позволяет эффективно проводить оценку фибринолитической активности слезной жидкости. 2 пр.

Способ относится к медицине и предназначен для выбора тактики лечения острых кишечных инфекций у детей раннего возраста. При выявлении в остром периоде заболевания интоксикационного синдрома и уровня сывороточной мочевины 2 ммоль/л и ниже определяют дисбиоз кишечника, протекающий с метаболической эндотоксемией на фоне избыточного размножения протеолитических кишечных бактерий, и назначают проведение дезинтоксикационной терапии. При выявлении воспалительного синдрома и уровня мочевины более 2 ммоль/л определяют дисбиоз кишечника, протекающий с дефицитом функциональной активности микрофлоры, и назначают антибактериальное лечение. Способ позволяет повысить точность и обоснованность выбора предлагаемого лечения. 1 пр., 1 табл., 1 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения люминального подтипа рака молочной железы N1 в постменопаузальном периоде. Для этого определяют рецепторы эстрогена, суммарный диаметр метастазов D в аксиллярных лимфоузлах и среднее количество метастатических клеток К, ядра которых экспрессируют рецепторы эстрогена, в них. При выявлении 2≤D<10 мм и значении К, превышающем 1%, проводят лучевую терапию по выбранной схеме лечения, а после ее завершения осуществляют сочетанное введение тамоксифена и неселективного бета-адреноблокатора ежедневно в терапевтических дозах в течение 1-5 лет. При выявлении D≥10 мм и при значении К≥33% осуществляют последовательное проведение адьювантной химиотерапии с одновременным подкожным введением фрагмина в суточной дозе 2500 ME ежедневно, затем проводят лучевую терапию по выбранным схеме лечения, а после этого проводят гормонотерапию ингибитором ароматазы в течение 5-7 лет. При выявлении D≥10 мм и при значении К<33% осуществляют одновременное проведение химиолучевой и гормонотерапии, при этом одновременно с химиотерапией вводят подкожно фрагмин в дозе 5000 ME ежедневно, а в качестве гормонотерапии используют ингибитор ароматазы в течение 7-10 лет. Способ обеспечивает возможность в более короткие сроки провести лечение, в ряде случаев сохранить трудоспособность во время его проведения, избавить пациента от возможных осложнений при обеспечении высокой эффективности терапии. 3 пр.

Изобретение относится к медицине, хирургии, интраоперационной дифференциальной диагностике объемных образований щитовидной железы (ЩЖ). В режиме реального времени проводят конфокальную лазерную микроскопию ткани ЩЖ. При получении изображения в виде сетки с ячейками округлой или полигональной формы диаметром 20-200 мкм с перегородкой толщиной 0,2 мкм диагностируют отсутствие объемных образований ЩЖ. При регистрации сетчатого изображения с диаметром ячеек более 200 мкм диагностируют узловой коллоидный зоб. При получении изображения с ячейками диаметром 20-200 мкм с толщиной перегородки 10-30мкм и участками фиброза диагностируют аденому ЩЖ. При регистрации изображения с бесструктурными массами с неровными изъеденными краями по всему полю зрения с просветлениями, расположенными в хаотичном порядке, диагностируют рак ЩЖ. Способ обеспечивает быструю и точную диагностику образований ЩЖ в режиме реального времени, интраоперационно. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии, и касается способа оценки эффективности фаготерапии при лечении инфекционных заболеваний. Способ включает забор исследуемого биологического материала, введение раствора коммерческого бактериофага в исследуемый биологический материал и определение эффективности взаимодействия коммерческого бактериофага с патогенными микроорганизмами в исследуемом биологическом материале. Перед проведением хирургического вмешательства осуществляют идентификацию патогенных микроорганизмов в области планируемого хирургического вмешательства. Определяют концентрацию (титр) бактериофага к патогенным микроорганизмам в исследуемом биологическом материале. Вводят первую дозу раствора коммерческого бактериофага сразу после выполнения хирургического вмешательства. Через 18-24 часов после введения первой дозы раствора коммерческого бактериофага производят забор исследуемого биологического материала и определяют концентрацию (титр) бактериофага в исследуемом биологическом материале. При установлении титра не менее 106 БОЕ/мл делают вывод об эффективном воздействии раствора коммерческого бактериофага на целевой патогенный микроорганизм. Через 18-24 часов после введения первой дозы раствора коммерческого бактериофага вводят вторую дозу раствора коммерческого бактериофага, через 18-24 часов после введения второй дозы раствора коммерческого бактериофага вводят третью дозу раствора коммерческого бактериофага. На 4-5 сутки после хирургического вмешательства выполняют забор исследуемого биологического материала и производят оценку эффективности путем сравнения бактериофага, содержащегося в исследуемом биологическом материале с раствором коммерческого бактериофага. При установлении тождественности литической активности не менее первых двух десятикратных разведений раствора коммерческого бактериофага, используемого для лечения пациента с бактериофагом, находящимся в исследуемом биологическом материале от пациента, делают вывод об эффективности фаготерапии и продолжают вводить раствор коммерческого бактериофага до полной элиминации патогенных микроорганизмов. Способ позволяет осуществлять качественный и количественный контроль присутствия бактериофагов, что приводит к более точной трактовке полученных результатов; позволяет отслеживать концентрацию бактериофагов в условиях in vitro и в условиях in vivo. Предусматривает идентификацию этиологически значимого возбудителя инфекционного процесса до проведения хирургического вмешательства, что позволяет сразу произвести подбор этиотропного штамма бактериофага. Позволяет оценить эффективность фаготерапии в процессе ее проведения, это позволяет установить активность бактериофага в ране и тем самым повысить оценку эффективности фаготерапии. Как следствие, повышается качество процесса лечения, уменьшается риск возникновения рецидива инфекции. 2 табл.
Изобретение касается определения угрозы нарушения имплантации зародыша в слизистую оболочку матки при обострении цитомегаловирусной инфекции на первом триместре гестации. Сущность способа: определяют титр антител IgG к ЦМВ на 7-8 неделях беременности и определяют содержание активных рецепторов к эстрогенам (ERα) в гомогенате хориона, и при определении титра антител IgG к цитомегаловирусу до 1:1600, снижении содержания ERα в гомогенате хориона до 3,62±0,51 нмоль/л определяют угрозу нарушения имплантации зародыша в слизистую оболочку матки, что может привести к его гибели в виде самопроизвольного выкидыша. 1 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для предупреждения появления и дальнейшего развития клиновидных дефектов зубов. Для этого проводят двукратно забор десневой жидкости в 8.00 и в 20.00, причем в десневой жидкости исследуют концентрации билирубина общего, билирубина прямого, билирубина непрямого, щелочной фосфатазы; если концентрация хотя бы одного из показателей в процессе исследования будет выше референтного значения, которое составляет для билирубина общего 8,35±1,04 ммоль/л, билирубина прямого 0,24±0,06 ммоль/л, билирубина непрямого 8,12±0,84 ммоль/л, щелочной фосфатазы 36,9±3,0 Ед/л, то подтверждают агрессивное воздействие на зубы желудочного содержимого и рекомендуют пациенту провести лечение патологии желудочно-кишечного тракта, сопровождающейся гастроэзофагеальнооральным рефлюксом. 3 пр.
Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики микробного фактора при хроническом неспецифическом эндометрите. Сущность способа заключается в том, что у больной на 7-9-й день менструального цикла берут бактериологический посев из полости матки и цервикального канала с помощью внутриматочной цитощетки. При выявлении Lactobacillus spp., Enterococcus faecali, Streptococcus viridans, Streptococcus agalactiae диагностируют микробный фактор при хроническом неспецифическом эндометрите. Использование способа позволяет с высокой точностью диагностировать микробный фактор при хроническом неспецифическом эндометрите. 3 пр.
Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики микробного фактора при хроническом неспецифическом эндометрите. Сущность способа заключается в том, что у больной на 7-9-й день менструального цикла берут бактериологический посев из полости матки и цервикального канала с помощью внутриматочной цитощетки. При выявлении Lactobacillus spp., Enterococcus faecali, Streptococcus viridans, Streptococcus agalactiae диагностируют микробный фактор при хроническом неспецифическом эндометрите. Использование способа позволяет с высокой точностью диагностировать микробный фактор при хроническом неспецифическом эндометрите. 3 пр.

Изобретение относится к области хранения образцов биологического материала, а именно к твердофазным носителям иммобилизации и хранения биологических образцов. Твердофазный носитель для иммобилизации и хранения образцов, содержащих нуклеиновые кислоты, представляет собой пористую целлюлозную основу, обработанную композицией, содержащей детергент, слабое основание, хелатообразующий агент и дисахарид. Изобретение обеспечивает увеличение срока хранения образцов при комнатной температуре без разрушения нуклеиновых кислот, а также позволяет осуществить стерилизационную обработку носителя от «примесной» ДНК или РНК без потери свойств носителя. 13 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

Наверх