Конъюгаты антагонистов интегрина для нацеленной доставки к клеткам, экспрессирующим vla-4

Изобретение относится к соединениям формулы I, где R1 выбран из группы, состоящей из соединений формулы (1), формулы (2), формулы (3), для изготовления и доставки конъюгированных молекул, таких как низкомолекулярные вещества, пептиды, нуклеиновые кислоты, флуоресцирующие молекулы и полимеры, которые связаны с антагонистами интегрина VLA-4, к клеткам-мишеням, экспрессирующим VLA-4. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 14 пр.

(1),(2),

(3)

 

Настоящее изобретение относится к синтезу и взаимодействию эффективных и селективных низкомолекулярных антагонистов интегрина, содержащих подходящие линкеры и функциональные группы для химической реакции с другими молекулами, содержащими реакционно-способные нуклеофильные группы, например тиольные группы, для образования ковалентной связи между молекулой, которую нужно конъюгировать, и нацеливающим фрагментом. Низкомолекулярные нацеливающие антагонисты связываются с распознаваемыми ими системами рецепторов, как, например, антагонисты VLA-4 с димером VLA-4 (как антагонисты α4β1 с интегрином α4β1, известным также как димерный белок Very Late Antigen-4). Ковалентно связанный радикал включает низкомолекулярные терапевтические вещества, полимеры, пептиды и олигонуклеотиды. Сюда входят 5'-тиосодержащие олигонуклеотиды для получения производных 5'-тио-миРНК в качестве средств для обеспечения нацеленной доставки указанных миРНК. Такие дериватизированные миРНК в составе конъюгата с подходящими агентами для трансфекции способствуют селективной доставке миРНК в клетки, экспрессирующие такие рецепторы интегрина, таким образом предотвращая экспрессию целевых генов за счет РНК-интерференции (РНКи).

VLA-4 (Very Late Antigen-4, называемый также α4β1) представляет собой димерный интегрин. Он составлен из двух субъединиц, состоящих из CD49d (альфа) и CD29 (бета). VLA-4 экспрессируется на плазменных мембранах. лейкоцитов, которые связываются с VCAM-1 на стенках кровеносных сосудов (после активации цитокинами), способствуя адгезии лейкоцитов на эндотелии сосудов (что вносит свой вклад в развитие атеросклероза и других воспалительных заболеваний). Раковые клетки определенных типов также могут экспрессировать VLA-4, который связывается с VCAM-1, вызывая адгезию таких клеток на эндотелии (что повышает риск метастаза). Таким образом, соединения, которые связываются с VLA-4, могут блокировать взаимодействие с VCAM-1, что потенциально предотвращает или лечит заболевания, опосредованные таким взаимодействием. Или же соединения, связывающиеся с VLA-4, можно применять в фармацевтических композициях для доставки лекарственных веществ, нуклеиновых кислот или других терапевтических соединений к тканям или клеткам, экспрессирующим VLA-4, для лечения или профилактики заболевания.

РНК-интерференция - хорошо известный процесс, при котором трансляция информационной РНК (иРНК) в белок затруднена за счет ассоциации или связывания комплементарных или частично комплементарных олигонуклеотидов, таких как малая интерферирующая РНК (миРНК), короткая шпилечная РНК (кшРНК), микро-РНК (миРНК) или антисмысловые олигонуклеотиды. Молекулы миРНК представляют собой двуспиральные молекулы РНК, длиной обычно в интервале 19-25 нуклеотидов, которые образуют ассоциаты с рядом белков в цитоплазме, известных как RISC (индуцированный РНК комплекс сайленсинга). В конечном итоге RISC разделяет двуспиральную миРНК, давая возможность одной цепи связаться или образовать ассоциат с комплементарным или частично комплементарным участком молекулы иРНК, после чего иРНК разрушается под действием RISC, или ее трансляция предупреждается иным путем, вследствие чего подавляется экспрессия кодируемого белка или продукта гена.

Одна из проблем в использовании нуклеиновых кислот, таких как миРНК, в терапевтических целях (в частности, для систематического введения у человека) заключается в доставке нуклеиновых кислот: (1) к конкретной целевой ткани или типам клеток и (2) к цитоплазме указанных клеток (т.е. туда, где указанная иРНК присутствует и транслируется в белок). Проблема доставки частично обусловлена тем фактом, что нуклеиновые кислоты отрицательно заряжены и легко разрушаются (особенно, если они не модифицированы), эффективно фильтруются почками, и их нельзя как таковые легко транспортировать в цитоплазму. Таким образом, основная масса исследований сфокусирована на разрешении проблемы доставки с помощью различных носителей и композиций, включая лизосомы, мицеллы, пептиды, полимеры, конъюгаты и аптамеры. См., например: Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009). Некоторые более перспективные средства доставки включают применение липидных систем, включая липидные наночастицы. См., например: Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009); Международная Заявка на патент № WO 2010/042877, Норе et al ("Improved Amino Lipids And Methods For the Delivery of Nucleic Acids"). Тем не менее, сохраняется необходимость в дальнейшем улучшении нацеленной доставки миРНК; а также в других веществах, таких как низкомолекулярные соединения, пептиды, другие нуклеиновые кислоты, флуоресцирующие молекулы и полимеры, для конкретных целевых клеток и цитоплазмы таких клеток.

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы I:

где R1, R2 и n определены в подробном описании и формуле изобретения. В частности, настоящее изобретение относится к соединениям формулы I для улучшенной доставки конъюгированных молекул, таких как низкомолекулярные вещества, пептиды, нуклеиновые кислоты, флуоресцирующие молекулы и полимеры, к клеткам-мишеням, экспрессирующим димер интегрина α4β1 (Very Late Antigen-4) для различных терапевтических целей и других видов применения. Настоящее изобретение относится также к способам изготовления и применения таких соединений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

В Табл. 1 представлен состав конкретных дериватизированных по 5'-концу одинарных и двойных цепей миРНК.

В Табл. 2 представлены данные анализа для низкомолекулярных конъюгатов миРНК.

В Табл. 3 представлены последовательности миРНК, в которых 5'-антисмысловая цепь была дериватизирована с помощью Nu547.

В Табл. 4 представлены активности низкомолекулярных конъюгатов миРНК в анализах антагонистов интегрина и данные по KD для миРНК.

В Табл. 5 представлены идентичность, характеристика и связывающая активность меченых изомером FITC реагентов.

На Фиг. 1 представлена гистограмма ("В": Дуплекс-27 500 нМ и соединение из Примера 140, 10 мкМ; "А": Дуплекс-27).

На Фиг. 2 представлен пример отображения захвата миРНК (Дуплекс-27 (500 нМ).

На Фиг. 3 представлены изображения клеток Jurkat с FITC, конъюгированным с соединением из Примера FITC-5 (LFA-1 антагонист-меченый FITC) при концентрации 10 мкМ.

На Фиг. 4 представлены изображения клеток Jurkat с FITC, конъюгированным с соединением из Примера FITC-14 (VLA-4 антагонист-меченный FITC) в концентрации 10 мкМ. На гистограмме показан сдвиг в присутствии дуплекса миРНК с элементом, нацеливающим на VLA-4. В присутствии антагониста VLA-4 из примера 140, указанный сдвиг оказывается сжатым.

На Фиг. 5 показано снижение экспрессии АНА1 в клетках Н1299 при их обработке дуплексами миРНК, которые были дериватизированы по 5'-смысловой цепи с помощью низкомолекулярного соединения, нацеливающего к интегрину. Y-ось отображает наблюдаемый уровень экспрессии АНА1. Более низкий столбик отражает более высокую степень выключения (более высокую степень трансфекции миРНК); высокий столбик - более низкую степень выключения (т.е. более низкую степень трансфекции миРНК). Дуплексы голубого цвета включают нацеливающую модификацию на 5'-конце смысловой цепи; дуплексы розового цвета содержат нацеливающую модификацию на 5'-конце смысловой цепи, а также флюорофор Nu547, присоединенный по 5'-концу антисмысловой цепи.

На Фиг. 6 показаны уровни экспрессии GAPDH иРНК, маркера здоровья клеток. Идентичность уровней экспрессии для тех клеток, которые были обработаны дериватизированной миРНК, по сравнению обработанными холостым образцом и необработанными клетками, говорит об отсутствии токсичности для клеток при используемых концентрациях и длительности обработки.

Если не указано иное, следующие специфические термины и выражения, используемые в описании и формуле изобретения, имеют приведенные ниже определения.

Термин "радикал" обозначает атом или группу химически связанных атомов, которые присоединены к другому атому или молекуле посредством одной или более химических связей, составляя таким образом часть молекулы. Например, переменные R1 и R2 формулы I обозначают радикалы, которые присоединены к структуре, изображенной на формуле I, посредством ковалентной связи, где это указано.

Термин "конъюгированный фрагмент" обозначает структуру, представляющую собой терапевтическое средство или полезное соединение, пептид, полимер, низкомолекулярное вещество, флюоресцирующую молекулу, олигонуклеотид или нуклеиновую кислоту. Примерами являются лекарственные вещества, терапевтические пептиды, антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК и флюоресцеинизотиоцианат (FITC).

Если не указано иное, термин "водород" или "гидро" обозначает радикал, состоящий из атома водорода (-Н), а не Н2.

Термин "галоген" обозначает радикал фтора, хлора, бром или иода.

Термин "алкил" обозначает алифатический насыщенный углеводородный радикал с линейной или разветвленной цепью, включающий от 1 до 25 атомов углерода.

Термин "TFA" обозначает трифторуксусную кислоту.

Если не указано иное, термин "соединение формулы" или "соединения формулы" обозначает любое соединение, выбранное из рода соединений, охватываемых указанной формулой (включая любые фармацевтически приемлемые соль или эфир любого такого соединения, если не указано иное).

Термин "фармацевтически приемлемые соли" обозначает такие соли, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных оснований или свободных кислот, которые не являются нежелательными с биологической или иной точки зрения. Такие соли могут быть образованы неорганическими кислотами, такими как хлороводородная кислота, бромоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п., предпочтительно хлороводородная кислота, и органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, N-ацетилцистеин и т.п. Кроме того, соли можно получать добавлением неорганического основания или органического основания к свободной кислоте. Соли, образованные неорганическим основанием, включают, без ограничения, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния и т.п. Соли, образованные органическими основаниями, включают, без ограничения, соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая природные замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, такие как изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, лизин, аргинин, N-этилпиперидин, пиперидин, полиаминовые смолы и т.п. В зависимости от природы заместителей, соединения по настоящему изобретению могут существовать также в форме цвиттер-ионов.

Соединения по настоящему изобретению могут присутствовать в форме фармацевтически приемлемых солей. Соединения по настоящему изобретению могут также присутствовать в форме фармацевтически приемлемых эфиров (т.е., метиловых и этиловых эфиров кислот формулы I для применения в качестве пролекарств). Соединения по настоящему изобретению можно также сольватировать, т.е. гидратировать. Сольватацию можно осуществлять в ходе процесса получения или она может протекать как следствие гигроскопических свойств изначально безводного соединения формулы I (гидратация).

Соединения, которые имеют одинаковую молекулярную формулу, но различаются по природе или последовательности связей составляющих атомов или расположения атомов в пространстве носят название "изомеры". Изомеры, которые различаются по расположению атомов в пространстве, называются "стереоизомеры". Диастереомеры представляют собой стереоизомеры с противоположной конфигурацией при одном или более хиральных центров, которые не являются энантиомерами. Стереоизомеры, включающие один или более асимметрических центров, представляющие собой несовместимые друг с другом зеркальные отображения друг друга, носят название "энантиомеры". Если соединение содержит асимметрический центр, например, если атом углерода связан с четырьмя различными группами, возможна пара энантиомеров. Энантиомер можно охарактеризовать по абсолютной конфигурации его асимметрического центра или центров, и она описывается правилами для определения R- и S-конфигурации Канна, Ингольда и Прелонга, или же исходя из того, каким образом данная молекула вращает плоскость поляризованного света, и обозначается как правовращающий или левовращающий (т.е. как (+) или (-)-изомеры, соответственно). Хиральное соединение может существовать как в виде индивидуального энантиомера, так и в виде их смеси. Смесь, содержащая равные части энантиомеров, называется "рацемическая смесь".

Термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество соединения, которое эффективно для предотвращения, облегчения или улучшения симптомов заболевания или удлинения срока жизни субъекта, которому проводят лечение. Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалиста в данной области техники. Терапевтически эффективное количество или дозировка соединения по настоящему изобретению может изменяться в широких пределах и ее можно определять способом, известным в данной области техники. Такую дозировку следует подбирать в соответствии с индивидуальными требованиями в каждом конкретном случае, включая конкретное вводимое(ые) соединение(я), способ введения, состояние, подлежащее лечению, а также пациента, которому проводят лечение. Суточную дозу можно вводить единственной дозой или разделенными дозами, или, в случае парентерального введения, ее можно вводить путем непрерывной инфузии.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает всевозможные материалы, совместимые с фармацевтическим введением, включая растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и агенты, замедляющие абсорбцию и другие материалы и соединения, совместимые с фармацевтическим введением. За исключением тех случаев, когда любая стандартная среда или агент не совместимы с действующим веществом, их применение в композициях по настоящему изобретению рассматривается. В композиции можно также включать дополнительные действующие вещества.

В частности, настоящее изобретение относится к соединениям формулы I:

или их фармацевтически приемлемым солям или эфирам; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3 и G выбран из группы, состоящей из:

(2) соединения формулы:

;

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой независимо водород или галоген, W представляет собой О или CH2, a G выбран из группы, состоящей из:

и

(3)соединения формулы:

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

;

(2) соединения формулы:

;

(3) соединения формулы:

; и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

Используемый в приведенных выше структурах символ указывает на то положение, по которому данная структура или радикал присоединены к основной молекуле посредством ковалентной связи. Кроме того, фраза "к ПЭГ" или "к S" или подобное выражение, используемое в сочетании с указанным выше символом, указывает на то, в каком месте и каким образом данная структура или радикал присоединены к основной молекуле, если имеется несколько возможных положений для присоединения. Например, если R2 представляет собой соединение формулы:

,

где X представляет собой соединение формулы:

.

то структура, соответствующая формуле I, будет следующей:

где R1, R3 и n определены в формуле I.

Настоящее изобретение относится также к способам изготовления и применения соединений формулы I, а также фармацевтических композиций, содержащих такие соединения. Соединения формулы I полезны для улучшения доставки низкомолекулярных веществ, белков, нуклеиновых кислот, полимеров, флюоресцирующих маркеров и других веществ к клеткам-мишеням, экспрессирующим рецепторы VLA-4. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к композициям и лекарственным формам, содержащим соединения формулы I, которые полезны для доставки миРНК в цитоплазму клеток-мишеней, экспрессирующих VLA-4 рецепторы, для ингибирования экспрессии конкретных целевых белков за счет РНК-интерференции.

В более частных воплощениях, настоящее изобретение относится к применению соединений формулы I в композициях для облегчения доставки нуклеиновых кислот, таких как миРНК, к опухолевым клеткам и клеткам других типов, экспрессирующим рецепторы VLA-4. Кроме того, частью настоящего изобретения является применение соединений формулы I в изготовлении композиций для доставки для лечения воспалительных и пролиферативных расстройств, таких как рак.

R1 представляет собой низкомолекулярный антагонист интегрина, который нацеливает соединения формулы I к комплексам рецепторов интегрина VLA-4, облегчая таким образом их доставку к клеткам, которые экспрессируют такие рецепторы.

В некоторых воплощениях нацеливающие фрагменты R1 низкомолекулярного антагониста интегрина присоединены по такому положению, чтобы аффинность низкомолекулярного вещества к рецептору интегрина существенно не снижалась, по сравнению со свободным низкомолекулярным антагонистом интегрина. Фрагменты R1 формулы I нацелены к димеру VLA-4 (Интегрин α4β1 или Very Late Antigen-4).

В некоторых воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир, где m равно от 0 до 3.

В других частных воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир, где m равно от 0 до 3.

В других частных воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир, где m равно от 0 до 3.

В других частных воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир, где m равно от 0 до 3.

В других воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир, где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой водород или галоген, a W представляет собой О или CH2.

В других частных воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир, где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой водород или галоген, a W представляет собой О или CH2.

В других частных воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир, где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой водород или галоген, а W представляет собой О или CH2.

В других частных воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир, где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой водород или галоген и W представляет собой О или CH2.

В других частных воплощениях R1 представляет собой нацеливающий к VLA-4 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль или эфир.

R2 может представлять реакционноспособные радикалы, которые могут давать ковалентные связи с терапевтическими или иными полезными соединениями или конъюгированными фрагментами, содержащими сильные нуклеофилы, например с тиол-содержащими фрагментами. Примеры таких реакционноспособных радикалов включают радикалы, выбранные из группы, состоящей из:

Как вариант, R2 может представлять собой радикал, который уже присоединен к конъюгированному фрагменту, такому как терапевтическое или другое полезное соединение, белок или олигонуклеотид (R3). В частности, R2 может представлять радикал формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

В некоторых воплощениях R3 представляет собой олигонуклеотид. В частных воплощениях R3 представляет собой 5'-конец смысловой цепи молекулы РНК, который может существовать как одинарная цепь или в дуплексе, например молекула миРНК. Такие молекулы миРНК, известные также как агенты РНКи, ингибируют экспрессию целевого гена в клетке. В частных воплощениях R3 представляет собой молекулу миРНК, которая состоит по существу из олигорибонуклеотидной цепи длиной от 15 до 30 нуклеотидов, в которой 5'-конец смысловой олигорибонуклеотидной цепи присоединен к R2, как показано в выше приведенных структурах и комплементарен по меньшей мере одной части иРНК, соответствующей целевому гену. В других воплощениях R3 представляет собой олигонуклеотид ДНК, присоединенный по своему 5'-концу. Такая дериватизированная ДНК может существовать в виде одинарной цепи или одной цепи, гибридизованной с комплементарной цепью другого олигонуклеотида. Олигонуклеотидные цепи могут быть как немодифицированными, так и модифицированными в целях метаболической стабильности. Подобные модификации включают, без ограничения, замещения в конкретных положениях по фосфатной группе (например, фосфоротиоат) и 2'-гидроксигруппе (например, 2'-O-метил и 2'-фтор).

В некоторых воплощениях R2 формулы I представляет собой -X-S-CH2-R3, где R3 включает смысловую цепь РНК, как показано ниже в формуле 5 (на основе формулы I):

где R1, n и X таковы, как определено в формуле I.

В других частных воплощениях смысловая цепь может быть связана с антисмысловой цепью.

В других частных воплощениях R2 представляет собой -X-S-CH2-R3, где R3 представляет собой низкомолекулярное соединение или белок, образуя таким образом ковалентно связанную, специфически нацеленную молекулу формулы I.

В более частных воплощениях R2 представляет собой -X-S-CH2-R3, где R3 представляет собой терапевтические низкомолекулярное соединение или белок.

В других частных воплощениях R2 представляет собой -X-S-CH2-R3, где R3 представляет собой флюоресцирующий радикал, полезный в целях визуализации указанных связей интегринового рецептора с применением технологий клеточной микроскопии.

В других частных воплощениях R2 представляет собой -X-S-CH2-R3, где R3 представляет собой полимер, содержащий первичные реакционноспособные сульфидные группы. Более конкретно, R3 может представлять собой катионный полимер, полезный для комплексирования и доставки миРНК к поверхностям клеток и цитоплазматическим доменам клеток.

В более частных воплощениях настоящее изобретение относится к соединениям формулы I, где R3 представляет собой один из структурных изомеров флуоресцеин изотиоцианата (FITC), показанных ниже:

.

В других более конкретных воплощениях настоящее изобретение 20 относится к соединениям формулы I, где R3 представляет собой один из структурных изомеров FITC-14, показанный ниже:

хиральный

В других воплощениях настоящее изобретение относится к соединению формулы I, где n равно от 9 до 13, предпочтительно 12.

В частных воплощениях настоящее изобретение относится к соединению формулы I, выбранному из группы, состоящей из одного из следующих соединений (или его фармацевтически приемлемой соли или эфира):

VLA-4 Лиганд - Реагент 1

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]этил]циклопентанкарбонил]амино]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 2

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]этил]циклопентил]карбонил]амино]-пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 3

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]-этил]циклопентанкарбонил]амино]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 4

(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанил-этокси)этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]-этил]-циклопентанкарбонил]-амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 5

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропокси]бензоиламино]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 6

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]-бензоиламино]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 7

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]пропиониламино]пропокси]бензоиламино]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 8

(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]бутил]циклопентанкарбонил]-амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 9

(S)-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]-бензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 10

(S)-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]пропиониламино]пропокси]бензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 11

(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино)метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовая кислота, трифторацетатная соль;

VLA-4 Лиганд - Реагент 12

(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино)метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота, трифторацетатная соль;

VLA-4 Лиганд - Реагент 13

(S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-ацетилсульфанил-этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовая кислота; и

VLA-4 Лиганд - Реагент 14

(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанилэтанокси)этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропионил]-[4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]-3,5-дифторбензиламино]метил]-2,6-дифторбензиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовая кислота.

Кроме того, настоящее изобретение относится к новым композициям и композициям, содержащим соединения формулы I, для создания наночастиц путем комбинирования с миРНК, с достижением улучшенной доставки нуклеиновых кислот, таких как миРНК, в цитоплазму клеток-мишеней, экспрессирующих комплексы α4β1. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к композиции миРНК, включающей: (1) соединение формулы I, в котором R2 включает 5'-миРНК олигонуклеотид; и (2) поликатионный агент для трансфекции.

Настоящее изобретение относится также к способам изготовления и применения таких соединений и композиций. Соединения формулы I полезны как компоненты композиций или лекарственные формы, которые улучшают доставку лекарственных веществ, нуклеиновых кислот или других терапевтических соединений к тканям или клеткам, экспрессирующим комплексы α4β1. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к композициям, содержащим соединения формулы I, которые полезны для доставки миРНК в цитоплазму клеток-мишеней, экспрессирующих комплексы α4β1, с целью ингибирования экспрессии конкретных белков за счет РНК-интерференции. В более частных воплощениях настоящее изобретение относится к соединениям формулы I и композициям, содержащим такие соединения, которые могут эффективно доставлять миРНК к опухолевым клеткам и клеткам других типов, экспрессирующим димеры α4β1, для лечения раковых или воспалительных заболеваний. Такие соединения и композиции более эффективны и демонстрируют улучшенную выключающую способность, по сравнению с такими же композициями, не включающими соединения формулы I.

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, a G выбран из группы, состоящей из:

(2) соединения формулы:

;

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой независимо водород или галоген, W представляет собой О или CH2, a G выбран из группы, состоящей из:

и

(3) соединения формулы:

;

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

;

(2) соединения формулы:

;

(3) соединения формулы:

; и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где: R1 представляет собой

где m равно от 0 до 3.

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

;

(2) соединения формулы:

;

(3) соединения формулы:

; и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 представляет собой соединение формулы:

где m равно от 0 до 3;

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

;

(2) соединения формулы:

;

(3) соединения формулы:

; и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 представляет собой соединение формулы:

где m равно от 0 до 3.

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

;

(2) соединения формулы:

;

(3) соединения формулы:

; и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 представляет собой соединение формулы:

где m равно от 0 до 3.

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

(2) соединения формулы:

(3) соединения формулы:

и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 представляет собой соединение формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой водород или галоген, а W представляет собой О или CH2.

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

(2) соединения формулы:

(3) соединения формулы:

и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 представляет собой соединение формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой водород или галоген, а W представляет собой О или CH2.

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

(2) соединения формулы:

(3) соединения формулы:

и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 представляет собой соединение формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой водород или галоген, а W представляет собой О или CH2.

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

(2) соединения формулы:

(3) соединения формулы:

и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 представляет собой соединение формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой водород или галоген, а W представляет собой О или CH2.

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

(2) соединения формулы:

(3) соединения формулы:

и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 представляет собой соединение формулы:

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

(2) соединения формулы:

(3) соединения формулы:

и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, a G выбран из группы, состоящей из:

(2) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой независимо водород или галоген, W представляет собой О или CH2, a G выбран из группы, состоящей из:

и

(3) соединения формулы:

R2 представляет собой соединение формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, a G выбран из группы, состоящей из:

(2) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой независимо водород или галоген, W представляет собой О или CH2, a G выбран из группы, состоящей из:

и

(3) соединения формулы:

R2 представляет собой соединение формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, a G выбран из группы, состоящей из:

(2) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой независимо водород или галоген, W представляет собой О или CH2, a G выбран из группы, состоящей из:

и

(3) соединения формулы:

R2 представляет собой соединение формулы:

где R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, a G выбран из группы, состоящей из:

(2) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой независимо водород или галоген, W представляет собой О или CH2, a G выбран из группы, состоящей из:

и

(3) соединения формулы:

R2 представляет собой соединение формулы:

где R3 представляет собой олигонуклеотид с одинарной или двойной цепью, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

В одном воплощении предложено соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; где n равно от 1 до 24 и где:

R1 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, a G выбран из группы, состоящей из:

(2) соединения формулы:

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой независимо водород или галоген, W представляет собой О или CH2, a G выбран из группы, состоящей из:

и

(3) соединения формулы:

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

(2) соединения формулы:

(3) соединения формулы:

; и

(4) соединения формулы:

где R3 представляет собой молекулу миРНК.

ОБЩИЙ СПОСОБ СИНТЕЗА СОЕДИНЕНИЙ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Подходящие способы для синтеза соединений формулы I представлены в примерах. В целом, соединения формулы I можно получить в соответствии со схемами, приведенными ниже. Если не указано иное, переменные n, R1 и R2 в ниже следующих схемах имеют такое же определение, как и в представленной ранее родовой формулы I.

Общий синтез конъюгирующих агентов малеимид-(ПЭГ)п-антагонистов интегрина

Соединения структуры 26 на схеме 1 с различной длиной ПЭГ имеются в продаже (например, в Pierce BioScience). Такие соединения можно также получать ацилированием амино-концов ПЭГ-аминокислот с помощью 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропионовой кислоты в условиях для образования амидной связи, с последующим образованием реакционноспособных N-гидроксисукциновых эфиров в ходе реакции N-гидроксиянтарной кислоты в условиях для образования эфира. Как показано на схеме 1, введение в реакцию соединений 26 с соединениями, содержащими первичную или вторичную аминогруппу, такими как соединения 27, проводят в апротонных или протонных растворителях в присутствии основных аминов, таких как DIEA (диизопропилэтиламин), при комнатной температуре, с образованием ПЭГ-илированных промежуточных продуктов 28.

Соединения структуры 29 на схеме 2, в которых R4 представляет собой тиоацетил или 2-дитиопиридил, содержащие ПЭГ-группы различной длины, также имеются в продаже (например, в Pierce Bioscience). Реакцию соединений структуры 29 с соединениями, содержащими первичные или вторичные аминогруппы, такими как соединения 27, проводят в апротонных или протонных растворителях в присутствии основных аминов, таких как DIEA (диизопропилэтиламин), при комнатной температуре, с получением ПЭГ-илированных промежуточных продуктов 30.

В качестве частного, не налагающего ограничений примера настоящего изобретения, промежуточное соединение 26 вводят в реакцию с соединением 31 с получением промежуточного малеимида 32, как показано на схеме 3.

Аналогичным образом, промежуточное соединение 26 можно вводить в реакцию с соединением 33 с получением промежуточного малеимида 34, как показано на схеме 4.

Аналогичным образом, промежуточное соединение 29 можно вводить в реакцию с соединением 35 с получением промежуточного соединения 36, как показано на схеме 5, на которой R4 представляет собой либо тиоацетил, либо 2-дитиопиридил.

Аналогичным образом, промежуточное соединение 29 можно вводить в реакцию с соединением 37 с получением промежуточного соединения 38, как показано на схеме 6, где R4 представляет собой либо тиоацетил, либо 2-дитиопиридил.

Для соединений общей структуры 26 или 29, коммерчески доступны ПЭГ различной длины, или их легко может получить специалист в данной области техники; предпочтительно n=8-24. По данной теме имеется много статей и обзоров (например: Chemistry for peptide и protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews Volume 54, Issue 4, 17 June 2002, Pages 459-476).

Промежуточное соединение 31 можно синтезировать таким же способом, как уже сообщалось в литературе (например, Sidduri, A. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002,12, 2475-2478), как показано на схеме 7.

В частности, как показано на схеме 7, промежуточное соединение 41 получали из имеющейся в продаже (S)-3-[4-нитрофенил]-2-трет-бутоксикарбонил-аминопропионовой кислоты 40. Нитрогруппу имеющегося в продаже исходного вещества 40 в метанольном растворе восстанавливали цинковой пылью в присутствии хлорида аммония при комнатной температуре в течение нескольких часов с получением анилина 41. Другие способы для восстановления нитрогруппы известны специалистам в данной области техники. Анилин 41 ацилировали производными бензоилгалида, такими как 2,6-дихлорбензоилхлорид 42, в апротонном растворителе, таком как дихлорметан, в присутствии основания, такого как диизопропилэтиламин, при комнатной температуре. Таким образом получали амид 43. Трет-бутилкарбонильную (Boc) аминопротекторную группу удаляли стандартными способами, известными специалистам в данной области техники, например путем обработки раствором HCl в диоксане при комнатной температуре; в результате этого получали гидрохлорид 44. Гидрохлорид 44 обрабатывали в условиях образования амидной связи (также хорошо известных специалистам в данной области техники) в присутствии хорошо известной 1-(2-азидоэтил)-циклопентанкарбоновой кислоты 45 с получением диамида 46. Азидную группу в промежуточном соединении 46 восстанавливали путем обработки триалкилфосфином в апротонном растворителе, таком как тетрагидрофуран, при комнатной температуре. Затем полученный метиловый эфир омыляли путем обработки гидроксидом натрия в смеси растворителей, таких как этанол и тетрагидрофуран, при повышенной температуре, например при 50°C, в течение 15 ч. В результате этого получали промежуточное соединение 31, которое может также существовать в виде цвиттер-иона.

Присоединение ПЭГ-фрагмента возможно также с помощью промежуточного соединения 39, которое синтезируют, как показано на схеме 8. В частности, 3,5-дихлорфенол 47 защищают с помощью три-изопропил-силилхлорида в присутствии основания, такого как имидазол, в полярном апротонном растворителе, таком как DMF, после чего проводят реакцию с сильным основанием, таким как бутиллитий, в безводном тетрагидрофуране при низкой температуре, например при -78°C. Получаемый комплекс лития гасят диоксидом углерода, который добавляют в форме сухого льда, с получением промежуточного соединения 48, производного бензойной кислоты. Промежуточное соединение 48 затем хлорируют с образованием ацилхлорида, путем обработки сульфонилхлоридом (SOCl2) в апротонном растворителе, таком как толуол. Полученный ацилхлорид далее вводят в реакцию с гидрохлоридом амина 49 в присутствии основания, такого как диизопропилэтиламин (DIPEA), в апротонном растворителе, таком как дихлорметан (DCM), получая при этом промежуточное соединение 50. Силильную защитную группу в промежуточном соединении 50 удаляют путем обработки фторидом тетрабутиламмония (TBAF) в протонном растворителе, таком как тетрагидрофуран, при комнатной температуре. Это фенольное промежуточное соединение вводят в реакцию в присутствии основания, такого как карбонат калия (K2CO3), в апротонном растворителе, таком как диметилформамид (DMF), с 3-N-трет-бутилкарбомат-1-бромпропаном. Таким образом получают промежуточное соединение 52, которое при снятии защиты с помощью трифторуксусной кислоты (TFA) и последующем гидролизе с помощью основания, такого как гидроксид натрия, в протонном растворителе, таком как этанол, образует промежуточное соединение 39:

Синтез дериватизирующих агентов антагонистов VLA-4

Синтез соединения формулы:

где:

можно эффективно осуществлять в соответствии со Схемой 9:

Кольцевые системы, представленные радикалом G, отличные от 2,6-дихлорбензоила, можно внедрять в промежуточное соединение 55, как показано на схеме 9. Затем промежуточное соединение 55 переводят в форму, удобную для последующего сочетания таким же образом, как показано на схеме 7, с получением целевой молекулы, подготовленной к конденсации по Схеме 4, по пути получения соединения формулы I. Подробное описание способов синтеза для получения промежуточного соединения 53 на выше представленной схеме 9 опубликованы в следующих источниках: Патенты США №№6388084 B1 и 6380387 B1. Вкратце, арил- или гетероарильные цинк-содержащие реагенты получают из известных промежуточных продуктов 53 или 54 в безводном растворителе, таком как диметилацетамид (DMA). При этом цинк-содержащие реагенты вводят в реакцию коммерчески доступным этиловым эфиром (S)-2-трет-бутоксикарбониламино-3-(4-иод)фенил]пропионовой кислоты 55 в присутствии палладиевого катализатора, такого как Pd(dba)2, в присутствии лигандов палладия тритолуилфосфина в апротонном растворителе, таком как тетрагидрофуран (THF) при 50°C. Таким образом, получают промежуточное соединение общей структуры 56. Промежуточное соединение 56 затем превращают в промежуточное соединение 57 в четыре стадии, как показано на Схеме 7.

Можно также получить димерные нацеленные мотивы антагониста VLA-4 в соответствии со способом синтеза, представленным на схеме 10. При этом промежуточное соединение 58, которое можно получить таким же способом, как описано выше на схеме 9, вводят в реакцию с реагентами, способствующими образованию амидной связи, такими как HBTU и основание DIPEA, в апротонном растворителе DMF, в присутствии 4-бром-2,6-дифторбензойной кислоты 52 согласно схеме 10. Получаемое промежуточное соединение 59 обрабатывают дицианоцинком в присутствии тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) фосфина в растворителе, таком как тетрагидрофуран, с образованием циано-замещенного продукта, промежуточного соединения 60. Путем гидрирования в н-пропаноле газообразным водородом, с палладием на угле в качестве катализатора, при комнатной температуре, получают промежуточный вторичный амин 63. На этой стадии ди-пропиловый эфир превращают в ди-метиловый эфир, а затем проводят реакцию с хлоридом кислоты N-Cbz-бета-аланина в присутствии основания, такого как ди-изопропилэтиламид, получая при этом промежуточное соединение 64. Это промежуточное соединение омыляют водным основанием, и N-Cbz-группу удаляют путем каталитического гидрогенолиза с получением димерного антагониста VLA-4 аминокислоты 65, как показано на схеме 10.

ПОЛЕЗНОСТЬ

Соединения формулы I полезны для доставки конъюгированных молекул, такие как терапевтические вещества, низкомолекулярные вещества, пептиды, нуклеиновые кислоты, флуоресцирующие молекулы и полимеры, к клеткам-мишеням, экспрессирующим комплексы рецептора интегрина VLA-4 в различных терапевтических целях и других типов применения. Таким образом, соединения формулы I можно применять для лечения различных заболеваний и состояний, связанных с экспрессией или сверхэкспрессией VLA-4. Такие заболевания и состояния могут включать воспалительные, раковые и метаболические заболевания.

В конкретных воплощениях настоящее изобретение включает способ лечения или профилактики рака у млекопитающих (предпочтительно у человека), нуждающихся в таком лечении, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I. Такие композиции можно вводить в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые следует учитывать в данном контексте, включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, которого нужно лечить, клиническое состояние индивидуального пациента, причину расстройства, сайт доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные лечащим врачам. "Эффективное количество" соединения, которое нужно ввести, определяют с учетом этих факторов как минимальное количество, необходимое для лечения или профилактики данного заболевания или состояния (например, для ингибирования экспрессии целевого белка), не допуская неприемлемой токсичности. Например, такое количество может быть ниже количества, которое токсично для нормальных клеток или для млекопитающего в целом. Такие композиции, содержащие соединение формулы I по настоящему изобретению, можно вводить парэнтерально, внутрибрюшинно и внутрилегочно. Парэнтеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение.

ПРИМЕРЫ

Понимание настоящего изобретения будет более полным со ссылкой на ниже следующие примеры. Однако их не следует воспринимать как ограничение объема настоящего изобретения.

Реагенты приобретали в компаниях Aldrich, Sigma и Pierce Bioscience или у других поставщиков, указанных ниже, и использовали без дополнительной очистки. Очистку в масштабе от нескольких миллиграмм до нескольких грамм проводили способами, известными специалистам в данной области техники, такими как элюирование с колонки для флэш-хроматографии с силикагелем. В некоторых случаях проводили также очистку с помощью препаративной флэш-хроматографии на колонке с использованием одноразовых предварительно упакованных мультиграммовых колонок с силикагелем (RediSep), элюировали с использованием системы CombiFlash. В целях данного изобретения для очистки промежуточных продуктов можно применять также устройства для колоночной флэш-хроматографии Biotage™ и ISCO™.

Для оценки чистоты и идентичности соединения снимали спектры LC/MS (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия), с применением следующей системы. Система для получения масс-спектров представляла собой спектрометр Micromass Platform II: электроспрэй-ионизация в положительном режиме (диапазон масс: 150-1200 а.е.м.). Одновременное хроматографическое разделение осуществляли с помощью следующей системы ВЭЖХ: колоночный картридж ES Industries Chromegabond WR C-18 3u 120Å (3,2×30 мм); подвижная фаза A: вода (0,02% TFA) и фаза В: ацетонитрил (0,02% TFA); градиент от 10% В до 90% В за 3 минуты; время уравновешивания 1 минута; скорость потока 2 мл/мин. В некоторых случаях использовали ацетат аммония в 20-миллимолярной концентрации в качестве модификатора эффективной ионизации в ходе препаративной ВЭЖХ. В таких случаях выделяли соль аммония.

В некоторых случаях разделения может быть также полезно применение суперкритической флюидной хроматографии. Разделение суперкритической флюидной хроматографией осуществляли с применением системы Mettler-Toledo Minigram в следующих стандартных условиях: 100 бар; 30°C; 2,0 мл/мин; элюировали с колонки AD 12 мм с 40% MeOH в суперкритическом флюиде CO2. Если аналиты содержали основные аминогруппы, добавляли 0,2% изопропиламин к метанольному модификатору.

Соединения характеризовали либо с помощью 1Н-ЯМР, с использованием ЯМР-спектрометра Varian Inova 400 МГц, либо или ЯМР-спектрометра Varian Mercury 300 МГц, а с помощью также масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием масс-спектрометра высокого разрешения Bruker Apex-ll 4.7Т FT. Конечные соединения были охарактризованы с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с помощью системы LTQ CL Orbitrap, поставляемой фирмой Thermo Electron.

Использована следующая аббревиатура:

AIBN 2,2'-азобисизобутиронитрил
Bu бутил
DCE 1,2-дихлорэтан
DCM дихлорметан
DBU 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен
DIAD диизопропил азодикарбоксилат
DIEA диэтиламин
DIPEA диизопропилэтиламин
DMF N,N-диметилформамид
DMSO диметилсульфоксид
EDC-HCl 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид
EtOAc этилацетат
EtOH этиловый спирт
FCC колоночная флэш-хроматография
h час
HBTU O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфат
HOBt гидроксибензотриазол
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
HRMS масс-спектры высокого разрешения
LRMS масс-спектры низкого разрешения
LC жидкостная хроматография
L-Pro L-пролин
МСРВА мета-хлорпероксибензойная кислота
МеОН метиловый спирт
MW микроволны
NIS N-иодсукцинимид
NBS N-бромсукцинимид
NMP 1-метил-2-пирролидинон
PdCl2(dppf) [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(II)
ПЭГn полиэтиленгликоль с n повторами (например, ПЭГ2 =-OCH2CH2CH2OCH2CH2-)
PG защитная группа
PyBroP бром-трис-пирролидино-фософоний гексафторфосфат
KT комнатная температура
TBAF фторид тетрабутиламмония
TBDMS трет-бутил-диметилсилил
TBTU 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторборат
TMS триметилсилил
TEA триэтиламин
TFA трифторуксусная кислота
THF тетрагидрофуран
ТСХ тонкослойная хроматография
ТРР трифенилфосфин

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЙ, НАЦЕЛИВАЮЩИХ К VLA-4

Пример 1

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]этил]циклопентанкарбонил]амино]пропионовая кислота;

VLA-4 Лиганд - Реагент 1:

Стадия 1: получение метилового эфира 1-(2-бромэтил)циклопентанкарбоновой кислоты:

К раствору диизопропиламина (56 мл; 396 ммоль) в THF (85 мл) добавляли по каплям раствор н-бутиллития (240 мл; 393 ммоль; 1,6М) в гексане при -10°C, при этом температуру поддерживали ниже 0°C. По окончании внесения раствор перемешивали в течение 30 мин при 0°C. К этой смеси добавляли по каплям раствор метилового эфира циклопентанкарбоновой кислоты (37,4 г; 263 ммоль) в THF (50 мл) при -70°C, выдерживая внутреннюю температуру в интервале от -60 до -70°C. По окончании внесения реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч в интервале от -50 до -60°C. Затем добавляли по каплями раствор 1,2-дибромэтана (47 мл; 545 ммоль) в THF (50 мл), и полученную светло-коричневую суспензию перемешивали в течение 1 ч при температуре от -70 до -60°C. Затем ее нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь вливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония (200 мл) и органическое вещество экстрагировали эфиром (2×100 мл). Объединенные экстракты промывали насыщенным раствором хлорида натрия (150 мл) и высушивали над безводным сульфатом магния. Отфильтровывали осушитель, после чего полученный раствор концентрировали в вакууме и полученный остаток перегоняли при 95-105°C/2,5 мм Hg с получением 49,6 г (выход 80%) метилового эфира 1-[2-бромэтил]циклопентанкарбоновой кислоты в виде бесцветного масла.

Стадия 2: получение метилового эфира 1-[2-азидоэтил]циклопентанкарбоновой кислоты:

Раствор метилового эфира 1-[2-бромэтил]циклопентанкарбоновой кислоты (49,6 г; 211 ммоль) и азида натрия (54 г; 831 ммоль) в DMF (200 мл) перемешивали при 50°C в течение 5 ч в атмосфере азота. Затем твердые вещества отфильтровывали, а фильтрат концентрировали практически досуха. Остаток разводили в этилацетате (500 мл) и не растворившиеся твердые вещества собирали фильтрацией, и фильтрат концентрировали с получением неочищенного этил-1-(2-азидоэтил)циклопентанкарбоксилата, который очищали хроматографией на 250 г силикагеля, элюировали 5% этилацетатом в гексане, с получением 36,2 г (выход 87%) метилового эфира 1-[2-азидоэтил]циклопентанкарбоновой кислоты в виде светло-коричневого масла. EI(+)-HRMS m/e расч. для C9H15N3O2 (М-Н)+ 196,1086, наблюд. 196,1342.

Стадия 3: получение 1-[2-азидоэтилциклопентанкарбоновой кислоты:

Метиловый эфир 1-[2-азидоэтил]циклопентанкарбоновой кислоты (36,2 г; 184 ммоль) растворяли в THF (500 мл) и метаноле (250 мл) и добавляли раствор LiOH моногидрата (15,44 г; 368 ммоль) в воде (300 мл). Полученный раствор перемешивали при 40°C в течение ночи и концентрировали. Остаток растворяли в 1 л воды, содержащей 40 мл 1 н NaOH, и промывали гексаном (500 мл). Водный слой подкисляли 1 н хлороводородной кислотой и полученное органическое вещество экстрагировали эфиром (2×500 мл). Объединенные экстракты промывали насыщенным раствором хлорида натрия и органический слой высушивали над безводным Na2SO4. Отфильтровывали осушитель и концентрировали с получением 32,5 г (выход 96%) 1-[2-азидоэтил-циклопентанкарбоновой кислоты в виде жидкости янтарного цвета. ES(+)-HRMS m/e расч. для C8H13N3O2 (M+Na)+ 206,0900; наблюд. 206,0900.

Стадия 4: получение метилового эфира (S)-3-[4-нитрофенил]-2-трет-бутоксикарбониламинопропионовой кислоты:

К суспензии (S)-3-[4-нитрофенил]-2-трет-бутоксикарбониламино-пропионовой кислоты (70,2 г; 226,2 ммоль) и карбоната натрия (95 г; 1,13 моль) в DMF (500 мл) добавляли при комнатной температуре метилиодид (70,4 мл; 1,13 моль). Эту суспензию перемешивали в течение 15 ч при комнатной температуре, при этом анализ смеси с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества, и избыток метилиодида и некоторого количества DMF удаляли в высоком вакууме. Затем смесь вливали в воду (2 л) и перемешивали при комнатной температуре, при этом медленно образовывался осадок в течение 72 ч. Выпавшее в осадок твердое вещество собирали фильтрацией и промывали водой (2 л). После высушивания на воздухе и в вакууме выделяли 72 г (выход 98%) метилового эфира (S)-3-[4-нитрофенил]-2-трет-бутоксикарбониламинопропионовой кислоты в виде светло-желтого твердого вещества (mp 95-96°C). ES(+)-HRMS m/e расч. для C15H20N2O6 (M+H)+ 325,1400; наблюд. 325,1404.

Стадия 5: получение метилового эфира (S)-3-[4-аминофенил]-2-трет-бутоксикарбониламинопропионовой кислоты:

К смеси метилового эфира метил-(S)-3-[4-нитрофенил]-2-трет-бутоксикарбониламинопропионовой кислоты (72 г; 222 ммоль), цинковой пыли (~325 меш, 145,2 г; 2,2 моль, 10 эквив.) и хлорида аммония (178,1 г; 3,3 моль, 15 эквив.) добавляли при комнатной температуре метанол (1 л) и воду (500 мл). В результате добавления воды протекала экзотермическая реакция, и внутренняя температура поднималась до 45-50°C. Эту суспензию перемешивали в течение от 30 мин до 1 ч при комнатной температуре, при этом анализ смеси с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества, реакционную смесь фильтровали через слой Celite и осадок на фильтре промывали метанолом (1 л) и водой (500 мл). Концентрировали с целью удаления большей части метанола и некоторого количества воды, в результате чего получали белое твердое вещество, которое собирали фильтрацией и промывали водой. После высушивания на воздухе выделяли 65,5 г (выход 100%) метилового эфира (S)-3-[4-аминофенил]-2-трет-бутоксикарбониламинопропионовой кислоты в виде белого твердого вещества (m.p. 86-89°C). ES(+)-HRMS m/e расч. для C15H22N2O4 (M+H)+ 294,1621; наблюд. 294,1614.

Стадия 6: получение метилового эфира (S)-2-трет-бутоксикарбониламино-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты:

К раствору метилового эфира (S)-3-[4-аминофенил]-2-трет-бутоксикарбониламинопропионовой кислоты (37,57 г; 127,6 ммоль) и 2,6-дихлорбензоилхлорида (29,45 г; 140,6 ммоль) в дихлорметане (350 мл) добавляли DIPEA (24,8 г; 192 ммоль) при комнатной температуре. Полученный коричневый раствор перемешивали в течение 15 ч при комнатной температуре с получением белой суспензии, при этом анализ смеси с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества. Затем твердые вещества собирали фильтрацией, и твердое вещество промывали дихлорметаном (150 мл) и высушивали на воздухе с получением 52,75 г (выход 88,4%) метилового эфира (S)-2-трет-бутоксикарбониламино-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества: m.p.192-194°C. ES(+)-HRMS m/e расч. для C22H24Cl2N2O5 (M+H)+ 466,1062; наблюд. 466,1069.

Стадия 7: получение метилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты, гидрохлоридной соли:

Твердый метиловый эфир (S)-2-трет-бутоксикарбониламино-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (43,45 г; 92.97 ммоль) в диоксане (90 мл) обрабатывали при комнатной температуре с помощью 166 мл 4,0 н хлороводородной кислоты в диоксане. Через 5 минут твердое вещество переходило в раствор и смесь перемешивали в течение 2 ч. Затем некоторое количество диоксана удаляли в вакууме с получением желтого сиропа и вносили 250 мл этилового эфира. Образовывалась смола, которую растворяли в THF (100 мл) и метаноле (100 мл). Растворитель удаляли в вакууме с получением 43,7 г (выход 100%) метилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)-фенил]пропионовой кислоты, гидрохлоридной соли, в виде белого твердого вещества: гл.р. 180-195°C. Это вещество хранили в холодильнике в атмосфере аргона. ES(+)-HRMS m/e расч. для C17H16Cl2N2O3 (M+H)+ 367,0616; наблюд. 367,0611.

Стадия 8: получение метилового эфира (S)-2-[[1-(2-азидоэтил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты:

К раствору метилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)-фенил]пропионовой кислоты, гидрохлоридной соли, (10 г; 24,79 ммоль) и метилового эфира 1-[2-азидоэтил]циклопентанкарбоновой кислоты (5,0 г; 27,29 ммоль) в DMF (100 мл) добавляли при комнатной температуре HBTU (10,37 г; 27,33 ммоль) и DIPEA (8,82 г; 68,3 ммоль). Полученный прозрачный раствор перемешивали в течение 48 ч при комнатной температуре и к реакционной смеси добавляли воду (~200 мл) для осаждения продукта. Полученное твердое вещество собирали фильтрацией и промывали водой (100 мл) и гексаном (~100 мл). После высушивания на воздухе получали 11,2 г продукта в виде светло-кирпичного твердого вещества, которое обрабатывали ацетонитрилом (100 мл) в горячих условиях. Все примеси переходили в ацетонитрил, и твердое вещество собирали фильтрацией с получением 8,24 г продукта конденсации. Ацетонитрильный раствор выпаривали в вакууме, остаток растворяли в этилацетате и осаждали продукт добавлением гексана. Твердое вещество снова собирали фильтрацией и высушивали на воздухе с получением еще 2,03 г (общий выход 78%) метилового эфира (S)-2-[[1-(2-азидоэтил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоил-амино)фенил]пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C25H27Cl2N5O4 (M+Na)+ 554,1332; наблюд. 554,1334.

Стадия 9: получение (S)-2-[[1-(2-азидоэтил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты:

К суспензии метилового эфира (S)-2-[[1-(2-азидоэтил)циклопентан-карбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (14,77 г; 27,7 ммоль) в THF (200 мл) и этаноле (200 мл) добавляли водный 1,0 н гидроксид натрия (150 мл) при комнатной температуре. Эту смесь перемешивали в течение 15 ч при комнатной температуре, при этом анализ смеси с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества. Затем смесь разбавляли водой (20 мл), удаляли THF и этанол на роторном испарителе, разбавляли с помощью 100 мл воды и экстрагировали эфиром (200 мл) для удаления всех нейтральных примесей. Водный слой нейтрализовали с помощью 1 н HCl, полученное белое твердое вещество собирали фильтрацией и промывали водой и гексаном. После высушивания на воздухе получали 13,37 г (выход 93%) (S)-2-[[1-(2-азидоэтил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C24H25Cl2N5O4 (M+Na)+ 540,1176; наблюд. 540,1177.

Стадия 10: получение (S)-2-[[1-(2-аминоэтил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд-1

К раствору (S)-2-[[1-(2-азидоэтил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (6,28 г; 12,11 ммоль) в THF (91 мл) добавляли раствор триметилфосфина в THF (48,5 мл; 48,46 ммоль; 1,0 М) при 0°C. Сначала смесь представляла собой прозрачный раствор, а через 30 мин образовалось небольшое количество осадка, полученную смесь перемешивали в течение в течение ночи, при этом анализ смеси с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества. Затем вносили 10 эквивалентов воды (120 ммоль; 2,16 мл) и эту смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Растворитель удаляли в вакууме и дважды проводили азеотропную перегонку остатка с толуолом с получением пастообразного вещества, которое очищали с помощью ВЭЖХ с получением 4,57 г (выход 77%) (S)-2-[[1-(2-аминоэтил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-пропионовой кислоты в виде аморфного белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C24H27Cl2N3O4 (M+H)+ 492,1452; наблюд. 492,1451.

Стадия 11: получение (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]-этокси]пропиониламино]этил]циклопентанкарбонил]амино]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 1):

К раствору (S)-2-[[1-(2-аминоэтил)циклопентанкарбонил]амино]3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (191,5 мг; 0,39 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (200 мг; 0,39 ммоль) в DMSO (2 мл) добавляли при комнатной температуре, в атмосфере азота избыток DIPEA (151 мг; 203 мкл; 1,17 ммоль). Полученный светло-желтый раствор перемешивали в течение 1 ч, при этом анализ с помощью LCMS показал отсутствие исходного вещества. Затем избыток DIPEA удаляли в вакууме и желаемый продукт выделяли в ходе очистки с помощью ВЭЖХ с получением 90 мг (выход 26%) (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]этил]циклопентанкарбонил]амино]пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C42H53Cl2N5O12 (M+H)+ 890,3141; наблюд. 890,3140.

Пример 2

Получение (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]этил]циклопентил]карбонил]-амино]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 2:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[[1-(2-аминоэтил)-циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (607 мг; 1,0 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (689 мг; 1,0 ммоль) и DIPEA (388 мг; 522 мкл; 3,0 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением светло-желтого твердого вещества (788 мг; 74%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C50H69Cl2N5O16 (M+H)+ 1066,4189; наблюд. 1066,4182.

Пример 3

Получение (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]этил]циклопентанкарбонил]амино]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 3:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[[1-(2-аминоэтил)-циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (100 мг; 0,2 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропионовой кислоты (176 мг; 0,2 ммоль) и DIPEA (258 мг; 191 мкл; 2,0 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением белого твердого вещества (28 мг; 11%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C58H85Cl2N5O20 (M+H)+ 1242,5238; наблюд. 1242,5248.

Пример 4

Получение (S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанилэтокси)этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]этил]циклопентанкарбонил]-амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты;

VLA-4 Лиганд - Реагент 4:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[[1-(2-аминоэтил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (194 мг; 0,32 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанилэтокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропионовой кислоты (190 мг; 0,32 ммоль) и DIPEA (124 мг; 167 мкл; 0.96 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением желтого вязкого масла (220 мг; 70%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C45H65Cl2N3O14S (M+H)+ 974,3637; наблюд. 974,3631.

Пример 5

(S)-3-[4-(2,6-Дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропокси]бензоиламино]пропионовая кислота; VLA-4 Лиганд - Реагент 5:

Стадия 1: получение (3,5-дихлорфенокси)-триизопропилсилана

К смеси 3,5-дихлорфенола (16,3 г; 100 ммоль), имидазола (14,98 г; 220 ммоль) и триизопропилхлорсилана (21,21 г; 110 ммоль) добавляли при комнатной температуре DMF (200 мл). Полученный коричневый раствор перемешивали в течение 15 ч и затем его разбавляли водой (500 мл). Органическое соединение экстрагировали этилацетатом (2×100 мл) и объединенные органические слои промывали солевым раствором и высушивали над безводным MgSO4. Фильтровали и концентрировали с получением неочищенного остатка, который очищали хроматографией на колонке ISCO (400 г) с получением 31,1 г (97%) (3,5-дихлорфенокси)триизопропилсилана в виде бесцветного масла. EI(+)-HRMS m/e расч. для C15H24Cl2OSi (М)+ 318,0973; наблюд. 318,0971.

Стадия 2: получение 2,6-дихлор-4-триизопропилсиланилоксибензойной кислоты:

К раствору THF (110 мл) добавляли при -78°C раствор н-бутиллития (28 мл; 70 ммоль; 2,5М) в гексане и тетраметилэтилендиамин (8,42 г; 10,94 мл; 72,45 ммоль). Полученный светло-желтый раствор перемешивали в течение 30 мин при этой температуре и затем в течение 30 минут добавляли по каплям раствор (3,5-дихлорфенокси)-триизопропилсилана (15,97 г; 50 ммоль) в THF (20 мл). Полученный светло-желтый раствор перемешивали в течение 3 ч и затем через реакционную смесь пропускали газообразный диоксид углерода. В ходе барботирования CO2 цвет реакционной смеси менялся от коричневого до светло-желтого раствора в течение 10 минут, и барботирование продолжали в течение 1 ч при -75, затем смесь нагревали до комнатной температуры в течение 30 при непрерывном пропускании CO2. Затем смесь вливали в 1 н раствор HCl и полученное органическое вещество экстрагировали дихлорметаном (2×150 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором и высушивали над безводным MgSO4. Фильтровали и концентрировали с получением неочищенного остатка, который очищали хроматографией на колонке ISCO (400 г) с получением 7,02 г (39%) 2,6-дихлор-4-триизопропилсиланилоксибензойной кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C16H24Cl2O3Si (M+H)+ 363,0945; наблюд. 363,0944.

Стадия 3: получение метилового эфира (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-(2,6-дихлор-4-триизопропилсиланилоксибензоиламино)пропионовой кислоты:

К раствору 2,6-дихлор-4-триизопропилсиланилоксибензойной кислоты (3,63 г; 10 ммоль) в толуоле (50 мл) добавляли при комнатной температуре избыток тионилхлорида (11,89 г; 7,2 мл; 100 ммоль). Полученный бесцветный раствор кипятили с обратным холодильником в течение 5 ч и затем его охлаждали до комнатной температуры, и растворитель и избыток тионилхлорида удаляли в вакууме. Полученный остаток однократно очищали азеотропной перегонкой с толуолом. Затем полученный выше хлорид 2,6-дихлор-4-триизопропилсиланил-оксибензойной кислоты растворяли в дихлорметане (50 мл) и добавляли к нему при комнатной температуре твердую гидрохлоридную соль метилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)-фенил]пропионовой кислоты, (4,1 г; 10 ммоль) и DIPEA (3,87 г; 5,26 мл; 30 ммоль). Полученный раствор перемешивали в течение 15 ч при комнатной температуре и к реакционной смеси добавляли воду (~200 мл). Затем полученное органическое вещество экстрагировали дихлорметаном (2×150 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором и высушивали над безводным MgSO4. Фильтровали и концентрировали с получением неочищенного остатка, который очищали хроматографией на колонке ISCO (120 г) с получением 6,48 г (95%) метилового эфира (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-(2,6-дихлор-4-триизопропил-силанилоксибензоиламино)пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C33H38Cl4N2O5Si (M+H)+ 711,1377; наблюд. 711,1377.

Стадия 4: получение метилового эфира (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-(2,6-дихлор-4-гидроксибензоиламино)пропионовой кислоты:

К раствору метилового эфира (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-(2,6-дихлор-4-триизопропилсиланилоксибензоиламино)пропионовой кислоты (6,76 г; 9,48 ммоль) в THF (150 мл) добавляли при 0°C раствор TBAF (14,22 мл; 14,22 ммоль; 1М) в THF. Полученный раствор медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 15 ч. Затем реакционную смесь разбавляли водой и полученное органическое вещество экстрагировали этилацетатом (2×150 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором и высушивали над безводным MgSO4. Фильтровали и концентрировали с получением неочищенного остатка, который растворяли в этилацетате в горячих условиях и затем разбавляли гексаном. Полученное твердое вещество собирали фильтрацией и промывали гексаном. После высушивания на воздухе получали 5,23 г (99%) метилового эфира (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-(2,6-дихлор-4-гидроксибензоиламино)пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C24H18Cl4N2O5 (М-Н)- 552,9897; наблюд. 552,9897.

Стадия 5: получение метилового эфира (S)-2-[4-(3-трет-бутоксикарбониламино-пропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-пропионовой кислоты:

К смеси метилового эфира (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-(2,6-дихлор-4-гидроксибензоиламино)пропионовой кислоты (5,05 г; 9,07 ммоль), 3-трет-бутоксикарбониламинопропилбромида (2,59 г; 10,89 ммоль) и карбоната калия (3,77 г; 27,29 ммоль) добавляли при комнатной температуре DMF (66 мл) и ацетон (132 мл). Затем полученную суспензию кипятили с обратным холодильником в течение 15 ч, при этом анализ с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли водой и полученное органическое вещество экстрагировали этилацетатом (2×150 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором и высушивали над безводным MgSO4. Фильтровали и концентрировали с получением неочищенного остатка, который очищали хроматографией на колонке ISCO (150 г) с получением 5,75 г (89%) метилового эфира (S)-2-[4-(3-тpeт-бутоксикарбониламинопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлор-бензоиламино)фенил]пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C32H33Cl4N3O7 (M+Na)+ 734,0965; наблюд. 734,0961.

Стадия 6: получение метилового эфира (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты:

К раствору метилового эфира (S)-2-[4-(3-трет-бутоксикарбониламинопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-пропионовой кислоты (7,5 г; 7,98 ммоль) в дихлорметане (100 мл) добавляли при комнатной температуре избыток TFA (9,12 г; 5,9 мл; 80 ммоль). Полученный раствор перемешивали в течение 15 ч. Затем этот растворитель удаляли в вакууме и остаток однократно очищали азеотропной перегонкой с толуолом. После высушивания в высоком вакууме получали 5,8 г (99%) метилового эфира (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)-фенил]пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C27H25Cl4N3O5 (M+H)+ 612,0621; наблюд. 612,0619.

Стадия 7: получение (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд 2:

К раствору метилового эфира (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (5,8 г; 7,98 ммоль,) в THF (200 мл) добавляли при комнатной температуре раствор гидроксида лития (2,4 г; 100 ммоль) в воде (30 мл). Эту смесь перемешивали в течение 15 ч при комнатной температуре, при этом анализ смеси с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества. Затем растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток очищали с помощью ВЭЖХ с получением 3,7 г (выход 65%) (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоил-амино)фенил]пропионовой кислоты в виде белого твердого вещества. ES(+)-HRMS m/e расч. для C26H23Cl4N3O5 (M+H)+ 598,0465; наблюд. 598,0465.

Стадия 8: получение (S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]этокси] пропиониламино]пропокси]бензоиламино]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 5:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (214 мг; 0,3 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]этокси]-пропионовой кислоты (154 мг; 0,3 ммоль) и DIPEA (388 мг; 522 мкл; 3,0 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ получали белое твердое вещество (52 мг; 17%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C44H49Cl4N5O13 (M+Na)+ 1018,1973; наблюд. 1018,1965.

Пример 6

(S)-3-[4-(2,6-Дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]-бензоиламино]пропионовая кислота; VLA-4 Лиганд - Реагент 6:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (107 мг; 0,15 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (100 мг; 0,145 ммоль) и DIPEA (194 мг; 261 мкл; 1,5 ммоль), после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением белого твердого вещества (50 мг; 28%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C52H65Cl4N5O17 (M+Na)+ 1194,3022; наблюд. 1194,3028.

Пример 7

(S)-3-[4-(2,6-Дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]-пропокси]бензоиламино]пропионовая кислота; VLA-4 Лиганд - Реагент 7:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовой кислоты (143 мг; 0,2 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (173 мг; 0,2 ммоль) и DIPEA (258 мг; 348 мкл; 2,0 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением белого твердого вещества (45 мг; 16,6%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C60H81Cl4N5O21 (M+Na)+ 1370,4070; наблюд. 1370,4066.

Пример 8

(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]бутил]циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота; VLA-4 Лиганд - Реагент 8:

Стадия 1: получение метилового эфира 1-(4-бромбутил)циклопентанкарбоновой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 1, исходя из диизопропиламина (21 мл; 150 ммоль), н-бутиллития (58 мл; 145 ммоль), метилового эфира циклопентанкарбоновой кислоты (13,1 г; 100 ммоль) и 1,4-дибромбутана (21,59 г; 100 ммоль) и после перегонки, с получением бесцветного масла (12,8 г; 48%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C11H19BrO2 (M+H)+ 262,0568; наблюд. 262,0565.

Стадия 2: получение метилового эфира 1-[4-азидобутил]циклопентанкарбоновой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 2, исходя из метилового эфира 1-[4-бромбутил]-циклопентанкарбоновой кислоты и азида натрия.

Стадия 3: получение 1-[4-азидобутил]циклопентанкарбоновой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 3, исходя из метилового эфира 1-[4-азидобутил]-циклопентанкарбоновой кислоты и гидроксида лития.

Стадия 4: получение метилового эфира (S)-2-трет-бутоксикарбониламино-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты:

К суспензии цинковой пыли (52,29 г; 800 ммоль) в THF (26,0 мл) добавляли при комнатной температуре 1,2-дибромэтан (4,58 мл; 53,2 ммоль). Эту суспензию нагревали до 60-65°C с помощью тепловой пушки до прекращения выделения газообразного этилена (по наблюдению). Эту суспензию охлаждали до комнатной температуры, добавляли триметилхлорсилан (3,38 мл; 26,6 ммоль) и эту смесь перемешивали в течение 15 мин. Суспензию 5-иод-1,3,6-триметилурацила (74,6 г; 266 ммоль) в DMA (225 мл) нагревали с получением прозрачного раствора и добавляли его одной порцией к реакционной смеси. По окончании внесения эту смесь нагревали до 70°C. Внутренняя температура реакционной смеси поднималась до 80-85°C из-за экзотермической реакции. Реакционную смесь перемешивали при 70°C в течение 3-4 ч, при этом ТСХ-анализ аликвоты реакционной смеси, погашенной насыщенным хлоридом аммония, показал отсутствие исходного вещества. Реакционную смесь разбавляли с помощью THF (140 мл), охлаждали до комнатной температуры и избыток цинковой пыли осаждали в течение 2-3 ч.

Этот раствор, содержащий соединение цинка (266 ммоль), добавляли при комнатной температуре к раствору Pd(dba)2 (4,6 г; 8 ммоль), три-о-толилфосфина [P(Tol)3] (9,0 г; 29,6 ммоль) и метилового эфира (S)-2-трет-бутоксикарбониламино-3-(4-иод)фенил]пропионовой кислоты (75,56 г; 186 ммоль) в THF (280 мл), и полученную светло-желтую смесь перемешивали в течение 48 ч при 50-55°C.

Реакционную смесь вливали в насыщенный раствор хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом (3×750 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (1,5 л) и высушивали над безводным сульфатом магния. Осушитель отфильтровывали и фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали хроматографией на колонке с силикагелем, с использованием колонки Biotage (75 m), с получением 57,88 г (выход 72%) метилового эфира (S)-2-трет-бутоксикарбониламино-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты в виде аморфного белого твердого вещества. EI-HRMS m/e расч. для C22H29N3O6+) 431,2056, фактич. 431,2054.

Стадия 5: получение метилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, гидрохлоридной соли:

Часть твердого метилового эфира (S)-2-трет-бутоксикарбониламино-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (7,4 г; 17,15 ммоль), полученного выше, обрабатывали при комнатной температуре 4 н хлороводородной кислотой в диоксане (17 мл; 68 ммоль) и этот раствор перемешивали в течение 1 ч, при этом образовывался белой осадок. Смесь разбавляли диэтиловым эфиром, супернатант декантировали и остаток высушивали сначала на роторном испарителе, а затем в высоком вакууме, с получением 6,28 г (выход 99%) метилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, гидрохлоридной соли, в виде аморфного желтого твердого вещества. FAB-HRMS m/e расч. для C17H21N3O4 (М+Н) 332,1610, фактич. 332,1617.

Стадия 6: получение пропилового эфира (S)-2-[[1-(4-азидобутил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 8, исходя из пропилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (10,78 г; 30 ммоль), 1-[4-азидобутил]циклопентанкарбоновой кислоты (8,24 г; 39 ммоль), HBTU (14,79 г; 39 ммоль) и DIPEA(11,63 г; 15,68 мл; 90 ммоль) и после очистки хроматографией на колонке ISCO, с получением аморфного грязно-белого твердого вещества (14,1 г; 85%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C29H40N6O5 (M+H)+ 553,3133; наблюд. 553,3133.

Стадия 7: получение (S)-2-[[1-(4-азидобутил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 9, исходя из пропилового эфира (S)-2-[[1-(4-азидобутил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (4,1 г; 7,42 ммоль) и NaOH (35 мл; 35 ммоль; 1 М), с получением белого твердого вещества (3,75 г; 99%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C26H34N6O5 (M+H)+ 511,2664; наблюд. 511,2664.

Стадия 8: получение (S)-2-[[1-(4-аминобутил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд 3:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 10, исходя из (S)-2-[[1-(4-азидобутил)-циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (1,02 г; 2 ммоль) и триметилфосфина (8 мл; 8 ммоль; 1М), с получением белого твердого вещества (0,96 г; 99%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C26H36N4O5 (M+H)+ 485,2759; наблюд. 485,2757.

Стадия 9: Получение (S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]бутил]циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 8:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[[1-(4-аминобутил)циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (300 мг; 0,62 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (318 мг; 0,62 ммоль) и DIPEA (160 мг; 215 мкл; 1,24 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением светло-желтого твердого вещества (274 мг; 50%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C44H62N6O13 (M+H)+ 883,4448; наблюд. 883,4449.

Пример 9

(S)-2-[2,6-Дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]-бензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота; VLA-4 Лиганд - Реагент 9:

Стадия 1: получение пропилового эфира (S)-2-(2,6-дихлор-4-триизопропил-силанилоксибензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 8, исходя из пропилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (3,95 г; 11 ммоль), 2,6-дихлор-4-триизопропилсиланилоксибензойной кислоты (3,63 г; 10 ммоль), HBTU (5,42 г; 14,3 ммоль) и DIPEA (4,26 г; 5,75 мл; 33,0 ммоль) и после очистки хроматографией на колонке ISCO, с получением аморфного белого твердого вещества (1,7 г; 24%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C35H47Cl2N3O6Si (M+H)+ 704,2684; наблюд. 704,2683.

Стадия 2: получение пропилового эфира (S)-2-(2,6-дихлор-4-гидроксибензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)-фенил]пропионовой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 5, Стадия 4, исходя из пропилового эфира (S)-2-(2,6-дихлор-4-триизопропилсиланилоксибензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (1,66 г; 2,35 ммоль) и TBAF (3,5 мл; 3,5 ммоль; 1 М) и после очистки хроматографией на колонке ISCO, с получением белого твердого вещества (884 мг; 69%). ES(+)-LRMS m/e расч. для C26H27Cl2N3O6 (M+H)+ 548; наблюд. 548.

Стадия 3: получение пропилового эфира (S)-2-[4-(3-трет-бутоксикарбониламинопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 5, Стадия 5, исходя из пропилового эфира (S)-2-(2,6-дихлор-4-гидроксибензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (558 мг; 1,07 ммоль), 3-трет-бутоксикарбониламинопропилбромида (306 мг; 1,28 ммоль) и карбоната калия (445 мг; 3,22 ммоль) и после очистки хроматографией на колонке ISCO, с получением белого твердого вещества (654 мг; 87%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C34H42Cl2N4O8 (M+H)+ 705,2453; наблюд. 705,2451.

Стадия 4: получение пропилового эфира (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, трифторацетатной соли:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 5, Стадия 6, исходя из пропилового эфира (S)-2-[4-(3-трет-бутоксикарбониламинопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (781 мг; 1,1 ммоль) и TFA (1,14 г; 742 мкл; 10 ммоль), с получением гигроскопичного белого твердого вещества (790 мг; 99%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C29H34Cl2N4O6 (M+H)+ 605,1928; наблюд. 605,1929.

Стадия 5: получение (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, трифторацетатной соли:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 5, Стадия 7, исходя из пропилового эфира (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (852 мг; 1,1 ммоль) и LiOH (53 мг; 2,2 ммоль), с получением аморфного белого твердого вещества (740 мг; 99%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C26H28Cl2N4O6 (M+H)+ 563,1459; наблюд. 563,1455.

Стадия 6: получение (S)-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]-бензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 9:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, трифторацетатной соли, (203 мг; 0,3 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (154 мг; 0,3 ммоль) и DIPEA(194 мг; 261 мкл; 1,5 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением аморфного белого твердого вещества (175 мг; 61%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C44H54Cl2N6O14 (M+H)+ 961,3148; наблюд. 961,3156.

Пример 10

Получение (S)-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропокси]бензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 10:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-[4-(3-аминопропокси)-2,6-дихлорбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-пиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, трифторацетатной соли, (98 мг; 0,145 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (100 мг; 0,145 ммоль) и DIPEA (187 мг; 252 мкл; 1,45 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением гигроскопического белого твердого вещества (88 мг; 53%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C52H70Cl2N6O18 (M+H)+ 1137,4197; наблюд. 1137,4196.

Пример 11

(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино)метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота, трифторацетатная соль; VLA-4 Лиганд - Реагент 11:

Стадия 1: получение пропилового эфира (S)-2-(4-бром-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,316-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 8, исходя из пропилового эфира (S)-2-амино-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (4,67 г; 13 ммоль), 4-бром-2,6-дифторбензойной кислоты (3,12 г; 13,16 ммоль), HBTU (4,99 г; 13,16 ммоль) и DIPEA (6,8 мл; 39 ммоль) и после очистки хроматографией на колонке ISCO, с получением аморфного грязно-белого твердого вещества (6,71 г; 89%). ES-HRMS m/e расч. для C26H26BrF2N3O5 (M+H)+ 578,1097, фактич. 578,1096.

Стадия 2: получение пропилового эфира (S)-2-(4-циано-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовой кислоты:

К суспензии пропилового эфира (S)-2-(4-бром-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовой кислоты (5,78 г; 10 ммоль) добавляли при комнатной температуре цианид цинка (940 мг; 8 ммоль) и тетракис(трифенилфосфин)палладий (1,16 г; 1 ммоль) в DMF (40 мл; перегнанный и дегазированный). Полученный раствор нагревали до 85°C и перемешивали в течение 24 ч, при этом анализ смеси с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и вливали ее в воду (100 мл) с получением мутной суспензии.

Далее полученное органическое вещество экстрагировали этилацетатом (2×100 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (100 мл) и высушивали над безводным сульфатом магния. Осушитель отфильтровывали и концентрировали растворитель с получением неочищенного продукта, который очищали хроматографией на колонке ISCO (150 г) с получением 5,2 г (выход 99%) пропилового эфира (S)-2-(4-циано-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты в виде аморфного белого твердого вещества. ES-HRMS m/e расч. для C27H26F2N4O5 (M+H)+ 525,1944, фактич. 525,1942.

Стадия 3: получение пропилового эфира (S)-2-(4-аминометил-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты:

К раствору борогидрида натрия (0,29 г; 7,62 ммоль; 2 экв.) в THF (5 мл) добавляли TFA (566 мкл; 7,62 ммоль; 2 экв.), реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли по каплям раствор пропилового эфира (S)-2-(4-циано-2,6-дифтор-бензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)-фенил]-пропионовой кислоты (2,0 г; 3,81 ммоль) в THF (6 мл) (колбу предварительно промывали с помощью THF (2×1 мл)). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 1,3 ч. Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане и гасили водой (20 мл) и раствором хлорида натрия (20 мл воды, 100 мл насыщенного раствора). Водную смесь экстрагировали с помощью DCM (2×200 мл) и затем органические слои промывали солевым раствором, объединяли и высушивали над сульфатом магния и затем концентрировали с получением грязно-белого твердого вещества, 1,77 г. Неочищенный продукт суспендировали в изопропилацетате (75 мл) и добавляли по каплям изопропиловый спирт (0,75 мл) и TMSCI (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и полученный белый осадок фильтровали и промывали изопропилацетатом и гексаном с получением 1,5 г (выход 63%) пропилового эфира (S)-2-(4-аминометил-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты в виде аморфного белого твердого вещества. ES-HRMS m/e расч. для C27H30F2N4O5 (M+H)+ 529,2257, фактич. 529,2258.

Стадия 4: получение (S)-2-(4-аминометил-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, трифторацетатной соли; VLA-4 Лиганд 4:

К суспензии пропилового эфира (S)-2-(4-аминометил-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовой кислоты (508 мг; 0,96 ммоль) в THF (10 мл) добавляли раствор гидроксида лития (240 мг; 10 ммоль) в воде (2 мл) при комнатной температуре. Эту смесь перемешивали в течение 15 ч, при этом анализ с помощью ТСХ показал отсутствие исходного вещества. Затем THF удаляли при пониженном давлении, остаток разбавляли водой (100 мл) и эту смесь подкисляли с помощью TFA. Неочищенный продукт очищали путем ВЭЖХ с получением 450 мг (выход 78%) (S)-2-(4-аминометил-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты в форме соли TFA, в виде белого твердого вещества. ES-LRMS m/e расч. для C24H24F2N4O5 (M+H)+ 487, фактич. 487.

Стадия 5: получение (S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино)метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)-фенил]пропионовой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-(4-аминометил-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)-фенил]пропионовой кислоты, TFA соли (120 мг; 0,2 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (103 мг; 0,2 ммоль) и DIPEA (129 мг; 174 мкл; 1,0 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением белого твердого вещества (75 мг; 43%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C42H50F2N6O13 (M+Na)+ 907,3296; наблюд. 907,3296.

Пример 12

Получение (S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино)метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, трифторацетатной соли; VLA-4 Лиганд - Реагент 12:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, Стадия 11, исходя из (S)-2-(4-аминометил-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты, TFA-соли (121 мг; 0,2 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]пропионовой кислоты (100 мг; 0,145 ммоль) и DIPEA (258 мг; 348 мкл; 2,0 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением белого твердого вещества (80 мг; 38%). ES(+)-HRMS m/e расч. для C50H66F2N6O17 (M+H)+ 1061,4526; наблюд. 1061,4521.

Пример 13

Получение (S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-ацетилсульфанил-этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 13:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, стадия 11, исходя из (S)-2-(4-аминометил-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (64 мг; 0,11 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-ацетилсульфанил-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (64 мг; 0,11 ммоль) и DIPEA (42 мг; 56 мкл, 0,32 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением вязкого масла (90 мг; 87%). ES(+)-LRMS m/e расч. для C45H62F2N4O15S1 (M+H)+ 969, набл. 969.

Пример 14

Получение (S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанилэтокси)этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропионил]-[4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]-этилкарбамоил]-3,5-дифторбензиламино]метил]-2,6-дифторбензиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд - Реагент 14:

Стадия 1: получение пропилового эфира (S)-2-[4-[[3,5-дифтор-4-[(S)-1-пропоксикарбонил-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовой кислоты:

В колбу на 100 мл с пропиловым эфиром (S)-2-(4-циано-2,6-дифторбензоиламино)-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты (524 мг; 1,0 ммоль), растворенным в н-пропаноле (20 мл), через который пропускали азот, вносили палладий на угле (10%, 106 мг). Реакционный сосуд герметизировали, трижды дегазировали, пропуская азот и создавая вакуум, и затем выдерживали в атмосфере водорода из баллона в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли с помощью ЕА, снова дегазировали и выдерживали в атмосфере водорода в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через Celite, концентрировали и очищали в ходе ВЭЖХ с получением указанного в заголовке соединения (204 мг; 19%). ES(+)-LRMS m/e расч. для C54H57F4N7O10 (M+H)+ 1041, набл. 1041.

Стадия 2: получение (S)-2-[4-[[3,5-дифтор-4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]-метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовой кислоты:

В колбу на 200 мл с пропиловым эфиром (S)-2-[4-[[3,5-дифтор-4-[(S)-1-пропоксикарбонил-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовой кислоты (1004 мг, 0,97 ммоль) вносили THF (25 мл), воду (25 мл) и LiOH (193 мг; 4,6 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, высушивали из ацетонитрила с получением белого твердого вещества, которое смешивали с DMSO (13 мл) и водой (12 мл). Эту смесь минимально нагревали, фильтровали, и к полученному фильтрату добавляли TFA (0,25 мл), с образованием осадка. Этот осадок разводили водой (50 мл), фильтровали, промывали водой и гексаном и высушивали в высоком вакууме с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (696 мг; 75%). ES(+)-LRMS m/e расч. для C48H45F4N7O10 (M+H)+ 956, набл. 956.

Стадия 3: получение метилового эфира (S)-2-[4-[[3,5-дифтор-4-[(S)-1-метоксикарбонил-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]-фенил]этилкарбамоил]бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовой кислоты:

В колбу с (S)-2-[4-[[3,5-дифтор-4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]-метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовой кислотой (560 мг; 0,59 ммоль) вносили метанол (50 мл) и TMSCI (398 мг; 460 мл; 3,66 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли с помощью ЕА (10 мл), DCM (140 мл) и промывали водным раствором NaHCO3 (вода: насыщенный раствор 50 мл: 50 мл; 10 мл солевого раствора) и солевым раствором (100 мл). Органические слои высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества, которое непосредственно использовали в таком виде. ES(+)-LRMS m/e расч. для C50H49F4N7O10 (M+H)+ 984, набл. 984.

Стадия 4: получение метилового эфира (S)-2-[4-[[3-бензилоксикарбониламинопропионил]-3,5-дифтор-4-[(S)-1-метоксикарбонил-2-[4-[[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]-метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-((1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенилпропионовой кислоты:

В колбу с CBZ-бета-аланином (123 мг; 0,55 ммоль) и DCM (1 мл) вносили по каплям оксалилхлорид (710 мг; 0,488 мл; 5,5 ммоль), растворенный в DCM (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 ч и затем концентрировали до твердого остатка. Это твердое вещество ресуспендировали в DCM (1 мл) и добавляли по каплям или порциями к раствору метилового эфира (S)-2-[4-[[3,5-дифтор-4-[(S)-1-метоксикарбонил-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]-бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовой кислоты (0,59 ммоль) в DMF (5 мл) и DIPEA (131 мг; 0,178 мл; 1,0 ммоль) с дополнительной промывкой с помощью DCM (2×0,4 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение выходных. Реакционную смесь разбавляли с помощью ЕА (200 мл), промывали водным раствором NaHCO3 (вода : насыщенный раствор 100 мл : 100 мл) и солевым раствором (100 мл), высушивали над MgSO4, фильтровали, концентрировали и очищали флэш-хроматографией с возрастающей концентрацией MeOH/DCM в DCM от 10% до 30%. Указанное в заголовке соединение выделяли в виде белого твердого вещества (400 мг; 67%). ES(+)-LRMS m/e расч. для C61H60F4N8O13 (M+H)+ 1189, набл. 1189.

Стадия 5: получение (S)-2-[4-[[3-бензилоксикарбониламинопропионил]-3,5-дифтор-4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-((1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенилпропионовой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 5, Стадия 7, исходя из метилового эфира (S)-2-[4-[[3-бензилоксикарбониламинопропионил]-3,5-дифтор-4-[(S)-1-метоксикарбонил-2-[4-[[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-((1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенилпропионовой кислоты (380 мг; 0,32 ммоль), THF (8 мл), воды (8 мл), LiOH (51 мг; 1,21 ммоль) и 1 н HCl, после осаждения, растворения и концентрирования, с получением белого твердого вещества (325 мг). ES(+)-LRMS m/e расч. для C59H56F4N8O13 (M+H)+ 1161, набл. 1161.

Стадия 6: получение (S)-2-[4-[[3-аминопропионил]-3,5-дифтор-4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]-этилкарбамоил]бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-((1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенилпропионовой кислоты; VLA-4 Лиганд 6:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 14, Стадия 1, исходя из (S)-2-[4-[[3-бензилоксикарбониламинопропионил]-3,5-дифтор-4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-((1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенилпропионовой кислоты (313 мг; 0,27 ммоль), палладия на угле (10%) и водорода при давлении 1 атм. Указанное в заголовке соединение получали после четырех циклов обработки (3×65 мг; 0,061 ммоль; комнатная температура, 3 ч, 4 ч, 18 ч; и 205 мг; 0,19 ммоль; 40°C 4,5 ч) и фильтрации, в виде грязно-белого твердого вещества (79 мг; 28%). ES(+)-LRMS m/e расч. для C51H50F4N8O11 (M+H)+ 1027, набл. 1027.

Стадия 7: получение (S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанилэтокси)-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропионил]-[4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]-3,5-дифторбензиламино]метил]-2,6-дифторбензиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]-пропионовой кислоты:

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как описано в Примере 1, стадия 11 исходя из (S)-2-[4-[[3-аминопропионил]-3,5-дифтор-4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]бензиламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-((1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенилпропионовой кислоты (84,3 мг; 0,082 ммоль), 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-ацетилсульфанилэтокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (49,1 мг; 0,082 ммоль) и DIPEA (31 мг; 43 мкл, 0,246 ммоль) и после очистки с помощью ВЭЖХ, с получением белого твердого вещества (57 мг; 46%). ES(+)-LRMS m/e расч. для C72H88F4N8O21S1 (М/2+Н)+ 755, набл. 755.

Получение меченных флуоресцеином (FITC) специфических реагентов

Специфические реагенты можно дериватизировать флюорофорами, которые могут быть полезны в исследованиях по отслеживанию их связывания с клетками, которые экспрессируют рецепторы к специфическим низкомолекулярным соединениям. Такие молекулы можно изготавливать любым из двух способов. Во-первых, можно провести реакцию нацеленных малеимидов с 2-[(5-флюоресцеинил)аминокарбонил]этилмеркаптаном. Как вариант, можно провести реакцию в одном реакционном сосуде нацеливающих низкомолекулярных лигандов - антагонистов интегрина с 2-[(5-флюоресцеинил)аминокарбонил]-этилмеркаптаном и бифункциональным ПЭГ-реагентом, как показано на схемах 17 и 18.

Пример по Способу а)

Получение полуамида (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропокси]-фенил]-3-[2-[3-(гуанидино)-бензоиламино]-ацетиламино]-янтарной кислоты-FITC

К желтой суспензии полуамида (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]-пропокси]фенил]-3-[2-[3-(гуанидино)-бензоиламино]-ацетиламино]-янтарной кислоты (37,5 мг; 0,03 ммоль) и 2-[(5-флюоресцеинил)аминокарбонил]-этилмераптана (FITC-реагент) (15,6 мг; 0,036 мл) в метаноле (5 мл) добавляли при комнатной температуре, в атмосфере азота избыток DIPEA (38,7 мг; 52 мкл; 0,3 ммоль). Полученную светло-желтую суспензию перемешивали в течение 2 ч, при этом анализ с помощью LCMS показал отсутствие исходного вещества. Затем избыток DIPEA удаляли в вакууме и выделяли желаемый продукт после проведения очистки с помощью ВЭЖХ, с получением 25 мг (выход 50%) FITC-производного полуамида (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]-фенил]-3-[2-[3-(гуанидино)-бензоиламино]-ацетиламино]-янтарной кислоты в виде коричневого твердого вещества.

ES(+)-HRMS m/e расч. для C80H104N10O28S (М+2Н)2+ 843,3444; наблюд. 843,3437. Данные LCMS = М+Н, 1687,6

Стадия 1. Цистамин дигидрохлорид (68 мг; 0,301 ммоль) и DIEA (110 мкл; 2,1 экв.) растворяли в DMF (10 мл), после чего добавляли NHS-флуоресцеин, смесь 5- и 6-карбоксифлуоресцеина (300 мг; 0,634 ммоль) и полученную реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем ее разводили этилацетатом и промывали три раза водой и один раз солевым раствором. Экстракт высушивали над безводным сульфатом натрия, концентрировали при пониженном давлении, перерастворяли в небольшом количестве метанола и этилацетата и затем обрабатывали диэтиловым эфиром с получением 140 мг аддукта флуоресцеина и цистамина в виде ярко-оранжевого твердого вещества.

Стадия 2. Аддукт флуоресцеина и цистамина (80 мг; 0,092 ммоль) растворяли в смеси 3:1 метанола и воды (4 мл) и добавляли ТСЕР гидрохлорид (80 мг; 3 экв.). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Продукт очищали путем ВЭЖХ с получением 78 мг вещества. LRMS (ESI) 435,0.

Получение конъюгатов меченных флуоресцеином низкомолекулярных соединений с ПЭГ

Общий способ. К раствору лиганда (1 экв.) в DMSO добавляли DIEA (2 экв.) и SM(PEG)4n (1 экв.). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавляли флуоресцеин с тиольной ножкой (1 экв.) и реакционную смесь перемешивали еще в течение 10 мин. Продукт очищали путем ВЭЖХ.

СПОСОБЫ КОВАЛЕНТНОГО ПРИСОЕДИНЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ИНТЕГРИН-НАЦЕЛИВАЮЩИХ ЛИГАНДОВ К 5'-ТИОЛ-МИРНК ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМ

Получение миРНК

Синтез олигорибонуклеотидов

Олигорибонуклеотиды синтезировали по фосфоамидитной (амидофосфитной) технологии на твердой фазе с использованием установки для синтеза ABI 394 (Applied Biosystems), в масштабе 10 мкмоль.

смысловая цепь миРНК: SEO ID NO. 1

антисмысловая цепь миРНК: SEQ ID NO. 2

Соответствующие миРНК направлены к конститутивному гену АНА1. Синтез проводили на твердой подложке из стекла с контролируемым размером пор (CPG, , с загрузкой 75 мкмоль/г, производства Prime Synthesis, Астон, Пенсильвания, США). Обычные фосфоамидиты РНК, 2'-O-метил-фосфоамидиты, а также вспомогательные реагенты заказывали в Proligo (Гамбург, Германия). В частности, использовали следующие амидиты: (5'-O-диметокситритил-N6-(бензоил)-2'-O-трет-бутилдиметилсилил-аденозин-3'-O-(2-цианоэтил-N,N-диизопропиламино)-фосфоамидит, 5'-O-диметокситритил-N4-(ацетил)-2'-O-трет-бутилдиметилсилил-цитидин-3'-O-(2-цианоэтил-N,N-диизопропиламино)фосфоамидит, (5'-O-диметокситритил-N2-(изобутирил)-2'-O-трет-бутилдиметилсилил-гуанозин-3'-O-(2-цианоэтил-N,N-диизопропиламино)фосфоамидит и 5'-O-диметокситритил-2'-O-трет-бутилдиметилсилил-уридин-3'-O-(2-цианоэтил-N,N-диизопропиламино)-фосфоамидит. 2'-O-Метилфосфоамидиты содержали такие же защитные группы, как и обычные амидиты РНК. Все амидиты растворяли в безводном ацетонитриле (100 мМ) и добавляли молекулярные сита . Для получения сульфогидрильного линкера на 5'-конце олигомера, 1-О-диметокситритил-гексил-дисульфида, использовали линкер 1'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфоамидит производства Glen Research (Стерлинг, Вирджиния, США). Перед конъюгированием низкомолекулярного соединения, дисульфидный линкер восстанавливали трис-(2-карбоксиэтил)фосфином (ТСЕР, см. ниже). Для мечения 5'-конца флюорофором Nu547 использовали соответствующий фосфоамидит производства Thermo Fisher (Милуоки, Висконсин). В качестве раствора активатора использовали 5-этил-тиотетразол (ЕТТ, 500 мМ раствор в ацетонитриле). Время конденсации составляло 6 минут. С целью введения фосфотиоатных (тиофосфатных) связей, использовали 100 мМ раствор 3-этокси-1,2,4-дитиазолин-5-она (EDITH, получали в Link Technologies, Ланкашир, Шотландия) в безводном ацетонитриле.

Расщепление и снятие защиты олигомера, связанного с подложкой

После завершения твердофазного синтез высушенную твердую подложку переносили в пробирку на 15 мл и обрабатывали метиламином в метаноле (2 М, Aldrich) в течение 180 мин при 45°C. После центрифугирования супернатант переносили в новую пробирку на 15 мл и стекло CPG промывали с помощью 1200 мкл N-метилпирролидин-2-она (NMP, Fluka, Бухс, Швейцария). Смыв объединяли с метанольным раствором метиламина и добавляли 450 мкл триэтиламин-тригидрофторида (TEA⋅3HF, Alfa Aesar, Карлсруэ, Германия). Эту смесь доводили до 65°C в течение 150 мин. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 0,75 мл NMP и 1,5 мл этокситриметилсилана (Fluka, Бухс, Швейцария). Через 10 мин выпавший в осадок олигорибонуклеотид собирали центрифугированием, супернатант отбрасывали и твердое вещество растворяли в 1 мл буфера А (см. ниже).

Очистка олигорибонуклеотидов

Неочищенные олигорибонуклеотиды очищали с помощью ВЭЖХ на сильном катионообменнике (SAX) с использованием препаративной колонки 22×250 мм DNA Рас 100 (Dionex, Идштайн, Германия) на установке АКТА Explorer (GE Healthcare). Буфер А содержал 10 мМ NaClO4, 1 мМ EDTA, 10 мМ Tris, pH 7,4, 6 M мочевину и 20% ацетонитрил. Буфер В содержал 500 мМ NaClO4 в Буфере А. Использовали скорость потока 4,5 мл/мин. Записывали УФ-сигнал при 260 и 280 нм. Использовали градиент от 20%В до 45%В за 55 мин. Нужные фракции объединяли и осаждали с помощью 3 M NaOAc, рН=5,2 и 70% этанола.

Неочищенные, меченные с помощью Nu547 олигомеры очищали в ходе препаративной ВЭЖХ с использованием колонки XTerra Prep MS С8 10×50 мм (Waters, Эшборн, Германия) на установке АКТА Explorer (GE Healthcare). Буфер А содержал 100 мМ ацетат триэтиламмония (Biosolve, Валкенсвард, Нидерланды), а буфер В содержал 50% ацетонитрил в буфере А. Скорость потока составляла 5 мл/мин. Записывали УФ-сигнал при 260, 280 и 547 нм (в случае меченного с помощью Nu547 олигорибонуклеотида). Использовали градиент от 5%В до 60%В за 58 объемов колонки (CV). Нужные фракции объединяли и осаждали с помощью 3 M NaOAc, рН=5,2 и 70% этанола.

В конце очищенный олигомер обессаливали с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке, содержащей Sephadex G-25 (GE Healthcare). Концентрацию этого раствора определяли по измерению абсорбции при 260 нм на УФ-фотомере (Beckman Coulter, Крефельд, Германия). До ренатурации отдельные цепи хранили в виде замороженных растворов при -20°C.

Получение низкомолекулярных конъюгатов РНК

Низкомолекулярные соединения, содержащие малеимидную функциональную группу, ковалентно конъюгировали с РНК через тиоэфирную связь. Для осуществления этого химического процесса ~60 мг РНК, содержащей 5'-дисульфидный линкер, восстанавливали в воде (5 мл) до соответствующего тиола, с помощью 1 мл ТСЕР (0,5 M в воде, производства Sigma Aldrich). Как только анализ с помощью аналитической анионнообменной ВЭЖХ показывал завершение реакции (~2 ч при комнатной температуре), РНК осаждали с помощью 30 мл смеси этанол / 3 M NaOAc (pH 5,4) 32:1 (об.%) в течение ночи при -20°C. Осадок собирали центрифугированием и использовали для последующей конъюгации низкомолекулярного соединения.

В стандартной реакции конъюгации 10 мг РНК растворяли в 2 мл натрий-фосфатном буфере (0,1 М; pH 7,0). К этому раствору добавляли низкомолекулярное соединение (0,12 мМ) в ACN/NMP 1:1 (об. %) в течение 5 минут. Когда, по данным анализа RPLC-ESI MS, внесенная РНК была израсходована, смесь разбавляли водой (~10 мл) и добавляли ~40 мл смеси этанол / 3 M NaOAc (pH 5,4) 32:1 (об. %) для осаждения конъюгированной РНК в течение ночи при -20°C. Осадок собирали центрифугированием, растворяли в воде и при необходимости очищали с помощью анионообменной ВЭЖХ, следуя описанной выше процедуре. Если конъюгат был достаточно чистым, реакционную смесь фильтровали через колонку для гель-фильтрации (Sephadex G-25, GE Healthcare).

Гибридизация олигорибонуклеотидов для получения миРНК Комплементарные цепи ренатурировали объединением эквимолярных растворов РНК. Эту смесь лиофилизовали и растворяли в подходящем объемебуфера для гибридизации (100 мМ NaCl, 20 мМ фосфат натрия, рН 6,8) для достижения желаемой концентрации. Этот раствор помещали на водяную баню при 95°C, которую охлаждали до КТ в течение 3 ч. Таблица 3: информация о последовательности миРНК; строчные буквы: 2'-ОМе нуклеотид; s: тиофосфатная связь; dT: дезокситимидин; (C6SSC6): С-6 дисульфидный линкер; (Су5): краситель цианин 5.

Ниже следующий анализ проводили для оценки эффективности ингибирования VLA-4-нацеленных соединений по настоящему изобретению в анализе связывания VLA-4/VCAM в клетках Jurkat.

Ниже следующий анализ адгезии был описан ранее и использован в настоящем изобретении с незначительными модификациями. См. Патенты США №№6229011 и 6380387, каждый из которых полностью включен в настоящее описание посредством ссылки. Функциональная активность in vitro VLA-4 (α4β1)-нацеливающих липидов (из примеров) определяли с помощью анализа, основанного на клетках Jurkat (см. ниже), поскольку клетки Jurkat экспрессируют на высоком уровне VLA-4 на поверхности своей мембраны. Каждый анализ проводили на 96-луночном планшете, при этом VCAM-1 использовали в качестве противолиганда для клеток (т.е. VCAM-1 привязывали к поверхности лунок).

Более детально, 96-луночные иммунологические микропланшеты высокого связывания F96 Maxisorp (Nunc) сенсибилизировали с помощью VCAM-1, 25 нг/лунку в течение ночи. В день эксперимента планшеты блокировали в течение 1 ч с помощью буфера PBS, содержащего 1% обезжиренное сухое молоко для предотвращения неспецифического связывания. Затем планшеты промывали с помощью DPBS (Физиологические раствор Дюльбекко, забуференный фосфатами) и промокали досуха. Избыток жидкости тщательно отсасывали из лунок.

В качестве контроля в контрольные лунки добавляли низкомолекулярный антагонист (140) для ингибирования VLA-4, указанный выше, в буфере, содержащем 4% DMSO, и серийно разводили на планшете, как правило, в диапазоне концентраций от 1000 нМ до 0,2 нМ. Клетки Jurkat, клон Е6-1 (АТСС), метили с помощью 100 мкг/мл 6-карбоксифлуоресцеиндиацетата, флюоресцирующего красителя, и затем активировали в среде RPMI 1640, содержащей 0,5 мМ двухвалентные катионы Mn2+ и 0,05% бычий сывороточный альбумин. Следует отметить, что такая активация необходима для достижения максимального связывания для лиганда, и она может симулировать активацию интегринов цитокинами и хемокинами in vivo. Было определено, что контрольное соединение (27) характеризуется величиной IC50 примерно 12 нМ (т.е. 50% клеток не связались с VCAM-1 на поверхности лунок, поскольку рецепторы VLA-4 клеток предположительно образовали связь или ассоциат с контрольным соединением).

Для оценки VLA-4 ингибирования VLA-4-нацеленных соединений по настоящему изобретению (из примеров), клетки Jurkat (экспрессирующие на высоком уровне VLA-4) вносили в планшеты, покрытые VCAM-1, до конечной концентрации 2×105 клеток/лунку на 96-луночных планшетах и инкубировали с тестируемыми соединениями (дериватизированные миРНК, низкомолекулярные соединения) в течение 45 минут при 37°C. После удаления не связавшихся клеток путем осторожного промывания лунок с помощью PBS, считывали сигнал флуоресценции от связанных клеток на ридере для микропланшетов Tecan Safire2 при 450 нм. Наносили точки и определяли величины IC50 для каждого исследуемого соединения с помощью регрессионного анализа, используя линейный участок кривой концентрация-отклик. Эти результаты представлены ниже в Таблицах 4 и 5.

Доказательство клеточной проницаемости и локализации производных низкомолекулярных соединений для ковалентно связанных антагонистов интегрина с FITC-флюорофорами и миРНК для нацеленной доставки.

Процедура

AML MV4-11 клетки в питательной среде (RPMI 1640 с 10% FBS) инкубировали с Дуплексом-27 (500 нМ) в течение 1 ч при 37°C. Для определения VLA-4-независимого связывания, включали 140 (10 мкМ) при одних условиях для блокировки VLA-4-зависимого связывания. Затем по окончании инкубации клетки дважды промывали с помощью D-PBS и фиксировали в 1% параформальдегиде в течение 10 минут. Захват миРНК анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии с визуализацией, с использованием ImageStreamx (Aminis Corporation, Сиэтл). Результаты представлены в Таблице А и на Фигурах 1-4.

Анализ миРНК с модифицированной 5'-смысловой цепью на выключение иРНК АНА1 в клеточных системах

Материалы и Методы

Референсный ген: GAPDH
Клеточная линия: H1299_Nut-Onc
Плотность посадки: 5000 клеток/лунку
Формат планшета: 96-луночный
Время от высеивания до обработки: 0
Обработка контроля: холостая, необработанная, контрольная миРНК
Реагент для трансфекции (TF): DharmaFect1
Способ трансфекции Обратная трансфекция
Объем TF-реагента на лунку 0,15 мл
конечная концентрация миРНК 50 нМ
Способ анализа: День 1 ручной/День 2 Вошер

Обратная трансфекция: клетки Н1299, трансфицированные с помощью указанной миРНК при конечной концентрации 50 нМ, с использованием реагента для трансфекции DharmaFect-1 в количестве 0,15 мкл/лунку. Затем клетки высевали в 96-луночный планшет в количестве 5000 клеток/лунку и инкубировали при 37°C в течение 48 ч.

Эффективность выключения миРНК измеряли с помощью анализа разветвленной ДНК, как рекомендовано производителем; результаты такого выключения показаны на Фиг. 5. Относительную жизнеспособность клеток оценивали по абсолютной экспрессии GAPDH в той же лунке (на Фиг. 6).

Если не указано обратное, все соединения в примерах получали и характеризовали, как описано выше. Все патенты и публикации, на которые даны ссылки в настоящем описании, полностью включены посредством ссылки.

1. Соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; в котором n равно от 1 до 24 и в котором:

R1 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

,

в котором m равно от 0 до 3, a G выбран из группы, состоящей из:

и ;

(2) соединения формулы:

;

в котором m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой независимо галоген, W представляет собой О или СН2, a G выбран из группы, состоящей из:

и ;

(3) соединения формулы:

;

R2 выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

и

(2) соединения формулы:

.

2. Соединение по п. 1, в котором R1 представляет собой соединение формулы:

,

где m равно от 0 до 3.

3. Соединение по п. 1, в котором R1 представляет собой соединение формулы:

,

где m равно от 0 до 3.

4. Соединение по п. 1, в котором R1 представляет собой соединение формулы:

,

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой галоген, a W представляет собой О или СН2.

5. Соединение по п. 1, в котором R1 представляет собой соединение формулы:

,

где m равно от 0 до 3, R4 и R5 представляют собой галоген, a W представляет собой О или СН2.

6. Соединение по п. 1, в котором R1 представляет собой соединение формулы:

.

7. Соединение по любому из пп. 1-6, в котором R2 представляет собой соединение формулы:

.

8. Соединение по любому из пп. 1-6, в котором R2 представляет собой соединение формулы:

.

9. Соединение по п. 1, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]этил]циклопентанкарбонил]амино]пропионовая кислота;

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]этил]циклопентил]карбонил]амино]-пропионовая кислота;

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]-этил]циклопентанкарбонил]амино]пропионовая кислота и

(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанилэтокси)этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]-этил]-циклопентанкарбонил]-амино]-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]пропионовая кислота.

10. Соединение по п. 1, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]-этокси]пропиониламино]пропокси]бензоиламино]пропионовая кислота;

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]бензоиламино]-пропионовая кислота;

(S)-3-[4-(2,6-дихлорбензоиламино)фенил]-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропокси]бензоиламино]пропионовая кислота и

(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]бутил]циклопентанкарбонил]амино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота.

11. Соединение по п. 1, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:

(S)-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]-бензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота;

(S)-2-[2,6-дихлор-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропокси]бензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовая кислота и

(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино)метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовой кислоты трифторацетатная соль.

12. Соединение по п. 1, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:

(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропионил-амино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино)-метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]пропионовой кислоты трифторацетатная соль;

(S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-ацетилсульфанил-этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]метил]-2,6-дифторбензоиламино]-3-[4-(1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)фенил]-пропионовая кислота и

(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанилэтанокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропионил]-[4-[(S)-1-карбокси-2-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]этилкарбамоил]-3,5-дифторбензил-амино]метил]-2,6-дифторбензиламино]-3-[4-[1,3,6-триметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]фенил]пропионовая кислота.

13. Соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль или эфир; в котором n равно от 1 до 24 и в котором:

R1 является таким, как определено в п. 1;

R2 представляет собой соединение формулы:

,

в котором R3 представляет собой конъюгированный фрагмент, выбранный из молекулы миРНК или флюоресцеинизотиоцианата, а X представляет собой соединение формулы:

.

14. Фармацевтическая композиция для нацеленной доставки миРНК или флюоресцеинизотиоцианата к клеткам-мишеням, экспрессирующим рецептор VLA-4, включающая эффективное количество соединения по п. 13 и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Способ нацеленной доставки миРНК или флюоресцеинизотиоцианата к клеткам-мишеням, экспрессирующим рецептор VLA-4, включающий введение эффективного количества соединения по п. 13.

16. Применение соединения по п. 13 для нацеленной доставки миРНК или флюоресцеинизотиоцианата к клеткам-мишеням, экспрессирующим рецептор VLA-4.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (I) и к его энантиомеру, где R1 представляет собой циклопропилметильную группу, и R2 представляет собой метильную группу; или R1 представляет собой 4-гидроксибутильную группу, и R2 представляет собой атом водорода.

Изобретение относится к соединению формулы I, где R1 выбран из -OR7 и -NR8R9; R2 представляет собой Н; X представляет собой -C1-9гетероарил, выбранный из пиразола, имидазола, триазола, бензотриазола, фурана, тетразола, пиразина, тиофена, оксазола, изоксазола, тиазола, оксадиазола, пиридазина, пиридина, пиримидина, бензоксазола, пиридилимидазола и пиридилтриазола; R3 отсутствует или выбран из Н; галогена; -С0-5алкилен-ОН; -NH2; -C1-6алкила; -CF3; -С3-7циклоалкила; -С0-2алкилен-О-C1-6алкила; -C(O)R20; -C0-1алкилен-COOR21; -С(О)NR22R23; -NHC(O)R24; =O; -NO2; -С(СН3)=N(ОН); фенила, необязательно замещенного одной или двумя группами, независимо выбранными из галогена, -ОН, -CF3, -ОСН3, -NHC(O)СН3 и фенила; нафталенила; пиридинила; пиразинила; пиразолила, необязательно замещенного метилом; тиофенила, необязательно замещенного метилом или галогеном; фуранила; и -СН2-морфолинила; и R3, когда присутствует, присоединен к атому углерода; R4 отсутствует или выбран из Н; -ОН; -C1-6алкила; -C1-2алкилен-COOR35; -ОСН2ОС(О)СН(R36)NH2; -ОСН2ОС(О)СН3; -СН2СН(ОН)СН2ОН; и фенила или бензила, необязательно замещенных 1-3 группами, выбранными из галогена, -COOR35, -ОСН3, -OCF3 и -SCF3; и R4, когда присутствует, присоединен к атому углерода или азота; или R3 и R4 взяты вместе с образованием -фенилен-О-(СН2)1-3- или -фенилен-O-СН2-СНОН-СН2-; а равен 0 или 1; R5 представляет собой галоген; b равен 0 или целому числу от 1 до 3; каждый R6 независимо выбран из галогена, -ОН, -СН3 и -ОСН3; R7 выбран из Н, -C1-8алкила, -[(СН2)2O]1-3CH3, -C1-6алкилен-OC(O)R10, -С0-6алкиленморфолинила, -С1-6алкилен-SO2-C1-6алкила и структуры формулы (а); R10 представляет собой -O-С3-7циклоалкил; и R32 представляет собой -C1-6алкил; R8 и R9 представляют собой Н; R20, R21 и R35 независимо выбраны из Н и -C1-6алкила; R22 и R23 независимо выбраны из Н, -C1-6алкила, -СН2СООН, -(СН2)2ОН, -(СН2)2ОСН3, -(CH2)2SO2NH2, -(СН2)2N(СН3)2, -С0-1алкилен-С3-7циклоалкила и -(СН2)2-имидазолила; или R22 и R23 взяты вместе с образованием цикла; R24 выбран из -C1-6алкила; -С0-1алкилен-О-C1-6алкила; фенила, необязательно замещенного галогеном или -ОСН3; и пиридинила; и R36 представляет собой -СН(СН3)2; и где метиленовый линкер на бифениле необязательно замещен одной или двумя -C1-6алкильными группами; или его фармацевтически приемлемая соль.

Изобретение относится к оптическому отбеливающему агенту, содержащему смесь соединений формул (3), (4) и (5) в которой R - водород или метил; Y - аминокислота, которая является производной аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты или иминодиуксусной кислоты и из которой удален атом водорода аминогруппы; а М - катион щелочного металла.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новому производному хинолина формулы (I) или к его пригодной для употребления внутрь соли, где R1 и R2 представляет собой водород; L представляет собой С1-С7 алкилен, С3-С6циклоалкилен или -(СН2)1-3-(С3-С6)циклоалкилен; М представляет собой -NR4-C(O)- или -C(O)-NR4-; когда М представляет собой -NR4-C(O)-, R4 представляет собой водород; либо в качестве альтернативы R4 представляет собой С1-С3 алкиленовый линкер, где указанный алкиленовый линкер и от 2 до 5 атомов в L вместе с азотом, к которому они присоединены, образуют 5-8-членное моноциклическое, бициклическое или мостиковое гетероциклическое кольцо, которое необязательно замещено и содержит один гетероатом, представляющий собой атом азота; и R3 представляет собой С1-С6 алкил, замещенный С1-С3 алкил, С3-С6циклоалкил, замещенный С3-С6циклоалкил, 6-членный гетероциклил, содержащий один атом кислорода или замещенный 6-членный гетероциклил, содержащий один атом азота; когда М представляет собой -C(O)-NR4-, R4 представляет собой водород; либо в качестве альтернативы R4 и R3 вместе с азотом, к которому они присоединены, образуют 5-6-членное моноциклическое гетероциклическое кольцо, которое содержит один атом азота; где в группе, обозначенной как замещенная, один заместитель выбирают из группы, состоящей из следующих заместителей: -NH2, гидроксил, C1-6 алкокси, C1-6 алкил, 6-членный гетероциклил, содержащий один или два атома, выбранных из N и О, С3-4 циклоалкил, и -C(=O)NRaRa, где каждый Ra независимо означает водород или С3-6 циклоалкил; при условии, что соединения формулы (I) не могут представлять собой соединения, указанные в п.1.

Изобретение относится к соединению общей формулы [Ib] или к его фармацевтически приемлемой соли. В формуле (I) Cy представляет собой фенил, С3-8 циклоалкил или С3-8 циклоалкенил, Cyа является гетероциклической группой, имеющей структуры, приведенные в формуле изобретения, R1a и R2b являются группами, определенными в формуле изобретения.

Изобретение относится к способу получения производных пролина формулы 1, где R1 выбран из C1-7-алкила или радикала формулы II, где R4 выбран из группы, содержащей С1-7-алкил, галоген-С1-7-алкил и фенил, возможно замещенный галогеном; R2 выбран из группы, содержащей галоген или галоген-С1-7-алкил; и R3 выбран из группы, содержащей водород, галоген, галоген-С1-7-алкил, С1-7-алкокси, галоген-С1-7-алкокси или 5- или 6-членный гетероцикл, содержащий один или два атома азота, причем цикл возможно замещен C1-7-алкилом или галогеном, и новым промежуточным соединением, используемым в способе.

Изобретение относится к применению сигма лиганда, представляющего собой 4-{2-[5-метил-1-(нафталин-2-ил)-1Н-пиразол-3-илокси]этил}морфолин или его фармацевтически приемлемую соль, для предотвращения и/или лечения боли, ассоциированной с диабетом 2 типа, и связанных с этим симптомов.

Настоящее изобретение относится к новым соединениям формулы (I), а также к их фармацевтически приемлемым солям, обладающим активностью ингибиторов HSL, к фармацевтической композиции, к способу ингибирования фермента липазы HSL, а также к применению предлагаемых соединений для изготовления лекарственного средства.

Изобретение относится к соединениям формулы I, приведенной ниже, или к их стереомерам, таутомерам или фармацевтически приемлемым солям. R1, R2, Ra, Rb, Rc, Rd, X, Y, B и кольцо C являются такими, как определено в формуле изобретения.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым производным хинолина общей формулы (IIIb) или к его приемлемой для проглатывания соли, где А является NH2; В является C1-C4 алкилом; С является -CO2R7; R7 является водородом; L1 является С1-С8 алкиленом, С6-циклоалкиленом или -СН2-С6-циклоалкиленом; L2 является -О-, NR34-C(O)-, -C(O)-NR34-, -(3-6-членной гетероциклилен-С(О))-группой, где гетероциклилен содержит один атом азота; R33 является С1-С6 алкилом, необязательно замещенным С1-С6 алкокси или гидрокси, С3-С10 карбоциклилом, необязательно замещенным одним C1-С6 алкокси, С6-С10 арилом, необязательно замещенным одним или двумя заместителями, выбранными из -ОН, галогена, -C(=O)NH2, -С(=O)NHC1-6 алкил, С1-С6 алкокси, C1-C6 алкил-ОН и O-C1-C6 алкил-ОН, С6-С10 арил С1-С4 алкилом, необязательно замещенным С1-С6 алкокси, 5-10-членным гетероциклилом, содержащим 1 или 2 атома кислорода, пиридином или пиридин-С1-С4 алкилом; и R34 является водородом.

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы I для применения в изготовлении и доставке конъюгированных молекул, таких как низкомолекулярные соединения, пептиды, нуклеиновые кислоты, флюоресцирующие молекулы и полимеры, которые соединены с антагонистами интегрина альфа-V-бета-3, для нацеливания к клеткам, экспрессирующим альфа-V-бета-3.

Производные аминокислот по настоящему изобретению предоставляют новые соединения общей формулы (I), где значения радикалов указано в описании. Производные аминокислот по настоящему изобретению представляют собой новые соединения, демонстрирующие превосходное анальгетическое действие не только в модели ноцицептивной боли на животных, но также и в модели нейропатической боли на животных, таким образом, производные аминокислот очень эффективны в качестве лекарственных средств для лечения различных заболеваний, сопровождающихся болью.

Изобретение относится к соединениям для лечения клеточно-пролиферативных нарушений, имеющих формулу (II): где значения R1, R2 , X, А, В, R6, R7, R9 указаны в пункте 1 формулы, за исключением соединения формулы: 4 н.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкогинекологии, и может быть использовано для лечения неоперабельных асцитных форм рака яичников. Для этого больным с неоперабельной III-IV стадией рака яичников после удаления асцитической жидкости в брюшную полость вводят дренаж, затем внутрибрюшинно вводят рекомбинантный интерферон-гамма в 1 день 500 тыс.

Группа изобретений относится к фармации и онкотерапии. Предложено: фармацевтическая комбинация для лечения меланомы, содержащая: (a) 2-амид 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилэтил)пиридин-4-ил]тиазол-2-ил}амида) (S)-пирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты (соединение А) или его фармацевтически приемлемую соль; и (b) по меньшей мере один ингибитор Hsp90, представляющий собой этиламид 5-(2,4-дигидрокси-5-изопропилфенил)-4-(4-морфолин-4-илметил-фенил)изоксазол-3-карбоновой кислоты (AUY922), или его фармацевтически приемлемую соль; применение указанной комбинации для получения лекарственного средства для лечения меланомы и соответствующий способ лечения меланомы.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения люминального подтипа рака молочной железы N1 в постменопаузальном периоде.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и онкологии, и может быть использовано для селективной химиоэмболизации опухолей поджелудочной железы. Для этого диагностический катетер устанавливают в проксимальный отдел гастродуоденальной артерии по предварительно заведенному проводнику.

Данное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен конъюгат антитела против 5Т4 или его антигенсвязывающего фрагмента с монометилауристатином F (MMAF), связанных через малеимидокапроил; и его фармацевтически приемлемая соль.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его связывающему фрагменту, где антитело или его связывающий фрагмент специфически связывают белок CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, ДНК его кодирующей, а также к фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, и к конъюгату, способному специфически связывать белок CAPRIN-1.

Изобретение относится к биохимии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную цепь, способную формировать димерный белок, и к указанному димерному белку.

Изобретение относится к соединениям формулы I, где R1 выбран из группы, состоящей из соединений формулы, формулы, формулы, для изготовления и доставки конъюгированных молекул, таких как низкомолекулярные вещества, пептиды, нуклеиновые кислоты, флуоресцирующие молекулы и полимеры, которые связаны с антагонистами интегрина VLA-4, к клеткам-мишеням, экспрессирующим VLA-4. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 14 пр. ,,

Наверх