Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека



Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека
Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека
Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека
Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека
Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека
Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека
Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека
Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека
Нуфлеин бисангидрохлорид, обладающий цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека

Владельцы патента RU 2624861:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ФГБНУ ВИЛАР) (RU)

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой применение соединения Нуфлеина бисангидродигидрохлорида формулы I

,

обладающего избирательной, цитотоксической активностью на клетки рака шейки матки человека. Изобретение позволяет применять препарат соединения Нуфлеина бисангидродигидрохлорида на основе растительного сырья по новому назначению. Препарат обладает наименьшим цитотоксическим действием по отношению к здоровым клеткам. 3 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области создания высокоэффективных противоопухолевых препаратов растительного происхождения, а именно к нуфлеину бисангидродихлорида, обладающему избирательной, цитотоксической активностью на клетки рака шейки матки человека. Изобретение может найти применение в медицине для лечения злокачественных опухолей женской половой сферы.

Одной из стратегий лечения злокачественных новообразований является медикаментозная терапия с использованием различных цитостатических средств, в том числе растительного происхождения.

Достаточно хорошо изученным алкалоидом является Лютенурин, полученный из кубышки желтой (лат. - ) [Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. Фармакогнозия, 2002, стр. 413]. Кубышка желтая распространена по всей России, за исключением горных районов и Арктики, растет зарослями в прудах, озерах, по берегам речек с тихим течением. Препарат «Лютенурин» впервые был разработан во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений, представляет собой сумму гидрохлоридов димерных серосодержащих фуранохинолизидиновых алкалоидов из корневищ кубышки желтой (Nuphar luteae (L.) Smith syn. Nuphar luteum. L.) семейства кувшинковых. Антимикробная активность препарата обусловлена основным компонентом суммы алкалоидов - бисангидродихлоридом нуфлеина. [М.Е. Перельсон, Т.Н. Ильинская, О.Н. Толкачев. Структура нуфлеина - алкалоида Nuphar Luteum // Химия природных соединений, 1975, №6, стр. 768-770]

Препарат Лютенурин представляет собой смесь гидрохлоридов, преимущественно димерных серусодержащих хинолизидиновых алкалоидов: тиобинуфаридина, неотиобинуфаридина, нуфлеина. Действующим началом препарата является алкалоид нуфлеин (дигидрокси-тиобинуфаридин) (Т.Н. Ильинская, А.Д. Кузовков, Т.Г. Монахова. Химическое изучение алкалоидов кубышки желтой, в кн.: "Лекарственные растения. Химия", Том 15, ВИЛАР, под ред. А.И.Баньковского, "Колос", Москва, 1969, с. 322-333). Известный препарат Лютенурин (авт. свид. СССР №145858, ФС 42-948-75) обладает высокой антибактериальной активностью и применяется для лечения трихомонадных урогенитальных заболеваний и в качестве контрацептивного средства.

Известны различные способы получения препарата Лютенурина, разработанные в ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР).

Так, например, способ получения препарата Лютенурин заключается в том, что сухой экстракт суммы алкалоидов корневища кубышки желтой растворяют в этаноле, добавляют 20%-ный раствор метилен-бис-салициловой кислоты или растворяют в 10%-ной соляной кислоте, отфильтровывают от смолистых примесей, добавляют 10%-ный раствор перхлората натрия и полученный лютенурин - основание (или перхлорат лютенурина) обрабатывают известными приемами (авт. свид. СССР №145184).

Также известен способ получения лютенурина из корневищ кубышки желтой (Nuphar Lutea (L.), заключающийся в экстракции сырья, извлечении алкалоидов и получении гидрохлоридов насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом, отличающийся тем, что экстракцию сырья на головной стадии осуществляют 20-60%-ным водным алифатическим спиртом, предпочтительно этиловым или изопропиловым, подкисленным 5%-ной фосфорной кислотой, фильтруют, удаляют органический растворитель, водный кубовый остаток после отгонки спирта обрабатывают бутанолом, который затем отделяют, водно-кислотную фазу после нейтрализации до рН 8 обрабатывают карбонатом кальция для удаления фосфат-ионов, выпавший осадок фильтруют, промывают ацетоном и фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в разбавленной серной кислоте, подщелачивают до рН 8, экстрагируют основания алкалоидов толуолом, упаривают экстрагент и получают гидрохлориды (пат. РФ №2292218).

Известен способ получения лютенурина, который заключается в следующем: высушенные и измельченные корневища кубышки желтой, содержащие 0,4% суммы алкалоидов, обрабатывают гидратом окиси аммония, экстрагируют дихлорэтаном, затем реэкстрагируют серной кислотой, подщелачивают водную фазу гидратом окиси аммония, извлекают алкалоиды эфиром, после сушки экстракта поташом его концентрируют, осаждают примеси петролейным эфиром, а затем получают гидрохлориды насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом, целевой продукт отделяют, промывают петролейным эфиром, сушат и просеивают через сито ("Лекарственные вещества из растений и способы их производства", Ташкент, ФАН Уз ССР, 1980, с. 10-12).

Действующим началом препарата Лютенурин является алкалоид нуфлеин (дигидрокси-тиобинуфаридин) формулы 1 (Т.Н. Ильинская, А.Д. Кузовков, Т.Г. Монахова. Химическое изучение алкалоидов кубышки желтой, в кн.: "Лекарственные растения. Химия", Том 15, ВИЛАР, под ред. А.И. Баньковского, "Колос", Москва, 1969, с. 322-333).

Формула 1. Нуфлеина бисангидродигидрохлорид

В результате проведенных авторами исследований была обнаружена высокая цитотоксическая активность нуфлеина бисангидродихлорида формулы 1, являющегося предметом настоящего исследования.

Основной задачей данного изобретения является создание нового препарата на основе растительного сырья, обладающего цитотоксической активностью на клетки рака шейки матки человека, высокой избирательной активностью по отношению к опухолевым клеткам и наименьшее цитотоксическое действие по отношению здоровым клеткам.

Такими свойствами могут обладать алкалоиды, полученные из лекарственных растений.

Поставленная цель достигается за счет использования соединение нуфлеина бисангидродигидрохлорида формулы I

C30H40N2C12 Мм 563,6

обладающего избирательной, цитотоксической активностью на клетки рака шейки матки человека.

Нуфлеина бисангидродигидрохлорид формулы 1 по эффективности в 100 раз превосходящей зарубежный цисплатин, используемый для тех же целей. Механизм цитотоксической активности нуфлеина бисангидродигидрохлорида связан с разобщением окислительного фосфорилирования в митохондриях, индукцией митохондриального пути апоптоза.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение Нуфлеина бисангидродигидрохлорида

Нуфлеин получают известным способом, заключающимся в экстракции сырья, извлечении алкалоидов и получении гидрохлоридов насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом. Полученный препарат «Лютенурин» растворяют в растворе хлороформа, который обрабатывают предпочтительно 10% раствором хлористоводородной кислоты. Образовавшиеся хлоргидраты алкалоидов распределяются по растворимости между хлороформом и водно-кислыми солями, в результате до 45% хлоргидратов побочных алкалоидов остаются в хлороформе, а нуфлеин с сопутствующими алкалоидами целиком переходит в кислые растворы, которые после подщелачивания экстрагируют хлороформом. Остаток после упаривания в вакууме хроматографируют на колонке с силикагелем (в качестве элюента используют хлороформ), отбирают нуфлеинсодержащие фракции, упаривают их, растворяют в диэтиловом эфире, из которого целевой продукт извлекают 5% раствором хлористоводородной кислоты. Кислые растворы обрабатывают раствором перхлората натрия, получают перхлорат нуфлеина, кристаллизуют и проверяют его чистоту, затем получают бисангидродихлорид нуфлеина.

Чистота полученной субстанции нуфлеина бисангидродихлорида подтверждается отсутствием в спектре 1Н ЯМР сигналов от других веществ (см. Рис. 1).

Пояснение к Рис. 1

В 1H ЯМР-спектре (Рис. 1) раствора нуфлеина в смеси растворителей бензол : хлороформ : трифторуксусная кислота (2:1:3) химические сдвиги сигналов имеют следующие значения (в м.д.): 0,69 и 0,67 дублеты 3Н (1,1' метальные группы), 2,47 и 2,62 (дублеты 2J=15,2 Гц) - протоны метиленовой группы в пятичленном кольце в β-положении к атому серы, 2,76 и 3,11 (дублеты J=12,3 Гц) - протоны метиленовой группы в α-положении к атому серы; 3,44 (2Н) мультиплеты с уширенными компонентами - протоны в положениях 1 и 1', уширенные синглеты 4,11, 4,17, 4,75 и 4,80 относятся к протонам 10,10' и 4, 4' соответственно. В фурановых кольцах сигналы 6,26 и 6,36 м.д. (β-протоны фурановых колец), 7,30 (2Н), 7,38, 7,52 и 7,58 м.д. (α-протоны фурановых колец), 7,58 и 7,83 м.д. (протоны иммониевого фрагмента).

Пример 2. Определение цитотоксической активности нуфлеина

Цитотоксическую активность нуфлеина бисангидродихлорида оценивали на культурах опухолевых клеток и нормальных клеток. В качестве модели опухолевых клеток использовали клетки рака шейки матки человека HeLa, чувствительные к цитостатикам. Данная клеточная культура является стандартным объектом оценки цитотоксического действия противоопухолевых соединений (Федеральное руководство по доклиническому испытанию лекарственных средств, 2014). В качестве нормальных клеток использовали быстроделящиеся фибробласты кожи крыс. Влияние нуфлеина бисангидродихлорида на параметры энергообеспечения клетки исследовали на изолированных митохондриях, полученных из печени крыс. Цитотоксическую активность нуфлеина бисангидродихлорида и препарата сравнения цисплатина определяли спектрофотометрическим методом МТТ. Клетки HeLa инкубировали при 37°С, в условиях 5% СО2 в стандартной культуральной среде DMEM и 10% эмбриональной телячьей с исследуемыми веществами в диапазоне концентрации 10-7-10-4 M в течение 48 ч, после чего в культуральную среду на 3 ч вносился 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ) до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Затем жидкость из лунок удаляли и вносили по 150 мкл диметилсульфоксида на 30 мин. МТТ восстанавливается за счет действия дегидрогеназ живых клеток до водонерастворимых кристаллов формазана. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях) и характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках и может быть использовано в качестве критерия цитотоксического действия изучаемых соединений. Оптическую плотность образцов регистрировали при длине волны 530 нм на анализаторе иммуноферментных реакций "УНИПЛАН" АИФР-01 (Россия). Оптическую плотность контрольных образцов принимали за 100% выживаемость клеток.

Показано, что нуфлеина бисангидродихлорид обладает цитотоксическим действием, в 100 раз превышающим цитотоксический эффект Цисплатина. Так, IC50 - концентрация, вызывающая 50% гибель клеток, - для цисплатина составила 6,2*10-6 М, а для нуфлеина - 2,89*10-8 M (см. Рис. 2). На Рис. 2 представлено влияние нуфлеина бисангидродихлорида на жизнеспособность опухолевых клеток линии HeLa, инкубация 48 ч.

На нормальные, трансформированные фибробласты кожи крыс нуфлеина бисангидродихлорид оказывал почти в 100 раз менее выраженное цитотоксическое действие, чем на опухолевые клетки (см. Рис. 3. Влияние нуфлеина бисангидродихлорида на жизнеспособность фибробластов кожи крыс).

Механизмы цитотоксического действия нуфлеина бисангидродихлорида связаны с действием на митохондрии - ключевые клеточные органеллы, участвующие как в процессах энергообеспечения клетки, так и в процессах апоптоза.

Митохондрии получали из печени взрослых крыс-самцов линии Wistar стандартным методом дифференциального центрифугирования [Fedotcheva N.I., Teplova V.V., Fedotcheva Т.А., Rzheznikov V.M., Shimanovskii N.L. Effect of progesterone and its synthetic analogues on the activity of mitochondrial permeability transition pore in isolated rat liver mitochondria // Biochemical Pharmacology. 2009. V. 78. No 8. P. 1060-1068]. Печень гомогенизировали в ледяном 10 мМ HEPES-Tris (рН 7.4) буфере, содержащем 220 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 1 мМ ЭГТА. Гомогенат центрифугировали при 600 g в течение 7 мин и 4°С, затем супернатант центрифугировали при 9,000 g в течение 10 мин для получения осадка с митохондриями. Митохондрии дважды промывали вышеуказанным буфером без ЭГТА. Конечный митохондриальный осадок суспендировали в промывочном буфере до получения 60-80 мг белка/мл. Митохондрии инкубировали в среде, содержащей 120 мМ KCl, 1.5 мМ KH2PO4, 10 мМ HEPES (рН 7.25). Контрольные пробы с растворителем проводились в каждой серии экспериментов.

Влияние нуфлеина бисангидродихлорида на индукцию митохондриальной поры ионами кальция определяли с помощью селективных электродов для измерения мембранного потенциала и кальциевой емкости митохондрий. Определение кальциевой емкости основано на измерении концентрации Са2+, требуемой для необратимого снижения мембранного потенциала и выхода ионов кальция из митохондрий при последовательных добавках Са2+ в концентрациях 20-50 мкМ. Митохондрии инкубировали в среде, содержащей 120 мМ KCl, 1.5 мМ KH2PO4, 10 мМ HEPES (рН 7.25). Концентрация ТРР+ в кювете составляла 1 мкМ. Все измерения проводили при постоянном перемешивании в термостатируемой кювете объемом 1 мл при 26°С.

На изолированных митохондриях печени крыс показано, что нуфлеина бисангидродихлорид (20-50 мкМ) вызывает разобщение окислительного фосфорилирования - митохондрии поглощают кислород, но при этом синтез АТФ не происходит. Кроме того, нуфлеина бисангидродихлорид индуцирует открытие митохондриальной поры, что в дальнейшем сопровождается выходом цитохрома С из митохондрий и индукцией апоптоза. В концентрациях 20-50 мкМ нуфлеина бисангидродихлорид ингибирует дыхание митохондрий.

Заявляемое соединение - нуфлеина бисангидродихлорид - обладает высокой цитостатической активностью в отношении клеток рака шейки матки человека, превосходящей активность цисплатина. В отношении нормальных клеток нуфлеин проявляет умеренное (в 1000 раз меньшее) цитотоксическое действие, что очень ценно для повышения избирательности химиотерапии опухолей. В механизме цитотоксического действия нуфлеина присутствует апоптотический компонент и ингибирование дыхания митохондрий. В настоящее время проходят клинические испытания нуфлеина.

Применение соединения Нуфлеина бисангидродигидрохлорида формулы I

,

обладающего избирательной, цитотоксической активностью на клетки рака шейки матки человека.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к соединениям формулы I, где R1 выбирают из соединений (1), (2), (3), которые применяют для изготовления и доставки конъюгированных группировок, таких как малые молекулы, пептиды, нуклеиновые кислоты, флуоресцентные группировки и полимеры, сшитых с антагонистами интегрина LFA-1, для нацеленной доставки к клеткам, экспрессирующим LFA-1.

Изобретение относится к соединениям формулы I, где R1 выбран из группы, состоящей из соединений формулы (1), формулы (2), формулы (3), для изготовления и доставки конъюгированных молекул, таких как низкомолекулярные вещества, пептиды, нуклеиновые кислоты, флуоресцирующие молекулы и полимеры, которые связаны с антагонистами интегрина VLA-4, к клеткам-мишеням, экспрессирующим VLA-4.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкогинекологии, и может быть использовано для лечения неоперабельных асцитных форм рака яичников. Для этого больным с неоперабельной III-IV стадией рака яичников после удаления асцитической жидкости в брюшную полость вводят дренаж, затем внутрибрюшинно вводят рекомбинантный интерферон-гамма в 1 день 500 тыс.

Группа изобретений относится к фармации и онкотерапии. Предложено: фармацевтическая комбинация для лечения меланомы, содержащая: (a) 2-амид 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилэтил)пиридин-4-ил]тиазол-2-ил}амида) (S)-пирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты (соединение А) или его фармацевтически приемлемую соль; и (b) по меньшей мере один ингибитор Hsp90, представляющий собой этиламид 5-(2,4-дигидрокси-5-изопропилфенил)-4-(4-морфолин-4-илметил-фенил)изоксазол-3-карбоновой кислоты (AUY922), или его фармацевтически приемлемую соль; применение указанной комбинации для получения лекарственного средства для лечения меланомы и соответствующий способ лечения меланомы.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения люминального подтипа рака молочной железы N1 в постменопаузальном периоде.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и онкологии, и может быть использовано для селективной химиоэмболизации опухолей поджелудочной железы. Для этого диагностический катетер устанавливают в проксимальный отдел гастродуоденальной артерии по предварительно заведенному проводнику.

Данное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен конъюгат антитела против 5Т4 или его антигенсвязывающего фрагмента с монометилауристатином F (MMAF), связанных через малеимидокапроил; и его фармацевтически приемлемая соль.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его связывающему фрагменту, где антитело или его связывающий фрагмент специфически связывают белок CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, ДНК его кодирующей, а также к фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, и к конъюгату, способному специфически связывать белок CAPRIN-1.

Изобретение относится к биохимии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную цепь, способную формировать димерный белок, и к указанному димерному белку.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к лекарственному препарату для лечения или профилактики рака, экспрессирующего белок CAPRIN-1. Также раскрыт способ лечения или профилактики рака, экспрессирующего белок CAPRIN-1.

Изобретение относится к способу получения бетаинов морфолин-4-илпропиламидов жирных кислот растительных масел формулы I , которые могут быть применены в качестве антимикробных и пенообразующих агентов в моющих композициях.

Изобретение относится в области нанотехнологии и пищевой промышленности. Описан способ получения нанокапсул семян чиа (ядро) в оболочке из каррагинана.

Изобретение относится к способу получения нанокапсул семян чиа в конжаковой камеди. Указанный способ характеризуется тем, что порошок семян чиа медленно добавляют в суспензию конжаковой камеди в бензоле, в присутствии 0,01 г Е472с в качестве поверхностно-активного вещества, затем перемешивают при 1000 об/мин, далее приливают бутилхлорид, после чего полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:1 или 1:3.

Изобретение относится к способу получения нанокапсул семян чиа в альгинате натрия. Указанный способ характеризуется тем, что в качестве оболочки нанокапсул используют альгинат натрия, при этом порошок семян чиа медленно добавляют в суспензию альгината натрия в бензоле в присутствии 0,01 г Е472с в качестве поверхностно-активного вещества, затем перемешивают при 1000 об/мин, далее приливают четыреххлористый углерод, после чего полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:1 или 1:3.

Изобретение относится к способу получения нанокапсул унаби в геллановой камеди. Указанный способ характеризуется тем, что 500 мг порошка ягод унаби диспергируют в суспензию 1,5 г геллановой камеди в бутаноле в присутствии 0,01 г препарата Е472с в качестве поверхностно-активного вещества при перемешивании 1300 об/мин, затем приливают 10 мл метиленхлорида, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и касается терапевтического средства для профилактики и лечения заболеваний пародонта, ухода за зубами и полостью рта.

Изобретение относится к солнцезащитному косметическому средству в виде эмульсии типа «вода в масле», содержащему следующие ингредиенты (а), (b), (с) и (d) во внешней фазе, а также (е), (f) и (g), но не содержащему октилметоксициннамат, октокрилен или авобензон, где (е) представляет собой поверхностно-активное вещество, являющееся сополимером полиоксиэтилена и метилполисилоксана, кристаллы ингредиента (а) имеют не коническую форму, а представляют собой почти сферические агрегаты, и общее количество ингредиентов (а) и (с) в смеси составляет от 16 до 25 мас.%: a) от 5 до 15 мас.% гидрофобизированного кристаллического диоксида титана типа рутила, имеющего средний размер частиц от 30 до 80 нм, b) от 0,1 до 10 мас.% оксида железа, c) от 5 до 15 мас.% гидрофобизированного оксида цинка, имеющего средний размер частиц от 20 до 80 нм, d) от 0 до 1,0 мас.% диоксида титана для белого пигмента, имеющего средний размер частиц 180 нм или более, e) от 0,5 до 4 мас.% поверхностно-активного вещества, f) от 5 до 30 мас.% воды, g) от 15 до 45 мас.% масла.

Изобретение относится к медицине, стоматологии, а именно к средствам для лечебно-профилактического ухода за слизистой десен и полости рта. Предлагаемый лечебно-профилактический стоматологический материал в виде пластин включает биологически активные вещества, мирамистин, аскорбиновую кислоту и биосовместимый полимер.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики и реабилитации детей школьного возраста с железодефицитным состоянием.

Изобретение относится к медицине, а именно к физиотерапии, и может быть использовано для комбинированного медикаментозного и бальнеологического лечения заболеваний суставов.

Изобретение относиться к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения экстракта из лишайников рода Cladonia Hill ex P. Browne, смеси лишайниковых кислот и лихенинов, обладающего бактерицидными свойствами. Способ получения экстракта из лишайника рода Cladonia, обладающего бактерицидными свойствами, включает очистку лишайника от механических примесей, измельчение слоевища лишайника, настаивание с карбонатом натрия, кипячение раствора, фильтрацию, при этом измельченную до порошкообразного состояния лишайниковую массу заливают 10-кратным по отношению к массе объемом 96% этилового спирта и кипятят в течение 1 часа, после чего полученный раствор охлаждают и засыпают измельченным карбонатом натрия в количестве, равном количеству измельченной лишайниковой массы, затем раствор настаивают в течение 5 часов при температуре 5-7°С, после настаивания раствор нагревают до кипения и фильтруют в горячем виде. Вышеописанный способ является исчерпывающим и позволяет получить экстракт с высокими бактерицидными свойствами. 3 табл.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2015-12-09 2017-07-12T21:26:12
Наверх