Способ отбора терапевтических средств

Настоящее изобретение касается способа предварительной оценки, будет ли терапевтическое средство, выбранное из группы полипептид, антитело или иммуноадгезин, иметь необходимую скорость выведения у яванского макака, человека. Сущность способа заключается в том, что наносят покрытие с баскуловирусными частицами (BV) на микротитрационный планшет. Далее проводят контактирование терапевтического средства с BV и проводят измерение уровня связывания терапевтического средства с BV. Также проводят измерение связывания терапевтического средства с микротитрационным планшетом без BV. Показатель BV рассчитывают из среднего значения, полученного в анализах связывания, в которых измеряют уровень связывания терапевтического средства с BV, деленного на среднее значение, полученное в анализах связывания, в которых измеряют уровень связывания терапевтического средства без BV. Показатель BV выше 5 указывает на повышенную вероятность того, что терапевтическое средство будет иметь быструю скорость выведения, при этом быстрая скорость выведения выше 12 мл/кг/день, а показатель BV ниже 5 указывает на повышенную вероятность того, что терапевтическое средство будет иметь необходимую скорость выведения. Использование способа позволяет выявлять антитела, у которых наблюдается быстрое выведение из организма. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 12 пр.

 

Ссылка на родственную заявку

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 61/650964, поданной 23 мая 2012 года, которая включена в настоящий документ с помощью ссылки в полном ее объеме.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам отбора для выявления терапевтических средств, которые подвержены повышенному риску быстрого выведения из организма людей или людей и яванских макак, и к способам снижения выведения такого терапевтического средства.

Уровень техники

Человеческие или гуманизированные моноклональные антитела стали вполне эффективными в качестве терапевтических средств от заболевания человека. На сегодняшний день более 30 антител получили одобрение FDA для лечения множества нарушений, при этом еще несколько сотен находятся на стадии клинического испытания.1 В дополнение к превосходной избирательности и высокой эффективности, которых можно достичь при помощи терапевтического средства на основе антитела, успех антител в качестве лекарственных средств в значительной степени обусловлен их, как правило, длинным периодом полувыведения из кровотока. Медленное выведение из крови дает возможность достижения необходимых концентраций лекарственного средства при редком введении дозы. Лекарственные средства на основе антитела обычно вводят посредством внутривенной инфузии или подкожного введения инъекцией, и менее частое введение повышает соблюдение больным режима лечения и, таким образом, клинический результат.

Антитела могут быть устранены из общего кровообращения посредством нескольких механизмов - внутриклеточного катаболизма после пиноцитоза (неспецифическое выведение), опосредованного антигеном выведения4 и в некоторых случаях в результате образования антител к терапевтическому средству (ATA). Опосредованное антигеном выведение, которое обычно наблюдают при связывании антител с фиксированным на клетке антигеном, является наиболее выраженным при низких концентрациях антитела, и его обычно можно нейтрализовать посредством повышения дозы антитела. Было отмечено, что АТА появляются через 4-7 дней после введения дозы, что включает образование иммунных комплексов, которые могут быстро выводиться, и иногда их можно легко определить по нетипичной форме профиля ʺконцентрация антител в плазме крови - времяʺ.

Устранение антитела замедляют с помощью FcRn-зависимого механизма рециркуляции. Поскольку антитело проходит по эндоцитозному пути, оно может связываться с FcRn при pH<6. Связывание с FcRn защищает IgG от катаболизма и способствует возврату к апикальной поверхности клетки, где он может быстро высвобождаться при pH (>7) крови. Эти средства в результате дают периоды полувыведения, составляющие 6-32 дней для человеческих или гуманизированных антител у людей (Keizer, R.J., Huitema, A.D.R., Schellens, J.H.M., Beijnen, J.H. Clinical Pharmacokinetics of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Clinical Pharmacokinetics 49, 493-507 (2010)). На основании фармакокинетических данных с 12 антителами IgG1 определили среднее значение выведения у людей, составляющее 3,9±1,2 (стандартное отклонение) мл/кг/день с диапазоном ~2-6 мл/кг/день (Deng, R. et al. Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned? 3: 61-66 (2011). Аналогично, исследования таких антител у яванских макак дали среднее выведение, составляющее 6,5±2,9 (стандартное отклонение) мл/кг/день. Конструирование Fc области антитела для увеличения связывания с FcRn при pH 6,0 может увеличить период полувыведения предполагаемых терапевтических антител у яванских макак и у мышей (Dall'Acqua, W.F., Kiener, Р.А. & Wu, Н. Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FcRn). The Journal of biological chemistry 281, 23514-23524 (2006); Hinton, P.R. et al. An Engineered Human IgG1 Antibody with Longer Serum Half-Life. J Immunol 176, 346-356 (2006); Yeung, Y.A. et al. Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates. J Immunol 182, 7663-7671 (2009); Zalevsky, J. et al. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nature biotechnology 28, 157-159 (2010)).

Доклиническое тестирование предполагаемого терапевтического антитела у релевантных видов, за исключением человека, необходимо для получения представления о предполагаемой схеме дозирования у людей и для оценки предполагаемых уровней токсичности. С учетом высокой гомологии целевой последовательности антигена между человеком и остальными приматами (NHP) и сходными аффинностями связывания с рециркулирующим рецептором FcRn (Dall'Acqua, Kiener & Wu, supra), яванский макак являет предпочтительным видом для доклинических фармакокинетических (PK) и токсикологических исследований. Ранее мы показали, что неспецифическое выведение терапевтических антител IgG1, выявляемое у людей, составляет обычно половину, измеряемого у яванских макак (Deng, R. et al., supra).

Одним возможным механизмом для более быстрого, чем ожидаемого выведения является нецелевое связывание13-16. Несмотря на то что высокоспецифичное нецелевое связывание иногда можно выявить и устранить14, чаще всего нецелевое связывание имеет неизвестное происхождение и является сложным для нейтрализации путем повышения дозы. Системы in vitro для оценки и прогноза механизмов абсорбции, распространения, метаболизма и выведения in vivo или фармакокинетических свойств антител in vivo на данный момент пока еще не созданы. Мы пытались разработать анализы неспецифичного связывания in vitro, которые могут быть пригодны для определения антител, у которых можно наблюдать быстрое выведение in vivo.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой график, на котором отображена корреляция значений выведения антител, измеренных у людей и яванских макак (ρ=0,74, n=16). Для наших анализов выбирали дозы антитело, которые, по предположению, нейтрализуют любое целевое выведение. Сплошная линия представляет собой построенную кривую линейной регрессии логарифма выведения у человека к логарифму выведения у яванского макака. Для большинства показанных антител выведение у человека приблизительно в 2 раза медленнее, чем соответствующее выведение у яванского макака. В противоположность этому, для антитела к NRP1 выведение у человека (9,2 мл/кг/день) в ~2-раза быстрее, чем выведение у яванского макака (4,3 мл/кг/день).

Фигура 2 представляет собой график, на котором представлены значения выведения антител (n=52) у яванских макак. Средние геометрические значения показаны у групп доз, в которых полагали, что вклад любого специфичного выведения для указанного выведения был незначительным. За исключением 4 исследований средние значения составляют 3 или более животных. Показаны гуманизированные (круг), человеческие (квадрат), синтетические человеческие производные от фага (треугольник) и химерные (ромб) антитела. Закрашенные символы указывают на антитела с легкой лямбда-цепью, все остальные имеют легкую каппа-цепь. Антитела изотипа IgG4, имеющие стабилизирующую шарнир мутантную S228P, помечены при помощи ʺxʺ, все другие имеют изотип IgG1. Горизонтальная линия в геометрической форме указывает на афукозилированное антитело. Агликозилированные антитела, полученные посредством замены Asn297 на Ala, указаны с помощью точки в геометрической форме. Антитела с аминокислотными замещениями в Fc для модулирования связывания с FcgammaR указаны посредством вертикальной линии в геометрической форме.

Фигура 3 представляет собой коробчатую диаграмму, на которой показано сравнение значений выведения у яванских макак гуманизированных и синтетических человеческих антител, полученных из библиотек фагового дисплея. Химерные антитела (n=1) и человеческие антитела из нефаговых источников (n=3) не показаны по причине очень малого размера наборов данных. На графиках показаны отдельные значения данных с наложенными коробчатыми диаграммами. С помощью коробчатой диаграммы прямоугольной формы показана межквартильная зона (IQR) между первой квартилью (25-ая процентиль) и третей квартилью (75-ая процентиль); более тонкая горизонтальная линия в коробчатой диаграмме прямоугольной формы соответствует медиане (50-ая процентиль). Нижний ʺусʺ диаграммы вида ʺящик с усамиʺ проходит до наименьшего значения данных, которое все еще находиться в 1,5 IQR нижнего квартиля, а верхний ʺусʺ проходит до наиболее высокого значения данных в 1,5 IQR верхнего квартиля.

На фигуре 4 показано взаимоотношение между выведением антител у яванских макак и аффинностью связывания (KD, pH 5,8) с FcRn яванского макака. Использованы символы, которые определены для фигуры 2. Константы диссоциации (KD) в нМ определяли по результатам статистического анализа данных SPR, как описано в работе Yeung et al., 2010. Используемые символы являются такими же, как и для фигуры 2.

На фигуре 5 показана связь значения выведения антител у А) яванского макака и В) человека с нормализированным показателем BV ELISA. Показатель BV ELISA>5 связан с повышенным риском быстрого выведения у яванского макака (ρ=0,53, n=45). Показатель BV рассчитывали из средних значений 6 определений, каждое определение нормализовали путем деления на сигнал, наблюдаемый для непокрытых лунок на том же аналитическом планшете. Из антител с показателем BV<5, 12% характеризовались выведением >10 мл/кг/день у яванского макак, в то время как для 75% антител с показателем BV>5 выведение превышает 10 мл/кг/день. Оценка по методу максимального правдоподобия соотношения шансов составляет 19,5 (точный критерий Фишера, 95% доверительный интервал (3,3, 165,7)). Доверительный интервал свидетельствует о 3,3-166-кратном повышении вероятности более быстрого выведения при BV>5; такой интервал не содержит 1 и подразумевает статистическую значимость. В) Показатель BV ELISA>5 ассоциирован с повышенным риском быстрого выведения у человека (ρ=0,83, n=16).

На фигурах 6-8 показано взаимоотношение между выведением антител у яванских макак и антителом в отношении A) pI, В) гидрофобности, измеренной посредством HIC, и С) заряда, рассчитанного для домена Fv, соответственно.

На фигуре 9 показано, что выведение и показатели BV ELISA у яванского макака коррелируют.

На фигуре 10 показано, что корреляция между выведением и нормализированным показателем BV у яванского макака сохраняется между тестируемыми антителами IgG1, имеющими каркасные цепи HIII и каппа 1 и различные CDR и положения остатков зоны Вернье.

На фигуре 11 показано, что корреляция между выведением у человека и показателями BV ELISA сохраняется даже для антител к NRP-1.

На фигуре 12 показан возможная каскадная схема скрининга для уменьшения риска быстрого выведения.

Подробное описание изобретения

В настоящем документе описан анализ, основанный на определении связывания с бакуловирусными (BV) частицами, который пригоден для оценки нецелевого связывания терапевтических средств. Этот анализ можно применять, наряду с прочими, в ходе определения потенциальных антител или их оптимизации для повышения вероятности получение подходящего лекарственного средства.

Посредством тестирования крупной панели антител в анализе по настоящему изобретению и анализа результатов тестирования с фармакокинетическими данными таких же антител у яванских макак и, если возможно, у людей, мы определили, что изменение взаимодействия с рециркулирующим рецептором FcRn не обусловливает более быстрое, чем ожидалось, выведение, наблюдаемое для таких антител. Мы не обнаружили, что выведение связано с изоэлектрической точкой (pI) или гидрофобностью интактного антитела, о чем сообщали другие авторы. По нашему мнению, нецелевое связывание обусловливает быстрое выведение большого количества антител, несмотря на то, что в большинстве случаев такие нецелевые связывания не были выявлены. Это затратные по времени и дорогие для осуществления фармакокинетические исследования на приматах, за исключением людей. До настоящего изобретения сложно было прогнозировать потенциальные вклады нецелевых связываний в фармакокинетическом профиле до проведения таких фармакокинетических исследований in vivo. Мы разработали недорогостоящий анализ in vitro с более высокой производительностью, который прост для реализации и который можно применять для облегчения отбора терапевтических кандидатов с более высокой вероятностью наличия соответствующих фармакокинетических свойств и отбраковки терапевтических кандидатов с более высокой вероятностью несоответствующих фармакокинетических свойств у людей и других приматов.

Теперь настоящее изобретение будет подробно описано с помощью простого обзора с применением приведенных далее определений и примеров. Все патенты и публикации, включая все последовательности в таких патентах и публикациях, на которые ссылаются в настоящем описании, однозначно включены при помощи ссылки.

ʺТерапевтическое средствоʺ относится к средству, которое может быть пригодным для лечения заболевания. Согласно одному варианту осуществления терапевтическое средство включает одну или несколько полипептидных последовательностей. Согласно другому варианту осуществления терапевтическое средство включает последовательность антитела. Согласно другому варианту осуществления терапевтическое средство представляет собой иммуноконъюгат.

Применяемое в настоящем документе сокращение ʺBVʺ относится к бакуловирусной частице.

Применяемое в настоящем документе выражение ʺпоказатель BVʺ относится к значению, рассчитанному из среднего значений, полученных по результатам нескольких (2 или более) анализов связывания, в которых измеряют уровень связывания терапевтического средства с бакуловирусной частицей.

ʺНормализированный показатель BVʺ относится к показателю BV, в котором значение, полученное по результатам каждого анализа связывания, было нормализировано перед расчетом среднего значения. Согласно одному варианту осуществления нормализацию осуществляют посредством деления значения, полученного по результатам каждого анализа связывания с BV, на значение, наблюдаемого в анализе необработанного образца (т.е. без BV). Согласно одному примеру, значение OD, полученное по результатам каждого анализа связывания с BV, делят на среднее значение от значений OD, наблюдаемых для лунок без покрытия.

ʺПовышенный рискʺ или ʺповышенная вероятностьʺ относятся к более высокой возможности того, что событие произойдет.

ʺБыстрое выведениеʺ относится к скорости выведения средства у человека или яванского макака. Согласно одному варианту осуществления высокая скорость выведения является любой скоростью, которая составляет больше 10 мл/кг/день. Согласно одному варианту осуществления высокая скорость выведения является любой скоростью, которая составляет больше 12 мл/кг/день.

ʺНеобходимое выведениеʺ относится к необходимой скорости выведения средства у человека или яванского макака. Согласно одному варианту осуществления необходимая скорость выведения является скоростью, которая составляет 8,5 мл/кг/день или менее. Согласно другому варианту осуществления необходимая скорость выведения является скоростью, которая составляет 12 мл/кг/день или менее.

Применяемый в настоящем описании термин ʺиммуноадгезинʺ обозначает антитело-подобные молекулы, которые сочетают в себе специфичность связывания гетерологичного белка (ʺадгезинаʺ) с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. Структурно иммуноадгезины представляют собой гибрид аминокислотной последовательности с необходимой специфичностью связывания, которая отличается от участка распознавания и связывания антигена у антитела (т.е. является ʺгетерологичнымʺ), и последовательности константного домена иммуноглобулина. Адгезиновая часть иммуноадгезиновой молекулы, как правило, представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере участок связывания рецептора или лиганда. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине можно получить из любого иммуноглобулина, такого как подтипы IgG-1, IgG-2, IgG-3 или IgG-4, IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM.

ʺГибридный белокʺ и ʺгибридный полипептидʺ относятся к полипептиду, имеющему по меньшей мере две ковалентно связанных друг с другом части, причем каждая из частей представляет собой полипептид, имеющий собственное свойство. Свойством может быть биологическое свойство, такое как активность in vitro или in vivo. Свойством также может быть сходное химическое свойство или физическое свойство, такое как связывание с целевой молекулой, катализ реакции и т.п. Части могут быть связаны напрямую посредством отдельной пептидной связи или посредством пептидного линкера, содержащего один или несколько аминокислотных остатков. Обычно, части и линкер будут находиться в рамке считывания друг с другом.

Термин ʺантителоʺ в настоящем документе используется в наиболее широком смысле и охватывает различные структуры по типу антител, в том числе без ограничения моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что у них наблюдают необходимую антиген-связывающую активность.

ʺФрагмент антителаʺ относится к отличной от интактного антитела молекуле, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают без ограничения Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

ʺАнтитело, которое связывается со тем же эпитопомʺ, в качестве эталонного антитела относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более, и наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более. Иллюстративный конкурентный анализ приведен в настоящем документе.

Термин ʺхимерноеʺ антитело относится к антителу, у которого часть тяжелой и/или легкой цепи происходит от конкретного источника или вида, в то время, как другая тяжелая и/или легкая цепь происходит от другого источника или вида.

ʺКлассʺ антитела относится к типу константного домена или константной области, содержащемуся в его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Используемый в настоящем документе термин ʺцитотоксическое средствоʺ относится к веществу, которое подавляет или препятствует клеточной функции и/или приводит к смерти или разрушению клетки. Цитотоксические средства включают без ограничения радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие средства), ингибиторы роста, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики, токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты, и раскрытые ниже различные противоопухолевые и противораковые средства.

ʺЭффекторные функцииʺ относятся к таким биологичеким активностям, которые связаны с Fc-областью антитела и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC), связывание рецепторов Fc, антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, даун-регуляцию рецепторов на клеточной поверхности (например, рецептора B-клеток) и B-клеточную активацию.

ʺЭффективное количествоʺ средства, например, фармацевтического состава, относится к количеству, эффективному при дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения необходимого терапевтического или профилактического результата.

Термин ʺFc областьʺ в настоящем документе используют для обозначения C-концевой области иммуноглобулиновой тяжелой цепи, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Термин включает Fc области с нативной последовательностью и вариантные Fc области. В соответствии с одним вариантом осуществления Fc область тяжелой цепи IgG человека длиться от Cys226, или от Pro230, до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако, C-концевой лизин (Lys447) Fc области может присутствовать или может не присутствовать. Если в настоящем документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой EU-нумерация, которая описана в работе Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

ʺКаркасʺ или ʺFRʺ относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно представлены в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-Н1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины ʺантитело полной длиныʺ, ʺинтактное антителоʺ и ʺцелое антителоʺ используют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения антитела со структурой, практически схожей со структурой естественного антитела, или с тяжелыми цепями, которые содержат описываемую в настоящем документе Fc область.

Термины ʺклетка-хозяинʺ, ʺлиния клеток-хозяевʺ и ʺкультура клеток-хозяевʺ используют взаимозаменяемо, и они обозначают клетки, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают ʺтрансформантовʺ и ʺтрансформированные клеткиʺ, которые включают первично трансформированную клетку и полученное от нее потомство без учета числа пересевов. Потомство может не быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновых кислот с родительской клеткой, но может содержать мутации. Настоящее изобретение относится к мутантному потомству, которое характеризуется такой же функциональной или биологической активностью, по которой проводят скрининг или отбор у изначально трансформированной клетки.

ʺИммуноконъюгатʺ представляет собой антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичными молекулами, включая без ограничения цитотоксическое средство или средство для детекции.

Термин ʺдетекцияʺ понимают как включающий детекцию наличия или отсутствия вещества или определение количества вещества. Таким образом, термин относится к применению материалов, композиций и способов по настоящему изобретению для качественных и количественных определений.

ʺИндивидуумʺ или ʺсубъектʺ является млекопитающим. Млекопитающие включают без ограничения одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и остальных приматов, таких как макаки), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления индивидуумом или субъектом является человек.

ʺВыделенноеʺ антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его естественного окружения. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело очищено до степени чистоты, превышающей 95% или 99%, с помощью, например, электрофореза (например, SDS-PAGE, изоэлектрического фокусирования (IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографии (например, ионообменной или обращенно-фазовой HPLC). Обзор способов оценки степени чистоты антитела см., например, в работе Flatman et al. J. Chromatogr. В 848: 79-87 (2007).

ʺВыделеннаяʺ нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента его естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в местоположении на хромосоме, которое отличается от его естественного местоположения на хромосоме.

ʺВыделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антителоʺ относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитело с тяжелой и легкой цепями (или их фрагментами), включая такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в отдельном векторе или разделенных векторах, и такая молекула(ы) нуклеиновой кислоты присутствуют в одном или нескольких местоположениях в клетке-хозяине.

Используемый в настоящем документе термин ʺмоноклональное антителоʺ относится к антителу, получаемому из совокупности практически однородных антител, т.е. формирующие популяцию отдельные антитела являются идентичными и/или связываются с одним эпитопом, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих природные мутации или образовавшихся в ходе получения препарата моноклональных антител, причем такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело из препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение ʺмоноклональноеʺ указывает на признак антитела как получаемого из практически однородной совокупности антител, и его не следует рассматривать как нуждающееся в получении каким-либо конкретным способом антитело. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью ряда методик, включая без ограничения способ гибридом, способы с использованием рекомбинантной ДНК, способы фагового дисплея и способы с использованием трансгенных животных, содержащих все иммуноглобулиновые локусы человека или их часть, причем в настоящем документе описаны такие способы и другие иллюстративные способы получения моноклональных антител.

Термин ʺголое антителоʺ относится к антителу, которое не конъюгировано с гетерологичной частью (например, цитотоксичной частью) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтическом составе.

Термин ʺестественные антителаʺ относится к встречающимся в природе молекулам иммуноглобулина с различными структурами. Например, естественные IgG-антитела представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидными мостиками. От N- до C-конца каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (CH1, CH2 и CH3). Аналогично, от N- до C-конца каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин ʺлистовка-вкладыш в упаковкеʺ используют для обозначения инструкций, традиционно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях касательно применения таких терапевтических продуктов.

Термин ʺфармацевтический составʺ относится к препарату, который находится в такой форме, которая дает возможность биологической активности описанного в настоящем документе активного ингредиента быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введен состав.

ʺФармацевтически приемлемый носительʺ относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает без ограничения буфер, вспомогательное средство, стабилизирующее средство или консервант.

Применяемый в настоящем описании термин ʺлечениеʺ (и ее грамматические вариации, такие как ʺлечитьʺ или ʺпроведение леченияʺ) относится к клиническому вмешательству в попытке изменить течение болезни подвергаемого лечению индивидуума, и ее можно осуществлять либо для профилактики, либо в ходе протекания клинической патологии. Необходимые эффекты лечения включают без ограничения предупреждение проявления или рецидива заболевания, ослабление симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предупреждение метастаза, понижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или ослабление течения заболевания и ремиссию или улучшенный прогноз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитела по настоящему изобретению применяют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

Термин ʺвариабельная областьʺ или ʺвариабельный доменʺ относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) естественного антитела обычно имеют подобные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (FR) и три гипервариабельных области (HVR). (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания антиген-связывающей специфичности. Кроме того, связывающиеся с конкретным антигеном антитела могут быть выделены с помощью домена VH или VL из связывающегося с антигеном антитела для скрининга библиотеки, соответственно, комплементарных доменов VL или VH. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).

Используемый в настоящем документе термин ʺвекторʺ относится к молекуле нуклеиновой кислоты способной, размножить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны к управлению экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем документе называют ʺвекторами экспрессии.ʺ

В соответствии со следующим аспектом антитело согласно любому из описанных выше вариантов осуществления может включать любой из признаков, отдельно или в комбинации, которые описаны ниже в разделах 1-7.

1. Аффинность антитела

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления приведенное в настоящем описании антитело характеризуется константой диссоциации (Kd)≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10-8 М или меньше, например, от 10-8 М до 10-13 М, например, от 10-9 М до 10-13 М).

В соответствии с одним вариантом осуществления Kd измеряют посредством анализа связывания с меченным радиоактивным изотопом антигеном (RIA), осуществляемого при помощи Fab версии представляющего интерес антитела и его антигена, которая описана посредством приведенного далее анализа. Аффинность связывания в растворе Fab с антигеном измеряют посредством уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (125I)-меченного антигена в присутствии серии титров антигена без метки, затем захвата связанного антигена при помощи планшета с покрытием антителом к Fab (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)). Для создания условий для анализа многолуночные планшеты MICROTITER® (Thermo Scientific) покрывали в течение ночи 5 мкг/мл антитела для захвата Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбоната натрия (pH 9,6), а затем блокировали при помощи 2% (масса/объем) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (примерно 23°C). В планшете без абсорбента (Nunc № 269620) 100 пМ или 26 пМ [1251]-антигена смешивали с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, соответствующих результатам оценки антитела к VEGF, Fab-12, у Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Представляющий интерес Fab затем инкубировали на протяжении ночи, однако, инкубацию можно было продолжать в течение более длительного периода (например, приблизительно 65 часов), чтобы убедиться, что равновесие было достигнуто. После этого смеси переносили в планшет для захвата для инкубирования при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем удаляли раствор, а планшет промывали восемь раз при помощи 0,1% полисорбата 20 (TWEEN-20®) в PBS. После высушивания планшетов добавляли 150 мкл/лунка сцинтиллятора (MICROSCINT-20 ТМ; Packard) и планшеты считывали на счетчике гамма-излучения TOPCOUNT ТМ (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, который давал меньше или равно 20% от максимального связывание, отбирали для использования в конкурентно-связывающих анализах.

В соответствии с другим вариантом осуществления Kd измеряли при помощи анализа поверхностного плазмонного резонанса с применением BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси) при 25°C с чипами с иммобилизированным антигеном СМ5 при ~10 единицах ответа (RU). Коротко говоря, микрочипы с карбоксиметилдекстрановым покрытием для биосенсора (СМ5, BIACORE, Inc.) активировали при помощи N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разводили при помощи 10 мМ ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед введением инъекцией со скоростью потока 5 мкл/минуту для достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связавшегося белка. После введения инъекцией антигена вводили 1 М этаноламин инъекцией для блокировки не вступивших в реакцию групп. Для кинетических измерений двухкратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) вводили инъекцией в PBS с 0,05% поверхностно-активным средством (PBST) полисорбат 20 (TWEEN-20TM) при 25°C со скоростью потока примерно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) рассчитали при помощи простой модели связывания Ленгмюра ʺодин к одномуʺ (программное обеспечение BIACORE® Evaluation Software, версия 3.2) посредством одновременного приближения сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывали как соотношение koff/kon. См., например, работу Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Если скорость ассоциации превышала 106 М-1 с-1 по данным описанного выше анализа поверхностного плазмонного резонанса, то скорость ассоциации можно было определить посредством методики гашения флуоресценции, с помощью которой измеряли повышение или понижение интенсивность испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, 16 нм полоса пропускания) при 25°C 20 нМ антитела к антигену (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии повышающихся концентраций антигена, которые измеряли в спектрометре, таком как спектрофотометр, оснащенный устройством для остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-AMINCO ТМ серии 8000 (ThermoSpectronic) со встряхиваемой кюветой.

2. Фрагменты антитела

В соответствии с определенными вариантами осуществления приведенное в настоящем документе антитело представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают без ограничения Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv и scFv фрагменты и другие описываемые ниже фрагменты. Обзор некоторых фрагментов антител см. в работе Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003). Обзор scFv фрагментов см., например, в работе Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. также WO 93/16185; и патентные документы США № 5571894 и № 5587458. Рассмотрение Fab и F(ab')2 фрагментов, содержащих остатки связывающегося с рецептором спасения эпитопа и характеризующихся повышенным периодом полужизни in vivo, см. в патентном документе США № 5869046.

Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антиген-связывающими участками, которые могут быть бивалентными или биспецифичными. См., например, ЕР 404097, WO 1993/01161, Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003) и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триотела и тетратела также описаны в работе Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В соответствии с определенным вариантом осуществления однодоменное антитело является человеческим однодоменным антителом (Domantis, Inc., Уолтем, Массачусетс; см., например, патентный документ США № 6248516 В1).

Фрагменты антител можно получить с помощью различных методик, в том числе без ограничения протеолитического расщепления интактного антитела, а также получения рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фага), как описано в настоящем документе.

3. Химерные и гуманизированные антитела

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления приведенное в настоящем документе антитело представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США № 4816567 и у Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). В соответствии с одним примером химерное антитело содержит отличную от человеческой вариабельную область (например, вариабельную область, полученную от мыши, крысы, хомяка, кролика или отличного от человека примата, такого как макак) и человеческую константную область. В следующем примере химерное антитело представляет собой антитело с ʺпереключенным классомʺ, у которого класс или подкласс был изменен по сравнению с классом исходного антитела. Химерные антитела включают их антиген-связывающие фрагменты.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления химерным антителом является гуманизированное антитело. Как правило, отличное от человеческого антитело гуманизируют для снижения иммуногенности для людей, в то же время с сохранением специфичности и аффинности исходного отличного от человеческого антитела. В целом, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например CDR, (или их части) получены из последовательностей отличного от человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно будет также содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления некоторые FR остатки в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из отличного от человеческого антитела (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, для восстановления или повышения специфичности или аффинности антитела.

Гуманизированные антитела и способы их получения рассмотрены, например, в работе Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), и дополнительно описаны, например, в работе Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); в патентах США № 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; в работе Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (описывающей прививку SDR (a-CDR)); в работе Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (описывающей ʺизменение поверхностиʺ); в работе Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (описывающей ʺFR шаффлингʺ); и в работе Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) и в работе Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (описывающей подход ʺуправляемого отбораʺ для FR шаффлинга).

Человеческие каркасные области, которые могут быть использованы для гуманизации, включают без ограничений: каркасные области, отобранные с помощью способа ʺнаибольшего соответствияʺ (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)); каркасные области, полученные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol., 151: 2623 (1993)); человеческие зрелые (с соматической мутацией) каркасные области или человеческие каркасные области эмбрионального типа (см., например, Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); и каркасные области, полученные в результате скрининга FR библиотек (см., например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).

4. Человеческие антитела

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления приведенное в настоящем документе антитело представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получить с помощью различных известных из уровня техники методик. Человеческие антитела в целом описаны в работе van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).

Человеческие антитела можно получить путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано с тем, чтобы продуцировать интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на стимуляцию антигеном. Такие животные, как правило, содержат весь или часть человеческих иммуноглобулиновых локусов, которые заменяют эндогенные иммуноглобулиновые локусы или которые присутствуют внехромосомно или рандомно интегрируются в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные иммуноглобулиновые локусы, в целом, были инактивированы. Обзор способов получения человеческих антител от трансгенных животных см. в работе Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США № 6075181 и № 6150584, в которых описана технология XENOMOUSETM, патент США № 5770429, в котором описана технология HUMAB®, патент США № 7041870, в котором описана технология K-M MOUSE®, и публикации заявки на выдачу патента США № US 2007/0061900, в которой описана технология VELOCIMOUSE®. Человеческие вариабельные области из интактных антител, выработанных такими животными, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем комбинирования с другой человеческой константной областью.

Человеческие антитела также могут быть получены при помощи гибридомных способов. Были описаны линии миеломных клеток человека и гетеромиеломных клеток мыши-человека для получения человеческих моноклональных антител. (См., например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Человеческие антитела, полученные с помощью технологии человеческих B-клеточных гибридом, также были описаны в работе Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают способы, описанные, например, в патенте США № 7189826 (в котором описано получение моноклональных человеческих антител IgM от линий гибридомных клеток); и в работе Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) (в которой описаны гибридомы человек-человек). Технология человеческой гибридомы (технология Trioma) также описана в работах Vollmers and Brandlein, (2005) Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3): 185-91 (2005).

Человеческие антитела также можно получить путем выделения последовательностей клонированных Fv вариабельных доменов, отобранных из полученных от человека фаг-дисплейных библиотек. Такие последовательности вариабельных доменов затем могут быть скомбинированы с необходимым человеческим константным доменом. Методики отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.

5. Полученные из библиотек антитела

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек в отношении антител с необходимой активностью или активностями. Например, в настоящей области техники известен ряд способов создания фаг-дисплейных библиотек и скрининга таких библиотек в отношении антител, обладающих необходимыми характеристиками связывания. Такие способы рассмотрены, например, в работе Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) и дополнительно описаны, например, в работе McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004).

В некоторых способах фагового дисплея репертуары генов VH и VL раздельно клонируют при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайно рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем можно подвергнуть скринингу в отношении связывающимся с антигеном фага, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг, как правило, несет фрагменты антитела, либо в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, либо в виде Fab фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников дают высокоаффинные антитела на иммуноген без необходимости построения гибридом. Альтернативно, может быть клонирован интактный репертуар (например, человека) с получением одного источника антител к широкому диапазону ʺчужихʺ, а также ʺсвоихʺ антигенов без какой-либо иммунизации, как описано в работе Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, интактные библиотеки также можно получить синтетически путем клонирования сегментов неперестроенного V-гена из стволовых клеток, а также с применением ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, с тем, чтобы закодировать высоковариабельные CDR3 области и осуществить перестройку in vitro, как описано в работе Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например, патент США № 5750373 и патентные публикации США № 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

Выделенные из библиотек человеческих антител антитела или фрагменты антител рассматривают в настоящем документе как человеческие антитела или фрагменты человеческих антител.

6. Мультиспецифичные антитела

В соответствии с определенными вариантами осуществления антитело, о котором идет речь в настоящем документе, представляет собой мультиспецифичное антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые характеризуются специфичностями связывания по меньшей мере для двух различных участков. В соответствии с определенными вариантами осуществления одна из специфичностей связывания предназначена для [[PRO]], а другая предназначена для другого антигена. В соответствии с определенными вариантами осуществления биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами [[PRO]]. Биспецифичные антитела также могут быть использованы для связывания цитотоксических средств с клетками, экспрессирующими [[PRO]]. Биспецифичные антитела могут быть получены в виде антител полной длины или в виде фрагментов антител.

Методики получения мультиспецифичных антител включают без ограничения рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина с различными специфичностями (см. работу Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) и конструирование ʺknob-in-holeʺ (см., например, патент США № 5731168). Мультиспецифичные антитела также можно получить путем создания эффектов электростатического управления для создания Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004 А1), сшивания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США № 4676980 и работу Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)), применения лейциновых застежек с получением биспецифичных антител (см, например, работу Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)), применения технологии ʺдиателаʺ для получения биспецифичных фрагментов антител (см, например, работу Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)), и применения димеров одноцепочных Fv (sFv) (см., например, Gruber et al., J. Immvmol., 152: 5368 (1994)), и получения триспецифичных антител, как описано, например, в работе Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Также в настоящий документ включены сконструированные антитела с тремя или более функциональными антиген-связывающими участками, в том числе ʺосьминоговые антителаʺ (см., например, US 2006/0025576 А1).

Антитело или фрагмент в настоящем документе также включают ʺFAb двойного действияʺ или ʺDAFʺ, содержащий антиген-связывающий участок, который связывается с [[PRO]], а также с другим, отличным антигеном (см., например, US 2008/0069820).

7. Варианты антител

В соответствии с определенными вариантами осуществления включаются приведенные в настоящем документе варианты аминокислотных последовательностей антител. Например, может быть необходимо увеличивать аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в кодирующую антитело нуклеотидную последовательность или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции из, и/или вставки в, и/или замены остатков в аминокислотной последовательности антитела. Для получения конечной конструкции может быть осуществлена любая комбинация делеции, вставки и замены при условии, что конечная конструкция обладает необходимыми характеристиками, например, антиген-связывающей характеристикой.

а) Варианты замен, вставок и делеций

В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к вариантам антител с одной или несколькими аминокислотными заменами. Представляющие интерес участки для приводящего к замене мутагенеза включают HVR и FR. Консервативные замены показаны в таблице 1 под заголовком ʺконсервативные заменыʺ. Более заметные замены приведены в таблице 1 под заголовком ʺиллюстративные заменыʺ и дополнительно описаны ниже на основании классов боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющее интерес антитело, а продукты подвергнуты скринингу в отношении необходимой активности, например, сохраненного/улучшенного связывания с антигеном, пониженной иммуногенности или повышенной ADCC или CDC.

Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии с общими свойствами боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены повлекут обмен члена одного из таких классов на члена другого класса.

Один тип варианта замены включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Обычно, выбранный для последующего исследования полученный вариант(ы) будет характеризоваться модификациями (например, улучшениями) определенных биологических свойств (например, повышенной аффинностью, сниженной иммуногенностью) относительно исходного антитела и/или будет характеризоваться практически сохраненными определенными биологическими свойствами исходного антитела. Иллюстративный вариант замены представляет собой антитело с созревшей аффинностью, которое традиционно может быть получено, например, с помощью таких методик созревания аффинности с использованием фагового дисплея, как те, что описаны в настоящем документе. Схематически, подвергают мутации один или несколько остатков HVR и представленные на фаге вариантные антитела подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).

В HVR могут быть осуществлены изменения (например, замены), например, для повышения аффинности антитела. Такие изменения могут быть осуществлены в ʺгорячих точкахʺ HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации в ходе процесса соматического созревания (см., например, работу Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)), и/или SDR (a-CDR), с тестированием полученной вариантной VH или VL на аффинность связывания. Созревание аффинности путем построения или повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, у Hoogenboom et al. в работе Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) В соответствии с некоторыми вариантами осуществления созревания аффинности в выбранные для созревания изменчивые гены вариабельность вносят с помощью любого из многочисленных способов (например, ПЦР с ошибающейся полимеразой, шаффлинга цепи или сайт-специфичного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антител с необходимой аффинностью. Другой способ введения вариабельности включает ориентированные на HVR подходы, при которых производят рандомизацию нескольких остатков HVR (например, 4-6 остатков за раз). Участвующие в связывании с антигеном остатки HVR могут быть точно идентифицированы, например, с помощью сканирующего аланином мутагенеза или моделирования. В частности, зачастую объектом являются CDR-H3 и CDR-L3.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления замены, вставки или делеции могут иметь место в одном или нескольких HVR при условии, что изменения практически не снижают способность антитела связывать антиген. Например, в HVR могут быть выполнены консервативные изменения (например, приведенные в настоящем документе консервативные замены), которые практически не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут быть за пределами ʺгорячих точекʺ HVR или SDR. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления приведенных выше вариантных последовательностей VH и VL каждая HVR либо не изменена, либо не содержит более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Пригодный способ идентификации остатков или областей антитела, которые могут служить объектом для мутагенеза, называется ʺсканирующий аланином мутагенезʺ, описываемый в работе Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Этот способ включает идентификацию и замену остатка или группы целевых остатков (например, заряженных остатков, таких как arg, asp, his, lys и glu) на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для выявления того, затрагивается ли взаимодействие антитела с антигеном. В аминокислотные положения могут быть введены дополнительные замены, демонстрирующие функциональную чувствительность изначальных замен. Альтернативно, или дополнительно, определяют кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта антитела и антигена. Такие контактирующие остатки и соседние остатки могут быть выбраны или исключены в качестве кандидатов на замену. Варианты могут быть подвергнуты скринингу для определения того, имеют ли они необходимые свойства.

Вставки в аминокислотных последовательностях включают слияния с амино- и/или карбоксильным концом, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотни или более остатков, а также вставки внутри последовательности из одного или множества аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метиониловым остатком. Другие варианты вставок у молекулы антитела включают слияние N- или C-конца антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который повышает период полужизни антитела в сыворотке крови.

b) Варианты с гликозилированием

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предлагаемое в настоящем документе антитело изменено с целью повышения или понижения степени, до которой гликозилируется антитело. Добавление или удаление участков гликозилирования у антитела можно легко осуществить путем изменения аминокислотной последовательности так, чтобы создать или удалить один или несколько участков гликозилирования.

Если антитело содержит Fc область, то может быть изменен присоединенный к ней углевод. Производимые клетками млекопитающего естественные антитела как правило содержат разветвленный, двуантенарный олигосахарид, который обычно присоединен с помощью N-связи к Asn297 СН2 домена Fc области. См., например, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в ʺстволеʺ двуантенарной олигосахаридной структуры. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления для создания вариантов антител с определенными улучшенными свойствами в антителе по настоящему изобретению могут быть выполнены модификации олигосахарида.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к вариантам антитела с углеводной структурой, которая не содержит (прямо или опосредованно) присоединенную к Fc области фукозу. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Определяют количество фукозы путем расчета среднего количества фукозы в сахарной цепи в Asn297 по отношению к сумме всех присоединенных к Asn 297 гликоструктур (например, сложных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы) по результатам измерения MALDI-TO масс-спектрометрии, как, например, описано в WO 2008/077546. Asn297 относится к аспарагиновому остатку, расположенному приблизительно в 297 положении Fc области (нумерация остатков Fc области по Eu); тем не менее, Asn297 также может быть расположен приблизительно ±3 аминокислоты выше или ниже 297 положения, т.е. между положениями 294 и 300, по причине незначительных вариаций последовательностей у антител. Такие варианты антител могут характеризоваться улучшенной ADCC функцией. См., например, патентные публикации США № US 2003/0157108 (Presta, L.), US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, относящихся к ʺдефукозилированнымʺ вариантам антител или вариантам антител ʺс дефицитом по фукозеʺ, включают: US 2003/0157108, WO 2000/61739, WO 2001/29246, US 2003/0115614, US 2002/0164328, US 2004/0093621, US 2004/0132140, US 2004/0110704, US 2004/0110282, US 2004/0109865, WO 2003/085119, WO 2003/084570, WO 2005/035586, WO 2005/035778, WO 2005/053742, WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры способных продуцировать дефукозилированные антитела клеточных линий включают клетки СНО Lecl3, дефектные по фукозилированию белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); патентная заявка № US 2003/0157108, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Adams et al., особенно в примере 11), и нокаутные клеточные линии, такие как клетки СНО с нокаутным геном альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); и WO 2003/085107).

Варианты антител дополнительно снабжают разделенными пополам олигосахаридами, например, у которых присоединенный к Fc области антитела двуантенарный олигосахарид разделен пополам посредством GlcNAc. Такие варианты антитела могут характеризоваться пониженным фукозилированием и/или повышенной ADCC функцией. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.), патенте США № 6602684 (Umana et al.) и US 2005/0123546 (Umana et al.). Также настоящее изобретение относится к вариантам антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в присоединенном к Fc области олигосахариде. Такие варианты антител могут характеризоваться улучшенной CDC функцией. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel et al.), WO 1998/58964 (Raju, S.) и WO 1999/22764 (Raju, S.).

с) Варианты Fc области

В соответствии с определенными вариантами осуществления в Fc область приведенного в настоящем документе антитела могут быть введены одна или несколько аминокислотных модификаций с получением, таким образом, варианта Fc области. Вариант Fc области может содержать последовательность Fc области человека (например, Fc область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к варианту антитела, который обладает некоторыми, но не всеми, эффекторными функциями, что делает его желаемым кандидатом для применений, в которых важен период полужизни антитела in vivo, но определенные эффекторные функции (например, комплемента и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Для подтверждения снижения/уменьшения CDC и/или ADCC активностей могут быть проведены анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, анализы связывания с Fc рецептором (FcR) могут быть проведены для того, чтобы убедиться, что антитело не может связываться с FcR (следовательно, вероятно не обладает ADCC активностью), но сохраняет способность связываться с FcRn. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только Fc(RIII, в то время как моноциты экспрессируют Fc(RI, Fc(RII и Fc(RIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена в таблице 3 на странице 464 в работе Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991). Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки ADCC активности представляющей интерес молекулы описаны в патенте США № US 5500362 (см., например, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985); 5821337 (см., Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)). Альтернативно, могут быть задействованы способы нерадиоактивных анализов (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, Калифорния) и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Мэдисон, Висконсин)). Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеары периферической крови (РВМС) и натуральные клетки-киллеры (NK). Альтернативно, или дополнительно, ADCC активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на животной модели, как, например, раскрыто в работе Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998). Также могут быть осуществлены анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не способно связываться с C1q и, следовательно, не обладает CDC активностью. См., например, результаты ELISA по связыванию с C1q и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). Определения связывания FcRn и выведение/период полужизни in vivo могут быть осуществлены с помощью известных в настоящей области техники способов (см., например, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006)).

Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 в Fc области (см., например, патент США № 6737056). Такие Fc-мутанты включают Fc-мутантов с заменами по двум или более аминокислотным положениям 265, 269, 270, 297 и 327, в том числе так называемый Fc-мутант ʺDANAʺ с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США № 7332581).

Описаны некоторые варианты антител с повышенным или пониженным связыванием с FcR. (См., например, патент США № 6737056, WO 2004/056312 и работу Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).)

В соответствии с определенными вариантами осуществления варианты антител содержат Fc область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые увеличивают ADCC, например, заменами по положениям 298, 333 и/или 334 в Fc области (нумерация остатков по EU).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления в Fc области осуществляют изменения, которые в результате дают измененное (т.е. либо повышенное, либо пониженное) связывание C1q и/или измененную комплементзависимую цитотоксичность (CDC), например, как описано в патенте США № 6194551, WO 99/51642 и работе Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Антитела с повышенными периодами полужизни и повышенным связыванием с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который ответственен за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), описаны в US 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). Такие антитела содержат Fc область с одной или несколькими заменами в ней, которые повышают связывание Fc области с FcRn. Такие Fc-варианты включают варианты с заменами по одному или нескольким остаткам Fc области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замена 434 остатка Fc области (патент США № 7371826).

Касательно других примеров вариантов Fc области см. также работу Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988), патент США № 5648260, патент США № 5624821 и WO 94/29351.

d) Варианты сконструированного антитела с цистеиновыми заменами

В соответствии с определенными вариантами осуществления может быть необходимо создание сконструированных антител с цистеиновыми заменами, например, ʺthioMAbʺ, у которых один или несколько остатков антитела заменены цистеиновыми остатками. В соответствии с конкретными вариантами осуществления заменяемые остатки находятся в доступных участках антитела. В результате замены таких остатков цистеином реакционно-способные тиоловые группы располагаются в доступных участках антитела и могут быть использованы для конъюгации антитела с другими частями, такими как лекарственные части или лекарственные части с линкером, с образованием иммуноконъюгата, который описан в настоящем документе далее. В соответствии с определенными вариантами осуществления цистеином может быть замещен любой один или несколько из следующих остатков: V205 (нумерация по Kabat) легкой цепи, A118 (нумерация по EU) тяжелой цепи и S400 (нумерация по EU) Fc области тяжелой цепи. Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами могут быть получены как описано, например, в патенте США № 7521541.

e) Производные антител

В соответствии с определенными вариантами осуществления приведенное в настоящем документе антитело может быть дополнительно модифицировано включением в его состав дополнительных небелковых частей, которые известны из уровня техники и легко доступны. Подходящие для получения производных антител части включают без ограничения водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают без ограничения полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пролипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные многоатомные спирты (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. При производстве преимуществами может обладать полиэтиленгликолевый пропиональдегид по причине его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество присоединенных к антителу полимеров может варьировать, и, если присоединено более одного полимера, то они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В целом, количество и/или тип используемых для получения производных полимеров можно определить исходя из обстоятельств, в том числе без ограничений конкретных свойств или функций нуждающегося в улучшении антитела, будут ли применять производное антитела в терапии при определенных условиях и т.д.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к конъюгатам антитела и небелковой части, которые могут избирательно нагреваться под воздействием излучения. В соответствии с одним вариантом осуществления небелковой частью является углеродная нанотрубка (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и включает без ограничения длины волн, которые не вредят обычным клеткам, но которые нагревают небелковую часть до температуры, при которой погибают клетки, находящиеся рядом с антителом-небелковой частью.

Рекомбинантные способы и композиции

Антитела можно получить с помощью рекомбинантных способов и композиций, например, которые описаны в патенте США № 4816567. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей описываемое в настоящем документе антитело. Такая нуклеиновая кислота может кодировать содержащую VL аминокислотную последовательность и/или содержащую VH аминокислотную последовательность антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к одному или нескольким содержащим такую нуклеиновую кислоту векторам (например, векторам экспрессии). В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к содержащей такую нуклеиновую кислоту клетке-хозяину. В соответствии с одним таким вариантом осуществления клетка-хозяин содержит (например, была им трансформирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, который кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В соответствии с одним вариантом осуществления клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомяка (СНО) или лимфоидной клеткой (например, клеткой Y0, NS0, Sp20). В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу получения антитела, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую приведенное выше антитело, в подходящих для экспрессии антитела условиях и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды клеток-хозяев).

Для рекомбинантного получения антитела нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, описываемое выше, выделяют и вставляют в один или несколько векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована с помощью традиционных процедур (например, путем применения олигонуклеотидньгх зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитела векторов включают описываемые в настоящем документе прокариотические или эукариотические клетки. Например, антитела могут продуцироваться у бактерий, особенно если нет необходимости в гликозилировании и Fc-эффекторной функции. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях, см., например, патенты США № 5648237, 5789199 и 5840523. (См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, в которой описана экспрессия фрагментов антител у Е. coli.) После экспрессии антитело может быть выделено из бактериальной клеточной массы в растворимой фракции и может быть дополнительно очищено.

Помимо прокариот, эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии кодирующих антитело векторов, в том числе штаммы грибов и дрожжей, чьи пути гликозилирования были ʺгуманизированыʺ, что приводит в результате к продуцированию антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела также получают от многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Было обнаружено множество бакуловирусных штаммов, которые могут быть использованы в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

Культуры растительных клеток также можно использовать в качестве хозяев. См., например, патенты США № 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие методику PLANTIBODIESTM для получения антител в трансгенных растениях).

В качестве хозяев также могут быть использованы клетки позвоночных. Например, могут быть пригодны линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия CV1 клеток почки мартышки, трансформированная посредством SV40 (COS-7); линия клеток первичной почки человека (293 или клетки 293, которая описана, например, в работе Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (клетки ТМ4, которые описаны, например, в работе Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); клетки почки мартышки (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки цервикальной карциномы человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крысы линии buffalo (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, которые описаны, например, в работе Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); MRC 5 клетки и FS4 клетки. Другие пригодные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), в том числе DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980)); и линии миеломных клеток, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых подходящих для продуцирования антитела линий клеток-хозяев млекопитающий см., например, в работе Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

В раскрытии приведенной далее экспериментальной части использованы следующие аббревиатуры: экв. (эквиваленты), М (молярный), мкМ (микромолярный), N (нормальный), моль (моли), ммоль (миллимоли), мкмоль (микромоли), нмоль (наномоли), г (граммы), мг (миллиграммы), кг (килограммы), мкг (микрограммы), л (литры), мл (миллилитры), мкл (микролитры), см (сантиметры), мм (миллиметры), мкм (микрометры), нм (нанометры), °C (градусы по Цельсию), ч (часы), мин. (минуты), с (секунды), мс (милисекунды), Ки (кюри) мКи (милликюри), мкКи (микрокюри), TLC (тонкослойная хроматография), Ts (тосил), Bn (бензил), Ph (фенил), Ms (мезил), Et (этил), Me (метил).

Примеры

Настоящее изобретение дополнительно подробно описано в приведенных далее примерах, которые ни в коем случае не направлены на ограничение заявляемого объема настоящего изобретения. Прилагаемые фигуры предназначены для рассмотрения как неотъемлемые части описания и раскрытия настоящего изобретения. Все упомянутые литературные источники специально включены в настоящий документ при помощи ссылки в отношении всего, что в них описано. Приведенные далее примеры предложены для иллюстрации, а не ограничения заявляемого изобретения.

Настоящая заявка включает с помощью ссылки заявки на патенты, и патенты, и публикации, упомянутые в настоящем документе, в полном их объеме, включая, в частности, работу Hotzel et al, (2012), ʺA Strategy for Risk Mitigation of Antibodies with Fast Clearanceʺ, mAbs 4:6, 1-8.

Пример 1

Определение выведения у яванских макак

В настоящем примере проиллюстрирован стандартный способ, применяемый для определения выведения антитела у отличных от человека приматов.

Фармакокинетические профили антител определяли после внутривенного введения отдельной дозы или многократных доз терапевтического антитела у яванских макак. Образцы сыворотки готовили из крови, собранной в различные моменты времени, и посредством ELISA определяли концентрацию антител. В большинстве случаев ELISA состоял из захвата при помощи нанесенного в виде покрытия антигена с последующим определением при помощи антитела к человеческой Fc. При ELISA анализе антитела 26 для захвата использовали антитело к идиотипу. С антителами 14, 17, 24, 33 и 44 применяли ELISA по типу сэндвича к человеческому Fc для определения концентрации в сыворотке. Профили концентрации сыворотки в зависимости от времени анализировали при помощи анализа без использования камерной модели для расчета общего выведения (Deng, R. et al. Pharmacokinetics of humanized monoclonal anti-tumor necrosis factor-{alpha} antibody and its neonatal Fc receptor variants in mice and cynomolgus monkeys. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 38, 600-605 (2010)). Выведение при наиболее высоких протестированных дозах для каждого антитела отображали как неспецифичное выведение и предполагали, что доля специфичного выведения к общему выведению была несущественной.

С помощью немного большего массива данных, чем был доступен ранее (Deng, R. et al. Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned? mAbs 3, 61-66 (2011)), мы подтверждали сильную корреляцию между значениями выведения, измеренными у яванских макак и людей (фиг. 1, коэффициент корреляции Спирмана (ρ) = 0,74). Получали простой принцип масштабирования, который заключался в том, что выведение, измеренное у людей, было приблизительно в 2 раза медленнее, чем выведение, измеренное у яванских макак, причем антитело к NRP1 было резко отклоняющимся значением.

Пример 2

Определение аффинности FcRn

В приведенном далее примере подробно описано как можно определить равновесные константы диссоциации (KD).

Равновесные константы диссоциации (KD) для связывания FcRn яванского макака с иммобилизированным антителом определяли по результатам измерений поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore® 4000 (GE Healthcare). FcRn яванского макака получали как описано ранее (Yeung, Y.A. et al. Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates. J Immunol 182, 7663-7671 (2009)). Микрочип для биосенсора серии S закрепляли, нормализовали и подготавливали для приведения в соответствие с гидродинамическими характеристиками с помощью протокола, предоставляемого производителем. Все 5 зон каждой из 4 проточных кювет активировали для связывания с амином посредством 10 минутного воздействия раствором EDC/NHS (0,2 М N-этил-N-(3-диэтиламинопропил)-карбодиимида (EDC) и 0,05 М N-гидроксисукцинимида (NHS)). Антитело связывали с зонами 1, 2, 4 и 5 путем 7 минутного воздействия раствором, содержавшим 2 мкг/мл антитела и 10 мМ NaOAc, pH 5. Не вступившие в реакцию участки затем блокировали посредством 7 минутного воздействия на все 5 зон 1 М этаноламином. В таком формате зона 3 представляла собой эталонную ячейку, для каждой проточной ячейки проводили связывание с 4 различными антителами, всего 16 на микрочип для биосенсора. Плотности связывания находились в диапазоне 200-1000 RU антитела. Отдельные эксперименты показывали, что рассчитанная Ко не зависела от плотности связывания в таком диапазоне (данные не показаны). Серия растворов FcRn яванского макака, которые варьировали по концентрации от 10 мкМ до 0,04 мкМ с 2-кратным шагом повышения концентрации, готовили в подвижном буфере, содержавшем 25 мМ MES, 25 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05% полисорбат-20, pH 5,8. Собирали данные для сенсограммы для инъекции 60 мкл таких растворов и только буферного контроля над микрочипом для биосенсора при скорости потока 30 мкл/мин. Температура измерения составляла 25°C, диссоциацию отслеживали в течение 180 секунд и затем любой оставшийся связанным FcRn вымывали посредством инъекции 30 мкл раствора, содержавшего 50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,05% полисорбат-20, pH 8. Константы диссоциации рассчитывали по результатам анализа афинности в стационарном состоянии при помощи программного обеспечения Biacore 4000 Evaluation Software 1.0.

Пример 3

Получение антигена для ELISA

В настоящем примере описано получение подложки, применяемой для нанесения покрытия на микротитрационные планшеты для применения в описанном в настоящем документе анализе.

Бакуловирусные частицы получали посредством инфицирования 1,8×109 Sf9 клеток насекомых в 600 мл среды без сыворотки ESF921 (Expression systems, Дэвис, Калифорния) рекомбинантным Autographa californica nucleopolyhedrovirus, экспрессирующим зеленый флуоресцентный белок (Bac-to-Bac, Invitrogen) при множественности инфицирования, составлявшей приблизительно 1. Инфицированные культуры инкубировали в течение 40 часов при 27°C со встряхиванием (200 об./мин.), собирали и клетки удаляли посредством центрифугирования при 5000×g в течение 10 минут. Вирус в надосадочной жидкости осаждали посредством центрифугирования при 25000×g в течение 4 часов при 4°C, ресуспендировали в PBS буфере (150 мМ NaCl, 10 мМ фосфат натрия, pH 7,4), наслаивали на 4 мл 35% (масса/объем) сахарозную подушку в PBS и центрифугировали в роторе SW40Ti (Beckman) со скоростью 30000 об./мин. в течение 1 часа при 4°C. Надосадочную жидкость с дебрисом отбрасывали, осадок с вирусом слегка один раз промывали при помощи PBS, ресуспендировали в 1,2 мл PBS с коктейлем протеазных ингибиторов (Roche) и хранили при 4°C на протяжении периода, составлявшего до 4 месяцев.

Сырые фракции мембран клеток Sf9l получали из неинфицированных клеток. Всего 2×108 неинфицированных клеток Sf9, выращенных в среде ESF без сыворотки, промывали один раз в PBS и ресуспендировали в 4 мл ледяного лизирующего буфера (1 мМ EDTA, 50 мМ буфер HEPES, pH 7,4, полный коктейль протеазных ингибиторов). Клетки переносили в гомогенизатор Даунса и разрушали при помощи 8 ударов свободного песта. К лизированным клеткам добавляли дополнительные 4 мл лизирующего буфера, содержавшего 0,5 М сахарозу, и клетки дополнительно разрушали при помощи 8 ударов плотно пригнанного песта. Лизат центрифугировали в течение 10 минут при 500×g при 4°C для удаления митахондрий, ядер и грубого дебриса. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку и центрифугировали при 25000×g в течение 20 минут при 4°C. Осадок один раз промывали лизирующим буфером и ресуспендировали в 5 мл такого же буфера при помощи гомогенизатора Даунса с плотно пригнанным пестом. Крупный дебрис удаляли при помощи центрифугирования при 500×g при 4°C.

Пример 4

Анализ ELISA

Антиген (например, бакуловирусные частицы) иммобилизировали в 384-луночных планшетах для ELISA (Nunc Maxisorp) посредством добавления 25 мкл 1% бакуловирусной суспензии в 50 мМ буфере на основе карбоната натрия с pH 9,6 в каждую лунку, обеспечения возможности частицам адсорбироваться на планшеты на протяжении ночи при 4°C. Лунки блокировали при помощи 50 мкл блокирующего буфера (PBS, содержавший 0,5% BSA) в течение 1 часа при комнатной температуре. После трехкратного промывания планшетов при помощи PBS очищенные антитела серийно разводили в блокирующем буфере, 25 мкл добавляли в двух повторностях в лунки для ELISA и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали 6 раз при помощи PBS и в каждую лунку добавляли 25 мкл 10 нг/мл антитела козы к человеческому IgG, (специфичного к Fc-гамма фрагменту), конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson). Планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали 6 раз в PBS и в каждую лунку добавляли 25 мкл ТМВ-субстрата. Реакции останавливали спустя 15 минут посредством добавления 25 мкл 1 М фосфорной кислоты в каждую лунку и считывали поглощательную способность на 450 нм с длиной сравнения 620 нм. Показатель BV рассчитывали по средним 6 результатам определения оптической плотности, каждый из которых был нормализован путем деления на средний сигнал, наблюдаемый для лунок без покрытия. Для анализов с клеточными мембранами Sf9 вместо бакуловирусных частиц для нанесения покрытия на планшеты для ELISA использовали 2% суспензию сырых мембран. Ни на одной из стадий в буферы не добавляли детергенты.

Пример 5

Анализ FACS

Клетки HEK293 ресуспендировали в 10% фетальной бычьей сыворотке-DMEM в количестве 5×106 клетки/мл и переносили в U-донные 96-луночные планшеты в количестве 100 мкл/лунка. Равный объем IgG (с конечной концентрацией 30-50 нМ), разведенный в PBS (150 мМ NaCl, 10 мМ фосфат натрия, pH 7,4), добавляли к клеткам и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. Клетки затем промывали 3 раза при помощи ледяного PBS, инкубировали с конъюгатом антитела к человеческому Fc IgG-R-фикоэритрин (Jackson Immunoresearch) или конъюгатом антитела к человеческому IgG-Alexa488 (Molecular Probes) в течение 30 мин при 4°C, промывали два раза в ледяном PBS и фиксировали в PBS при помощи 0,1% параформальдегида. Клетки анализировали в проточном питометре FACSCaliburlow (BD Biosciences) при помощи автоматического пробоотборника с высокой пропускной способностью.

Пример 6

Статистический анализ

Все статистические анализы осуществляли при помощи R (R Development Core Team (2011). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, доступная онлайн на R-project[dot]org). Оценка характеристики показателя BV при точном определении быстро и медленно выводящихся антител при помощи соотношения неравенства, которое описано в легенде для фигуры 5, была оптимистичной, так как ее осуществляли при помощи такого же набора данных, который был использован для определения порога сортировки, который составлял BV=5. Более консервативную оценку полезности анализа in vitro получали для порога выведения 10 мл/кг/день при помощи 5-кратной перекрестной проверки и регрессивного моделирования для определения порога показателя BV; этот подход давал меньшую оценку соотношения неравенства, составлявшую 14,1 (95% доверительный интервал (2.4,113.3)).

Пример 7

Прогнозное масштабирование выведения у человека относительно выведения у макак

При помощи немного большего набора данных, чем ранее доступный 8, мы подтверждали сильную корреляцию между значениями выведения, измеренными у яванских макак и людей (фиг. 1, коэффициент корреляции Спирмана (ρ) = 0,74). Получали простой принцип масштабирования, который заключался в том, что выведение, измеренное у людей, было приблизительно в 2 раза медленнее, чем выведение, измеренное у яванских макак, причем антитело к NRP1 было резко отклоняющимся значением.

Пример 8

Характеристика структурных вариантов и выведения у яванских макак для панели терапевтических антител

При нормальном ходе доклинических исследований фармакокинетические данные от яванских макак собирали для 52 гуманизированных и человеческих антител. Преобладающим изотипом таких антител был IgG1, каппа (n=46). Такая панель антител также включала 4 IgG1, лямбда, и 2 IgG4, каппа антитела. Антитела IgG4 включали стабилизирующую шарнир замену 17 S228P. Пять из 52 антител были агликозилированными для уменьшения эффекторной функции, 1 было афукозилированным для повышения ADCC активности, и 3 имели аминокислотные замены в Fc для устранения или повышения связывания с FcgammaR. Вариабельные домены таких антител были либо гуманизированными (n=32), либо полученными из синтетических фаговых библиотек 18 человеческого антитела (n=16), либо человеческими (n=3), либо мышиными (n=1; ритуксимаб). У таких антител наблюдали широкий диапазон значений выведения (фиг. 2), при этом 15 (29%) антител характеризовались выведением, превышавшим 10 мл/кг/день.

Разработали гипотезу, что быстрое выведение связано с антителами синтетической библиотеки. Антитела, полученные из синтетических фаговых библиотек человеческих антител, выбирали и оптимизировали посредством in vitro отбора 18. Для достижения необходимой аффинности и активности для большинства из них было необходимо созревание аффинности в результате аминокислотных изменений в их определяющих комплементарность областях (CDR). Несмотря на то что многие из гуманизированных антител также имели замены в CDR относительно последовательности грызунов для улучшения либо аффинности, либо химической стабильности, как правило гуманизированные антитела были подвергнуты меньшей оптимизации in vitro. Проблема с отбором in vitro заключалась в том, что он может случайно привести к нецелевым взаимодействиям, поскольку отрицательный отбор, который можно осуществлять in vitro, является менее обширным, чем отбор, который может иметь место in vivo 13. Тем не менее, сравнение полученных из гуманизированных и синтетических библиотек антител показывало перекрывающийся диапазон значений выведения (фиг. 3). Медианное значение выведения составляло 6,5 мл/кг/день для гуманизированных антител и 9,0 мл/кг/день для человеческих антител из синтетических фаговых библиотек. Такие данные не обеспечивали доказательство взаимосвязи между антителами из синтетической библиотеки и быстрым выведением (P=0,28, критерий Уилкоксона).

Пример 9

Аффинность связывания для яванских макак

Для того, чтобы проверить, можно ли рассчитать вариации в связывании FcRn для наблюдаемого диапазона значений выведения, мы использовали способы на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для определения значений KD для связывания таких антител с очищенным FcRn яванского макака при pH 5,8. Поскольку связывание IgG-FcRn представляет собой относительно слабое взаимодействие, для определения констант связывания мы применяли описанный ранее статистический подход 11. Авидные эффекты, возникавшие в результате 2:1 FcRn:IgG взаимодействий, устраняли посредством иммобилизации каждого из доступных для анализа антител (n=44). Значения KD, определенные таким образом, варьировали от приблизительно 250 нМ до 1500 нМ. Поскольку каждое антитело иммобилизировали раздельно при помощи рандомного связывания через аминогруппы с сопутствующей неоднозначностью ориентации на поверхности микрочипа для биосенсора, диапазон значений KD не был неожиданным. В результате множества (n=7) определений KD для пертузумаба получали среднее, составлявшее 940±140 (S.D.) нМ. При помощи способа измерения можно определить изменения аффинности FcRn, поскольку мы могли воспроизвести эффекты связывания (данные не показаны) для мутантов Fc с известным повышением аффинности к FcRn 19. Более быстрое выведение, наблюдаемое для некоторых антител, не связано с измененной аффинностью связывания при низком pH к FcRn яванского макака (фиг. 4). В действительности, сравнение нескольких антител с примерно идентичными аффинностями связывания FcRn давало почти 30-кратный диапазон значений выведения. Посредством отдельных экспериментов (данные не показаны) определяли, что скорость диссоциации FcRn яванского макака от таких антител при pH 7,4 была быстрой и эквивалентной по всей протестированной панели. Несмотря на то что такие эксперименты не достаточны для исключения изменения пути рециркуляции для некоторых антител в качестве объяснения наблюдаемого быстрого выведения, по-видимому, маловероятно, что значительное изменение аффинности связывания при pH 5,8 или кинетики высвобождения при нейтральном pH играет основную роль в быстром выведении.

Пример 10

Разработка анализа in vitro для уменьшения риска быстрого выведения

Наблюдаемое быстрое выведение для нескольких антител было связано со специфичным 14, 15 или неспецифичным 13, 16 нецелевым связыванием. При создании и оптимизации антител большинство антител в нашей панели подвергали скринингу на предмет недостатка связывания с близко родственными гомологами антигенов. В дополнение к этому, многие антитела, полученные с помощью фагового дисплея, отбирали в присутствии добавок для предупреждения насыщения для неспецифичного связывания. Как отмечено в работе у Wu et al. 13, скрининг посредством ELISA с ограниченным разнообразием антигенов не может определить вид специфичного или неспецифичного нецелевого связывания, которое может влиять на поведение in vivo. Поэтому мы пытались разработать in vitro анализ, подходящий для выявления вероятности наблюдения у антител-кандидатов быстрого выведения. В ходе экспериментов с применением интактных BV частиц, несущих специальные, связанные с мембраной мишени в качестве антигена в анализах ELISA21, мы отмечали, что некоторые антитела связывались с бакуловирусными частицами, которые не экспрессировали мишень. Также было показано, что большое количество таких антител неспецифично связывались с неэкспрессирующимися человеческими 293 клетками в ходе FACS (данные не показаны). Однако, экспрессия некоторых родственных антигенов на 293 клетках затрудняла различие специфичного связывания от неспецифичного.

Результаты предварительного скрининга из тестового набора из 15 антител, выбранных из панели из фигуры 2, позволяли предположить, что быстро выводящиеся антитела неспецифично связывались в ходе бакуловирусного (BV) ELISA. Затем, в анализе тестировали более крупную группу из 45 антител. Несмотря на то что имела место значительная изменчивость, более высокий показатель в анализе in vitro был связан с более быстрым выведением у яванского макака (фиг. 5). Пороги, составлявшие >10 мл/кг/день для ʺбыстрогоʺ выведения и >5 для нормализованного показателя BV, были пригодными для количественной оценки этих данных. Значение выведения, составлявшее 10 мл/кг/день, превышало 1 стандартное отклонение от среднего значения (6,5±2,9), определенного для 12 человеческих антител IgG1 у макак 8. При таких порогах 9 антител корректно выявляли (ʺистинно положительныеʺ) как имеющие быстрое выведение у макак, лишь с 3 ʺложно положительнымиʺ антителами со значениями выведения <10 мл/кг/день, у которых наблюдали нормализованный показатель BV>5. Четыре антитела были ʺложно отрицательнымиʺ, имеющими выведение, превышавшее 10 мл/кг/день, и показатель BV<5. Остальные 29 антител корректно выявляли как ʺистинно отрицательныеʺ.

Несмотря на то что набор данных (n=16) был меньшим, повышенный риск быстрого выведения у людей также был связан с высоким показателем BV (фиг. 5В; ρ Спирмена = 0,83). В ходе анализа у людей корректно выявляли пять антител с выведением, превышавшим 5 мл/кг/день. В частности, антитело к NRP1, которое имело выведение <10 мл/кг/день у яванских макак, определяли как истинно положительное для выведения у человека в ходе BV ELISA. В ходе анализа не выявляли одно антитело с выведением >5 мл/кг/день у людей и >10 мл/кг/день у яванских макак. Остальные 10 антител корректно классифицировали как имеющие медленное выведение у людей.

Мы тестировали, можно ли BV ELISA проспективно применять для облегчения при отборе кандидатов посредством дальнейшего конструирования антитела 47. Оно представляло собой гуманизированное антитело с аминокислотными изменениями CDR как для улучшения аффинности, так и для удаления возможных недостатков последовательностей. Яванский макак является видом с неспецифичным связыванием что касается антитела 47. Не наблюдали воспроизводимое окрашивание ткани у макак с антителом 47, но для такого антитела у яванских макак определяли выведение, составлявшее 20,2 мл/кг/день. У варианта антитела 47, который сохранял 2 изменения созревания аффинности и аминокислотное изменение для удаления потенциального N-связанного участка гликозилирования в одной из CDR тяжелой цепи (антитело 47b), наблюдали уменьшенное связывание в BV ELISA. Антитело 47 с сохраняло только аминокислотное изменение для удаления потенциального N-связанного участка гликозилирования, а также имело уменьшенное связывание BV. Результаты отдельных экспериментов показывали, что большой вклад в связывание BV у антитела 47 был сделан посредством изменения VL-D27cS для удаления потенциального участка изомеризации Asp-Gly. У яванских макак антитела 47b и 47с имели более медленное выведение по отношению к антителу 47.

Пример 11

Неожиданным был широкий разброс значений выведения у яванских макак, измеренных для такой панели антител, а также более быстрое выведение (>10 мл/кг/день), наблюдаемое для 15 из этих антител. Так как 40 из 52 антител имели идентичные Fc последовательности человеческого IgG1, предполагали, что более быстрое выведение не могло быть связанным с изменениями во взаимодействии с FcRn. В действительности, несмотря на то, что измеренная KD для связывания FcRn при pH 5,8 варьировала в 7-кратном диапазоне, это не было связано с трендом у значений выведения. Учитывая, что относительно большие увеличения аффинности к FcRn при pH 5,8 приводили к умеренному улучшению выведения19, не было удивительным, что малые различия аффинности к FcRn, определенные в настоящем эксперименте, не оказывали влияния на выведение. У всех протестированных антител наблюдали эквивалентное или быстрое высвобождение от FcRn при нейтральном pH. В противоположность результатам, которые сообщались у Wang et al22, мы не определяли взаимосвязи между выведением и влиянием Fab части антитела на скорость высвобождения от FcRn при нейтральном pH. В ходе нашего исследования применяли более крупную панель антител и иную ориентацию экспериментов SPR для минимализации авидных эффектов на связывание.

Учитывая, что наибольшее отличие между антителами в нашей панели заключалось в вариабельных доменах, и, в частности, в CDR, вероятно, что различия в составе таких доменов вносят вклад в вариабельность характеристик выведения. Другие группы наблюдали эффекты на выведение, связанные с изменениями последовательности CDR, которые не были связаны с различиями аффинности связывания с целевым антигеном 13, 16. Нами не было обнаружено, что выведение связано с изоэлектрической точкой (pI) или гидрофобностью интактного антитела (дополн. фиг. 1А, В). В работе Igawa et al. 23 ранее было показано, что выведение человеческого антитела IgG1 у яванских макак можно уменьшить посредством изменений вариабельного домена, которые приводят в результате к более низкой pI. Этот эффект наблюдали при дозе, при которой происходило значительное антиген-зависимое выведение. Было предположено, что механизм не зависит от FcRn. Для сравнения большой панели антител с фармакокинетическими данными, собранными при дозах, при которых период полувыведения зависел от FcRn, скорости выведения не зависели от pI. Оговоркой для этого утверждения является то, что большинство антител согласно этому анализу были объединены в относительно узком диапазоне значений pI (7,5-9,5), поэтому можно было наблюдать тренд, если протестировать широкий диапазон pI. В дополнение к этому, нами было обнаружено, что выведение не коррелировало с суммарным зарядом, рассчитанным для Fv антитела (дополн. фиг. 1С). Таким образом, физиохимические свойства антитела, которые в результате приводят к быстрому выведению, не просто распознать, исходя только из результатов сравнений последовательностей, и они могут нуждаться в более подробном структурно-функциональном анализе.

В настоящем описании мы показывали, что простой анализ неспецифичного связывания можно применять для определения антител с повышенным риском наличия быстрого выведения как у людей, так и у яванских макак. В настоящем анализе, который основан на связывании антител с вирусными частицами, полученными из клеток инфицированных бакуловирусом насекомых, используют простой формат ELISA, и анализ можно применять с высокой пропускной способностью. Поскольку фармакокинетические данные определяли у видов млекопитающих, то можно было ожидать, что анализ, основанный на неспецифичном связывании с клетками млекопитающих, покажет более сильную корреляцию с быстрым выведением. Из предварительных результатов видна корреляция между быстрым выведением и неспецифичным связыванием с человеческими 293 клетками, определенным посредством FACS, но широкое применение этого анализа было затруднено, поскольку на 293 клетках экспрессировалось большое количество родственных антигенов для такой коллекции антител. BV ELISA анализ, который был нами разработан, не страдал от такого ограничения экспрессии мишени. Для антител, которые можно оценить при помощи обоих анализов, наблюдали такой же тренд для неспецифичного связывания (данные не показаны). Отпочковавшиеся бакуловирусные вирионы представляли собой стабильные наночастицы, которые имитировали инфицированные клеточные поверхности, обеспечивая комплексную смесь фосфолипида, углевода, гликопротеинов, внеклеточного матрикса и нуклеиновых кислот, а также вирусный капсид.24, 25 Антиген предположительно также содержал дебрис некоторых клеток насекомых, включавший белок, мембраны и нуклеиновые кислоты. У такой смеси отсутствовали специфичные цели терапевтических антител, в то же время сохранялась та же общая биохимической сложность, поскольку человеческие клетки и ткани обладали преимуществами при анализе неспецифичного связывания так, как с помощью него можно определять различные виды взаимодействий в различных антителах, например, электростатические в зависимости от гидрофобных.

Важной оговоркой в отношении связи между выведением антител у яванских макак и связыванием с BV частицами является то, что, за исключением для антитела 47, это было наблюдение, основанное на данных, собранных в ходе обычного доклинического испытания, а не разработанного эксперимента, в котором связывание BV частиц систематически изменялось. Значения выведения получали в результате отдельных исследований с широко изменяющимися уровнями доз и при помощи изменения типов анализа PK. Однако, при доступности достаточных данных для получения оценки, было обнаружено, что связь между быстрым выведением у яванских макак и связыванием BV сохранялась среди уровней доз, типов анализа и источников антител и типов мишеней.

Риск быстрого выведения можно уменьшить с помощью анализа для минимализации внесения неспецифичного связывания в ходе конструирования антитела. В антителе 47 как уменьшение заряда, так и повышенная гидрофобность были связаны с повышенным неспецифичным связыванием с частицами BV. Варианты с пониженным неспецифичным связыванием имели более медленное выведение. Не ожидали, что BV ELISA будет надежным анализом специфичных нецелевых эффектов. Например, гуманизированное антитело, которое, как было показано ранее, характеризовалось быстрым выведением у мышей в связи с непредусмотренным специфичным связыванием с белком комплемента14, не характеризовалось выявляемым связыванием с BV частицами (не показано). По нашему опыту, специфичные нецелевые эффекты менее распространены, чем антитела с более широким нецелевым связыванием. Кроме того, специфичные нецелевые эффекты обычно можно выявить посредством исследований механизма быстрого выведения.

С помощью ELISA на основе BV частиц определяли большинство, но не все антитела с быстрым выведением у яванских макак, с несколькими ложно положительными результатами. Таким образом, анализ необходимо рассматривать как инструмент для скрининга для уменьшения числа терапевтических антител, которые нуждаются в проверке в NHP РК экспериментах, но не как анализ, который закономерно прогнозирует выведение у яванских макак. Если доступно множество кандидатов со сходными специфичными активностями к мишеням, так что приемлема низкая, но не нулевая доля ложно положительных результатов, то этот анализ представляет собой экономически эффективный инструмент для минимизации риска быстрого выведения. BV ELISA анализ можно улучшить, если можно выявить основание для ложно отрицательных результатов. Что касается мембран из клеток млекопитающих, фосфолипидный состав мембран клеток насекомых обогащен фосфатидилинозитолом, фосфатидилхолином и фосфотидилэтаноламином, при этом имеет более низкие уровни кислого фосфолипида фосфатидилсерин, холестерола, глико- и сфинголипидов24. Более высокие количества нейтральных фосфолипидов можно рассчитать для ложно отрицательных результатов в анализе, если более быстрое выведение таких антител связано со связыванием с кислыми фосфолипидами на мембранах млекопитающих. Два из четырех ложно отрицательных антител имели высокий суммарный положительный заряд для домена Fv. Будет интересно исследовать, можно ли управлять фосфолипидным составом BV частиц посредством ростовых условий или различий линий клеток с сопутствующим улучшением достоверности анализа неспецифичного связывания. Такие исследования могут дополнительно осветить особенности, которых необходимо избегать в ходе конструирования антител для сохранения приемлемых фармакокинетических характеристик.

Пример 12

Оптимизация выведения антител

В настоящем примере мы тестировали, можно ли BV ELISA проспективно применять для облегчения отбора кандидатов посредством дополнительного конструирования.

Антитело 47 представляло собой гуманизированное антитело с аминокислотными изменениями CDR как для улучшения аффинности, так и для удаления возможных недостатков последовательностей. Яванский макак является видом с неспецифичным связыванием что касается антитела 47. Не наблюдали воспроизводимое окрашивание ткани у макак с антителом 47, но для такого антитела у яванских макак определяли выведение, составлявшее 20,2 мл/кг/день. У варианта антитела 47, который сохранял 2 изменения созревания аффинности и аминокислотное изменение для удаления потенциального TV-связанного участка гликозилирования в одной из CDR тяжелой цепи (антитело 47b), наблюдали уменьшенное связывание в BV ELISA (таблица 1). Антитело 47 с сохраняло только аминокислотное изменение для удаления потенциального N-связанного участка гликозилирования, а также имело уменьшенное связывание BV. Результаты отдельных экспериментов показывали, что большой вклад в связывание BV у антитела 47 был сделан посредством изменения для удаления потенциального участка изомеризации Asp-Gly. У яванских макак антитела 47b и 47с имели более медленное выведение по отношению к антителу 47 (таблица 1).

Таким образом, этот анализ можно применять в качестве быстрой оценки выведения и облегчения в исследовании клинически релевантных антител с более низким выведением по сравнению с исходным антителом.

Перечень литературы

1. Reichert, J.M. Marketed therapeutic antibodies compendium. mAbs 4 (2012).

2. Wang, W., Wang, E.Q. & Balthasar, J.P. Monoclonal antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics. Clinical pharmacology and therapeutics 84, 548-558 (2008).

3. Tabrizi, M.A., Tseng, C.M. & Roskos, L.K. Elimination mechanisms of therapeutic monoclonal antibodies. Drug discovery today 11, 81-88 (2006).

4. Mager, D.E. Target-mediated drug disposition and dynamics. Biochemical pharmacology 72, 1-10 (2006).

5. Mould, D.R. & Green, B. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies: Concepts and Lessons for Drug Development. Biodrugs 24, 23-39 (2010).

6. Kuo, T.T. & Aveson, V.G. Neonatal Fc receptor and IgG-based therapeutics. mAbs3, 422-430 (2011).

7. Keizer, R.J., Huitema, A.D.R., Schellens, J.H.M., Beijnen, J.H. Clinical Pharmacokinetics of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Clinical Pharmacokinetics 49, 493-507 (2010).

8. Deng, R. et al. Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned? mAbs 3, 61-66 (2011).

9. Dall'Acqua, W.F., Kiener, P.A. & Wu, H. Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FcRn). The Journal of biological chemistry 281, 23514-23524 (2006).

10. Hinton, P.R. et al. An Engineered Human IgG1 Antibody with Longer Serum Half-Life. J Immunol 176, 346-356 (2006).

11. Yeung, Y.A. et al. Engineering human IgGl affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates. J Immunol 182, 7663-7671 (2009).

12. Zalevsky, J. et al. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nature biotechnology 28, 157-159 (2010).

13. Wu, H. et al. Development of motavizumab, an ultra-potent antibody for the prevention of respiratory syncytial virus infection in the upper and lower respiratory tract. Journal of molecular biology 368, 652-665 (2007).

14. Bumbaca, D. et al. Highly specific off-target binding identified and eliminated during the humanization of an antibody against FGF receptor 4. mAbs 3, 376-386 (2011).

15. Vugmeyster, Y. et al. Complex pharmacokinetics of a humanized antibody against human amyloid beta peptide, anti-abeta Ab2, in nonclinical species. Pharmaceutical research 28, 1696-1706 (2011).

16. Vugmeyster, Y. et al. In vitro potency, pharmacokinetic profiles and phamacological activity of optimized anti-IL-21R antibodies in a mouse model of lupus. mAbs 2, 335-346 (2010).

17. Angal, S. et al. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Molecular immunology 30, 105-108 (1993).

18. Lee, C.V. et al. High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold. Journal of molecular biology 340, 1073-1093 (2004).

19. Yeung, Y.A. et al. A therapeutic anti-VEGF antibody with increased potency independent of pharmacokinetic half-life. Cancer research 70, 3269-3277 (2010).

20. Dennis, M.S. & Lowman, H.B. in Phage Display, Vol. 266. (eds. T. Clackson & H.B. Lowman) 61-94 (Oxford University Press, Oxford, UK; 2004).

21. Hotzel, I. et al. Efficient production of antibodies against a mammalian integral membrane protein by phage display. Protein engineering, design & selection: PEDS 24, 679-689 (2011).

22. Wang, W. et al. Monoclonal antibodies with identical Fc sequences can bind to FcRn differentially with pharmacokinetic consequences. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 39, 1469-1477 (2011).

23. Igawa, T. et al. Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region. Protein engineering, design & selection: PEDS 23, 385-392 (2010).

24. Marheineke, K. Lipid Composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters 441, 4 (1998).

25. Wang, R. et al. Proteomics of the Autographa californica nucleopolyhedrovirus budded virions. Journal of virology 84, 7233-7242 (2010).

26. Deng, R. et al. Pharmacokinetics of humanized monoclonal anti-tumor necrosis factor-{alpha} antibody and its neonatal Fc receptor variants in mice and cynomolgus monkeys. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 38, 600-605 (2010).

27. Stone, M. Cross-validatory choice and assessment of statistical predictions. Journal of the Royal Statistical Society Ser. В 36, 111-147 (1974).

28. Geisser, S. The predictive sample reuse method with applications I. Amer. Stat. Assoc. 70, 320-328 (1975).

1. Способ предварительной оценки, будет ли терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из полипептида, антитела или иммуноадгезина, иметь необходимую скорость выведения у яванского макака, человека или яванского макака и человека, где необходимая скорость выведения представляет собой скорость выведения менее или равную около 12 мл/кг/день, при этом способ включает стадию нанесения покрытия на микротитрационный планшет с бакуловирусными частицами (BV), контактирование терапевтического средства с бакуловирусной частицей (BV), измерение уровня связывания терапевтического средства с BV, измерение уровня связывания терапевтического средства с микротитрационным планшетом без BV и расчет показателя BV для терапевтического средства на основании уровня связывания терапевтического средства с BV, где показатель BV рассчитывают из среднего значения, полученного в анализах связывания, в которых измеряют уровень связывания терапевтического средства с BV, деленного на среднее значение, полученное в анализах связывания, в которых измеряют уровень связывания терапевтического средства без BV, причем показатель BV выше 5 указывает на повышенную вероятность того, что терапевтическое средство будет иметь быструю скорость выведения, при этом быстрая скорость выведения выше 12 мл/кг/день, а показатель BV ниже 5 указывает на повышенную вероятность того, что терапевтическое средство будет иметь необходимую скорость выведения.

2. Способ по п. 1, в котором терапевтическое средство помечено при помощи реагента для детекции.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию связывания второго средства, содержащего реагент для детекции, с терапевтическим средством.

4. Способ по п. 2, в котором измеряют сигнал от реагента для детекции.

5. Способ по п. 1, в котором указанный способ включен в анализ ELISA.

6. Способ по п. 1, в котором ни на одной из стадий не присутствуют детергенты.

7. Набор для определения того, будет ли терапевтическое средство иметь необходимую скорость выведения, где отбор терапевтического средства осуществляют посредством способа по п. 1, при этом набор содержит бакуловирусную частицу и инструкцию для анализа ELISA.

8. Способ получения терапевтического средства, включающий стадию отбора терапевтического средства, которое характеризуется необходимой скоростью выведения у людей, где отбор терапевтического средства осуществляют посредством способа по п. 1, и экспрессии терапевтического средства в клетке-хозяине.

9. Способ по п. 8, дополнительно включающий стадию выделения терапевтического средства, экспрессируемого клеткой-хозяином.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин и предназначено для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения риска развития артериальной гипертензии. Осуществляют забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и определение инсерции/делеции (I- и D-аллели) Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики острого лимфобластного лейкоза у пациента, включающий выявление признаков лейкоза, тестирование клеток крови на лейкоз, инкубирование клеток крови фактором, идуцирующим лейкоз, с тем, чтобы индуцировать экспрессию клеточных поверхностных маркеров, которые являются признаком лейкоза, где фактор, индуцирующий лейкоз - это супернатант Aspergillus flavus, EBV-инфицированный CCL87 супернатант, очищенная EBV культура или их комбинации.

Изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов кори.

Изобретение относится к медицине и описывает способ идентификации модуляторов активности фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий а) получение 4-нитрокатехола, ковалентно связанного с Alexa Fluor® 488, б) приведение в контакт молекулы из этапа а) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (COMT), S-аденозилметионином (SAM) и соединением-кандидатом и в) измерение показателей флуоресценции смеси из этапа б), в котором измененные показатели флуоресценции в присутствии соединения-кандидата по сравнению с контролем являются признаком наличия модулятора фермента катехол-O-метилтрансферазы (COMT).

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для обнаружения модифицированных нуклеотидов в составе РНК. Осуществляют подбор подходящей для исследуемой области РНК пары олигонуклеотидных зондов, подбор пары донора и тушителя флуоресценции с подходящими оптическими свойствами.

Изобретение относится к способам определения эффективности лиганда ионного канала. Ex vivo способ определения эффективности лиганда ионного канала in vivo в зависимости от присутствия плазмы, включает стадии: a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) лигандом ионного канала и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) соединением, которое определяют как лиганд ионного канала, и b) определение эффекта соединения на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с плазмой животного, которому был введен лиганд ионного канала, и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку.

Изобретение относится к способу маркировки парных спиральных филаментов (PHF), включающему взаимодействие PHF с соединением и детектирование присутствия указанного соединения, где соединение имеет формулу , в которой -R- означает , -Q- выбран из: -NHC(O)-, -N=N-, -CH=CH-; -P выбран из: ; -T выбран из: ; X представляет собой N или CH; -W1-6, -G1-4, -Р1-5 являются такими, как указано в формуле изобретения.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской диагностики. Предложен способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.

Изобретение относится к визуализирующим агентам, подходящим для оптической визуализации in vivo организма млекопитающего. .
Изобретение относится к области медицины, к лабораторной диагностике в гинекологии и касается способа определения вида эндометриоза яичника. Способ включает анализ транскриптома эндометриоидной ткани очага эндометриоза яичника путем проведения исследования экспрессии гена TIMP1, при превышении экспрессии гена TIMP1 относительно гена выше 0,5 о.е.
Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии. Для этого после удаления селезенки определяют ее массу.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей для прогнозирования возникновения рецидива. Для этого с помощью проточной цитофлюориметрии проводят определение процентного содержания T-regs(CD3+CD4+CD25+CD127dim) лимфоцитов от количества CD3+CD4+клеток в гомогенатах образцов опухолевой ткани и в ткани линии резекции после хирургического удаления опухоли.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики анаэробной энтеротоксемии сельскохозяйственных животных, вызываемой бактериями Clostridium perfringens (Cl.

Изобретение относится к области медицины, а именно к авиакосмической медицине, и может быть использовано для оценки оптимального уровня компенсаторно-приспособительных и адаптационных возможностей организма космонавтов в условиях космического полета.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогинекологии, и может быть использовано для прогноза возникновения рецидива у больных раком вульвы. Для этого в ткани больных раком вульвы иммуногистохимическим методом полуколичественно оценивают экспрессию маркеров ангиогенеза - CD34, апоптоза - р53, пролиферативной активности - Ki-67.

Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования вероятности развития метастазов в лимфоузлы у пациентов с диагнозом рак желудка. Осуществляют амплификацию фрагментов генетических локусов В2М, HV2 и CFLAR методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с помощью набора высокоспецифичных праймеров на матрице выделенной ДНК, проводят количественную интерпретацию результатов амплификации и расчет относительной копийности генов по формуле rC=2-(Ct(ген мишень)-Ct(B2M)), где rС - относительная копийность гена в опухолевой ткани, Ct - среднее значение сигналов флюоресценции, сравнивают полученные значения относительной копийности генов с прогностическими, и при значениях rСHV2<870 и rСCFLAR>0,40 прогнозируют отсутствие метастазов, а при значениях rСHV2>870 и rСCFLAR<0,40 прогнозируют развитие метастазов.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологи, и представляет собой способ подготовки пробы для проведения иммунофлюоресцентного исследования при диагностике болезни Хейли-Хейли, включающий размещение на предметном стекле криостатных срезов кожи лабораторного животного, нанесение на них типированной сыворотки больного, инкубацию при температуре 37,2°C во влажной камере в течение 45 мин, промывку срезов, отличающийся тем, что криостатные срезы кожи лабораторного животного предварительно обрабатывают 100% охлажденным ацетоном с температурой 4,0-6,0°C в течение 3-5 мин, затем высушивают в течение 2-3 мин при комнатной температуре, причем промывку срезов осуществляют в течение 3-5 минут.

Изобретение относится к медицине и к клинической биохимии и может быть использовано для оценки содержания циркулирующих десиалированных липопротеидов низкой плотности (цмЛПНП).

Изобретение относится к области анализа биологических проб. Способ анализа проб включает в себя анализ клинико-химических и иммунологических параметров, а также включает установку картриджей для реагентов в приемное устройство, установку сосуда для пробы в пробоприемник, определение клинико-химических и иммунологических параметров с применением измерительной кюветы, промывку или извлечение использованных измерительных кювет, извлечение использованных картриджей для реагентов и сосуда для проб.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связывают белок gB цитомегаловируса (CMV).

Настоящее изобретение касается способа предварительной оценки, будет ли терапевтическое средство, выбранное из группы полипептид, антитело или иммуноадгезин, иметь необходимую скорость выведения у яванского макака, человека. Сущность способа заключается в том, что наносят покрытие с баскуловирусными частицами на микротитрационный планшет. Далее проводят контактирование терапевтического средства с BV и проводят измерение уровня связывания терапевтического средства с BV. Также проводят измерение связывания терапевтического средства с микротитрационным планшетом без BV. Показатель BV рассчитывают из среднего значения, полученного в анализах связывания, в которых измеряют уровень связывания терапевтического средства с BV, деленного на среднее значение, полученное в анализах связывания, в которых измеряют уровень связывания терапевтического средства без BV. Показатель BV выше 5 указывает на повышенную вероятность того, что терапевтическое средство будет иметь быструю скорость выведения, при этом быстрая скорость выведения выше 12 млкгдень, а показатель BV ниже 5 указывает на повышенную вероятность того, что терапевтическое средство будет иметь необходимую скорость выведения. Использование способа позволяет выявлять антитела, у которых наблюдается быстрое выведение из организма. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 12 пр.

Наверх