Сайт-специфически монопегилированные аналоги эксендина и способ их получения

Авторы патента:


Сайт-специфически монопегилированные аналоги эксендина и способ их получения
Сайт-специфически монопегилированные аналоги эксендина и способ их получения
Сайт-специфически монопегилированные аналоги эксендина и способ их получения
Сайт-специфически монопегилированные аналоги эксендина и способ их получения
Сайт-специфически монопегилированные аналоги эксендина и способ их получения
Сайт-специфически монопегилированные аналоги эксендина и способ их получения
C07K1/06 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2625015:

Шанхай Бенемае Фармасьютикал Корпорэйшн (CN)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к сайт-специфически монопегилированному аналогу эксендина, и может быть использовано в медицине. Использование более стабильной защитной группы Dde (N-α-1-(4,4-диметил-2,6-диоксо-циклогексилен)) на стадии синтеза аналога эксендина позволяет избежать побочных реакций полипегилирования белка, не предотвращаемых нестабильными защитными группами. Изобретение позволяет достигнуть высокого выхода монопегилированного аналога эксендина при низком реакционном молярном соотношении по сравнению с известными методами получения производных такого рода. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к сайт-специфически монопегилированным аналогам эксендина, способу получения и применению в фармацевтических целях.

Уровень техники

В 1960-х годах McIntyre and Elrick et al. обнаружили "инкретиновый эффект", заключающийся в том, что пероральное введение глюкозы вызывает значительно большее увеличение секреции инсулина, чем ее внутривенное вливание. Дальнейшие исследования, проведенные Perley et al., показали, что "инкретиновый эффект" обеспечивает более 50% постпрандиального высвобождения инсулина. В 1986 году Nauck et al. обнаружили ослабление "инкретинового эффекта" у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа (СД 2, type 2 diabetes mellitus (T2DM)), которое указывает на то, что нарушение в инкретиновой системе может являться одним из проявлений патогенеза T2DM.

Инкретины представляют собой вырабатываемые в кишечнике и зависящие от концентрации глюкозы гормоны, включающие в себя глюкагоноподобный пептид (ГПП-1; glucagon-like peptide-1 (GLP-1)) и глюкозозависимый инсулинотропный пептид (ГИП; glucose-dependent msulinotropic peptide (GIP)), которые могут стимулировать секрецию инсулина после приема пищи. По-видимому, GLP-1 играет более важную роль для разработки стратегий терапевтического лечения T2DM. GLP-1 стимулирует секрецию инсулина, необходимого для контроля уровня сахара в крови, одновременно он стимулирует пролиферацию островковых (3-клеток, предотвращает апоптоз β-клеток, ингибирует высвобождение глюкагона, двигательную активность желудочно-кишечного тракта и желудочную секрецию, задерживает опорожнение желудка, обуславливает ощущение сытости и понижает аппетит. Однако GLP-1 быстро разлагается дипептидилпептидазой 4-го типа (ДПП-4; dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV)) in vivo в силу короткого периода полураспада, составляющего от 1 до 2 минут. Вследствие этого его применение и разработка ограничены.

Эксендин-4 (Exendin-4), выделенный из слюны ящерицы Heloderma suspectum, представляет собой аналог GLP-1, имеющий 39 аминокислот, 53% которых схожи с соответствующими аминокислотами последовательности GLP-1. Подобно GLP-1, он может связываться с рецептором GLP-1, стимулируя секрецию инсулина, снижая концентрацию глюкозы в крови как натощак, так и после еды с целью лечения T2DM. Находящийся во втором положении с N-конца аминокислотный остаток GLP-1 представляет собой аланин, который в эксендине-4 замещен глицином. Это придает эксендину-4 устойчивость к разрушению дипептидазой (DPP-IV) in vivo, продлевая период полураспада от 1-2 минут до от 2 до 4 часов. В силу этого на основе эксендина-4 были разработаны зарегистрированные продукты, вводимые дважды в день (Byetta, Amylin Corporation).

Однако, частые инъекции приводят к несоблюдению режима пациентом, что побуждает к дальнейшим исследованиям с целью получения лекарственных препаратов с постепенным высвобождением. Например, лираглутид (liraglutide (NN-2211)) разработан компанией Novo Nordisk, и его вводят один раз в день; эксенатид-LAR (Exenatide LAR) (заключенный в микросферы из поли(лактид-когликолид)-глюкозного полимера (PLGA)) разработан компанией Amylin, и его вводят один раз в неделю. Таким образом, исследования и разработки препаратов пролонгированного действия или неинъекционных препаратов приобретают все большую актуальность.

Наиболее широко изучаемый и применяемый метод, используемый в технологии приготовления лекарственного средства для получения терапевтического пептида/белка пролонгированного действия, представляет собой пегилирование. Активированные производные полиэтиленгликоля (ПЭГ; polyethylene glycol (PEG)) взаимодействуют с определенными доступными аминокислотными остатками терапевтически значимых белков с образованием новых молекул. Наиболее полно изученной и широко применяемой технологией получения применяемых в медицине белков и пептидов пролонгированного действия является технология пегилирования, посредством которой могут образовываться новые молекулы в результате взаимодействия между активированным полиэтиленгликольным реагентом и определенными аминокислотными остатками пептида или белка. Полиэтиленгликоль в качестве своего рода водорастворимой макромолекулярной структуры может придавать следующие признаки белку/пептиду: (1) улучшение растворимости лекарственного средства; (2) снижение иммуногенности; (3) удлинение периода полураспада в крови благодаря уменьшению почечного клиренса. Данные признаки способствуют продлению действия лекарственного средства и улучшению состояния пациента.

В целом, технология пегилирования позволяет взаимодействие активированных производных PEG с активными остатками (в порядке активности, сульфгидрильными группами, аминогруппами, карбоксильными группами, и т.д.) пептида или белка с образованием пегилированного продукта со стабильной химической связью. Однако, наличие многочисленных активных остатков приводит к получению смеси различных монопегилированных продуктов, пегилированных по различным остаткам. Более того, в условиях высокого молярного соотношения PEG к пептиду или белку и непрерывной реакции могут образовываться полипегилированные соединения, и это может существенно влиять на активность и эффективность лекарственного средства in vivo. Помимо этого, контроль качества полипегилированных продуктов представляет собой трудную задачу. Таким образом, зарегистрированные пегилированные препараты, в основном, являются монопегилированными.

Поскольку позиция, по которой происходит монопегилирование, существенно влияет на активность пептидных или белковых лекарственных средств, необходимо получение монопегилированного продукта с оптимально выбранным активным сайтом.

Существующие технологии сайт-специфического пегилирования относятся к одному из двух типов:

Технологии первого типа сводятся к контролю количества реакционно-способных остатков в структуре. Широко используемый подход заключается в мутировании по оптимально выбранному положению или в добавлении цистеина синтетическим способом, с последующим присоединением реакционноспособного по отношению к сульфгидрильной (меркапто) группе производного PEG (например, пегилированного малеимида) к цистеину. Однако i) данный способ изменяет структуру лекарственного средства, приводя к неопределенности в том, что касается эффективности и токсичности лекарственного средства; ii) введение цистеина может повлиять на стабильность белка, поскольку цистеин может быть легко окислен. В других подходах в качестве сайта пегилирования рассматривается аминогруппа лизинового остатка, при этом лизиновые остатки, за исключением определенного остатка, который должен вступать в реакцию, замещаются остатками аргинина, имеющего основной характер. Данный подход также существенно влияет на эффективность и токсичность лекарства, что обусловлено структурными изменениями. Автор настоящей заявки экспериментально показал, что такое структурное изменение значительно изменило эффект терапевтического пептида.

Технологии второго типа заключаются в модификации N-концевой аминогруппы с использованием производного полиэтиленгликоль-пропиональдегида в кислой среде. Некоторые исследователи обнаружили, что величина рКа для N-концевых аминогрупп меньше, чем для аминогруппы лизинового остатка, т.е. последняя имеет более сильный основной характер. Таким образом, пегилирование аминогруппы лизинового остатка необходимо проводить в щелочной среде (рН 7-8), в то время как пегилирование N-концевой аминогруппы необходимо проводить в кислых условиях (рН 5-6), при которых аминогруппы лизинового остатков не вступают в реакцию. Соответственно, некоторые исследователи предлагали проводить сайт-специфическое пегилирование N-концевых аминогрупп в кислых условиях. Однако, данный подход имеет два недостатка: во-первых, он не может быть применен, если активный сайт находится на N-конце; во-вторых, с учетом молярного соотношения производного PEG к пептиду или белку, достигающего 5 или 10, выход составляет только от 50% до 60%, что приводит к высокой стоимости и невозможности производства.

PEG-малеимид, не имеющий цистеинового остатка, не может быть использован для модификации аналога эксендина-4 с использованием сайт-специфического пегилирования; а наличие активного сайта на N-конце (см. British Journal of Pharmacology, 2003, 140, 339-346) делает невозможным сайт-специфическое пегилирование на N-конце с использованием полиэтиленгликоль-пропиональдегида.

Аналоги эксендина-4 содержат не более четырех лизиновых остатков, т.е всего 5 потенциальных реакционных сайтов, если учитывать N-концевую аминогруппу. Следовательно, когда для модификации аминогрупп боковой цепи аналогов эксендина-4 используется полиэтиленгликоль-сукцинимидное производное, способ будет неизбежно приводить к образованию смеси полипегилированных и монопегилированных продуктов. В такой смеси только одно соединение является лучшим активным целевым продуктом.

Youn et al. предложили способ защиты аминогрупп, участие которых в реакции нежелательно, с использованием Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонильной группы) (Biocomjugate Chem, 2007, 18, 500-506). Однако, такой подход имеет существенный недостаток, который заключается в том, что защитная группа Fmoc очень легко отваливается в щелочной среде. Действительно, во многих экспериментах по пептидному синтезу используется основание (20% пиперидин) для удаления защитных групп Fmoc. Пегилирование аминогруппы в аналогах эксендина-4 может происходить в определенной щелочной среде. Данная противоречивость условий приводит к тому, что в щелочных условиях защитная группа Fmoc очень легко отваливается при пегилировании пептидов, защищенных Fmoc, и при этом неизбежно получают значительное количество полипегилированных побочных продуктов.

Поэтому существует необходимость обеспечения способа получения сайт-специфически монопегилированных аналогов эксендина-4.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к созданию способа получения сайт-специфически монопегилированных аналогов эксендина и к сайт-специфически монопегилированным аналогам эксендина, получаемых упоминаемым способом.

Для достижения указанной задачи изобретения настоящее изобретение предлагает способ получения сайт-специфически монопегилированного аналога эксендина, который содержит следующие стадии:

(1) Синтез пептидных исходных материалов аналогов эксендина-4.

Некоторые лизиновые остатки пептида защищают защитной группой Dde, где Dde представляет собой N-α-1-(4,4-диметил-2,6-диоксо-циклогексил-илиден);

(2) Реакцию между пептидным материалом и полиэтиленгликольным реагентом проводят в органическом растворителе основного характера, в результате чего происходит связывание лизиновых остатков, не защищенных Dde, с полиэтиленгликольной группой;

(3) Удаление защитной группы продукта, полученного на стадии (2).

После выделения и очистки получают пегилированный аналог эксендина. В способе, раскрытом в настоящем изобретении, в качестве защитной группы используют Dde, которая имеет большую устойчивость к щелочной среде, чем Fmoc, что позволяет избегать полипегилирования и появления различных побочных продуктов, обусловленных нестабильностью (отваливанием) Fmoc. Таким образом, количество побочных продуктов значительно снижается, и это делает возможным крупномасштабное производство.

В соответствии с раскрытым способом пептидный исходный материал должен иметь лизиновый остаток, не защищенный Dde, по меньшей мере в одном местоположении для обеспечения соединения с полиэтиленгликольной группой, предпочтительно лизиновый остаток, не защищенный Dde, только в одном местоположении для облегчения получения сайт-специфически монопегилированного аналога эксендина. В соответствии с раскрытым способом N-конец пептида может быть защищен защитной группой Dde или защитной группой Fmoc. С точки зрения фармацевтической чистоты, N-конец, защищенный Dde; лучше, однако с точки зрения стоимости, допустим выбор Fmoc для защиты N-конца, поскольку проведение реакции показало, что при наличии N-конца, защищенного Fmoc, не образуется слишком больших количеств полипегилированных аналогов эксендина.

Например, в соответствии с раскрытым способом конкретный пептидный исходный материал может иметь следующую структуру:

(X) His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y1-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y2-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Y3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Y4,

в которой Х представляет собой Fmoc или Dde, Z представляет собой Leu или Ile; Y1-Y4 представляет собой Lys или (Dde) Lys, и по меньшей мере один из Y1-Y4 представляет собой Lys; предпочтительно среди Y1-Y4 только один из Y2-Y4 представляет собой Lys, остальные остатки представляют собой (Dde) Lys; более предпочтительно, Y2 представляет собой Lys, Y1, Y2 и Y4 представляют собой (Dde) Lys.

Тем не менее, настоящее изобретение не имеет ограничения по получению пегилированных аналогов эксендина, имеющих приведенную выше последовательность; среди всех аналогов эксендина, включая аналоги эксендина-4, при условии, что имеется более одного лизинового остатка в аминокислотной последовательности (по меньшей мере два лизиновых остатка), способ по настоящему изобретению является подходящим для получения монопегилированного аналога эксендина. В настоящем изобретении применяется пептид, имеющий четыре лизиновых остатка, для получения монопегилированных аналогов эксендина, поскольку структура аналогов эксендина с четырьмя лизиновыми остатками является относительно сложной. Способ по настоящему изобретению является подходящим для получения всех пегилированных аналогов эксендина, что раскрыто заявителем в китайской заявке на патент CN 101125207А. Содержания, раскрытые в CN 101125207А, интегрированы в настоящую заявку.

Согласно способу продукции по настоящему изобретению молекулярная масса (MW) производного PEG (пегилированного производного) составляет от 20,000 до 60,000 Da. Дополнительно, полиэтиленгликоль, молекула которого имеет разветвленные структуры, раскрытые в CN 101125207А, может быть использован в соответствии со способом по изобретению.

Например, один вариант осуществления настоящего изобретения заключается в следующем:

Приготовление и очистка сайт-специфически монопегилированного аналога эксендина-4 в соответствии со следующими процедурами:

1. Синтез аналога эксендина-4 с защитными группами

Если пегилирование происходит по N-концевой аминогруппе, синтезируется аналог эксендина-4 следующей структуры с защитными группами:

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde) Lys

Если пегилирование происходит по боковой цепи аминогруппы Lys 12, синтезируется аналог эксендина-4 следующей структуры с защитными группами:

(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys или

(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;

Если пегилирование происходит по боковой цепи аминогруппы Lys20, синтезируется аналог эксендина-4 следующей структуры с защитными группами:

(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys или

(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;

Если пегилирование происходит по боковой цепи аминогруппы Lys27, синтезируется аналог эксендина-4 следующей структуры с защитными группами:

(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys или

(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;

Если пегилирование происходит по боковой цепи аминогруппы Lys40, синтезируется аналог эксендина-4 следующей структуры с защитными группами:

(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys или

(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser-Lys;

2. Аналоги эксендина-4, имеющие защитные группы, и производное PEG, имеющее MW от 20,000 до 60,000 Da с определенным молярным соотношением (предпочтительно PEG-NHS-эфир (ПЭГ-N-гидросукцинимид) Y-типа (разветвленный) с молекулярной массой 40 кДа), растворяют в соответствующем количестве органического растворителя (предпочтительно в диметилсульфоксиде (ДМСО;

DMSO)). После полного растворения добавляют органическое основание, которое не взаимодействует с производным PEG, до защелачивания среды. Для этого необязательно могут использоваться такие реагенты как триэтиламин (TEA), диизопропилэтиламин (DIEA), 4-диметиламинопиридин (DMAP), 2,4,6-триметил-пиридин (colidine), лутидин (lutidine), пиридин (pyridine) и т.д.

3. Реакцию пегилирования проводят выдерживая систему раствора при определенной температуре (не более 40°С) в течение некоторого времени. В дальнейшем, достаточные количества реагентов (предпочтительно гидразин-гидрата) добавляют для удаления защитных групп Fmoc и Dde. Все защитные группы удаляют при определенной температуре (менее 40°С) в течение некоторого времени.

4. Конечный реакционный раствор разбавляют в 10 раз очищенной водой, и рН немедленно доводят до 5,0-6,0, используя соляную кислоту или уксусную кислоту для обеспечения стабильности образца. Затем используют наполнитель SOURCE 30RPC и водную смесь, содержащую 20 ммоль уксусной кислоты:ацетонитрила, или водно-этанольную смесь для обеспечения выделения и очистки целевого пегилированного аналога эксендина-4 с использованием способа линейного градиентного элюирования.

5. Дополнительно, проводится очистка целевых соединений (содержащих некоторые количества органического растворителя, ацетонитрила или этанола), полученных на последней стадии, с использованием катионообменной смолы, 10 ммоль буферного раствора цитрата, 1,5 М NaCl, для удаления органического растворителя способом градиентного элюирования.

6. Проводится ультрафильтрация пегилированного аналога эксендина-4, полученного на стадии 5, с использованием ультрафильтрационной мембраны 10KD. Хроматографию на молекулярных ситах используют для обессоливания с очищенной водой. После лиофилизации полученного водного раствора пегилированных аналогов эксендина-4 получают первичные продукты пегилированного аналога эксендина-4.

Для достижения задачи настоящего изобретения обеспечивается пегилированный аналог эксендина, полученный вышеупомянутым способом. Для достижения задачи настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к пегилированному аналогу эксендина, где аналог эксендина имеет следующую последовательность:

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys,

в которой Z представляет собой Leu (SEQ ID NO:1) или Не (SEQ ID NO:2) и аминогруппа одного лизинового остатка соединена с полиэтиленгликолем.

Предпочтительно, в вышеописанной последовательности аминогруппа остатка Lys20 или остатка Lys27 соединена с полиэтиленгликолем.

Для достижения задачи настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к применению при лечении диабета или ожирения с использованием пегилированных аналогов эксендина.

В соответствии со способом по настоящему изобретению группа Dde используется в качестве защитной группы более высокой стабильности, позоляющей избегать полипегилирования, обусловленного нестабильностью группы Fmoc, достижения низкой стоимости и высокого выхода аналога эксендина с низким молярным соотношением реагентов. Пегилированные аналоги эксендина по настоящему изобретению представляют собой сайт-специфически монопегилированные аналоги эксендина и имеют низкое содержание побочных продуктов, что помогает избежать появления различных побочных эффектов, вызванных побочными продуктами.

Для более подробного описания изобретения прилагаемые чертежи используются для описания конкретного варианта осуществления с помощью конкретных способов реализации. Однако, настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления.

Краткий перечень фигур

На фигуре 1 представлен MALDI-TOF масс-спектр сайт-специфически защищенного аналога эксендина-4;

На фигуре 2 представлены хроматограммы ВЭЖХ до и после пегилирования сайт-специфически защищенного аналога эксендина-4;

На фигуре 3 представлена хроматограмма очистки пегилированного аналога эксендина-4 посредством SOURCE;

На фигуре 4 представлена хроматограмма очистки пегилированного аналога эксендина-4 с помощью катионообменной хроматографии на сульфопропильной смоле (SP);

На фигуре 5 представлена хроматограмма обессоливания пегилированного аналога эксендина-4 способом молекулярных сит;

На фигуре 6 показано действие монопегилированного HYBR-003-PEG при внутрибрюшинном введении мышам С 5 7 BL/6 в тесте на толерантность к глюкозе (n равно 8), в котором а Р<0,01 по сравнению с плацебо, b P 0,01 по сравнению с контролем.

Осуществление изобретения

Пример 1

(1) Аминокислотные мономеры, используемые в синтезе

Fmoc-His (Trt)-OH, Dde-His (Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu)-OH, Fmoc-Thr (TBU)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser (TBU)-OH, Fmoc-Asp (OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Lys (Dde)-OH, Fmoc-GIn (Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp (Boc)-OH, Fmoc-Asn (Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys (Trt)-OH

Аббревиатура, использованная выше: Fmoc 9-флуоренил-метоксикарбонил; Вое трет-бутоксикарбонильная группа; Trt тритил; OtBu трет-бутокси; Tbu трет-бутил; Dde N-[1-(4,4-диметил-2,6-диоксо-циклогексилен)

(2) Реагенты: N, N-диизопропилэтиламин, диизопропилкарбодиимид (DIC), N,N-диметилформамид (DMF), дихлорметан, гексагидропиридин, 1-гидроксибензотриазол триазол (HOBt), смола Rink Amide, нингидрин, метанол, триизопропилсилан, трифторуксусная кислота.

(3) Проведение эксперимента

А. Синтез: как показано в пересчете на 0,25 ммоль, последовательность синтезировали от С-конца к N-концу в реакторе в присутствии 0,5 г смолы Rink Amide и 1 ммоль аминокислоты, которая была активирована способом DIC/HOBt. Реакцию проводили при комнатной температуре, составлявшей 25°С, и эксперимент осуществляли следующим образом:

1. Защитную группу Fmoc удаляли с использованием 20% раствора пиперидина в DMF, 10 минут на каждый эксперимент;

2. Промывали три раза, используя 10 мл DMF, процеживали;

3. Защищенную аминокислоту (1 ммоль) и HOBt (1 ммоль) растворяли в 10 мл DMF, добавляли DIC (1 ммоль) для активации в течение 10 минут;

4. Раствор активированной аминокислоты добавляли в реактор, встряхивая в течение 1 часа;

5. Промывали три раза DMF и процеживали;

6. Если нингидриновая реакция была отрицательной, то следовало продолжить повторение стадий 1-5;

Если нингидриновая реакция была положительной, повторение стадий 3-5.

После завершения синтеза пептидной цепи промыть смолу метанолом и высушить ее.

В. Удаление защитной группы и отрезание лишнего участка пептида

1 г смолы с присоединенным к ней пептидом добавляли в реактор и затем добавляли лизирующий раствор (соотношение: 2 мл анизола, 2 мл метанола, 2 мл триизопропилсилана и 6 мл трифторуксусной кислоты).

Образец встряхивали в течение 2 часов при комнатной температуре. После фильтрации собирали фильтрат. Смолу промывали небольшим количеством уксусной кислоты. Собранные образцы объединяли и концентрировали. Диэтиловый эфир добавляли к осадку, после фильтрования осадка образец промывали небольшим количеством диэтилового эфира, и тогда получали неочищенный продукт.

С. Образцы разделяли и очищали препаративной ВЭЖХ и лиофилизировали.

Полученный неочищенный продукт растворяли в небольшом количестве 10% раствора уксусной кислоты, наносили на колонку, очищали с помощью препаративной ВЭЖХ и затем лиофилизировали. С помощью масс-спектрометрии подтверждали, что полученные пептиды являются требуемыми соединениями.

Хроматографическая колонка: Boston С 18, 5 мкм, 100А, длина волны 214 нм. Waters preparative ВЭЖХ

Градиент: 10% 0,05% TFA/CAN-45% 0,05% TFA/CAN 20 минут, 45% 0,05% TFA/CAN 10 мин.

На фигуре 1 представлен MALDI-TOF масс-спектр сайт-специфически защищенного аналога эксендина-4

Пример 2

Способ пегилирования сайт-специфически защищенного аналога эксендина-4

В настоящем варианте осуществления используются стандартные производные PEG, несущие аминогруппу, такие как (SC-PEG, SS-PEG, NHS-PEG и т.д.), для связывания и модифицирования единственной свободной аминогруппы боковой цепи, которая может быть пегилирована в молекуле аналога эксендина-4, где производное PEG предпочтительно выбрано из NHS-PEG типа Y с молекулярной массой 40 кДа, и сайт-специфически защищенный аналог эксендина-4 представляет собой:

(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys или

(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-S er-Lys.

2 г сайт-специфически защищенного аналога эксендина-4 и 26 г NHS-PEG типа Y с молекулярной массой 40 кДа (с молярным соотношением по отношению к пептиду, составляющим около 1,5:1) растворяли в 400 мл DMSO, затем непрерывно перемешивали при 40°С. После полного растворения добавляли 200 мкл (0,05%) триэтиламина (TEA) для активации реакции пегилирования при 40°С, и пегилирование по существу завершалось (более 90%, рассчитано по защищенному аналогу эксендина-4) при перемешивании в течение 2 часов. Затем 8 мл (2%) гидразина добавляли при 40°С, и раствор перемешивали в течение 1 часа, чтобы удалить защитные группы, до завершения реакции. Конечный реакционный раствор разбавляли в 10 раз с использованием очищенной воды и немедленно доводили значение рН до 6,0 с помощью 6 М HCl, а затем хранили в холодильнике при 4°С.

На фигуре 2 представлены хроматограммы ВЭЖХ до и после пегилирования сайт-специфически защищенного аналога эксендина-4.

Пример 3

Способ выделения и очистки пегилированного аналога эксендина-4

Очищенный первичный продукт пегилированного аналога эксендина-4 может быть получен ВЭЖХ с обращенной фазой, ионным обменом, ультрафильтрацией, способом молекулярных сит и лиофилизацией конечного реакционного раствора сайт-специфически защищенных аналогов эксендина-4.

А. Очистка посредством SOURCE обращенно-фазовой ВЭЖХ

Подвижная фаза: фаза А: 20 ммоль НАс, 5% ацетонитрил; фаза В: 20 ммоль НАс, 50% ацетонитрил

Колонка: GE Fineline Pilot 35

Наполнитель: SOURCE 30RPC 175 мл

Скорость потока: 30 мл/мин

Градиент элюирования: после доставки образца уравновешивание 2-мя объемами колонки, 0-30% 5 мин, 30%-100% 5 мин

На фигуре 3 представлена хроматограмма очистки пегилированного аналога эксендина-4 посредством SOURCE.

В. Очистка с помощью катионообменной хроматографии на SP

Подвижная фаза: фаза А: 10 ммоль CBS рН 3,5

Фаза В1: 10 ммоль CBS рН 3,5+0,15 М NaCl

Фазы В2: 10 ммоль CBS рН 3,5+1,5 М NaCl

Хроматограф ическая колонка: GE XK 50

Наполнитель: SP сефароза Fast Flow 600 мл

Скорость потока: 30 мл/мин

Градиент элюирования: 0%-100% фаза В1 20 минут, 100% фаза В1-фаза В2 100% 0 мин

На фигуре 4 представлена хроматограмма очистки пегилированного аналога эксендина-4 с помощью катионообменной хроматографии на сульфопропильной смоле (SP).

С. Ультрафильтрация

Устройство: система ультрафильтрации 10KD PALL

Объем перед пропусканием через фильтр составлял 2400 мл, и объем после фильтрации составлял 400 мл

Ультрафильтрацию (от 1000 мл до 400 мл) повторяли три раза.

D. Обессоливание с помощью хроматографии на G25

Подвижная фаза: вода

Хроматографическая колонка: GE XK 50

Наполнитель: G25; 900 мл

Скорость потока: 30 мл/мин,

Количество нагрузки образца: 200 мл

На фигуре 5 представлена хроматограмма обессоливания пегилированного аналога эксендина-4 способом молекулярных сит.

Е. Лиофилизация

Температура совместного плавления раствора пегилированного аналога эксендина-4 в чистой воде составляет около -5°С, так что температуру первой стадии лиофилизации устанавливают при -10°С, а второй стадии - при 5°С. Другие параметры (время замораживания и температура печи и т.д.) устанавливают в соответствии с объемом образца, производительностью лиофилизатора и конкретными климатическими условиями.

Пример 4

Внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе у нормальных мышей С57 (IPTT)

(1) Материалы

Животные: Мыши С57 были приобретены у Shanghai SLACCAS Laboratory Animal Co., уровень стерильности SPF (Specific Pathogen Free). Животные были выращены во временном виварии компании, CL-класса. Количество: 60, пол: самцы.

Реагенты: аналог эксендина-4 (0,125 мкг/мл); пегилированный аналог эксендина-4 (3,125 мкг/мл, рассчитано по чистому пептиду); глюкозный набор; 20% глюкозы для инъекций; и физиологический раствор для инъекций.

(2) Экспериментальные способы

Группа животных, которым вводили лекарственный препарат: каждой мыши вводили аналог пегилированного эксендина-4 (3,125 мкг/мл, рассчитано по чистому пептиду); группа, получавшая плацебо в количестве 0,2 мл/20 г; каждой мыши вводили физиологический раствор в дозе 0,2 мл/20 г; контрольная группа: каждой мыши вводили аналог эксендина-4 (0,125 мкг/мл) в дозе 0,2 мл/20 г. Уровень глюкозы в крови повышали посредством внутрибрюшинной инъекции 20% раствора глюкозы из расчета 0,2 мл/20 г массы тела за полчаса до тестирования уровня глюкозы в крови. Продолжительность гипогликемического эффекта у подопытных животных оценивалась через 24 ч и 72 ч после введения.

(3) Экспериментальные результаты

На фигуре 6 представлены продолжительности гипогликемического эффекта при введении отдельных пегилированных аналогов эксендина-4.

1. Способ получения сайт-специфически монопегилированного аналога эксендина-4, включающий следующие стадии:

1) синтезируют пептидный исходный материал аналога эксендина-4, в котором некоторые лизиновые остатки пептида были защищены Dde, где Dde представляет собой N-α-1-(4,4-диметил-6-диоксо-циклогексилен);

2) вводят в реакцию пептидный материал, указанный на стадии (1), с производным PEG, имеющим молекулярную массу от 20000 до 60000 Da, в органическом растворителе основного характера, что дает возможность лизиновым остаткам без защитной группы Dde связаться с полиэтиленгликольной группой;

3) удаляют защитные группы продукта, полученного на стадии (2), выделяют и очищают продукт с получением пегилированного аналога эксендина-4.

2. Способ по п. 1, в котором упомянутый пептидный материал включает в себя не защищенный группой Dde лизиновый остаток только в одном местоположении.

3. Способ по п. 1, в котором N-конец упомянутого пептидного материала защищен Dde или Fmoc, причем Fmoc представляет собой 9-флуоренил-метоксикарбонил.

4. Способ по п. 1, в котором упомянутый пептидный материал имеет следующую структуру:

(X)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y1-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y2-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Y3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Y4, в которой X представляет собой Fmoc или Dde, Z представляет собой Leu или Ile; Y1-Y4 представляет собой Lys или (Dde) Lys, и по меньшей мере один из Y1-Y4 представляет собой Lys.

5. Способ по п. 1, в котором упомянутое производное PEG представляет собой SC-PEG.

6. Способ по п. 1, в котором упомянутое производное PEG представляет собой SS-PEG.

7. Способ по п. 1, в котором упомянутое производное PEG представляет собой NHS-PEG.

8. Способ по п. 4, в котором среди Y1-Y4 только один из остатков Y2-Y4 представляет собой Lys, а остальные остатки представляют собой (Dde) Lys.

9. Способ по п. 8, в котором Y2 представляет собой Lys, Y1, Y3 и Y4 представляют собой (Dde) Lys.

10. Пегилированный эксендин-4, имеющий следующую структуру последовательности: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys, в которой Z представляет собой Leu или Не, и в упомянутой структуре аминогруппа остатка Lys20 или остатка Lys27 соединена с производным PEG, имеющим молекулярную массу от 20,000 до 60,000 Da.

11. Применение аналога эксендина-4 по п. 10 для лечения сахарного диабета.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биохимии. Представлен способ получения конъюгата физиологически активного белка и непептидного полимера, включающий взаимодействие указанного белка с непептидным полимером, имеющим реакционноспособные группы по обоим концам или по трем концам, в реакционном растворе, содержащем органический растворитель, для связывания указанного белка с указанным полимером, посредством этого получение конъюгата, где указанный белок имеет два или более N-конца, указанный полимер связан с N-концом указанного белка, где органический растворитель представляет собой спирт, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, реакционный раствор содержит органический растворитель в количестве от 30 до 55% по объему от общего объема реакционного раствора, рН реакционного раствора составляет от 4,5 до 7,0.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению конъюгата ПЭГ и интерферона-β-1a человека, и может быть использовано в медицине. Присоединением линейной молекулы ПЭГ 20-40 кДа к интерферону-β-1a человека получен конъюгат формулы (I): , где: n - целые значения от 454 до 909; m - целое число ≥4; IFN -природный или рекомбинантный интерферон-β-1a человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению молекулы Фактора VIII с укороченным В-доменом и ковалентно конъюгированной с гидрофильным полимером, имеющей измененное время полужизни в кровотоке, и может быть использовано в медицине для лечения гемофилии.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгату варианта эксендина с молекулой ПЭГ, и может быть использовано в медицине. Указанный конъюгат включает эксендин с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4 и одну молекулу ПЭГ с молекулярным весом от 21 кДа до 29 кДа, конъюгированную с остатком цистеина в эксендине.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен ПЭГ-модифицированный эксендин или аналог эксендина, содержащий одно или более ПЭГ-производных (варианты).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пептидного производного - миметика ЭПО, имеющего формулу (I): и его фармацевтических солей, где R1, R5 выбраны из циклических пептидов, имеющих последовательности SEQ ID NO:5, 6, 7 и 8; n1, n2 представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-10; R2, R4 выбраны из -СО или -CH2; R3 выбран из О, S, CH2, N(CH2)n3NHR6, NCO(CH2)n4NHR6, CHOCONH(CH2)n5NHR6, CHSCON(CH2)n5NHR6 или CHNHCON(CH2)n5NHR6; где n3 представляет собой целое число, выбранное из 1-10, n4 представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n5 представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R6 выбран из Н или производных метоксиполиэтиленгликоля.

Изобретение относится к области технологий изготовления биологических препаратов и может быть использовано в фармацевтической промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу направленной доставки ДНК в опухолевые и стволовые клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков в клетках млекопитающих, и может быть использовано для получения рекомбинантного антимюллерова гормона человека в клетках СНО.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгату варианта эксендина с молекулой ПЭГ, и может быть использовано в медицине. Указанный конъюгат включает эксендин с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4 и одну молекулу ПЭГ с молекулярным весом от 21 кДа до 29 кДа, конъюгированную с остатком цистеина в эксендине.

Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано в ветеринарии для создания вакцин, регулирующих половую функцию животных.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов панкреатического полипептида человека, и может быть использовано в медицине. Предложенные аналоги отличаются от нативного панкреатического полипептида человека заменами аминокислот по одному или более остатков, причем в положении 0 снабжены дополнительной аминокислотой, представляющей собой Gly.

Настоящее изобретение относится к производному пептидов PYY или РР или их аналогу, модифицированному одной или более связывающимися с сывороточным альбумином боковыми цепями, содержащими дистальную тетразольную группу или группу карбоновой кислоты.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен ПЭГ-модифицированный эксендин или аналог эксендина, содержащий одно или более ПЭГ-производных (варианты).

Настоящее изобретение предоставляет способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера посредством регулирования рН и содержания спирта реакционной среды.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии. .

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных пептидов, и может быть использовано в медицине. Способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина - производного модифицированного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, предусматривает культивирование штамма-продуцента Е.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к сайт-специфически монопегилированному аналогу эксендина, и может быть использовано в медицине. Использование более стабильной защитной группы Dde ) на стадии синтеза аналога эксендина позволяет избежать побочных реакций полипегилирования белка, не предотвращаемых нестабильными защитными группами. Изобретение позволяет достигнуть высокого выхода монопегилированного аналога эксендина при низком реакционном молярном соотношении по сравнению с известными методами получения производных такого рода. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

Наверх