Способ получения трансфер-фактора для профилактики вирусных болезней птиц

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к ветеринарной иммунологии. Предложен способ получения трансфер-фактора для профилактики вирусных болезней птиц, включающий приготовление экстракта лимфоцитов, гидролиз ДНК-азой, диализ с последующей консервацией или лиофилизацией целевого продукта, где в качестве источника лимфоцитов используют селезенки вакцинированных против одной или нескольких инфекций или переболевших цыплят или кур. Изобретение обеспечивает эффективное получение трансфер-фактора из экстракта лимфоцитов с увеличенным выходом продукта. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности ветеринарной иммунологии, и предназначено для получения иммунологических стимуляторов, а именно способу получения трансфер-фактора кур для профилактики вирусных болезней птиц, обеспечивающего адаптивный перенос иммунологической информации с целью его применения в промышленном птицеводстве и при производстве вакцин. Биологически активную фракцию диализата экстракта лейкоцитов, представляющую собой низкомолекулярный (менее 10000 дальтон) антигенспецифический рибонуклеопептид, способный переносить клеточно-опосредованный иммунитет на несенсибилизированные лимфоциты и получивший название фактора переноса или трансфер-фактора (ТФ), применяют для передачи клеточного иммунитета при различных патологиях, сопровождающихся снижением реактивности организма, а также в качестве вспомогательного средства для профилактики и лечения хронических инфекционных болезней, инфекций вирусной и бактериальной этиологии, кандидозов, иммуннодефицитных состояний.

Известны способы получения трансфер-фактора из лимфоцитов донорской крови, лимфоидных органов, например миндалин, содержащих до 40% лимфоцитов, путем приготовления экстракта или лизата, который подвергают диализу или ультрафильтрации для выделения низкомолекулярной фракции с последующей лиофилизацией [1, 2, 3, 4].

Трансфер-фактор также можно получить путем экстракции с помощью тритона Х-100 из культивированных лимфоцитов, разрушенных замораживанием и оттаиванием, с помощью ультрафильтрации на полых волокнах ХМ-50, РМ-10 и М-2 с последующей лиофилизацией [5].

Недостатком способа является примесь в конечном продукте тритона Х-100, обладающего побочной биологической активностью.

Известен также способ получения трансфер-фактора из плазмы донорской крови путем экстракции этанолом при его конечной концентрации 3,0-3,5% и насыщении раствора двуокисью углерода. Для создания давления при ультрафильтрации используется двуокись углерода при его рабочем движении 0,15-0,20 МПа [6].

Известен также способ получения трансфер-фактора, включающий использование донорской крови (больших объемов) в качестве источника лейкоцитов [7].

Однако данный способ обладает высокой трудоемкостью, сложностью исполнения. К тому же, использование человека в качестве объекта для выделения трансфер-фактора делает невозможным использование препарата в ветеринарии из-за его специфичности.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ получения трансфер-фактора из регионарных лимфоузлов крупного рогатого скота, предложенный Щегловым В.М. с соавт. [8].

Данный способ предусматривает следующие этапы:

1. Получение экстракта лимфоцитов. Регионарные лимфоузлы (предлопаточные, надколенной складки и другие) отбирают при убое здорового крупного рогатого скота. Их освобождают от соединительной ткани, жира и измельчают на мелкие кусочки, помещают в гомогенизатор, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:1 и подвергают гомогенизации до однородной консистенции при 20 тыс.об/мин в течение 2-3 минут. Такой режим обработки лимфоидной ткани обеспечивает полное разрушение клеточных структур.

2. Гидролиз экстракта лимфоцитов и получение трансфер-фактора. Для осуществления гидролиза белка готовят 0,5%-ный раствор пепсина на 0,5% растворе соляной кислоты. Суспензию, полученную после гомогенизации лимфоузлов, смешивают в стеклянной емкости с данным раствором в соотношении 1:10. Одновременно для деполимеризации ДНК в реагентную смесь вносят кристаллы MgSO4 в количестве 0,015-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,004-0,006 мг. Сосуд помещают в термостат на 24-28 часов при температуре 37-38°С. Периодически проверяют рН среды и при необходимости доводят его исходным раствором пепсина и соляной кислоты до оптимального значения 1,75-2,0. Контролем окончания гидролиза является отсутствие реакции на белок (биуретовая реакция).

Полученный трансфер-фактор фильтруют и консервируют раствором карболовой кислоты до конечной концентрации раствора 0,5%.

Однако, несмотря на упрощение технологии получения препарата, выбор в качестве объекта для получения трансфер-фактора крупного рогатого скота и специфичность конечного продукта делают невозможным использование получаемого препарата в птицеводстве.

Задачей заявляемого изобретения является создание способа получения трансфер-фактора с целью применения его в промышленном птицеводстве для профилактики вирусных болезней птиц, при производстве вакцин, а также с возможностью использования его с диагностическими целями в экспериментальной иммунологии и биотехнологии.

Поставленная задача решена путем создания способа получения трансфер-фактора для профилактики вирусных болезней птиц, включающего приготовление экстракта лимфоцитов, гидролиз ДНК-азой, диализ с последующей консервацией или лиофилизацией целевого продукта, характеризующийся тем, что в качестве источника лимфоцитов используют селезенки вакцинированных против одной или нескольких инфекций или переболевших ими цыплят или кур, которые измельчают в физиологическом растворе в соотношении 1:1, затем гомогенизируют до однородной консистенции при 5000 об/мин в течение 2-3 мин, в полученный гомогенат добавляют кристаллы MgSO4 в количестве 0,013-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,003-0,006 мг, полученную суспензию 4-5-кратно замораживают при -40°С, размораживают при +37°С, затем центрифугируют при 3000g 60 минут, подвергают диализу против 50 объемов дистиллированной воды с использованием диализных мешков при постоянном помешивании течение 24 часов при температуре +4°С, полученный целевой продукт консервируют мертиолятом в конечной концентрации не менее 0,0001% или лиофилизируют.

Сравнительный анализ заявленного решения со способом, выбранным за прототип, показал, что новое решение обладает следующими отличительными признаками:

- выбор в качестве объекта для получения трансфер-фактора кур;

- использование в качестве исходного материала для получения лимфоцитарной массы селезенок;

- упрощение технологии получения препарата;

- специфичность конечного продукта для кур.

Наличие отличительных от прототипа признаков обеспечивает соответствие заявляемого технического решения критерию «новизна».

Анализ доступных авторам источников информации показал, что сведений о способе получении трансфер-фактора из селезенок кур не обнаружено.

Таким образом, все указанные отличительные признаки являются необходимыми и существенными, тесно связаны между собой, и поэтому трудно выделить вклад каждого отдельного признака в решении поставленной задачи.

Проведенные испытания заявляемого способа получения трансфер-фактора подтверждают его преимущества перед способом-прототипом.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Схема получения трансфер-фактора для профилактики вирусных болезней птиц.

1. Получение экстракта лимфоцитов.

Селезенки, отобранные при убое вакцинированных против одной или нескольких инфекций или переболевших ими цыплят или кур, через 14-35 дней после вакцинации или переболевания в количестве 100 г помещают в гомогенизатор, добавляют физиологический раствор в соотношении 1:1 и подвергают гомогенизации до однородной консистенции при 5000 об/мин в течение 2-3 мин.

2. Гидролиз экстракта лимфоцитов и получение трансфер-фактора.

Затем осуществляют гидролиз белков, находящихся в гомогенате.

Для деполимеризации ДНК в смесь вносят кристаллы MgSO4 в количестве 0,013-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,003-0,006 мг. Полученную суспензию 4-5-кратно замораживают - размораживают. Замораживание проводят при -40°С, оттаивание - при +37°С.

Клеточную суспензию центрифугируют при 3000g 60 минут. Надосадочную жидкость переносят в диализный мешок. Диализный мешок ополаскивают 0,85% раствором соляной кислоты и помещают в сосуд со стерильной дистиллированной водой. Соотношение между диализатом и водой 1:50. Диализ проводят при постоянном помешивании на магнитной мешалке в течение 24 часов при температуре +4°С. По окончании диализа полученный целевой продукт в количестве (10000 доз) консервируют мертиолятом в конечной концентрации 0,0001% или разливают во флаконы по 3 см3 и лиофилизируют.

Полученный трансфер-фактор представляет собой слегка опалесцирующую жидкость светло-желтого цвета, не содержит белок, представляет собой низкомолекулярный рибонуклеопептид, устойчив к повторному замораживанию и размораживанию, лиофилизации, устойчив к действию РНК-азы и ДНК-азы, трипсина.

Тестирование полученного трансфер-фактора проводят по измерению его цитоиммобилизующей активности в реакции торможения миграции лейкоцитов с конканавалином А (РТМЛ с КоА) и по результатам биопробы. Результаты тестирования представлены в Таблице 1.

Примечание: * - р<0,05 - достоверные отличия от показателей контрольных групп.

** - Для постановки биопробы в каждую группу берут 25 цыплят.

Как видно из приведенных результатов тестирования, трансфер-фактор, полученный представленным способом, сообщает лимфоцитам нормальных цыплят способность выделять лимфокины в ответ на антиген вируса ИББ и предотвращает смертность при заражении высоковирулентными вирусами ИББ.

Пример 2.

СПФ-цыплятам суточного возраста вводили трансфер-фактор, полученный из селезенок цыплят-бройлеров, переболевших инфекционной анемией цыплят (ИАЦ) (опытная группа). Цыплятам контрольной группы трансфер-фактор не вводили. Цыплят содержали в боксе, контаминированном вирусом ИАЦ. В возрасте 40 суток отбирали сыворотки крови от цыплят опытной и контрольной групп для исследования с использованием иммуноферментного анализа. Результаты исследований представлены в Таблице 2.

Как видно из приведенных результатов тестирования трансфер-фактор, полученный представленным способом, переносит иммунитет против вируса ИАЦ и предотвращает заражение вирусом ИАЦ.

Использование предлагаемого способа получения трансфер-фактора позволяет привлечь дополнительный источник сырья, способный увеличить выход продукта. Получаемый согласно способу трансфер-фактор может быть использован как при производстве биологических препаратов для профилактики инфекционных болезней птиц, в том числе в раннем возрасте, так и с диагностическими целями, а также в экспериментальной иммунологии и биотехнологии.

Источники информации

1. Лоуренс X., Эль-Аскари С. Приготовление и очистка фактора переноса. Методы изучения in vitro клеточного иммунитета. - М. - 1974. - с. 256-272.

2. Кухаркина О.В. Получение и изучение свойств препаратов фактора переноса против некоторых вирусных и бактериальных инфекций животных: дис. канд. биол. наук. - Владимир, 2003. - 140 с.

3. Петров Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. - М.: Медицина, 1987. - 416 с: ил.

4. Чередеев А.Н. Фактор переноса // Итоги науки и техники, т. 9. Медиаторы иммунной системы. - М., 1981. - с. 51-79.

5. GB №1443948 A1, А61К 45/00, 20.10.1972.

6. SU №787031 A1, А61К 35/16, 15.12.1980.

7. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля, пер. с нем. - М.: Медицина, 1987. - 472 с: ил.

8. RU №2270021 С2, А61К 35/16, 20.02.2006.

Способ получения трансфер-фактора для профилактики вирусных болезней птиц, включающий приготовление экстракта лимфоцитов, гидролиз ДНК-азой, диализ с последующей консервацией или лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве источника лимфоцитов используют селезенки вакцинированных против одной или нескольких инфекций или переболевших ими цыплят или кур, которые измельчают в физиологическом растворе в соотношении 1:1, затем гомогенизируют до однородной консистенции при 5000 об/мин в течение 2-3 мин, в полученный гомогенат добавляют кристаллы MgSO4 в количестве 0,013-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,003-0,006 мг, полученную суспензию 4-5-кратно замораживают при -40°С - размораживают при +37°С, затем центрифугируют при 3000g 60 минут, подвергают диализу против 50 объемов дистиллированной воды с использованием диализных мешков при постоянном помешивании в течение 24 часов при температуре +4°С, полученный целевой продукт консервируют мертиолятом в конечной концентрации не менее 0,0001% или лиофилизируют.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и физиотерапии, и может быть использовано для лечения подростков с недифференцированной дисплазией соединительной ткани.

Изобретение относится к медицине, в частности к ревматологии и кардиологии, и может быть использовано для коррекции артериальной ригидности у больных ревматоидным артритом.
Изобретение относится к медицине и предназначено для профилактики фетоплацентарной недостаточности (ФПН) у беременных с хронической болезнью почек (ХБП). Назначают антиагрегантное средство в профилактической дозе.

Изобретение относится к области биохимии, фармакологии, биологии и медицины. Предложено применение хлоркрезацина для стимуляции экспрессии матричной РНК триптофанил-тРНК-синтетазы.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для повышения неспецифической резистентности организма свиней. Смешивают 90 мас.ч.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для активизации неспецифической резистентности организма крупного рогатого скота. Смешивают 90 мас.

Изобретение относится к N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-[2-(6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран-5-ил)ацетил]тиофен-3-сульфонамиду или его фармакологически приемлемой соли. Соединение по изобретению предназначено в качестве антагониста рецептора эндотелина или терапевтического или профилактического средства для лечения легочной артериальной гипертензии.

Изобретение относится к медицине, а именно к бальнеологии и физиотерапии, и может быть использовано для проведения оздоровительных процедур. Для этого на мараловодческом предприятии для пациентов осуществляют курс общих ванн с варочной пантовой водой.

Изобретение относится к новому гидроксиметилфурфуральному производному, представленному общей формулой I, где R - радикал формулы (I), которое входит в состав продукта, полученного тепловой обработкой стебля спаржи с горячей водой, способу его получения, а также к способу индукции белка теплового шока или регуляции автономной нервной системы и индукции антистрессового действия.

Комбинация антибиотиков, содержащая рифабутин, кларитромицин и клофазимин, предназначенная для лечения аутоиммунного заболевания, такого как рассеянный склероз. 2 н.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для специфической пассивной профилактики вирусных инфекций бройлеров. Способ включает введение птице трансфер-фактора.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству для лечения заболеваний кожи, обладающему противовоспалительным, антибактериальным, противовирусным, противогрибковым действием, представляющему собой масляный экстракт из листьев Gynura procumbens, полученному определенным способом.

Изобретение относится к области ветеринарии. Клинически здоровым телятам 20-30-дневного возраста применяют внутрь ксимедон гидрохлорид в смеси с 3,5% спиртовой настойкой почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.), взятых в соотношении 2:1:1, из расчета 2,0 г ксимедона гидрохлорида на 100,0 мл 3,5% спиртовой настойки почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) в дозе 1,5-2,0 мл/кг живой массы первый раз за 18-24 часа до и двукратно после иммунизации.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для динамического контроля лечения цервикальных интраэпителиальных поражений шейки матки.

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармацевтической промышленности, и описывает фармацевтическую композицию для профилактики и терапии респираторных вирусных инфекций.

Изобретение относится к новым синтетическим соединениям, а именно 1-(1-адамантил)этиламиду-3-(2-тиэнил)-пропеновой кислоты (TEPr-Rem), 1-адамантаиламиду-3-(2-тиэнил)-пропеновой кислоты (TEPr-Amt) и 1-(1-адамантил)этиламиду-4-(2-тиэнил)-бутановой кислоты (TEBu-Rem): Предложенные соединения: TEPr-Rem, TEPr-Amt и TEBu-Rem ингибируют репродукцию патогенных штаммов вируса гриппа A/H1N1pdm2009 и A/H5N1, также обладают вирулицидным действием по отношению к вирусным частицам гриппа A/H5N1.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для специфической профилактики кори, эпидемического паротита, краснухи у ВИЧ-инфицированных детей.

Группа изобретений раскрывает фармацевтическую композицию, включающую микофенолят с нанесенным на него энтеросолюбильным покрытием, обеспечивающую высвобождение микофенолята в верхней части кишечного тракта, и способ подавления иммунитета у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества указанной композиции пациенту, нуждающемуся в такой терапии.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к противовирусному средству на основе экстракта культуры «бородатых корней» («hairy roots») селитрянки Шобера (Nitraria schoberi L.), представляющему собой сухой растительный экстракт.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для профилактики колибактериоза у телят. Проводят иммунизацию глубокостельных коров за 1,5-2 месяца до родов вакциной против эшерихиоза животных Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ- и ТС-анатоксины дважды с интервалом 15 дней, первая доза составляет 10 см3, вторая - 15 см3.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для специфической пассивной профилактики вирусных инфекций бройлеров. Способ включает введение птице трансфер-фактора.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к ветеринарной иммунологии. Предложен способ получения трансфер-фактора для профилактики вирусных болезней птиц, включающий приготовление экстракта лимфоцитов, гидролиз ДНК-азой, диализ с последующей консервацией или лиофилизацией целевого продукта, где в качестве источника лимфоцитов используют селезенки вакцинированных против одной или нескольких инфекций или переболевших цыплят или кур. Изобретение обеспечивает эффективное получение трансфер-фактора из экстракта лимфоцитов с увеличенным выходом продукта. 2 табл., 2 пр.

Наверх