Доставка к цнс лечебных агентов

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для лечения лизосомных болезней накопления. Для этого осуществляют прямую доставку в ЦНС путем интратекального введения субъекту, страдающему от или предрасположенному к лизосомной болезни накопления, ассоциированной со снижением уровня или активности лизосомального фермента, композиции, содержащей замещающий фермент для замещения лизосомального фермента в концентрации выше примерно 5 мг/мл и до 50 мМ фосфата. Также предложены способы интратекальной доставки фермента, способы лечения синдрома Хантера, метахроматической лейкодистрофии, синдромов Санфилиппо типа А и типа В, лейкодистрофии глобоидных клеток. Группа изобретений позволяет осуществлять прямую доставку в ЦНС композиций, имеющих высокую концентрацию (более 5 мг/мл) замещающего лизосомального фермента и низкую концентрацию фосфата, не вызывая при этом существенных побочных эффектов. 11 н. и 62 з.п. ф-лы, 49 табл., 192 ил., 29 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительным заявкам на патент США под номерами 61/358,857 с датой подачи 25 июня, 2010; 61/360,786 с датой подачи 1 июля, 2010; 61/387,862 с датой подачи 29 сентября, 2010; 61/435,710 с датой подачи 24 января, 2011; 61/442,115 с датой подачи 11 февраля, 2011; 61/476,210 с датой подачи 15 апреля, 2011; и 61/495,268 с датой подачи 9 июня, 2011; каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки. Родственными для данной заявки являются заявки на патент США, озаглавленным "Способы и композиции для доставки в ЦНС гепаран-N-сульфатазы", с такой же датой подачи; "Способы и композиции для доставки в ЦНС идуронат-2-сульфатазы", та же дата подачи; "Способы и композиции для доставки в ЦНС β-галактоцереброзидазы", та же дата подачи; "Способы и композиции для доставки в ЦНС арилсульфатазы A", та же дата подачи; "Лечение синдрома Санфилиппо типа B", та же дата подачи; каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Заместительная ферментная терапия (ЗФТ) включает системное введение субъектам природных или рекомбинантных белков и/или ферментов. Одобренные терапевтические средства обычно вводят субъектам внутривенно и обычно они эффективны в лечении соматических симптомов первичной ферментной недостаточности. В результате ограниченного распределения введенного внутривенно белка и/или фермента по клеткам и тканям центральной нервной системы (ЦНС) лечение заболеваний, имеющих этиологию, связанную с ЦНС, является особенно сложной задачей, поскольку введенные внутривенно белки и/или ферменты не проникают в достаточной мере через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

[0003] Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) - это структурная система, состоящая из эндотелиальных клеток, функцией которых является защита центральной нервной системы (ЦНС) от вредных веществ в крови, таких как бактерии, макромолекулы (например, белки) и другие гидрофильные молекулы, путем ограничения проникновения подобных веществ через ГЭБ в спинномозговую жидкость (СМЖ) и ЦНС.

[0004] Существует несколько способов обойти ГЭБ для улучшения доставки терапевтического агента в мозг, в том числе прямая внутричерепная инъекция, кратковременная пермеабилизация ГЭБ и модификация активного агента, изменяющая распределение в тканях. Прямая инъекция терапевтического агента в ткани мозга полностью обходит сосудистую систему, но связана в первую очередь с риском осложнений (инфекция, повреждение тканей, иммунный ответ), которые возникают в результате внутричерепных инъекций и слабой диффузии активного агента из места введения. На настоящий момент прямое введение белков в мозговое вещество не обеспечило значительного терапевтического эффекта вследствие существования барьера для диффузии и ограниченного объема состава, который может быть введен. Была изучена диффузия с конвекцией через катетеры, размещенные в паренхиме мозга с использованием медленной долгосрочной инфузии (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), однако ни один способов одном из одобренных способов терапии не этот подход не используется для длительного лечения. Кроме того, размещение внутримозговых катетеров является крайне инвазивным и является менее желательной клинической альтернативой.

[0005] Также были предприняты попытки осуществить интратекальную (ИТ) инъекцию или введения белков в спинномозговую жидкость (СМЖ), но они также не привели к терапевтическому успеху. Одной из основных проблем в таком лечении является склонность активного вещества к очень плотному связыванию с эпендимной выстилкой желудочка, которое мешает последующей диффузии. В настоящее время отсутствуют разрешенные продукты для лечения генетического заболевания мозга путем прямой доставки агентов в СМЖ.

[0006] На самом деле, многие полагают, что барьер для диффузии на поверхности мозга, а также отсутствие эффективных и удобных способов доставки, являются слишком существенными препятствием для достижения соответствующего терапевтического эффекта в головном мозге при лечении любого заболевания.

[0007] Многие лизосомные болезни накопления затрагивают нервную систему, что особенно усложняет лечение этих болезней при помощи традиционных методов терапии. Часто встречаются значительные накопления глюкозоаминогликанов (ГАГ) в нейронах и в мозговых оболочках больных индивидов, что приводит к различным формам симптомов со стороны ЦНС. На сегодняшний день не известно случаев успешного лечения симптомов со стороны ЦНС, вызванных лизосомными болезнями, использованием доступных средств.

[0008] Таким образом, остается большая потребность в эффективной доставке терапевтических веществ в мозг. В частности, существует большая потребность в более эффективной доставке активных веществ в центральную нервную систему для лечения лизосомных болезней накопления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящее изобретение обеспечивает эффективный и менее инвазивный подход для прямой доставки терапевтических агентов в центральную нервную систему (ЦНС). В частности, настоящее изобретение основано на неожиданно обнаруженном факте, заключающемся в том, что замещающий фермент длч лизосомных болезней накопления может быть напрямую введен в спинномозговую жидкость (СМЖ) субъекта, нуждающегося в лечении, в высокой концентрации (например, более 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл или больше), благодаря чему фермент эффективно и активно проникает через различные поверхности и распространяется по различным областям мозга, включая глубокие области мозга. Совершенно неожиданно, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что доставка такой высокой концентрации белка может быть достигнута с использованием простых физиологических или буферных растворов, не вызывая существенных побочных эффектов, таких как резко выраженный иммунный ответ, у субъекта. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает высокоэффективный, клинически желательный и удобный для пациента подход для прямой доставки в ЦНС для лечения различных заболеваний и нарушений, связанных с компонентами ЦНС, в частности, лизосомных болезней накопления. Настоящее изобретение представляет собой значительное достижение в области направленной доставки веществ в ЦНС и фермент-заместительной терапии.

[0010] Среди прочего, настоящее изобретение относится к способам интратекального (ИТ) введения терапевтического агента (например, замещающего фермента) субъекту, нуждающемуся в лечении. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент может быть рекомбинантным, генно-активированным или природным ферментом. В настоящей заявке термины "интратекальное введение", "интратекальная доставка" или грамматические их эквиваленты относятся к инъекции в спинномозговой канал (интратекальное пространство, окружающее спинной мозг). В некоторых вариантах реализации "интратекальное введение" или "интратекальная доставка" в соответствии с настоящим изобретением относится к ИТ введению или доставке через поясничный отдел или область, т.е. поясничному (люмбальному) ИТ введению или доставке. В настоящей заявке термин "поясничный отдел" или "поясничная область" относится к области между третьим и четвертым поясничными позвонками (нижняя часть спины), включая L2-S1 отделы позвоночника. Предполагается, что поясничное ИТ введение или доставка отличается от доставки через заднюю мозжечково-мозговую цистерну (т.е. инъекция через окружающее пространство и ниже мозжечка через отверстие между черепом и верхней частью позвоночника) тем, что при поясничном ИТ введении или доставке в соответствии с настоящим изобретением обеспечивается лучшая и более эффективная доставка к дистальному спинному каналу, в то время как доставка через заднюю мозжечково-мозговую цистерну, среди прочего, как правило, не достигает дистального отдела спинномозгового канала.

[0011] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим стадию интратекального введения композиции, содержащей фермент, замещающий лизосомальный фермент, в концентрации более 5 мг/мл (т.е. более 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 75 мг/мл, или 100 мг/мл) субъекту, страдающему от или предрасположенному к лизосомной болезни накопления, связанной с уменьшением уровня или активности лизосомального фермента.

[0012] В некоторых вариантах реализации композиция дополнительно содержит один или более из следующих компонентов: (i) буферный агент, (ii) поверхностно-активное вещество или (iii) регулятор тоничности. В некоторых вариантах реализации композиция имеет pH примерно 3.0-8.0 (т.е. 4.0-7.5, 5.0-7.5, 5.5-7.7, 5.5-7.0, 6,0-7.0, 6.5-7.5, 6.5-7.0 или 5.5-6.5). В некоторых вариантах реализации композиция включает замещающий фермент в виде лекарственного вещества, которое не является синтетической СМЖ.

[0013] В некоторых вариантах реализации композицию вводят в виде одной дозы объемом менее примерно 15 мл (например, менее чем 10 мл, 9 мл, 8 мл, 7 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1,5 мл, 1.0 мл или 0.5 мл).

[0014] В некоторых вариантах реализации интратекальное введение композиции не приводит к существенному негативному эффекту у субъекта. В некоторых вариантах реализации интратекальное введение композиции не приводит к адаптивному Т-клеточно-опосредованному иммунному ответу.

[0015] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим стадию введения композиции, содержащей фермент, замещающий лизосомальный фермент, субъекту, страдающему или предрасположенному к лизосомной болезни накопления, связанной с уменьшением уровня или активности лизосомального фермента, причем введение включает интратекальное введение композиции в отсутствие сопутствующей терапии иммунодепрессантами. В некоторых вариантах реализации способ не включает индукцию иммунной толерантности у субъекта, которого лечат. В некоторых вариантах реализации способ не включает предварительное лечение или предварительную подготовку субъекта путем применения для иммуносупрессии T-клеток.

[0016] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим стадию интратекального введения субъекту, страдающему или предрасположенному к лизосомной болезни накопления, связанной с уменьшением уровня или активности лизосомального фермента, композиции, содержащей фермент, замещающий лизосомальный фермент, в терапевтически эффективной дозе и интервал введения такой, которые обеспечивают достижение по меньшей мере примерно 10% (например, по меньшей мере примерно 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%) нормальных уровней или активности лизосомальных ферментов в одной или более тканях мозга, спинного мозга и периферических органах.

[0017] В некоторых вариантах реализации одна или более тканей мозга, к которым доставляется фермент, содержит менингеальную ткань. В некоторых вариантах реализации менингеальная ткань выбрана из группы, включающей мягкую мозговую оболочку, твердую мозговую оболочку и паутинную ткань.

[0018] В некоторых вариантах реализации одна или более тканей мозга, в которые доставляют фермент, включают ткань головного мозга. В некоторых вариантах реализации ткани головного мозга представляют собой поверхностные или неглубокие ткани головного мозга. В некоторых вариантах реализации поверхностные ткани головного мозга выбраны из группы, включающей ткани мягкой мозговой оболочки, ткани коры головного мозга, гиппокампа, ткани в пределах 4 мм от поверхности головного мозга, пространства Вирхова-Робина (ВР), кровеносных сосудов пространства ВР, гиппокампа, частей гипоталамуса на нижней поверхности головного мозга, зрительных нервов и трактов, обонятельной луковицы и проекций и их комбинаций.

[0019] В некоторых вариантах реализации ткани головного мозга, в которые доставляют фермент, представляют собой глубокие ткани головного мозга. В некоторых вариантах реализации глубокие ткани головного мозга выбраны из группы, включающей ткани, расположенные глубже коры головного мозга, ткани, расположенные глубже 4 мм от поверхности коры головного мозга, ткани, лежащие глубже 6 мм от поверхности коры головного мозга, ткани, лежащие глубже 10 мм от поверхности коры головного мозга, промежуточного мозга, гипоталамуса, таламуса, вентрального таламуса (субталамуса), заднего мозга, ножек мозга, красного ядра, ядра III черепных нервов, глубокого серого вещества, чечевицеобразных ядер, базальных ганглиев, хвостатого ядра, скорлупу, миндалевидное тело, бледный шар и их комбинации.

[0020] В некоторых вариантах реализации одна или более тканей мозга, в которые доставляют фермент, включает ткани мозжечка. В некоторых вариантах реализации ткани мозжечка выбраны из группы, включающей ткани молекулярного слоя, ткани слоя клеток Пуркинье, ткани зернистого слоя, мозжечковых ножек и их комбинаций. В некоторых вариантах ткани мозжечка представляют собой глубокие ткани мозжечка, выбранные из группы, включающие ткани слоя клеток Пуркинье, тканей зернистого слоя, глубокой ткани белого вещества мозжечка и тканей глубоких ядер мозжечка.

[0021] В некоторых вариантах реализации одна или более тканей мозга, в которые доставляют фермент, включает ткани ствола мозга. В некоторых вариантах реализации ткани ствола мозга выбраны из группы, включающей ткани белого вещества ствола головного мозга и/или ткани ядер ствола мозга.

[0022] В некоторых вариантах реализации одна или более тканей спинного мозга, в которые доставляют фермент, представляет собой поверхностные или неглубокие ткани спинного мозга. В некоторых вариантах реализации поверхностные или неглубокие ткани спинного мозга выбраны из группы, включающей мягкую оболочку, пути белого вещества, и ткани в пределах 4 мм от поверхности спинного мозга. В некоторых вариантах реализации одна или более тканей спинного мозга представляют собой глубокую ткань спинного мозга. В некоторых вариантах реализации глубокие ткани спинного мозга выбраны из группы, включающей серое вещество спинного мозга, клетки эпендимы и ткани, расположенные глубже 4 мм от поверхности поверхности спинного мозга.

[0023] В некоторых вариантах реализации одна или более тканей мозга, в которые доставляют фермент, включает поверхностные или неглубокие ткани. В некоторых вариантах поверхностные или неглубокие ткани выбраны из группы, включающей мягкую оболочку, твердую оболочку и паутинную ткань мозговой оболочки, ткани мягкой мозговой оболочки, ткани коры головного мозга, ткани в пределах 4 мм от поверхности головного мозга, а также их комбинации.

[0024] В некоторых вариантах реализации ткани, в которые доставляют фермент, включают глубокие ткани. В некоторых вариантах реализации глубокие ткани мозга выбраны из глубокого белого вещества головного мозга, глубокого серого вещества спинного мозга, мозолистого тела, перивентрикулярной ткани, таламуса, базальных ганглиев, промежуточного мозга, бахромки, тканей, лежащих глубже коры головного мозга, тканей, лежащих глубже 4 мм от поверхности головного мозга, тканей, лежащих глубже 6 мм от поверхности головного мозга, тканей, лежащих глубже 10 мм от поверхности головного мозга, слоя клеток Пуркинье, тканей зернистого слоя, глубокой ткани белого вещества мозжечка и глубоких тканей ядер мозжечка и их комбинации.

[0025] В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективные дозы лежат в диапазоне от 0,005 мг/кг веса мозга до 100 мг/кг веса мозга. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективной дозой является 1 мг/кг веса мозга (например, более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг веса мозга). В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективной дозой является доза более, чем 30 мг/кг веса мозга.

[0026] В некоторых вариантах реализации интервал введения составляет один раз в две недели. В некоторых вариантах реализации интервал введения составляет один раз в месяц. В некоторых вариантах реализации интервал введения составляет один раз в два месяца. В некоторых вариантах реализации интервал введения составляет два раза в месяц. В некоторых вариантах реализации интервал введения составляет один раз в неделю. В некоторых вариантах реализации интервал введения составляет два или несколько раз в неделю. В некоторых вариантах реализации введение является непрерывным, например, с использованием продолжительной насосной перфузии.

[0027] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим стадию введения субъекту, страдающему от или предрасположенному к лизосомной болезни накопления, связанной с пониженным уровнем или активностью лизосомального фермента, композиции, содержащей фермент, замещающий лизосомальный фермент, причем введение включает интратекальное введение композиции, что обеспечивает доставку замещающего фермента к глубоким тканям мозга, лежащим глубже по меньшей мере 5 мм от наружной поверхности (например, по меньшей мере на 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм, 10 мм, 11 мм, 12 мм или глубже внешней поверхности). В некоторых вариантах реализации замещающий фермент доставляют в глубокие ткани мозга, по меньшей мере, на 10 мм ниже наружной поверхности. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент является специфично доставляют в лизосомы клеток в глубоких тканях мозга.

[0028] В некоторых вариантах реализации глубокие ткани мозга, в которые доставляют фермент, выбраны из глубокого белого вещества головного мозга, глубокого серого вещества спинного мозга, мозолистого тела, перивентрикулярной ткани, таламуса, бахромки, тканей, лежащих глубже коры головного мозга, тканей, лежащих глубже 4 мм от поверхности головного мозга, тканей, лежащих глубже 6 мм от поверхности головного мозга, тканей, лежащих глубже 10 мм от поверхности головного мозга, слоя клеток Пуркинье, тканей зернистого слоя, глубокой ткани белого вещества мозжечка и ядер глубокой ткани мозжечка и их комбинации.

[0029] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим стадию введения интратекально субъекту, страдающему или предрасположенному к лизосомной болезни накопления, связанной с уменьшением уровня или активности лизосомального фермента, композиции, содержащей фермент, заменяющий лизосомный, который продуцируется в клетках человека.

[0030] В некоторых вариантах реализации лизосомная болезнь накопления выбрана из группы, состоящей из аспартилглюкозаминурии, болезни накопления холестериновых эфиров, болезни Вольмана, цистиноза, болезни Данона, болезни Фабри, липогрануломатоза, болезни Фабера, фукозидоза, галактосиалидоза VII типа, болезни Гоше I/II /III типов, глобоидной клеточной лейкодистрофии, болезни Краббе, болезни накопления гликогена II типа, болезни Помпе, GM1-ганглиозидоз I/II/III типов, GM2-ганглиозидоз I типа, болезни Тэя-Сакса, болезни Сандхофа, GM2-ганглиозидоза, α-маннозидоза I/II типов, β-маннозидоза, метахроматической лейкодистрофии, муколипидоза I типа, сиалидоза I/II типов, муколипидоза II/III типов, муколипидоза IV типа, I-клеточной анемии, муколипидоза IIIC типа, псевдо Хурлера полидистрофии, мукополисахаридоза I типа, мукополисахаридоза II типа, синдрома Хантера, мукополисахаридоза IIIA типа, синдрома Санфилиппо А типа, В типа или D типа (мукополисахаридоза IIIB типа, мукополисахаридоза IIIC типа, мукополисахаридоза IIID типа), мукополисахаридоза IVA типа, синдрома Моркио, мукополисахаридоза IVB типа, мукополисахаридоза VI типа, мукополисахаридоза VII типа, синдрома Слая, мукополисахаридоза IX типа, множественного дефицита сульфатазы, нейронного цероидного липофусциноза, CLN1 болезни Баттена, CLN2 болезни Баттена, болезни Ниман-Пика A/B типов, болезни Ниман-Пика C1 типа, болезни Ниман-Пика C2 типа, пикнодизостоза, болезни Шиндлера I/II типов, болезни Гоше и болезни накопления сиаловых кислот.

[0031] В некоторых вариантах реализации лизосомная болезнь накопления выбрана из группы, включающей синдром Хантера, метахроматическую лейкодистрофию (МЛД), синдром Санфилиппо типа A, синдром Санфилиппо типа В и болезнь глобоидной клеточной лейкодистрофии (ГЛД). В некоторых вариантах реализации замещающий фермент выбран из группы, включающей рекомбинантную идуромат-2-сульфатазу (I2S), арилсульфатазу A (ASA), гепаран N-сульфатазу (HNS), альфа N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu) и β-галактозидазу (GLC). В некоторых вариантах реализации замещающий фермент содержит остатки манноза-6-фосфата. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент представляет собой гибридный белок, содержащий часть, обуславливающую направленную доставку в лизосомы) (лизосомный таргетинг).

[0032] В некоторых вариантах реализации замещающий фермент доставляют в нейроны, глиальные клетки, периваскулярные клетки и/или менингеальные клетки. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент доставляют затем в нейроны в спинном мозге.

[0033] В некоторых вариантах реализации интратекальное введение дополнительно обеспечивает системную доставку замещающего фермента в периферические ткани-мишени. В некоторых вариантах реализации периферические ткани-мишени выбраны из печени, почек и/или сердца, эндотелия, костного мозга и клеток, происходящих из костного мозга, селезенки, легких, лимфатических узлов, костей и хрящей, яичников и семенников.

[0034] В некоторых вариантах реализации интратекальное введение вызывает лизосомную локализацию замещающего фермента в тканях-мишенях мозга, нейронах спинного мозга и/или периферических тканях-мишенях. В некоторых вариантах реализации интратекальное введение вызывает снижение Накопления ГАГ в тканях-мишенях мозга, нейронах спинного мозга и/или периферических тканях-мишенях. В некоторых вариантах реализации накопление ГАГ снижается по меньшей мере на 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, в 1 раз, в 1,5 раза или в 2 раза, по сравнению с контролем.

[0035] В некоторых вариантах реализации интратекальное введение вызывает уменьшение вакуолизации в нейронах. В некоторых вариантах реализации нейроны содержат клетки Пуркинье.

[0036] В некоторых вариантах реализации интратекальное введение приводит к повышению ферментативной активности замещающего фермента в тканях-мишенях мозга, нейронах спинного мозга и/или периферических тканях-мишенях. В некоторых вариантах реализации ферментативная активность повышается по меньшей мере в 1 раз, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз или в 10 раз, по сравнению с контролем. В некоторых вариантах реализации повышенная ферментативная активность составляет по меньшей мере примерно 10 нмоль/ч/мг, 20 нмоль/ч/мг, 40 нмоль/ч/мг, 50 нмоль/ч/мг, 60 нмоль/ч/мг, 70 нмоль/ч/мг, 80 нмоль/ч/мг, 90 нмоль/ч/мг, 100 нмоль/ч/мг, 150 нмоль/ч/мг, 200 нмоль/ч/мг, 250 нмоль/ч/мг, 300 нмоль/ч/мг, 350 нмоль/ч/мг, 400 нмоль/ч/мг, 450 нмоль/ч/мг, 500 нмоль/ч/мг, 550 нмоль/ч/мг или 600 нмоль/ч/мг.

[0037] В некоторых вариантах реализации ферментативная активность повышается в поясничном отделе. В некоторых вариантах реализации повышенная ферментативная активность в поясничном отделе составляет по меньшей мере примерно 500 нмоль/ч/мг, 600 нмоль/ч/мг, 700 нмоль/ч/мг, 800 нмоль/ч/мг, 900 нмоль/ч/мг, 1000 нмоль/ч/мг, 1500 нмоль/ч/мг, 2000 нмоль/ч/мг, 3000 нмоль/ч/мг, 4000 нмоль/ч/мг, 5000 нмоль/ч/мг, 6000 нмоль/ч/мг, 7000 нмоль/ч/мг, 8000 нмоль/ч/мг, 9000 нмоль/ч/мг или 10000 нмоль/ч/мг.

[0038] В некоторых вариантах реализации лизосомные болезни накопления ассоциированы с периферическими симптомами, и указанный способ также включают внутривенное введение замещающего фермента субъекту. В некоторых вариантах реализации внутривенное введение осуществляют не чаще, чем еженедельно (например, не чаще, чем раз в две недели, раз в месяц, раз в два месяца, раз в три месяца, раз в четыре месяца, раз в пять месяцев или раз в шесть месяцев). В некоторых вариантах реализации внутривенное введение представляет собой введение чаще, чем раз в месяц, например, два раза в неделю, еженедельно или два раза в месяц. В некоторых вариантах реализации внутривенное и интратекальное введение осуществляют в один и тот же день. В некоторых вариантах реализации внутривенное и интратекальное введение не осуществляют в течение некоторого периода времени между введениями, например, в пределах по меньшей мере 2 дней, в пределах по меньшей мере 3 дней, в пределах по меньшей мере 4 дней, в пределах по меньшей мере 5 дней, в пределах по меньшей мере 6 дней, в пределах по меньшей мере 7 дней или, по меньшей мере в пределах по меньшей мере одной недели. В некоторых вариантах реализации внутривенное и интратекальное введение осуществляют по переменному графику, например, переменное введение еженедельно, раз в две недели, два раза в месяц или ежемесячно. В некоторых вариантах реализации внутривенное введение заменяют интратекальным введением в графике введений, например, при графике внутривенного введения еженедельно, раз в две недели, два раза в месяц или ежемесячного введения, каждое третье или четвертое, или пятое внутривенное введение в этом графике может быть заменено на интратекальное введение вместо. В некоторых вариантах реализации внутривенное введение заменяет интратекальное введение в графике введений, например в графике интратекального еженедельного введения, введения раз в две недели, введения два раза в месяц или ежемесячного введения, каждое третье или четвертое, или пятое введение в этом графике может быть заменено на внутривенное введение интратекального введения. В некоторых вариантах реализации внутривенное и интратекальное введения осуществляют последовательно, например, сперва осуществляют внутривенное введение (например, еженедельно, раз в две недели, два раза в месяц или ежемесячное, дозирование в течение двух недель, месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или года и более) с последующим интратекальным введением (например, еженедельно, раз в две недели, два раза в месяц, или ежемесячно, дозирование в течение более двух недель, месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или года или более). В некоторых вариантах реализации интратекальное введение осуществляют первым (например, еженедельно, раз в две недели, два раза в месяц, ежемесячно, раз в два месяца, раз в три месяца, дозирование в течение двух недель, месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или года, или более) с последующим внутривенным введением (например, еженедельно, раз в две недели, два раза в месяц или ежемесячно, дозирование в течение более двух недель, месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или года, или более).

[0039] В некоторых вариантах реализации лизосомные болезни накопления связаны с периферическими симптомами, и способ включает введение замещающего фермента интратекально, но включает введение замещающего фермента субъекту внутривенно. В некоторых вариантах реализации интратекальное введение замещающего фермента облегчает или ослабляет один или более периферических симптомов ферментной недостаточности у субъекта.

[0040] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения синдрома Хантера, включающим стадию внутривенного введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантной идуромат-2-сульфатазы (I2S) в такой терапевтически эффективной дозе и с таким интервалом введения, при которых снижается интенсивность, тяжесть или частота, или замедляется проявление по меньшей мере одного симптома или признака синдрома Хантера. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один симптом или признак синдрома Хантера представляет собой когнитивное нарушение (нарушение познавательной функции); повреждение белого вещества; расширение периваскулярного пространства в паренхиме головного мозга, ганглиев, мозолистого тела и/или ствола мозга; атрофию; и/или вентрикуломегалию.

[0041] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения метахроматической лейкодистрофии (МЛД), включающим стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантной арилсульфатазы A (arylsulfatase A, ASA) в такой терапевтически эффективной дозе и с такой периодичностью введения, при которых снижается интенсивность, тяжесть или частота, или замедляется проявление по меньшей мере одного симптома или признака МЛД. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один симптом или признак МЛД представляет собой повышенной внутричерепное давление, гидроцефалию вследствие атрофии вещества головного мозга, накопление сульфатированных гликолипидов в миелиновых оболочках центральной и переферической нервных систем и во внутренних органах, прогрессивную демиелинизацию, утрату аксонов в ЦНС и ПНС и/или моторную и познавательную дисфункцию.

[0042] в другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения синдрома Санфилиппо типа A (Санфилиппо A), включающим стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантной гепаран N-сульфатазы (heparan N-sulfatase, HNS) в такой терапевтически эффективной дозе и с такой периодичностью введения, при которых снижается интенсивность, тяжесть или частота, или замедляется проявление по меньшей мере одного симптома или признака Санфилиппо типа A.

[0043] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения синдрома Санфилиппо типа B (Санфилиппо B), включающим стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантной альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (alpha-N-acetylglucosaminidase, Naglu) в такой терапевтически эффективной дозе и с такой периодичностью введения, при которых снижается интенсивность, тяжесть или частота, или замедляется проявление по меньшей мере одного симптома или признака Санфилиппо типа B.

[0044] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один симптом или признак Санфилиппо A или Санфилиппо B представляет собой потерю слуха, нарушение развития речи, дефицит моторных навыков, моторную гиперактивность, прогрессирующее нарушение познавательной функции, агрессивность и/или нарушение сна.

[0045] В некоторых вариантах реализации рекомбинантный фермент Naglu представляет собой гибридный белок, содержащий Naglu и часть, обуславливающую направленную доставку в лизосомы. В некоторых вариантах реализации часть, обуславливающая лизосомную доставку, представляет собой IGF-II.

[0046] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способы лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии (ГКЛ), включающие стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантной β-галактозидазы (recombinant β-galactosidase, GLC) в такой терапевтически эффективной дозе и с такой периодичностью введения, при которых снижается интенсивность, тяжесть или частота, или замедляется проявление по меньшей мере одного симптома или признака ГКЛ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один симптом или признак ГКЛ представляет собой раздражительность, судороги, умственную деградацию, глухоту, слепоту, миоклонические судороги, чрезмерный мышечный тонус, отставание в развитии, регрессию навыков развития, повышенную чувствительность, тремор, атаксию, спастичность, эпизодическую сильную рвоту, лекодистфрофию, церебральную атрофию, нарушение развития глобоидных клеток и/или демиелинизацию.

[0047] В другом аспекте настоящее изобретение относится к устройствам для интратекального введения, включающим порт ввода жидкости; полую основную часть, включающую первое отверстие для жидкости, сообщающееся с входным портом для жидкости и второе отверстие для жидкости, выполненную с возможностью введения в спинной мозг; и блокирующее приспособление для блокировки введения полой основной части в спинной мозг. В некоторых вариантах реализации блокирующее приспособление включает одну или более выпуклостей, выполненных на поверхности полого основной части, и блокирующее кольцо, выполненное с возможностью установки над одной или большим числом выпуклостей. В некоторых вариантах реализации порт ввода жидкости включает резервуар. В некоторых вариантах реализации порт ввода жидкости является имплантируемым. В некоторых вариантах реализации порт ввода жидкости представляет собой инъекционный порт. В некоторых вариантах реализации порт ввода жидкости представляет собой механический насос.

[0048] В настоящей заявке термины «приблизительно» и «примерно» являются эквивалентными. Подразумевается, что любые числительные, используемые в настоящей заявке с терминами «приблизительно/примерно» или без них охватывают любые отклонения, являющиеся обычными согласно оценки специалиста.

[0049] Другие признаки, задачи и преимущества настоящего изобретения приведены в подробном описании, которое следует ниже. Однако следует понимать, что указанные варианты реализации настоящего изобретения приведены только в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения. Различные изменения и модификации в рамках изобретения станут очевидны для специалистов в данной области из подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0050] Графические материалы приведены только для иллюстрации, а не для ограничения.

[0051] На Фигуре 1 представлена типичная схема устройства для интратекальной доставки лекарственных средств (УИДЛС) с механизмом безопасности.

[0052] На Фигуре 2A представлены примеры участков на теле пациента, где может быть размещено УИДЛС; на Фигуре 2B показаны различные компоненты устройства для интратекальной доставки лекарственных средств (УИДЛС), а на Фигуре 2C показаны примеры участков на теле пациента для ИТ поясничной инъекции.

[0053] На Фигуре 3 показаны показательные результаты, суммирующие данные о наполнителях, протестированных на взрослых обезьянах.

[0054] На Фигуре 4 показаны показательные результаты, иллюстрирующие стабильность hGalC при термическом скрининге hGalC в зависимости от pH.

[0055] На Фигуре 5 приведены показательные результаты, иллюстрирующие специфическую активность hGalC в зависимости от pH.

[0056] На Фигуре 6 приведены показательные результаты, иллюстрирующие результаты термического скрининга hGalC в зависимости от концентрации соли.

[0057] На Фигурах 7A-7D приведены показательные результаты, иллюстрирующие скорость осаждения потоков GalC, сравнивающие различные ионные силы в 5 мМ Na-фосфатном буфере, pH 6,0. Фигура 7A показывает показательные результаты при использовании 50 мМ NaCl и hGalC. Фигура 7 В показывает показательные результаты при использовании 500 мМ NaCl и hGalC. Фигура 7D показывает показательные результаты при использовании 150 мМ NaCl и мышиного GalC.

[0058] На Фигуре 8 показаны показательные результаты, иллюстрирующие профиль ППК (площадь под кривой) для GalC в зависимости от концентрации соли (1 мг/мл GalC, 5 мМ Na-фосфатный буфер, pH 6,0) (ось Y=s*g(s*); ось Х=s*).

[0059] На Фигуре 9 приведены показательные результаты, иллюстрирующие серии разведении hGalC в универсальном буфере, pH 6,0 (ось Y=<g(s*)/Co>(1/сведберг); ось X=s*(сведберг)).

[0060] На Фигуре 10 приведены показательные результаты, иллюстрирующие профиль ППК для GalC в зависимости от pH (1 мг/мл, 3 мМ цитратный, фосфатный и боратный буферы в 50 мМ NaCl).

[0061] На Фигуре 11 приведены показательные результаты, иллюстрирующие базовое показание при обширном анализе распределения (wide distribution analysis, WDA) при самых высоких концентрациях при pH 6,0, в 15 мМ фосфате Na и 150 мМ NaCl.

[0062] На Фигуре 12 приведены показательные результаты, иллюстрирующие показания при стрессе, полученные при WDA-анализе при самых высоких концентрациях при pH 6,0, в 15 мМ фосфате Na и 150 мМ NaCl.

[0063] На Фигуре 13 приведено графическое сравнение и перекрывание фоновых и стрессовых образцов GalC.

[0064] На Фигуре 14 приведены показательные результаты, иллюстрирующие серии разведении hGalC в присутствии 1% NaTC.

[0065] На Фигуре 15 приведены показательные результаты, иллюстрирующие серии разведении hGalC в присутствии 1% NaTC (1.0 мг/мл и 0.3 мг/мл).

[0066] На Фигуре 16 приведены показательные результаты, иллюстрирующие собственную флюоресценцию hGalC (1 мг/мл) в различных буферах и при различных pH.

[0067] На Фигуре 17 приведены показательные результаты, иллюстрирующие круговой дихроизм hGalC в зависимости от pH.

[0068] На Фигуре 18 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке, крови и красных кровяных тельцах у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы ¹²⁵I-hGalC.

[0069] На Фигуре 19 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке, сердце, почках, печени, легких, селезенке у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы ¹²⁵I-hGalC.

[0070] На Фигуре 20 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке, сердце, почках, печени, легких, селезенке у самцов крыс Sprague-Dawley после однократной внутривенной болюсной инъекции ¹²⁵I-hGalC.

[0071] На Фигуре 21 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке, сердце, почках, печени, легких, селезенке у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы и внутривенной болюсной инъекции ¹²⁵I-hGalC.

[0072] На Фигуре 22 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке и различных тканях (жировой ткани (почечной капсулы), надпочечниках, костях (бедренных), мышечной (скелетной), седалищном нерве) у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы ¹²⁵I-hGalC.

[0073] На Фигуре 23 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке и различных тканях (жировой ткани (почечной капсулы), надпочечниках, костях (бедренных), мышечной (скелетной), седалищном нерве) у самцов крыс Sprague-Dawley после однократной внутривенной болюсной инъекции ¹²⁵I-hGalC.

[0074] На Фигуре 24 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке и различных тканях (жировой ткани (почечной капсулы), надпочечниках, костях (бедренных), мышечной (скелетной), седалищном нерве) у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы и внутривенной болюсной инъекции ¹²⁵I-hGalC.

[0075] На Фигуре 25 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке, спинномозговой жидкости и других тканях у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы ¹²⁵I-hGalC.

[0076] На Фигуре 26 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке, спинномозговой жидкости и других тканях у самцов крыс Sprague-Dawley после однократной внутривенной болюсной инъекции ¹²⁵I-hGalC.

[0077] На Фигуре 27 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке, спинномозговой жидкости и тканях у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы и внутривенной болюсной инъекции ¹²⁵I-hGalC.

[0078] На Фигуре 28 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке и тканях у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы ¹²⁵I-hGalC.

[0079] На Фигуре 29 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке и тканях у самцов крыс Sprague-Dawley после однократной внутривенной болюсной инъекции ¹²⁵I-hGalC.

[0080] На Фигуре 30 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние концентрации радиоактивности в сыворотке и тканях у самцов крыс Sprague-Dawley после однократного интратекального введения дозы и внутривенной болюсной инъекции ¹²⁵I-hGalC.

[0081] На Фигуре 31 приведены показательные результаты, иллюстрирующие, что ИП введение rmGalC снижает уровень психозина в мозге у мышей twitcher. Данные представляют собой среднее значение ± СОС при n=4 мыши в группе лечения.

[0082] На Фигуре 32 приведены показательные результаты, иллюстрирующие увеличение выживаемости только при терапии только с использованием ИЦВ и ИЦВ/ИП rmGalC.

[0083] На Фигуре 33 приведены показательные результаты, иллюстрирующие, что у мышей twitcher уровень психозина в мозге значительно снижается после ИЦВ и ИЦВ/ИП инъекции.

[0084] На Фигуре 34 приведены показательные результаты, иллюстрирующие улучшение гистологических маркеров, наблюдаемых у мышей twitcher, обработанных 40 rmGalC. Глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ) был использован в качестве маркера астроцитов. Iba 1 был использован в качестве маркера микроглии/макрофагов. Лизосомный, связанный с мембраной белок-1 (LAMP-1), был использован в качестве лизосомного маркера.

[0085] На Фигуре 35 приведены показательные результаты, иллюстрирующие повторное накопление психозина после однократной ИЦВ инъекции rmGalC или носителя.

[0086] На Фигуре 36 приведены показательные результаты, иллюстрирующие процент выживаемости мышей twitcher после однократной ИЦВ инъекции rmGalC на 19/20 послеродовой день (ПРД). Данные представлены для n=8 в каждой группе.

[0087] На Фигуре 37 приведены показательные результаты, иллюстрирующие процент выживаемости мышей, обработанных ИЦВ/ИП с использованием rmGalC и rhGalC.

[0088] На Фигуре 38 приведены показательные результаты, иллюстрирующие анализ походки мышей, получавших однократную ИЦВ инъекцию rmGalC и rhGalC.

[0089] На Фигуре 39 приведены показательные результаты, иллюстрирующие антигенный ответ на rmGalC и rhGalC у мышей twitcher.

[0090] На Фигуре 40 приведены показательные результаты, иллюстрирующие уровень психозина в СМЖ простых собак, и собак, которым вводили rhGalC.

[0091] На Фигуре 41 приведены показательные результаты, иллюстрирующие ИГХ окрашивание инъецированного ИТ GalC в головном мозге с использованием поликлональных антител группы 1.

[0092] На Фигуре 42 приведены показательные результаты, иллюстрирующие ИГХ окрашивание инъецированного ИТ GalC в головном мозге с использованием антител группы 2.

[0093] На Фигуре 43 приведены показательные результаты, иллюстрирующие ИГХ окрашивание ИТ инъецированного GalC в головном мозге с использованием мышиных моноклональных антител.

[0094] На Фигуре 44 приведены показательные результаты, иллюстрирующие ИГХ окрашивание ИТ инъецированного GalC в головном мозге с использованием мышиных моноклональных антител.

[0095] На Фигуре 45 приведены показательные результаты, иллюстрирующие ИГХ окрашивание ИТ инъецированного GalC в печени с использованием мышиных моноклональных антител.

[0096] На Фигуре 46 приведены показательные результаты, иллюстрирующие ИГХ окрашивание ИТ инъецированного GalC в печени с использованием поликлональных антител группы 2.

[0097] На Фигуре 47 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние значения активности GalC в головном мозге.

[0098] На Фигуре 48 приведены показательные результаты, иллюстрирующие средние значения активности GalC в печени.

[0099] На Фигуре 49 приведены показательные результаты, иллюстрирующие иммуноокрашивание на GalC в головном мозге при 10Х увеличении.

[0100] На Фигуре 50 приведены показательные результаты, иллюстрирующие иммуноокрашивание на GalC в головном мозге при 40Х увеличении.

[0101] На Фигуре 51 приведены показательные результаты, иллюстрирующие окрашивание на Iba активированной микроглии при 40Х увеличении.

[0102] На Фигуре 52 приведены показательные результаты, иллюстрирующие окрашивание на LFB/PAS в головном мозге при 10Х увеличении.

[0103] Фигура 53 иллюстрирует показательный результат ИГХ окрашивания на I2S, демонстрирующий выявленный I2S в нейронах (стрелки) коры большого мозга и мозжечка, включая слой менингеальных клеток, покрывающих поверхность мозга (стрелки), после интратекальной инъекции 3 доз I2S. ИГХ окрашивание на I2S после 2 доз, введенных в мозг, было слабее (фото не показано). Не наблюдали положительного окрашивания на I2S для какого-либо из типов клеток головном мозге контрольных животных, которых вводили наполнитель. Увеличение 40Х.

[0104] На Фигуре 54 пример обратного развития патологии в головном мозге мышей IKO после интратекально-поясничной инъекции I2S. Окрашенные Г/Э ткани мозга демонстрируют многочисленные клеточные вакуоли (стрелки) у контрольных животных, которым вводили наполнитель. Клеточная вакуолизация уменьшена по всему мозгу после 2 доз (фото не показано) и 3 доз, инъецированных мышам. Заметное снижение было обнаружено после инъекции 3 дозы. Увеличение 40Х.

[0105] На Фигуре 55 изображен показательный результат иммуногистохимического окрашивание LAMP-1, было отмечено существенное снижение лизосомной активности в мозге после 2 доз (фото не показано) и 3 доз лечения I2S по сравнению с контрольными животными, которым вводили наполнитель. Такое снижение характеризовалось уменьшением количества LAMP-1 положительных клеток и небольшой интенсивностью окрашивания во всех исследованных областях мозга. Увеличение 40Х.

[0106] На Фигуре 56 приведены показательные морфометрические результаты сравнения средних значений LAMP-1-положительной области среди дикого типа (WT), контрольных не получавших лечение) мышей и мышей, которым вводили I2s (2 и 3 дозы), в коре головного мозга (Кора), хвостатом ядре (ХЯ), таламусе (Т), белом веществе (БВ) и мозжечке (М), подтверждающие уменьшение LAMP-1-положительного окрашивания во всех оцененных областях мозга. Данные представлены как средние значения ± ст. откл.. #=Р<0,05; *=Р<0,01; **=Р<0,001.

[0107] На Фигуре 57 приведены показательные электронные микрофотографии клеток головного мозга, показывающие улучшения патологии на ультраструктурном уровне. Нейроны мышей, которым вводили наполнитель, имели пластинчатые включения, структуру типа «зеброидных телец» и вакуоли, содержащие отложение в форме гранул (вставка), которых было меньше у мышей, которым инъецировали I2S. Олигодендроциты получавших наполнитель мышей показывали большие электронно-просвечивающие запасающие вакуоли (стрелка), в то время как олигодендроциты Мышей, которым инъецировали I2S, имели минимальную вакуолизацию. Шкала: в нейронах, 2 мкм; в олигодендроцитах 500 нм.

[0108] На Фигуре 58 приведены показательные иммуногистохимические результаты, демонстрирующие I2S, обнаруженные в синусоидальных клетках печени после интратекальной инъекции 3 доз I2S. 2S ИГХ окрашивание после 2 дозы, введенной в печень, было слабее (фото не показано). Не наблюдалось 128-положительного окрашивания в печени получавших наполнитель контрольных животных. Увеличение 40Х.

[0109] На Фигуре 59 приведены типичную ткань печени. Интенсивная клеточная вакуолизация и аномально высокая лизосомная активность показана с использованием Г/Э окрашивания, и интенсивное иммуноокрашивание на LAMP-1 было обнаружено у получавших наполнитель контрольных животных, по сравнению с WT. Заметное ослабление клеточной вакуолизации и иммуноокрашивания на LAMP-1 было обнаружено после интратекального введения 3 и 2 (фото не показано) доз I2S. Окрашивание с использованием Г/Э, выявившее внутрицитоплазматическую вакуолизацию, почти полностью исчезало, при этом наблюдалась практически нормальная структура клеток печени. Окрашивание Г/Э, увеличение 40Х; окрашивание на LAMP-1, увеличение 20Х.

[0110] На Фигуре 60 приведены примеры тканей, представляющие головной мозг животных группы, получавшей дозу 3 мг. I2S-положительное окрашивание наблюдалось в менингеальных клетках. Увеличение 4Х.

[0111] На Фигуре 61 приведены примеры тканей, представляющие головной мозг животных группы, получавшей дозу 30 мг. I2S-положительное окрашивание наблюдалось в нейронах и менингеальных клетках. Увеличение 4Х.

[0112] На Фигуре 62 приведены примеры тканей, представляющие головной мозг животных группы, получавшей дозу 100 мг. I2S-положительное окрашивание в нейронах и менингеальных клетках было сильнее, чем в случае мышей, получавших дозу 3 и 30 мг. Увеличение 4Х.

[0113] На Фигуре 63 приведены примеры тканей, представляющие головной мозг у животных группы, получавшей дозу 150 мг. Отмечена обширная популяция I2S-положительных нейронов среди сильно положительных менингеальных клеток.

[0114] На Фигуре 64 приведены примеры тканей, демонстрирующие ns-положительные нейроны и глиальные клетки, а также менингеальные клетки внутри I слоя головного мозга у животных группы, получавшей дозу 30 мг. Увеличение 40Х.

[0115] На Фигуре 65 приведены примеры тканей, демонстрирующие I2S-положительные нейроны и глиальные клетки, а также периваскулярные клетки внутри III слоя головного мозга у животных группы, получавшей дозу 30 мг. Увеличение 40Х.

[0116] На Фигуре 66 приведены примеры тканей, демонстрирующие 128-положительные нейроны и глиальные клетки внутри VI слоя головного мозга, прилегающие к белому веществу, у животных группы, получавшей дозу 30 мг. Увеличение 40Х.

[0117] На Фигуре 67 приведены примеры тканей, демонстрирующие сильное I2S-положительное окрашивание нейронов (головной мозг) у животных группы, получавшей дозу 150 мг. Увеличение 100Х.

[0118] На Фигуре 68 приведены примеры тканей, демонстрирующие иммуноокрашивание на I2S шейного отдела спинного мозга у животных группы, получавшей дозу 150 мг. Увеличение 4Х.

[0119] На Фигуре 69 приведены примеры тканей, демонстрирующие сильное иммуноокрашивание на I2S поясничного отдела спинного мозга у животных группы, получавшей дозу 150 мг. Увеличение 4Х.

[0120] На Фигуре 70 приведены примеры тканей, демонстрирующие сильное позитивное иммуноокрашивание на I2S менингеальных клеток, глиальных клеток и эпи/пери/эндоневрия (соединительные клетки) в поясничном отделе у животных группы, получавшей дозу 150 мг. Увеличение 40Х.

[0121] На Фигуре 71 приведено изображение, демонстрирующее, что нейроны в поясничном отделе спинного мозга в группе животных, получавшей дозу 150 мг, были в значительной степени I2S-положительными. Увеличение 40Х.

[0122] На Фигуре 72 приведены показательные результаты для печени в группе животных, получавшей дозу 3 мг. Только синусоидальные клетки были I2S-положительными. Увеличение 40Х.

[0123] На Фигуре 73 приведены показательные результаты для печени в группе животных, получавшей дозу 30 мг. I2S-положительными были синусоидальные клетки и гепатоциты. Увеличение 40Х.

[0124] На Фигуре 74 приведены показательные результаты для печени в группе животных, получавшей дозу 100 мг. I2S иммуноокрашивание было сильным в синусоидальных клетках и гепатоцитах. Увеличение 40Х.

[0125] На Фигуре 75 приведены показательные результаты для печени в группе животных, получавшей дозу 150 мг. сильное I2S-положительное окрашивание было выявлено в синусоидальных клетках и гепатоцитах. Увеличение 40Х.

[0126] На Фигуре 76 приведены показательные результаты для сердца в группе животных, получавшей дозу 3 мг. Иммуноокрашивание на I2S было отрицательным. Увеличение 40Х.

[0127] На Фигуре 77 приведены показательные результаты для сердца в группе животных, получавшей дозу 30 мг. I2S-положительными были интерстициальные клетки. Увеличение 40Х.

[0128] На Фигуре 78 приведены показательные результаты для сердца в группе животных, получавшей дозу 100 мг. I2S-положительное окрашивание было обнаружено для интерстициальных клеток. Увеличение 40Х.

[0129] На Фигуре 79 приведены показательные результаты для сердца в группе животных, получавшей дозу 150 мг. Было обнаружено значительное I2S-положительное окрашивание интерстициальных клеток. Увеличение 40Х.

[0130] На Фигуре 80 приведены показательные результаты для почки в группе животных, получавшей дозу 3 мг. Иммуноокрашивание на I2S было отрицательным. Увеличение 40Х.

[0131] На Фигуре 81 приведены показательные результаты для почки в группе животных, получавшей дозу 30 мг. I2S-положительными были клубочковые и интестициальные клетки.

[0132]] На Фигуре 82 приведены показательные результаты для почки в группе животных, получавшей дозу 100 мг. Было выявлено усиление I2S-окрашивания клубочковых и интестициальных клеток. Увеличение 40Х.

[0133] На Фигуре 83 приведены показательные результаты для почки в группе животных, получавшей дозу 150 мг. Выявлено I2S-положительное окрашивание проксимальных трубчатых, клубочковых и интестициальных клеток. Увеличение 40Х.

[0134] На Фигуре 84 приведены результаты иммуногистохимических (ИГХ) исследований по оценки тканей ЦНС длиннохвостых макак, которым вводили еженедельно дозы идуронат-2-сульфатазы (I2S). Как было показано методами ИГХ, клеточные отложения I2S встречались в всей ЦНС. В сером веществе I2S был обнаружен в нейронах головного мозга, мозжечка, стволе мозга и спинном мозге во всех группах в зависимости от дозы. На поверхности серого вещества групп, получавших высокую дозу, большое количество нейронов на поверхности коры головного мозга были окрашены I2S-положительно (На Фигуре 84А). I2S также был обнаружен в нейронах таламуса (На Фигуре 84В), гиппокампа (На Фигуре 84С), хвостатого ядра (На Фигуре 84D) и спинного мозга (На Фигуре 84Е). Менингеальные и периваскулярные клетки были также позитивно окрашены на I2S (На Фигуре 84F). Указанная шкала соответствует 25 мкм.

[0135] На. Фигуре 85 приведено графическое сравнение клиренса идуронат-2-сульфатазы (I2S) в краниальном и спинальном пулах на основании графика зависимости количества I2S в этих таких пулах от времени после введения.

[0136] На Фигуре 86 показано дозозависимое накопление в сером веществе у приматов, отличных от человека, которым интратекально вводили идуронат-2-сульфатазу (I2S) в течение шести месяцев. Показанная интенсивность окрашивания соответствует накоплению идуронат-2-сульфатазы в таламусе. На Фигуре 86 ядра контрастированы с использованием DAPI и выглядят синими, а белок (I2S) выглядит зеленым.

[0137] На Фигуре 87 показано дозозависимое накопление введенной интратекально идуронат-2-сульфатазы (I2S) приматам, отличным от человека, после однократной инъекции и после нескольких инъекций в течение шести месяцев. Показанная интенсивность окрашивания соответствует накоплению белка I2S в коре головного мозга.

[0138] На Фигурах 88А и 88В показана клеточная локализация идуронат-2-сульфатазы (I2S) в головном мозге приматов. На Фигуре 88А представлен поперечный срез тканей головного мозга, извлеченных из головного мозга приматов, а на Фигуре 88В показано, что отдельные области отделов, соответствующих трем областям тканей белого вещества (обозначенных W1, W2 и W3), белого вещества вблизи желудочка (VW) и поверхностное сероое вещество (СВ) разреза, идентифицированного на Фигуре 88А.

[0139] Фигуры 89A-89D иллюстрируют поглощение нейронами и олигодендроцитами и ассоциацию аксонов у приматов, при интратекальном введении идуронат-2-сульфатазы (I2S) после ежемесячных инъекций на протяжении шестимесячного периода. В частности, Фигура 89А, Фигура 89В, Фигура 89С и Фигура 89D иллюстрируют окрашенные волокна в тканях головного мозга приматов, которым интратекально вводили идуронат-2-сульфатазу (I2S) и, соответственно, соотносящиеся с тремя областями белого вещества (W1, W2 и W3) и областями поверхности серого вещества, определенными на Фигуре 87В. Фигура 89А иллюстрирует поглощение олигодендроцитами, I2S интратекально введенного в ткани белого вещества. На Фигуре 89В и на Фигуре 89С показано поглощение олигодендроцитами и ассоциацию аксонов при интратекальном введении I2S в ткани белого вещества W2 и W3, соответственно. На Фигуре 89В показано поглощение нейронами интратекально введенного I2S в тканях на поверхности серого вещества (SG).

[0140] На Фигуре 90 показана клеточная идентификация идуронат-2-сульфатазы в белом веществе вблизи желудочка (VW) у приматов, отличных от человека (стрелки сверху слева). Как показано на объединенном изображении (стрелки снизу, справа), идуронат-2-сульфатаза не связана с миелином (сверху справа). На Фигуре 90 ядра контрастированы с использованием DAPI (снизу слева) белок (I2S) проявляется сверху слева.

[0141] На Фигуре 91 показано окрашивание в тканях здоровых собак породы бигль, которым интрацеребровентрикулярно (ИЦВ) или интратекально (ИТ) вводили однократную инъекцию идуронат-2-сульфатазы (I2S). Как показано на изображениях a-h, I2S была широко распределена по всему серому веществу в обоих случаях, как у ИТ, так и у ИЦВ групп, что было определено с использованием иммуногистохимии (ИГХ). Изображения а и b показывают, что в коре головного мозга нейроны положительно окрашены на I2S во всех шести нейронных слоях, от поверхностного молекулярного слоя до глубокого внутреннего слоя в обеих группах: ИТ и ИЦВ. Изображения end иллюстрируют, что в коре мозжечка групп ИТ и ИЦВ I2S выявлена в нейронах, включая клетки Пуркинье. Аналогично, изображения е и f демонстрируют, что в обеих группах с ИТ и ИЦВ введением большие популяции нейронов в гиппокампе были положительно окрашены на I2S. Наконец, изображения g и h показывают, что I2S-положительные нейроны были также найдены в таламусе и хвостатом ядре как в ИТ, так и в ИЦВ группе. На Фигуре 91 окрашивание на I2S показано стрелками.

[0142] На Фигуре 92 приведена сравнительная иллюстрация ткани мозолистого тела мышей, нокаутированных по идуронат-2-сульфатазе (IKO), которые относятся к контрольной группе (без обработки), либо получавшим I2S интратекально. Как можно увидеть на изображении, у мышей IKO, получавших 2S, наблюдалось снижение клеточной вакуолизации, характерной чертой некоторых лизосомных болезней накопления, в мозолистом теле и сводом тканей 128-обработанных мышей.

[0143] Фигура 93А иллюстрирует заметное снижение в присутствии лизосомного связанного с мембраной белка 1 (LAMP-1) патологического маркера лизосомных болезней в тканях на поверхности коры мозга обработанных мышей IKO (Фигура 93А), по сравнению с необработанными контрольными мышами IKO (Фигура 93В) при 20Х и 40Х увеличении.

[0144] На Фигуре 94 показан пример устройства интратекальной доставки лекарственных средств (УИДЛС).

[0145] На Фигуре 95 показан пример низкопрофильной интратекально имплантируемой системы доступа PORT-A-CATH®.

[0146] На Фигуре 96 показан пример устройства интратекальной доставки лекарственных средств (УИДЛС).

[0147] На Фигуре 97 показан пример устройства интратекальной доставки лекарственных средств (УИДЛС), которое позволяет вводить в домашних условиях ферменты в ЦНС при фермент-заместительной терапии (ЗФТ).

[0148] На Фигуре 98 приведена типичная иллюстрация, демонстрирующая эффект вакуолизации после одной внутримозговой инъекции идурсульфазы в нейроны (клетки Пуркинье).

[0149] Фигура 99 представляет собой пример активности I2S в мозге в зависимости от дозы и области.

[0150] Фигура 100 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера данные по иммуногистохимической локализации идурсульфазы в различных уровнях коры головного мозга.

[0151] Фигура 101 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера активность I2S в спинном мозге обезьян после интратекального введения идурсульфазы.

[0152] Фигура 102 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера активность I2S в печени, сердце и почках обезьян после интратекального введения идурсульфазы.

[0153] На Фигуре 103 показана примерная схема программы испытаний с эскалацией дозы Hunter-IT.

[0154] Фигура 104 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера измерение концентрации I2S в различных срезах тканей мозга после 30 мг дозы. Различные кривые соответствуют разному времени измерения.

[0155] Фигура 105 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера измерение концентрации I2S после длительного введения с использованием разных путей введения и различных концентраций продукта.

[0156] На Фигуре 106 приведены PET изображение ¹²⁴I-меченую идурсульфазу-ИТ в обезьянах циномолгус при t=5 часов после IV, IT-L или ICV введения.

[0157] Фигура 107 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера данные по концентрации ASA в сыворотке после внутривенного введения.

[0158] Фигура 108 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера данные по концентрации ASA в сыворотке после ИТ поясничного введения.

[0159] Фигура 109 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера данные по концентрации ASA в спинномозговой жидкости после внутривенного введения.

[0160] Фигура 110 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера данные по концентрации ASA в спинномозговой жидкости после ИТ поясничного введения.

[0161] На Фигуре 111 приведена типичная микрофотография тканей мозга, мозговых оболочек, инфильтратов (группы со средними и высокими дозами, оба пола) после лечения.

[0162] На Фигуре 112 приведена другая типичная микрофотография тканей мозга, мозговых оболочек, инфильтратов (группы со средними и высокими дозами, оба пола) после лечения.

[0163] На Фигуре 113 приведена типичная микрофотография тканей мозга, периваскулярных, инфильтратов (группы со средними дозами, мужчины; группы с высокими дозами, женщины) после лечения.

[0164] На Фигуре 114 приведено показательное окрашивание спинного мозга иммунотолерантных мышей MLD с использованием альцианового синего, которые получали rhASA1, и результаты, демонстрирующие уменьшение сульфатидов, которое было определено путем окрашивания с использованием альцианового синего шейного отдела спинного мозга у животных, которые получили интратекальные инъекции rhASA на 1, 8, 15 и 22 дни в дозе 520 мг/кг веса мозга, или контрольных мышей, которым вводили наполнитель. Как показано, обработка путем интратекального введения rhASA приводила к снижению накопления сульфатидов в спинном мозге, в том числе в шейном отделе спинного мозга.

[0165] Фигура 115 иллюстрирует показательный морфометрический анализ окрашивания с использованием альцианового синего отделов позвоночника у иммунотолерантных мышей MLD, обработанных rhASA и результаты, иллюстрирующие оптическую плотность альцианового синего всего спинного мозга (Т-спинной мозг), всего серого вещества (T-GM), поясничного отдела серого вещества (L-GM), шейного отдела серого вещества (C-GM), всего белого вещества (Т-БВ), поясничного отдела белого вещества (L-БВ) и шейного отдела белого вещества (C-MW), как определено с использованием морфометрического анализа. Статистически значимое уменьшение окрашивания, показанное окрашиванием альцианового синего, было обнаружено у животных, обработанных rhASA, по сравнению с контрольными мышами, которым вводили наполнитель.

[0166] На Фигуре 116 показано типичное уменьшение окрашивания на LAMP в белом веществе (фимбрия) иммунотолерантных мышей MLD, обработанных rhASA, приведены показательные результаты, иллюстрирующие уровень LAMP-1 в бахромке, определенный с использованием иммуногистохимии. Увеличение 20Х. Показано, что обработка путем интратекального введения rhASA приводила к уменьшению LAMP-1 в белом веществе головного мозга.

[0167] На Фигуре 117 приведены результаты типичного морфометрического анализа окрашивания на LAMP тканей мозга иммунотолерантных мышей MLD, получавших rhASA1, и результаты, иллюстрирующие интенсивность окрашивания на LAMP-1 в мозолистом теле (СС), бахромке (F), белом веществе мозжечка (СВ-БВ) и стволе мозга (BS) животных, получавших 20 мг/кг внутривенно rhASA, 300 мг/кг веса мозга интратекально rhASA, 520 мг/кг веса мозга внутривенно rhASA или контрольных мышей, которым вводили наполнитель.

[0168] Фигура 118 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию ASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак (Cynomolgus), которым вводили наполнитель, после введения раз в две недели (РДН) в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0169] Фигура 119 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию ASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН rhASA1 в 1,8 мг/дозе в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0170] Фигура 120 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию ASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН rhASA1 в 0.6 мг/дозе в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0171] Фигура 121 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак после ИТ В8ведения РДН rhASA1 в 18,6 мг/дозе в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0172] Фигура 122 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН (ФСБ как контроль) в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0173] Фигура 123 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН наполнителя в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0174] Фигура 124 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН rhASA1 в 1,8 мг/дозе в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0175] Фигура 125 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН rhASA1 в 6,0 мг/дозе в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0176] Фигура 126 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA во фрагментах тканей мозга молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН rhASA1 в 18,6 мг/дозе в течение 6 месяцев (общая некропсия).

[0177] Фигура 127 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA в выбранных фрагментах ткани мозга, взятых с поверхности мозга животных с контрольным устройством, животных, которым вводили наполнитель, 1,8 мг, 6,0 мг и 18,6 мг (самцы и саки разделены, контрольные данных для эксперимента с устройством представляют собой данные, полученные при прижизненном вскрытии, все остальные данные получены при общей некропсии).

[0178] Фигура 128 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA в выбранных фрагментах ткани из глубокого белого вещества мозга животных с контрольным устройством, животных, которым вводили наполнитель, 1,8 мг, 6,0 мг и 18,6 мг (самцы и саки разделены, контрольные данных для эксперимента с устройством представляют собой данные, полученные при прижизненном вскрытии, все остальные данные получены при общей некропсии).

[0179] Фигура 129 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA в выбранных фрагментах ткани из глубокого серого вещества мозга мозга животных с контрольным устройством, животных, которым вводили наполнитель, 1,8 мг, 6,0 мг и 18,6 мг (самцы и саки разделены, контрольные данных для эксперимента с устройством представляют собой данные, полученные при прижизненном вскрытии, все остальные данные получены при общей некропсии).

[0180] Фигура 130 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA в выбранных фрагментах ткани из различных областей мозга животных с контрольным устройством, животных, которым вводили наполнитель, 1,8 мг, 6,0 мг и 18,6 мг (самцы и самки разделены, контрольные данных для эксперимента с устройством представляют собой данные, полученные при прижизненном вскрытии, все остальные данные получены при общей некропсии).

[0181] Фигура 131 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA в отделах позвоночника молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН в течение 6 месяцев (прижизненное вскрытие).

[0182] Фигура 132 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрацию rhASA в печени молодых длиннохвостых макак после ИТ введения РДН в течение 6 месяцев (047-021) (прижизненное вскрытие).

[0183] Фигура 133 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера анатомическое положение фрагментов тканей мозга в подкорковом БВ (белом веществе), перивентрикулярном БВ (и в глубоком белом веществе) и подкорковом БВ.

[0184] Фигура 134 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера анатомическое положение фрагментов тканей мозга в мозолистом теле и подкорковом околомозолистом БВ, внутренней капсуле - Gpi, внутренней капсуле-хвостатом ядре, глубоком белом веществе, подкорковом БВ и коре, скорлупе и временном подкорковом БВ и коре.

[0185] Фигура 135 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера анатомическое положение фрагментов тканей мозга в глубоком сером веществе, глубоком БВ (фронтальных перивентрикулярных и подкорковых) и подкорковом белом веществе и коре - поверхностно сагиттально.

[0186] Фигура 136 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера анатомическое положение фрагментов тканей мозга в мозолистом теле и подкорковом околомозолистом БВ, глубоком подкорковом БВ, глубоком сером веществе, перивентрикулярном БВ, подкорковом БВ и гиппокампе.

[0187] Фигура 137 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера анатомическое положение фрагментов тканей мозга в глубоком БВ мозолистого тела.

[0188] Фигура 138 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера анатомическое положение фрагментов тканей мозга в подкорковом БВ - затылочных долях и белого вещества мозжечка, включая зубчатые ядра (БВ).

[0189] Фигура 139А иллюстрирует концентрацию рекомбинантной человеческой арилсульфатазы (ASA) в выделенных фрагментов тканей мозга взрослых и молодых длиннохвостых макак, которым инъецировали либо наполнитель, либо 1,8 мг rhASA или 18,6 мг rhASA. Каждая из Фигур 139A-139G соответствует области ткани мозга, показанной на Фигуре 134.

[0190] Фигура 140А и Фигура 140В являются типичными иллюстрациями, показывающими сравнение концентраций рекомбинантной человеческой арилсульфатазы А (ASA), определенной в глубоком белом (Abuehf 140A) или в глубоком сером (Фигура 140В) веществе мозга взрослых или молодых длиннохвостых макак, которые получали интратекальные или интрацеребровентрикулярные инъекции rhASA.

[0191] Фигура 141A представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера концентрации ASA, определенные в нескольких фрагментах тканей, полученных в молодых (12 месяцев от роду) длиннохвостых макаках, которые получали интратекальные инъекции 18,6 мг рекомбинантной человеческой арилсульфатазы А (rhASA). Как показано на обеих Фигурах 141А-141В, концентрация ASA, доставленной в ткани, была в пределах или превышала необходимую терапевтическую концентрацию 2.5 нг/мг rhASA. Анатомическими областями тканей мозга, которые соответствуют образцам ткани, показанным на Фигуре 141А и Фигуре 141В, являются: подкорковое белое вещество (1); перивентрикулярное белое вещество и глубокое белое вещество (2); подкорковое белое вещество (3); подкорковое белое вещество (4); внутренняя капсула (5); хвостатое ядро внутренней капсулы (6); глубокое белое вещество (7); подкорковое белое вещество и кора (8); скорлупа (9); подкорковое белое вещество и кора височной доли (10); глубокое серое вещество (11); глубокое серое вещество (12); перивентрикулярное и подкорковое лобной доли (13); подкорковое белое вещество, корковое поверхностное вещество (14); мозолистое тело и околомозолистое подкорковое белое вещество (15); глубокое подкорковое белое вещество (16); глубокое серое вещество (17); глубокое серое вещество (18); перивентрикулярное белое вещество (19); глубокое подкорковое белое вещество (20); гиппокамп (21); мозолистое тело (22); глубокое белое вещество (23); подкорковое белое вещество, затылочная доля (24); и белое вещество мозжечка (25).

[0192] На Фигуре 142А показаны участки тканей глубокого белого вещества, полученного от длиннохвостых макак, которые получали интратекальные инъекции 1,8 мг ASA. Фигура 142В иллюстрирует иммуноокрашивание тканей глубокого белого вещества и распределение ASA в соответствующих клетках. На фигуре 142В белок (ASA) показан в правом нижнем окне. Фигура 142С иллюстрирует, что ИТ введенный ASA демонстрирует органельную колокализацию в тканях глубокого белого вещества у длиннохвостых макак и, в частности, в лизосомах. На Фигуре 142С в верхнем левом окне показано иммуноокрашивание на ASA.

[0193] На Фигуре 143 приведено сравнение распределения ¹²⁴I-меченой арилсульфатазы (ASA) с использованием ПЭТ-сканирования через 24 часа после ИТ или ИЦВ введения длиннохвостым мартышкам ASA, меченной указанным способом.

[0194] На Фигуре 144 приведено сравнение распределения ¹²⁴I-меченой ASA сразу после ИЦВ введения длиннохвостым мартышкам и сравнение распределения ИТ введенной ¹²⁴I-меченой ASA в течение 2-5 часов. Как показано, ИТ введение доставляет ¹²⁴I-меченую ASA в те же самые исходные отделы (цистерна и проксимальный отдел позвоночника), как это показано для ИЦВ введения.

[0195] На Фигуре 145 приведены результаты типичного ИЦВ и ИТ введения на модели мыши.

[0196] На Фигуре 146А приведены показательные результаты, иллюстрирующие концентрацию HNC в СМЖ в зависимости от времени в дозах 1,5, 4,5 и 8,3 мг после 6 месяцев приема. На Фигуре 146В более детально показан показательный результат, иллюстрирующий концентрацию антител к HNS в СМЖ после 6 месяцев ИТ введения 1,5, 4,5 и 8,3 мг доз обезьянам. Данные для самцов и самок объединены. На Фигуре 146С более детально показан показательный результат, иллюстрирующий концентрацию антител к HNS в СМЖ после 6 месяцев ИТ введения 1,5, 4,5 и 8,3 мг доз обезьянам после 6 месяцев введения. Данные для самцов и самок объединены. Два наиболее высоких значения концентрации (32,205 нг/мл и 15,467 нг/мл), доставленных ИТ дозой 6 8,3 мг HNS, были исключены из графика, т.к. пробы СМЖ не были взяты перед введением дозы 6.

[0197] На Фигурах 147A-147F приведены результаты, демонстрирующие показательные изображения срезов тканей мозговых оболочек и паренхимы мозга, окрашенных гематоксилином и эозином. На Фигуре 147A приведен показательный результат, иллюстрирующий вид при малом увеличении нейтрофильных инфильтратов локальных ИТ катетеров у обезьян DC. На Фигуре 147B приведен показательный результат, иллюстрирующий вид при большом увеличении эозинофильных инфильтратов в мозговых оболочках обезьян, получавших высокие дозы (8,3 мг/доза); общая тяжесть инфильтратов была схожа со значением для группы со средней дозой (4,5 мг/доза) (не показано). На Фигуре 147C приведен показательный результат, иллюстрирующий вид при большом увеличении для обезьян, получавших низкую дозу (1,5 мг/доза), показаны эозинофилы в периваскулярном пространстве (паренхима мозга). На Фигуре 147D приведен показательный результат для группы обезьян, получавших низкую дозу (1,5 мг/доза), показаны эозинофилы в периваскулярном пространстве и прилегающей паренхиме. На Фигуре 147Е приведен показательный результат, иллюстрирующий эозинофилы в паренхиме спинного мозга (показаны стрелками) для группы животных, получавших низкую дозу; нейроны в этой области являются нормальными. На Фигуре 147F приведен показательный результат, иллюстрирующий эозинофилы и область микроглии (стрелки указывают на эозинофилы; рамкой показана область микроглии) у группы обезьян, получавших низкую дозу (1,5 мг/доза). В этой области выявлено несколько нейронов, все из них являются нормальными. Масштабная линейка: 200 мкм.

[0198] На Фигурах 148A-148D приведены показательные результаты, иллюстрирующие активность фермента HNS в спинном мозге и головном мозге обезьян. На Фигуре 148А/В приведен показательный результат, иллюстрирующий активность в спинном мозге (A) самцов и (B) самок обезьян. Срез 3 = поясничный отдел, срезы 3, 6 = грудной отдел и срез 9 = шейный отдел; 0 = головка катетера. На Фигуре 148C/D приведен показательный результат, иллюстрирующий активность HSN в мозге (С) самцов и (D) самок обезьян. Срезы пронумерованы от головы к хвосту (от 3 до 15). Все образцы тканей были собраны примерно после 24 часов после последнего приема или после 4 недель после последнего приема, нужных для восстановления животных. DC, контрольное наблюдение. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего при n=4 обезьян в группе лечения.

[0199] На Фигурах 149А и 149В приведены показательные результаты, иллюстрирующий активность фермента HNS в головном мозге и печени обезьян. На Фигуре 149А приведен показательный результат, иллюстрирующий распределение активности HSN в мозге в группе обезьян, получавших высокую дозу (8,3 мг/доза). Показаны кратные изменения активности в поверхностных, глубоких и очень глубоких (перивентрикулярных) областях мозга, по сравнению с эндогенным уровнем (группа DC). Все образцы тканей были собраны примерно через 24 часа после введения последней дозы или через 4 недели после приема последней дозы для группы животных с восстановлением. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего при n=6 обезьян (оба пола), срезы мозга 6 и 9. Данные для двух обезьян не были включены; при некропсии на катетерах не обнаружили метки. На Фигуре 149В показана активность HNS в печени обезьяны. Все образцы тканей были собраны примерно через 24 часа после приема последней дозы или через 4 недели после приема последней дозы для группы животных с восстановлением. DC, контрольное наблюдение. Rec, группа выздоровевших животных. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего при n=4 обезьян в группе, за исключением группы самок, получавших низкую дозу (4,5 мг/доза) (n=3).

[0200] На Фигурах 150A-150D приведены показательные результаты, иллюстрирующие локализацию HNS в мозжечке молодых длиннохвостых макак: 3-месячная когорта). На Фигуре 150А приведен показательный результат, иллюстрирующий отсутствие иммуноокрашивания на HSN в мозжечке контрольных животных, получавших наполнитель (0 мг/доза); увеличение 20Х. На Фигуре 150В приведен показательный результат, иллюстрирующий окрашивание в мозжечке группы животных, получавших низкую дозу (1,5 мг/доза), показывающий минимальное позитивное окрашивание, ограниченное молекулярным слоем; увеличение 20Х. На Фигуре 150С приведен показательный результат, иллюстрирующий окрашивание в мозжечке группы животных, получавших среднюю дозу (4,5 мг/доза), показывающий минимальное окрашивание в наружном зернистом слое; увеличение 20Х. На Фигуре 150D приведен показательный результат, иллюстрирующий окрашивание в мозжечке группы животных, получавших высокую дозу (8,3 мг/доза), охватывающее молекулярный, наружный зернистый слои и клетки Пуркинье; увеличение 20Х.

[0201] На Фигуре 151 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в головной области в зависимости от времени в первые 20 минут после ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг.

[0202] На Фигуре 152 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в мозге в зависимости от времени после ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг.

[0203] На Фигуре 153 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в области мозга в зависимости от времени после ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг.

[0204] На Фигуре 154 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в головной области в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг.

[0205] На Фигуре 155 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в проксимальном отделе позвоночника в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг.

[0206] На Фигуре 156 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в серединном отделе позвоночника в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг.

[0207] На Фигуре 157 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в дистальном отделе позвоночника в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг.

[0208] На Фигуре 158 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в печени в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг.

[0209] На Фигуре 159 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в мозге в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг, индивидуальные значения (вверху) и среднее ± ст. откл. (внизу).

[0210] На Фигуре 160 приведен показательный результат измерения печеночной концентрации HNS в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг, индивидуальные значения (вверху) и среднее ± ст. откл. (внизу).

[0211] На Фигуре 161 приведен показательный результат измерения печеночной концентрации HNS в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг, индивидуальные значения (вверху) и среднее ± ст. откл. (внизу).

[0212] На Фигуре 162 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в сердце в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг, индивидуальные значения (вверху) и среднее ± ст. откл. (внизу).

[0213] На Фигуре 163 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг, индивидуальные значения (вверху) и среднее ± ст. откл. (внизу).

[0214] На Фигуре 164 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в мозге в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг (вверху), и сравнение некомпартментализованных ФК параметров в мозге (внизу).

[0215] На Фигуре 165 приведен показательный результат измерения концентрации HNS в печени в зависимости от времени ИТ введения ¹²⁴I-HNS 1 и 10 мг/кг (вверху), и сравнение некомпартментализованных ФК параметров в печени (внизу).

[0216] На Фигуре 166 показаны показательные первичные фибробласты нормального человека, использованные для изучения клеточной интернализации rhNaglu и Naglu-IGFII. Клеточное поглощение rhNaglu было минимальным, в то время как клеточное поглощение Naglu-IGFII было очень ярко выражено. Кривая насыщения интернализации Naglu-IGFII свидетельствует о рецептор-опосредованном поглощении. Такое поглощение ингибировалось с использованием IGFII, но не с использованием манноза-6-фосфата.

[0217] На Фигуре 167 приведены показательные результаты исследования с использованием конфокальной микроскопии образцов с использованием фибробластов субъекта с болезнью Санфилиппо В (GM01426). Наблюдали обширную интернализацию Naglu-IGFII и колоколизации Naglu-IGFII с LAMP-1.

[0218] Фигура 168 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера активность Naglu в диком типе (WT), в Naglu -/- (KO) и в гетерозиготных Naglu +/- (Het) мышах. Общую недостаточность Naglu у мышей с болезнью Санфилиппо B наблюдали в мозге, печени, почках и селезенке.

[0219] На Фигуре 169 приведен верхний и боковой вид мозга мыши, на котором отмечено место интрацистернальной инъекции (ИИ) и срезов для гистологического анализа. Срединная микрография, поперечное сечение мозга мыши просматривали при IX увеличении. На нижней микрографии рамкой выделено поле при 4Х увеличении микроскопического изображения. Нижняя микрография, 4Х увеличение гистологического среза. Рамки A и B показывают поле при 40Х увеличении микроскопического изображения на Фигуре 170 и Фигуре 171.

[0220] На Фигуре 170 приведен показательный результат иммуногистохимического окрашивания коры головного мозга у мышей с болезнью Санфилиппо В на 7 день после интрацистернальной инъекции (ИИ) при увеличении 40Х. Как rhNaglu, так и Naglu-IGFII демонстрируют обширное клеточное поглощение в нейронах, а также в глиальных клетках; распределение и паттерн клеточного поглощения был очень схожим для двух белков (моноклональные антитела к человеческому Naglu).

[0221] На Фигуре 171 приведено типичное иммуноокрашивание на LAMP-1 коры головного мозга при увеличении 40Х. По сравнению с мозгом мыши дикого типа повышение лизосомных отложений наблюдали в мозге мышей с болезнью Санфилиппо В, получавших наполнитель, как показано с использованием увеличения положительных пятен при иммуноокрашивании на LAMP-1. Обработка мозга как rhNaglu, так и Naglu-IGFII мышей с болезнью Санфилиппо В приводила к уменьшению лизосомного накопления, что было сходно с результатом, полученным для мышей WT.

[0222] Фигура 172А иллюстрирует обширное уменьшение клеточной вакуолизации в тканях белого вещества Naglu-дефицитных мышей, которые получали интратекальные инъекции Naglu, относительно с данными для таких же Naglu-дефицитных мышей, которым вводили наполнитель. Фигура 172В иллюстрирует заметное уменьшение иммуноокрашивания лизосомного связанного с мембранной белка 1 (LAMP-1) в тканях белого вещества Naglu-дефицитных мышей, которые получали интратекальные инъекции Naglu в сравнении с такими же Naglu-недостаточными мышами, которым вводили наполнитель.

[0223] На Фигурах 173A и 173B приведены количественные данные и сравнение концентрации LAMP, измеренного в коре головного мозга, хвостатом ядре и скорлупе (СР), таламусе (ТН), мозжечке (CBL) и белом веществе (БВ) Naglu-дефицитных мышей, которым вводили Naglu, в сравнении с мышами дикого типа и Naglu-недостаточными мышами, которым вводили наполнитель. LAMP-положительные области в каждом районе проанализированной ткани мозга в дальнейшем уменьшались после интратекального введения трех доз Naglu в течение семидневного курса (Фигура 173A) в сравнении с 2 дозами Naglu в течение двухнедельного курса (Фигура 173B).

[0224] На Фигуре 174 показана среднесагиттальная анатомическая схема ЦСН человека, которая приведена для того, чтобы указать место ИТ инъекции у крыс дикого типа с канюлей. Стрелки показывают примерное анатомическое расположение ИТ инъекции в спинной мозг, в которых брали ткани для иммуногистохимического исследования.

[0225] На Фигуре 175 показана типичная активность Naglu в мозге после ИТ инъекции. Активность Naglu была значительно выше в мозге получавших инъекции Naglu-TAT и Naglu-IGFII крыс дикого типа.

[0226] На Фигуре 176 приведены типичное иммунокрашивание на Naglu коры головного мозга крыс дикого типа с канюлей, получавших rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-kif и PerT-Naglu через 24 часов после ИТ инъекции, увеличение 20Х. Naglu-IGFII был единственным белком, показывающим широкое распространение по паренхиме мозга. Клеточное поглощение в нейроны и глиальные клетки отмечено у крыс, получавших Naglu-IGFII. С другой стороны, у мышей, обработанных rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-kif и PerT-Naglu, белок сохранялся в мозговых оболочках (М).

[0227] На Фигуре 177 показаны срезы, приведенные на Фигуре 176, при более высоком увеличении. Верхняя панель: у крыс дикого типа с канюлей, получавших rhNaglu, rhNaglu сохраняется в мозговых оболочках, не обнаружено положительного окрашивания в паренхиме мозга. Нижняя панель: у крыс дикого типа с канюлей, получавших Naglu-IGFII, наблюдали широкое распространение в паренхиме мозга, наблюдается клеточное поглощение в нейронами и глиальными клетками.

[0228] На Фигуре 178 показан пример активности Naglu в мозге и печени через 24 часов после последней инъекции. Среди трех обработанных групп не выявлено значительных различий активности Naglu в мозге, также как и активности Naglu в печени. Этот результат показывает, что активность Nagku, выявленная в мозге и печени, обусловлена во многом последней инъекцией, которую проводили за 24 часа до умерщвления.

[0229] На Фигуре 179 показано общее содержание ГАГ в мозге и печени после ИТ инъекции Naglu-IGFII. Было выявлено прогрессирующее увеличение общего содержания ГАГ в мозге мышей с болезнью Санфилиппо В, которым вводили наполнитель, что отражает накопительный эффект с увеличением возраста мышей с Санфиллипо B. Статистически значимое снижение ГАГ в мозге наблюдали в группах, получавших по три инъекции (р<0,05). Статистически значимое снижение ГАГ в мозге наблюдали группах, получавших по две и три инъекции (p<0,05). Феномен более быстрого и более резкого изменение уровня ГАГ в печени, чем в мозге, также наблюдали при ИТ доставке I2S при синдроме Хантера.

[0230] На Фигуре 180 приведен показательный результат анализа биораспределения Naglu в мозге мышей с Санфидиппо В после ИТ инъекции. Иммунофлуоресцентное окрашивание на Naglu выявило белок Naglu-IGFII в мозговых оболочках (М) и паренхиме мозга. Клеточное поглощение наблюдали в группах, получавших по две и три инъекции. G: глиальные клетки.

[0231] Фигура 181 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера коронарный срез мозга мыши. Рамками выделены области, для которых проводили иммуноокрашивание на LAMP-1. Для анализа степени распространения белка и эффективности для иммуноокрашивания на LAMP-1, были выбраны кора головного мозга и подкорковые ткани, такие как хвостатые ядра, таламус и белое вещество.

[0232] Фигура 182 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера иммуноокрашивание на LAMP-1 коры головного мозга при 40Х увеличении. По сравнению с мозгом мыши дикого типа увеличение лизосомных отложений наблюдали в мозге мышей с болезнью Санфилиппо В, которым вводили наполнитель, о чем свидетельствуют увеличенные LAMP-1-положительные пятна. Уменьшение лизосомных отложений после ИТ инъекции Naglu-IGFII было видно на основании уменьшения размера положительных пятен в мозге с болезнью Санфилиппо В, получавших по две инъекции, и уменьшения размера и количества положительных пятен в мозге мышей с болезнью Санфилиппо B, получавших по три инъекции.

[0233] Фигура 183 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера иммуноокрашивание на LAMP-1 хвостатого ядра, подкорковых ядер (увеличение 40Х). Аналогично тому, как было отмечено в коре головного мозга, повышение лизосомных отложений наблюдали в мозге мышей с болезнью Санфилиппо B, которым вводили наполнитель, как показано с использованием увеличения иммуноокрашенных LAMP-1-положительных пятен. На сокращение лизосомных отложений после ИТ инъекции Naglu-IGFII указывает уменьшение размера положительных пятен в мозге с болезнью Санфилиппо В, получавших по две инъекции, и уменьшение размера и количества положительных пятен в мозге мышей с болезнью Санфилиппо В, получавших по три инъекции.

[0234] Фигура 184 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера иммуноокрашивание на LAMP-1 таламуса, ядер среднего мозга (увеличение 40Х). На сокращение лизосомных отложений после ИТ инъекции Naglu-IGFII указывает уменьшение размера положительных пятен в мозге мышей с болезнью Санфилиппо В, получавших по две инъекции, и уменьшение размера и количества положительных пятен в мозге мышей с болезнью Санфилиппо В, получавших по три инъекции.

[0235] Фигура 185 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера иммуноокрашивание на LAMP-1 белого вещества (увеличение 40Х). Продольная дорожка из волокон аксонов отделяет белое вещество от серого вещества, показанного на Фигурах 181-184. Тем не менее, тот же паттерн увеличения лизосомного накопления наблюдали в мозге мышей с болезнью Санфилиппо В, которым вводили наполнитель, по сравнению с мышами дикого типа. Об уменьшении лизосомного накопления после ИТ инъекции Naglu-IGFII свидетельствует уменьшение размера и количества положительных пятен в мозге в мозге мышей с болезнью Санфилиппо В, получавших по две и три инъекции.

[0236] Фигура 186 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера иммуноокрашивание на LAMP-1 коры мозжечка. Морфология коры мозжечка видна по высокой плотности зернистых нейронов, гипоклеточным молекулярным слоем и одинарным слоем нейронов Пуркинье между зернистыми нейронами и молекулярным слоем. Нейроны Пуркинье были идентифицированы по большой цитоплазме и небольшому количеству дендритов, проникающих в молекулярный слой.

[0237] Фигура 187 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера иммуноокрашивание на Naglu в головном мозге, спинном мозге и печени. В головном мозге и спинном мозге, инъецированный Naglu был выявлен с использованием ИГХ только в мозговых оболочках (М), в других областях Naglu-положительного окрашивания не было обнаружено. В печени синусоидальные клетки (S) были Naglu-положительными, а в гепатоцитах не было отмечено поглощение Naglu.

[0238] Фигура 188 представляет иллюстрацию, которая демонстрирует в качестве примера иммуноокрашивание на LAMP и окрашивание печени и спинного мозга с использованием Г/Э. По сравнению с животными, получавшими наполнитель, окрашивание на LAMP было уменьшено как в печени, так и в спинном мозге у мышей, получавших Naglu. Окрашивание с использованием Г/Э показало, что клеточная вакуолизация в гепатоцитах была уменьшена в группе лечения по сравнению с животными, получавшими наполнитель.

[0239] Фигуры 189А и 189В представляют собой показательные иллюстрации, которые демонстрируют в качестве примера окрашивание с использованием Г/Э тканей головного мозга и улучшение морфологии головного мозга после 6 ИТ инъекций Naglu раз в две недели (РДН) в течение 3 месяцев. В обработанном головном мозге, клеточная вакуолизация (показана стрелками) во всех исследованных областях уменьшена, по сравнению с группой животных, получавших наполнитель.

[0240] Фигура 190А и Фигура 190В представляют собой показательные иллюстрации, показывающие иммуноокрашивание на LAMP в различных областях мозга после 6 ИТ инъекций Naglu в течение 3 месяцев. По сравнению группой животных, получавших наполнитель, ИТ инъекции Naglu у мышей с болезнью Санфилиппо В приводили к снижению лизосомной активности во всех исследованных областях, выявленных иммуноокрашиванием на LAMP. На такое снижение характеризуется уменьшением числа LAMP-положительных клеток, меньшим размер клеток и менее интенсивным окрашиванием. Заметное снижение было обнаружено в областях мозжечка и ствола мозга, расположенных в области хвостатого ядра мозга, близкой к спинному мозгу, по сравнению с другими областями мозга. Явное снижение было также обнаружено в глубоких областях мозга, в том числе в белом веществе, гиппокампе и таламусе.

[0241] Фигура 191А и Фигура 191В представляют собой показательные иллюстрации, показывающие ИГХ окрашивание на Iba различных областей мозга после 6 ИТ инъекций Naglu в течение 3 месяцев, приводящее к активации клеток микроглии. По сравнению с группой животных, получавших наполнитель, в группе животных, получавшей Naglu, не наблюдали уменьшения количества положительных клеток и интенсивности окрашивания. Однако клеточная морфология положительных клеток изменялась с уменьшением клеточного размера во всех исследованных областях мозга, по сравнению с большими и вакуолизированными клетками в группе животных, получавшей наполнитель (вставки).

[0242] Фигура 192А и Фигура 192В представляют собой показательные иллюстрации, показывающие ИГХ на GFAP в различных областях мозга после 6 ИТ инъекций Naglu в течение 3 месяцев, приводящее к активации астроцитов. По сравнению с группой животных, получавших наполнитель, GFAP - положительное окрашивание было уменьшено в мозжечке и стволе мозга и немного уменьшено в других исследованных областях.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0243] Для облегчения понимания настоящего изобретения ниже даны определения некоторых терминов. Дополнительные определения следующих терминов и другие термины приведены в тексте описания.

[0244] Приблизительно или примерно: В настоящей заявке термин "примерно" или "около" применительно к одному или более рассматриваемым значениям, относится к значению, которое близко к указанному эталонному значению. В некоторых вариантах реализации термин "приблизительно" или "примерно" относится к диапазону значений, которые входят в диапазон 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любом направлении (больше или меньше) от установленного эталонного значения, если не оговорено иное или другое не очевидно из контекста (кроме случаев, когда такое значение превышает 100% от возможного значения).

[0245] Улучшение: В настоящей заявке "улучшение" означает предотвращение, сокращение или временное облегчение состояния, или улучшение состояния субъекта. Улучшение включает, но не обязательно, полное выздоровление или полное предотвращение болезненного состояния. В некоторых вариантах реализации улучшение включает повышение уровней соответствующего белка или его активности, которые являются недостаточными в соответствующих больных тканях.

[0246] Биологическая активность: В настоящей заявке выражение "биологическая активность" относится к характеристике любого агента, который обладает активностью в биологической системе и, в частности, в организме. Например, агент, который при введении в организм демонстрирует биологическое влияние на организм, считается биологически активным. В конкретных вариантах реализации, в случаях, когда белок или полипептид является биологически активными, ту часть белка или полипептида, которая обладает по меньшей мере одним видом биологической активности белка или полипептида, как правило, называют "биологически активной" частью.

[0247] Наполнитель: В настоящей заявке термин "наполнитель" относится к соединению, которое добавляет массу лиофилизированной смеси и вносит вклад в физическую структуру лиофилизированной таблетки (например, облегчает производство по существу однородной лиофилизированной таблетки, поддерживающей структуру с открытыми порами). Примеры таких наполнителей включают маннитол, глицин, хлорид натрия, гидроксиэтилкрахмал, лактозу, сахарозу, трегалозу, полиэтиленгликоль и декстран.

[0248] Катион-независимый манноза-6-фосфатный рецептор (CI-MRP): В настоящей заявке термин "катион-независимый манноза-6-фосфатный рецептор (CI-MRP)" относится к клеточным рецепторам, которые связывают фрагменты манноза-6-фосфата на предшественниках кислых гидролаз в аппарате Гольджи, предназначенных для транспорта в лизосомы. В дополнение к манноза-6-фосфатам, CI-MRP также связывает другие белки, в том числе IGF-II. CI-MRP также известен как рецептор "M6P/IGF-U", рецептор "CI-MRP/IGF-II", "рецептор IGF-II" или "рецептор IGF2". Эти термины и их сокращения используются в настоящей заявке взаимозаменяемо.

[0249] Сопутствующая иммуноподавляющая терапия: В настоящей заявке термин "сопутствующая иммуноподавляющая терапия" включает любые способы иммуноподавляющей терапии, используемые в качестве предварительного лечения, прекондиционирования или параллельно со способом лечения.

[0250] Растворитель: В настоящей заявке термин "растворитель" относится к фармацевтически приемлемому (например, безопасным и нетоксичным для инъекции человеку) растворяющему веществу, применимому для приготовления восстанавливаемого состава. Примеры растворителей включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекций (БВИ), буферный раствор (например, фосфатно-солевой буфер), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.

[0251] Лекарственная форма: В настоящей заявке термин "лекарственная форма" и "дозированная лекарственная форма" относится к физически дискретной единице терапевтического белка для лечения пациента. Каждая единица содержит некоторое количество активного вещества, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта. Следует понимать, однако, что общая доза в композиции будет определена лечащим врачом в рамках обоснованного медицинского заключения.

[0252] Заместительная ферментная терапия (ЗФТ): В настоящей заявке термин "Заместительная ферментная терапия (ЗФТ)" относится к любой терапевтической стратегии, которая корректирует дефицит фермента с использованием доставки недостающего фермента. В некоторых вариантах реализации отсутствующий фермент доставляют путем интратекального введения. В некоторых вариантах реализации отсутствующий фермент доставляют путем инфузии в кровяной поток. После введения фермент поглощается клетками и транспортируется в лизосомы, где фермент действует, удаляя вещества, которые накапливаются в лизосомах в результате ферментной недостаточности. Как правило. Заместительная ферментная терапия лизосомальными ферментами является эффективной, терапевтические ферменты доставляются в лизосомы в клетках соответствующих тканей-мишеней, где проявляется дефект накопления.

[0253] Улучшение, увеличение или уменьшение: В настоящей заявке термины "улучшение", "увеличение" или "уменьшение" или грамматические эквиваленты, указывают значения, полученные относительно базовых измерений, например, у того же самого индивида, до начала обработки/лечения, описанного в настоящей заявке, или измеренные контрольных индивидов (или нескольких контрольных индивидов) в отсутствие обработки/лечения, описанного в настоящей заявке. "Контрольные индивиды" представляют собой индивиды, страдающие теми же самыми формами лизосомной болезни накопления, что и индивиды, проходящих лечение, примерно того же возраста как и индивиды, проходящие лечение (для того, чтобы стадии заболевания индивида, проходящего лечение, и контрольного индивида (индивидов) были сопоставимыми).

[0254] Индивид, субъект, пациент: В настоящей заявке термины "индивид", "субъект" или "пациент" относятся к человеку или животному, отличному от человека. Индивид (также упоминаемый как "пациент" или "субъект"), проходящий лечение, представляет собой индивид (плод, младенец, ребенок, подросток или взрослый человек), страдающий рассматриваемым заболеванием.

[0255] Интратекальное введение: В настоящей заявке термин "интратекальное введение" или "интратекальная инъекция" относится к инъекции в спинномозговой канал (интратекальное пространство, окружающее спинной мозг). Могут быть использованы различные методики, включая, но не ограничиваясь перечисленными: латеральную церебровентрикулярную инъекцию через трепанационное отверстие или цистерновую или поясничную пунктуру, или т.п.В некоторых вариантах реализации "интратекальное введение" или "интратекальная доставка" в соответствии с настоящим изобретением относится к ИТ введению или доставке через поясничную область или отдел, например, поясничное ИТ введение или доставка. В настоящей заявке термин "поясничный отдел" или "поясничная область" относится к области между третьим и четвертым поясничными (нижняя часть спины) позвонками и, более строго, отделу позвоночника L2-S1.

[0256] Линкер: В настоящей заявке термин "линкер" относится к аминокислотной последовательности в гибридном белке, помимо той, которая встречается в конкретном положении в природных белках и, как правило, линкер сконструирован таким образом, что он является гибким или представляет собой промежуточную структуру, такую как a-спираль, между двумя частями белка. Линкер также относится к спейсеру.

[0257] Лиопротектор: В настоящей заявке термин "лиопротектор" относится к молекуле, которая предотвращает или уменьшает химическую и/или физическую нестабильность белка или другого вещества при лиофилизации и последующем хранении. Примеры лиопротекторов включают сахара, такие как сахароза или трегалоза; аминокислоты, такие как глутамат натрия или гистидин; метиламины, такие как бетаин; лиотропные соли, такие как сульфат магния; многоатомные спирты, такие как трехатомные или высшие спирты, например, глицерин, эритрит, глицерин, арабитол, ксилит, сорбит и маннитол, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль; плюроники; и их комбинации. В некоторых вариантах реализации лиопротектор представляет собой невосстановленный сахар, такой как трегалоза или сахроза.

[0258] Лизосомальный фермент: В настоящей заявке термин "лизосомальный фермент" относится к любому ферменту, который является способным уменьшить накопленные соединения в лизосомах животных или который может предотвратить или улучшить один или более симптом лизосомной болезни накопления. Лизосомальные ферменты, пригодные для настоящего изобретения, включают в себя как фермент дикого типа, так с модифицированный лизосомальный фермент, и они могут быть получены с использованием рекомбинантных и синтетических методик или могут быть выделены из природных источников. Примеры лизосомальных ферментов перечислены в Таблице 1.

[0259] Лизосомная ферментная недостаточность: В настоящей заявке термин "лизосомная ферментная недостаточность" относится к группе генетических заболеваний, которые являются результатом недостаточности, по меньшей мере, одного фермента, который является необходимым для разрушения макромолекул (например, ферментных субстратов) до пептидов, аминокислот, моносахаров, нуклеиновых кислот и жирных кислот в лизосомах. В результате, у индивидов, страдающие лизосомной ферментной недостаточностью, накапливаются соединения в различных тканях (например, ЦНС, печени, селезенке, кишечнике, стенках кровеносных сосудов и в других органах).

[0260] Лизосомная болезнь накопления: В настоящей заявке термин "лизосомная болезнь накопления" относится к любой болезни в результате недостаточности одного или нескольких лизосомальных ферментов, необходимых для метаболизма природных макромолекул. Эти заболевания, как правило, приводят к накоплению не разрушенных молекул в лизосомах, что приводит к увеличению числа запасных гранул (также называемых запасными пузырьками). Эти заболевания и различные примеры описаны более подробно ниже.

[0261] Полипептид: В настоящей заявке "полипептид", в целом, представляет собой цепочку из по меньшей мере 2 аминокислот, соединенных друг с другом при помощи пептидной связи. В некоторых вариантах реализации полипептид может включать по меньшей мере 3-5 аминокислот, каждая из которых соединена с другими с использованием по меньшей мере одной пептидной связи. Специалистам в данной области известно, что полипептиды могут включать "неприродные" аминокислоты или другие молекулы, которые, тем не менее, способны к интеграции в полипептидную цепь.

[0262] Замещающий фермент: В настоящей заявке термин "замещающий фермент" относится к любому ферменту, который может действовать как замещающий, по меньшей мере, частично, при недостатке или отсутствии фермента при лечении болезни. В некоторых вариантах реализации термин "замещающий фермент" относится к любому ферменту, действие которого может замещать, по меньшей мере частично, недостаток или отсутствие лизосомальных ферментов при лизосомных болезнях накопления, подлежащих лечению. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент позволяет снизить накопление веществ в лизосомах млекопитающих или может предотвратить или улучшить один или несколько симптомов лизосомной болезни накопления. Замещающие ферменты, пригодные для настоящего изобретения, включают в себя оба фермент дикого типа или модифицированный лизосомальный фермент и могут быть получены с использованием рекомбинантных и синтетических способов или выделены из природных источников. Замещающий фермент может быть рекомбинантным, синтетическим, ген-активированным или природным ферментом.

[0263] Растворимый: В настоящей заявке термин "растворимый" относится к способности терапевтического агента образовывать гомогенный раствор. В некоторых вариантах реализации растворимость терапевтического агента в растворе, в который он введен и с использованием которого он транспортируется к участку-мишени (например, к клеткам и тканям головного мозга), является достаточной для доставки терапевтически эффективного количества терапевтического агента к сайту-мишени. Несколько факторов могут влиять на растворимость терапевтических агентов. Например, факторы, которые могут влиять на растворимость белка, включают ионную силу, аминокислотную последовательность и наличие других сопутствующих косолюбилизирующих агентов или солей (например, солей кальция). В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции составлены так, что соли кальция, исключаются из таких композиций. В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты в соответствии с настоящим изобретением являются растворимыми в соответствующей фармацевтической композиции. Следует иметь в виду, что, хотя изотонические растворы, как правило, предпочтительны для парентерального введения составов, применение изотонических растворов может ограничивать адекватную растворимость для некоторых терапевтических агентов и, в частности, некоторых белков и/или ферментов. Было продемонстрировано, что слегка гипертонические растворы (например, до 175 мм хлорида натрия в 5 мМ фосфата натрия при pH 7,0) и сахаросодержащих растворов (например, до 2% сахарозы в 5 мМ фосфата натрия при pH 7,0) хорошо переносятся обезьянами. Например, наиболее распространенной принятой композицией болюсного состава для ЦНС является физиологический раствор (150 мМ NaCl в воде).

[0264] Стабильность: В настоящей заявке термин "стабильность" относится к способности терапевтического агента (например, рекомбинантного фермента) поддерживать его терапевтическую эффективность (например, всю или преимущественно всю его предполагаемую биологическую активность и/или физико-химическую целостность) при длительном периоде времени. Стабильность терапевтического агента и способность фармацевтической композиции поддерживать стабильность такого терапевтического агента, могут быть оценены в течение длительного периода времени (например, по меньшей мере, в течении 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 месяцев и более). В общем, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению были составлены таким образом, чтобы они были бы способны стабилизировать, или же замедлять или предотвращать деградацию одного или более терапевтических агентов, составленных с ними (например, рекомбинантных белков). В контексте настоящего изобретения стабильным составом является тот, в котором терапевтический агент по существу сохраняет свои физическую и/или химическую целостность и биологическую активность при хранении и во время обработки (например, замораживания/оттаивания, механического перемешивания и лиофилизации). Стабильность белка может быть оценена по образованию высокомолекулярных агрегатов, потере ферментативной активности, формированию пептидных фрагментов и сдвигу профилей заряда.

[0265] Субъект: В настоящей заявке термин "субъект" обозначает любое млекопитающее, включая человека. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения субъект представляет собой взрослого, подростка и младенца. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает введение фармацевтической композиции и/или осуществление способов лечения внутриутробно.

[0266] Существенная гомология: В настоящей заявке словосочетание "существенная гомология" относится к сравнению между последовательностями аминокислот или нуклеиновых кислот. Как будет понятно специалистам в данной области, две последовательности обычно считаются "по существу гомологичными", если они содержат гомологичные остатки в соответствующих положениях. Гомологичные остатки могут быть одинаковыми остатками. Кроме того, гомологичные остатки могут быть не идентичными остатками, обладающие адекватно близкими структурными и/или функциональными характеристиками. Например, как хорошо известно специалистам в данной области, некоторые аминокислоты обычно классифицируют как "гидрофобные" или "гидрофильные" аминокислоты, и/или имеющие "полярные" или "неполярные" боковые цепи. Замена одной аминокислоты на другую того же типа, часто может считаться "гомологичной" заменой.

[0267] Как хорошо известно в данной области, аминокислотные или последовательности нуклеиновых кислот могут быть сравнены с использованием любой из множества алгоритмов, в том числе теми, которые доступны среди коммерческих компьютерных программ, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, gapped BLAST, и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Примерами таких программ, описанных в Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.132), Humana Press, 1999. В дополнение к идентификации гомологичных последовательностей, программы, упомянутые выше, как правило, обеспечивают индикацию степени гомологии. В некоторых вариантах реализации две последовательности считаются действительно гомологичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков гомологичны соответствующему участку остатков. В некоторых вариантах реализации соответствующий участок остатков является полной последовательности. В некоторых вариантах реализации соответствующий участок составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 или более остатков.

[0268] Существенная идентичность: В настоящей заявке сочетание "Существенная идентичность" относится к сравнению последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот. Как будет понятно специалистам в данной области, две последовательности, как правило, считаются "по существу идентичными", если они содержат одинаковые остатки в соответствующих позициях. Как хорошо известно в данной области, аминокислотные или последовательности нуклеиновых кислот могут быть сравнены с использованием любой из множества алгоритмов, в том числе теми, которые доступны среди коммерческих компьютерных программ, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, gapped BLAST, и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Примерами таких программ, описанных в Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3); 403-410, 1990; Altschul, el al., Methods in Enzymology; Altschul et al.. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.132), Humana Press, 1999. В дополнение к определению одинаковых последовательностей, программы, упомянутые выше, как правило, обеспечивают индикацию степени идентичности. В некоторых вариантах реализации две последовательности считаются действительно идентичными, если не менее 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков идентичны соответствующему участку остатков. В некоторых вариантах реализации соответствующий участок является полной последовательностью. В некоторых вариантах реализации соответствующий участок составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 или более остатков.

[0269] Синтетическая СМЖ: В настоящей заявке термин "синтетическая СМЖ" относится к раствору, который имеет pH, электролитный состав, содержание глюкозы и осмос в соответствии с таковыми в спинномозговой жидкости. Синтетическую СМЖ также называют искусственной СМЖ. В некоторых вариантах реализации синтетическая СМЖ представляет собой раствор Эллиотта В.

[0270] Подходящий для доставки в ЦНС: В настоящей заявке фраза "подходящий для доставки в ЦНС " или "подходящий для интратекальной доставки" в отношении фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, как правило, относится к стабильности, переносимости и свойствам растворимости таких композиций, а также к способности таких композиций доставлять эффективное количество терапевтического агента, содержащегося в нем, к целевым местам доставки (например, в СМЖ или мозг).

[0271] Ткани-мишени: В настоящей заявке термин «ткани-мишени» относится к любой ткани, на которую влияет лизосомная болезнь накопления, рассматриваемая для лечения, или любая ткань, в которой недостаточно лизосомальных ферментов, выраженных в норме. В некоторых вариантах реализации ткани-мишени включают те ткани, в которых существует заметное или аномально высокое количество фермента, субстрата, например, накопленных в клеточных лизосомах ткани, у пациентов, страдающих или восприимчивых к болезни лизосомных накопления. В некоторых вариантах реализации ткани-мишени включают те ткани, которые отражают патологии, сопутствующие болезни, симптомы или функции. В некоторых вариантах реализации ткани-мишени включают ткани, в которых недостаточно лизосомальных ферментов, как правило, в норме экспрессируемых на высоком уровне. В настоящей заявке «ткани-мишени» могут представлять собой ткани-мишени головного мозга, ткани-мишени спинного мозга и/или периферическими ткани-мишени. Примеры тканей-мишеней подробно описаны ниже.

[0272] Терапевтическая группа/фрагмент: В настоящей заявке термин "терапевтическая группа/фрагмент" относится к группе/фрагменту молекулы, которая обуславливает терапевтический эффект молекулы. В некоторых вариантах реализации терапевтическая группа/фрагмент представляет собой полипептид, обладающий терапевтической активностью.

[0273] Терапевтически эффективное количество: В настоящей заявке термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтического белка (например, замещающего фермента), который дает терапевтический эффект у прошедшего лечение субъекта, в соответствии с разумным соотношением польза/риск, применимым для любого медицинского лечения. Терапевтический эффект может быть объективным (то есть измеримым с использованием некоторых испытаний или маркеров) или субъективным (то есть субъект проявляет признаки или чувствует эффект). В частности, "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтического белка или композиции, которые обеспечивают лечение, улучшение или предотвращение желаемого заболевания или состояния, или демонстрирует заметный терапевтический или профилактический эффект, такой как улучшение симптомов, связанных с болезнью, предотвращение или задержка проявления заболевания и/или уменьшение тяжести или частоты симптомов заболевания. Терапевтически эффективное количество обычно вводят в режиме введения, который может включать многократное введение доз. Для любого конкретного терапевтического белка, терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая доза с эффективным режимом введения) может варьировать, например, в зависимости от способа введения, в сочетании с другими фармацевтическими средствами. Кроме того, конкретное терапевтически эффективное количество (и/или доза) для каждого конкретного пациента может зависеть от различных факторов, включая заболевание, которое лечат, тяжесть заболевания; активность применяемого конкретного фармацевтического агента, конкретного применяемого состава, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и диеты пациента, времени введения, пути введения и/или скорости выведения или метаболизма применяемого конкретного гибридного белка, продолжительности лечения и подобных факторов, которые хорошо известны в медицине.

[0274] Допустимый/переносимый: В настоящей заявке термины "допустимый/переносимый" и "переносимость" относятся к способности фармацевтических композиции согласно настоящему изобретению не вызывать побочных реакций у субъекта, которому вводят такую композицию, или, как вариант, не вызывать серьезной побочной реакции у субъекта, которому вводят такую композицию. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению хорошо переносится субъектом, которому вводят такую композицию.

[0275] Лечение: В настоящей заявке термин "лечение " (а также "лечить/ ") относится к любому введению терапевтического белка (например, лизосомального фермента), которое полностью или частично смягчает, улучшает состояние, снимает, тормозит, задерживает наступление, уменьшает тяжесть и/или уменьшает частоту одного или нескольких симптомов или особенностей конкретного заболевания, расстройства и/или условия (например, синдрома Хантера, синдрома Санфилиппо типа В). Такое лечение/обработка может проводиться для субъекта, который не проявляет признаков соответствующего заболевания, расстройства и/или состояния и/или субъекта, который демонстрирует только первые признаки заболевания, расстройства и/или патологического состояния. В качестве альтернативы или дополнения такое лечение может проводиться для субъекта, который обладает одним или более выраженным признаком соответствующего заболевания, расстройства и/или патологического состояния.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0276] Настоящее изобретение предусматривает, среди прочего, улучшенные способы для эффективной прямой доставки терапевтических агентов в центральную нервную систему (ЦНС). Как уже говорилось выше, настоящее изобретение основано на неожиданно обнаруженном факте, что замещающий фермент для лизосомной болезни накопления может быть непосредственно введен в спинномозговую жидкость (ликвор) субъекта, нуждающегося в лечении, в высоких концентрациях, не вызывая существенных неблагоприятных эффектов у субъекта. Наиболее удивительно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что замещающий фермент может быть доставлен в простом физиологическом растворе или буферной композиции, без применения синтетической СМЖ. Еще более неожиданно то, что интратекальная доставка в соответствии с настоящим изобретением не приводит к существенным побочным эффектам, таким как тяжелый иммунный ответ, у субъекта. Таким образом, в некоторых вариантах реализации интратекальную доставку в соответствии с настоящим изобретением можно применять в отсутствие сопутствующей терапии иммунодепрессантами (например, без индукции иммунной толерантности с использованием предварительной обработки или предварительной подготовки).

[0277] В некоторых вариантах реализации интратекальная доставка в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает эффективную диффузию в различные ткани головного мозга, что приводит к эффективному замещению фермента в различных тканях-мишенях на поверхности головного мозга, в неглубоких и/или глубоких областях головного мозга. В некоторых вариантах реализации интратекальная доставка в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает достаточное количество замещающего фермента, циркулирующего в периферической системе кровообращения. В результате, в некоторых случаях, интратекальная доставка в соответствии с настоящим изобретением приводит к доставке замещающего фермента в периферические ткани, такие как печень, сердце и почки. Этот результат является неожиданным и может быть особенно полезен для лечения лизосомных болезней накопления, затрагивающих как ЦНС, так и периферический компоненты, которые, как правило, требуют как регулярного интратекального введения, так и внутривенного введения. Предполагается, что интратекальная доставка в соответствии с настоящим изобретением может позволить уменьшить дозы и/или частоту внутривенной инъекции без ущерба для терапевтического эффекта при лечении периферических симптомов.

[0278] Настоящее изобретение обеспечивает различные неожиданные и полезные признаки, которые обеспечивают эффективную и удобную доставку замещающего фермента к различным тканям мозга, что приводит к эффективному лечению лизосомных болезней накопления, проявление которых связано с ЦНС.

[0279] Различные аспекты настоящего изобретения подробно описаны в следующих разделах. Использование разделов не предназначено для ограничения настоящего изобретения. Каждый раздел можно применить к любому аспекту настоящего изобретения. В настоящей заявке использование "или" означает "и/или", если не указано иное.

Лизосомные болезни накопления и замещающие ферменты

[0280] Способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения любых лизосомных болезней накопления, в частности лизосомных болезней накопления. имеющих этиологию и/или симптомы ЦНС, включая, но не ограничиваясь перечисленными: аспартилглюкозаминурию, болезнь накопления холестериновых эфиров, болезнь Вольмана, цистиноз, болезнь Данона, болезнь Фабри, липогрунуломатоз Фарбера, болезнь Фарбера, фукозидоз, галактазидоз I/II типов, болезнь Гоше I/II/III типа, лейкодистрофию глобоидных клеток, болезнь Краббе, болезнь накопления гликогена II, болезнь Помпе, GM1-ганглиозидоз I/II/III типа, GM2-ганглиозидоз I типа, болезнь Тея-Сакса, GM2-ганглиозидоз П типа, болезнь Сандхоффа, GM2-ганглиозидоз, α-маннозидоз I/II типа, β-маннозидоз, метахроматическую лейкодистрофию, мулипидоз типа I, сиалидоз типа I/II, муколипидоз II/III типа, болезнь клеточных включений, муколипидоз типа IIIC, муколипидоз III типа, мукополисахаридоз I типа, мукополисахаридоз II типа, синдром Хантера, мукополисахаридоз IIIA типа, синдром Санфилиппо (тип А, В, С или D), мукополисахаридоз IIIB типа, мукополисахаридоз IIIC типа, мукополисахаридоз IIID типа, мукополисахаридоз IVA типа, синдром Моркио, мукополисахаридоз IVB типа, мукополисахаридоз VI типа, мукополисахаридоз VII типа, синдром Слая, мукополисахаридоз IX типа, множественный дефицит сульфатазы, нейронный цероидный липофусциноз, болезнь Баттена CLN1, болезнь Баттена CLN2, болезнь Ниман-Пика типа А/В, болезнь Ниман-Пика типа С1, болезнь Ниман-Пика типа С2, пикнодизостоз, болезнь Шиндлера I/II типа, болезнь Гоше и болезнь накопления сиаловых кислот.

[0281] В некоторых вариантах реализации лизосомные болезни накопления, которые можно лечить способами согласно настоящему изобретению, включают синдром Хантера, метахроматическую лейкодистрофию (МЛД), синдром Санфилиппо типа А, синдром Санфилиппо типа В и лейкодистрофию глобоидных клеток (ЛГК).

[0282] Подробный обзор генетической этиологии, клинических проявлений и молекулярно-биологические механизмы лизосомных болезней накопления, подробно изложен в работе Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol.II, McGraw Hill, (1995). Таким образом, ферментная недостаточность при вышеупомянутых заболеваниях известна специалистам в данной области, некоторые из таких заболеваний них приведены в качестве примеров в таблице 1 ниже.

Таблица 1
Название болезни	Недостаток фермента	Накапливаемые вещества
Болезнь Помпа	Кислая α1,4-глюкорозилаза	Гликоген α1-4-связанные олигосахариды
GM1 ганглиозид	β-галактозидаза	GM1 ганглиозиды
Болезнь Тея-Сакса	β-гексозаминидаза А	GM2 ганглиозид
GM2 ганглиозидоз: АВ вариант	GM2 активаторный белок	GM2 ганглиозид
Болезнь Сандхоффа	β-гексозаминидаза А и В	GM2 ганглиозид
Болезнь Фабри	α-галактозидаза А	глобозиды
Болезнь Гоше	глюкоцереброзидаза	глюкосилцерамид
Метахромотическая лейкодистрофия	Арилсульфатаза А	Сульфатиды
Болезнь Краббе	Галактозилцерамидаза	Галактоцереброзид
Болезнь Нимана-Пика, типы А и В	Кислая сфингомиелиназа	Сфингомиелин
Болезнь Нимана-Пика, тип С	Повреждение эстерификации холестерина	Сфингомиелин
Болезнь Нимана-Пика, тип D	Неизвестно	Сфингомиелин
Болезнь Фарбера	Кислая керамидаза	Церамид
Болезнь Вольмана	Кислая липаза	Холестериновые эфиры
Синдром Хурлера (MPS IH)	α-L-идуронидаза	Гепаран и дерматан, сульфаты
Синдром Шая (MPS IS)	α-L-идуронидаза	Гепаран и дерматан, сульфаты
Хурлер-Шай (MPS IH/S)	α-L-идуронидаза	Гепаран и дерматан, сульфаты
Синдром Хантера (MPS II)	Идуронат сульфатаза	Гепаран и дерматан, сульфаты
Синдром Санфилиппо типа A (MPS IIIA)	Гепаран N-сульфатаза	Гепаран сульфатаза
Синдром Санфилиппо типа B (MPS IIIB)	α-N-ацетилглюкозаминидаза	Гепаран сульфатаза
Синдром Санфилиппо типа C (MPS IIIC)	Ацетил-CoA-глюкозамиминид ацетилтрансфераза	Гепаран сульфатаза
Синдром Санфилиппо типа D (MPS IIID)	N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза	Гепаран сульфатаза
Моркио B (MPS IVB)	β-галактозидаза	Кератан сульфат
Марото-Лами (MPS VI)	Арилсульфатаза В	Дерматан сульфат
Синдром Слая (MPS VII)	β-глюкоронидаза
α-маннозидоз	α-маннозидаза	Манноза/олигосахариды
β-маннозидоз	β-маннозидаза	Манноза/олигосахариды
Фукозидоз	α-L-фукозидаза	Фукозил олигосахариды
Аспартилглюкозами нурия	N-Аспартил-β-глюкозоаминидаза	Аспартилглюкозамин аспарагины
Сиалидоз (Муколипидоз I)	α-нейроминидаза	Сиалилолигосахариды
Галактосиалидоз (Синдром Голдберга)	Недостаточность лизосомного защитного белка	Сиалилолигосахариды
Болезни Шиндлера	α-N-Ацетил-Галактозаминидаза
Муколипидоз II (I-клеточная болезнь)	N-ацетилглюкозоамин-1 -фосфотрансфераза	Гепаран сульфат
Муколипидоз III (Псевдо-Хантер полидистрофия)	То же, что и при ML II
Цистиноз	Цистин транспортный белок	Свободный цистин
Болезнь Салла	Сиаловый кислый транспортный белок	Свободная сиаловая кислота и глюкуроновая кислота
Инфантильная болезнь накопления сиаловых кислот	Сиаловый кислый транспортный белок	Свободная сиаловая кислота и глюкуроновая кислота
Инфантильный нейро-цероидный липофусциноз	Пальмитоил-белковая тиоэстераза	Липофусцины
Муколипидоз IV	Неизвестно	Ганглиозиды & хиалуроновые кислоты
Прозапосин	Сапозины A, B, C и D

Замещающие ферменты

[0283] Способы согласно настоящему изобретению можно применять для доставки любых замещающих ферментов. В настоящей заявке замещающие ферменты, подходящие для настоящего изобретения, могут включать любой фермент, который может действовать как замещающий, по меньшей мере, частично, активность недостаточного или отсутствующего лизосомального фермента при лизосомной болезни накопления, подлежащей лечению. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент способен снизить накопленные вещества в лизосомах, или он может облегчить или улучшить один или несколько симптомов лизосомной болезни накопления.

[0284] В некоторых вариантах реализации подходящие замещающие ферменты могут представлять собой любые лизосомальные ферменты, о которых известно, что они связанны с лизосомной болезнью накопления, которую лечат. В некоторых вариантах реализации подходящие замещающие ферменты выбраны из ферментов, перечисленных в таблице 1. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент, подходящий для настоящего изобретения, представляет собой идуронат-2-сульфатаза (I2S), арилсульфатазу (ASA), гепаран N-сульфатазу (HNS), альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu) или β-галактозидазу (GLC).

[0285] В некоторых вариантах реализации замещающий фермент, подходящий для настоящего изобретения, может иметь последовательность дикого типа или природную последовательность. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент, подходящий для настоящего изобретения, может иметь измененную последовательность, по существу идентичную или гомологичную последовательности дикого типа или природной последовательности (например, имеющую по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% идентичности последовательности с последовательностью дикого типа или природной последовательностью).

[0286] Замещающий фермент, подходящий для настоящего изобретения, может быть получен любым доступным способом. Например, замещающие ферменты могут быть получены рекомбинантным путем с использованием системы клетки-хозяина, в которой экспрессируются нуклеиновые кислоты, кодирующие замещающий фермент. В качестве альтернативы или дополнения замещающие ферменты могут быть получены путем активации эндогенных генов. В качестве альтернативы или дополнения замещающие ферменты могут быть частично или полностью получены путем химического синтеза. В качестве альтернативы или дополнения замещающие ферменты также могут быть выделены из природных источников.

[0287] При получении ферментов рекомбинантным путем можно применять любую систему экспрессии. Например, известные системы экспрессии включают, например, яйцеклетки, бакуловирусы, растения, дрожжи или клетки млекопитающих.

[0288] В некоторых вариантах реализации ферменты, подходящие для настоящего изобретения, получают в клетках млекопитающих. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, включают линию мышиной миеломы BALB/c (NSO/I, ECACC No: 85110503); ретинобласты человека (PER.C6, Crucell, Лейден, Нидерланды); линию CV1 почек обезьяны, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию клеток почки эмбриона человека (293 или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol, 36:59, 1977.); клеточную линию фибросаркомы человека (например, НТ1080); клетки почек детенышей хомяка (ВНК, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка +/- DHFR (СНО, Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216, 1980); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251, 1980); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клетки цервикальной карциномы человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крыс buffalo (BRL 3А, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68, 1982); MRC 5 клетки; клетки FS4 и линию гепатомы человека (Hep G2).

[0289] В некоторых вариантах реализации предложенные способы в соответствии с настоящим изобретением применяют для доставки замещающих ферментов, вырабатываемых клетками человека. В некоторых вариантах реализации предлагаемые способы в соответствии с настоящим изобретением применяют для доставки замещающих ферментов, вырабатываемых клетками CHO.

[0290] В некоторых вариантах реализации замещающие ферменты, доставляемые с использованием способа согласно настоящему изобретению, содержат молекулу, которая связывается с рецепторами на поверхности клеток головного мозга, что способствует поглощению клетками и/или нацеливанию на лизосомы. Например, такой рецептор может представлять собой катион-независимый манноза-6-фосфат рецептор (CI-MPR), который связывается с остатком манноза-6-фосфата (M6P). Кроме того, CI-MPR также связывается с другими белками, в том числе IGF-II. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент, подходящий для настоящего изобретения, содержит остатки M6P на поверхности белка. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент, подходящий для настоящего изобретения, может содержать бис-фосфорилированные олигосахариды, которые имеют более высокую аффинность связывания с CI-MPR. В некоторых вариантах реализации подходящий фермент содержит по меньшей мере примерно 20%-бис-фосфорилированных олигосахаридов в ферменте. В других вариантах реализации подходящие ферменты могут содержать примерно 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% бис-фосфорилированных олигосахаридов в ферменте. Хотя такие бис-фосфорилированные олигосахариды могут естественным образом присутствовать в ферменте, следует отметить, что ферменты могут быть модифицированы с получением ферментов, содержащих такие олигосахариды. Например, подходящие замещающие ферменты могут быть модифицированы с использованием некоторых ферментов, которые способны катализировать перенос N-ацетилглюкозамина-L-фосфата из UDP-GlcNAc в положении 6 ‘α-1,2-связанных манноз на лизосомальные ферменты. Способы и композиции для получения и применения таких ферментов описаны, например, Canfield et а. в патенте США №6537785 и патенте США №6534300, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[0291] В некоторых вариантах реализации замещающие ферменты для применения в настоящем изобретении могут быть коньюгированы или гибридизованы с молекулами, обуславливающими направленную доставку (таргетинг) в лизосомы, которые способны связываться с рецептором на поверхности клеток головного мозга. Подходящими молекулами для лизосомного таргетинга являются IGF-I, IGF-II, RAP, p97, и их варианты, гомологи или фрагменты (например, включая их пептиды, имеющие последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичную последовательности зрелого пептида человека IGF-I, IGF-II, RAP, p97 дикого типа).

[0292] В некоторых вариантах реализации замещающие ферменты, пригодные для настоящего изобретения, не модифицированы для улучшения доставки или транспорта таких агентов через ГЭБ и в ЦНС.

Интратекальная доставка

[0293] В соответствии с настоящим изобретением замещающий фермент доставляют в ЦНС. В некоторых вариантах реализации замещающий фермент доставляют в центральную нервную систему путем введения в спинномозговую жидкость (ликвор) субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В некоторых вариантах реализации для доставки желаемого замещающего фермента в СМЖ применяют интратекальное введение. В настоящей заявке интратекальное введение (также известное как интратекальная инъекция) относится к инъекции в спинномозговой канал (интратекальное пространство, окружающее спинной мозг). Могут применяться различные методики, включая, без ограничений, церебровентрикулярные инъекции через трепанационное отверстие или цистерны, или спинномозговую пункцию, или тому подобное. Примеры способов описаны в работах Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 и Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179, содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[0294] В соответствии с настоящим изобретением фермент может быть инъецирован в любую область вокруг спинномозгового канала. В некоторых вариантах реализации фермент инъецируют в поясничную область или цистерну, или интравентрикулярно в пространство мозгового желудочка. В настоящей заявке термин "поясничный отдел" или "поясничная область" относится к области между третьим и четвертым поясничными (нижняя часть спины) позвонками и, более строго, к отделу позвоночника L2-S1. Как правило, интратекальные инъекции через поясничный отдел или поясничную область также называют "поясничной ИТ доставкой" или "поясничным ИТ введением". Термин "цистерна" относится к пространству вокруг и ниже мозжечка через отверстие между черепом и в верхней части позвоночника. Как правило, интратекальное введение через цистерну, также упоминается как "доставка в большую цистерну". Термин "желудочек мозга" относится к полости мозга, которая продолжается в центральный канал спинного мозга. Как правило, инъекции через мозговую полость желудочка называют интравентрикулярной церебральной (ИВЦ) доставкой.

[0295] В некоторых вариантах реализации "интратекальное введение" или "интратекальная доставка" в соответствии с настоящим изобретением относится к поясничному ИТ введению или доставке, например, доставке между третьим и четвертым поясничными (нижняя часть спины) позвонками и, более конкретно, L2-S1 отдела позвоночника. Предполагается, что поясничное ИТ введение или доставка отличается от доставки в большую цистерну тем, что поясничное ИТ введение или доставка в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает лучшую и более эффективную доставку к дистальному каналу позвоночника, в то время как цистерновая доставка, помимо всего прочего, как правило, не обеспечивает доставку состава в дистальный канал позвоночника.

Стабильные составы для ИТ доставки

[0296] В некоторых вариантах реализации желаемые ферменты добавляют в стабильные составы для интратекальной доставки. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения основаны, по меньшей мере, частично, на обнаруженном факте, что различные композиции, описанные в настоящей заявке, способствуют эффективной доставке и распределению одного или более терапевтических агентов (например, фермента) в тканях-мишенях, в целевых клетках и/или органеллах ЦНС. Среди прочего, композиции, описанные в настоящей заявке, способны солюбилизировать высокие концентрации терапевтических агентов (например, белков или ферментов) и пригодны для доставки таких терапевтических агентов в ЦНС субъектов, при лечении заболеваний, имеющих связанный с ЦНС компонент и/или этиологию. Композиции, описанные здесь, также характеризуется улучшенной стабильностью и улучшенной переносимостью при введении в ЦНС субъекта (например, интратекально), нуждающемуся в этом.

[0297] До настоящего изобретения для интратекальной доставки обычно применяли традиционный небуферный изотонический солевой раствор и раствор Эллиотта В, представляющий собой искусственную СМЖ,. Сравнение состава СМЖ и раствора Эллиотта B приведено в Таблице 2. Как показано в Таблице 2, концентрации веществ в растворе Эллиотта В близки таковым в СМЖ. Раствор Эллиотта B, однако, содержит очень низкие концентрации буфера и, соответственно, не может обеспечить адекватную буферную емкость, необходимую для стабилизации терапевтических агентов (например, белков), особенно в течение длительного периода времени (например, в ходе хранения). Кроме того, раствор Эллиотта В содержит некоторые соли, которые могут быть несовместимы с составами, предназначенными для доставки некоторых терапевтических агентов, и, в частности белков или ферментов. Например, соли кальция, присутствующих в растворе Эллиотта B, способствуют осаждению белков и тем самым снижают стабильность состава.

Таблица 2
Раствор	Na+	K+	Ca++	Mg++	HCO3-	Cl-	pH	Фосфор	Глюкоза
	мЭкв/л	мЭкв/л	мЭкв/л	мЭкв/л	мЭкв/л	мЭкв/л		мг/л	мг/л
СМЖ	117-137	2.3	2.2	2.2	22.9	113-127	7.31	1.2-2.1	45-80
Раствор Элиотта В	149	2.6	2.7	2.4	22.6	132	6,0-7.5	2.3	80

Таким образом, в некоторых вариантах реализации составы, пригодные для интратекальной доставки, в соответствии с настоящим изобретением, не являются синтетической или искусственной СМЖ.

[0298] В некоторых вариантах реализации составы для интратекальной доставки составлены таким образом, что они являются стабильными, или же замедляют или предотвращают деградацию одного или более терапевтического агента, входящего в их состав (например, рекомбинантных белков). В настоящей заявке, термин "стабильный" относится к возможности терапевтического агента (например, рекомбинантного фермента) поддерживать его терапевтическую эффективность (например, все или большинство видов предполагаемой биологической активности и/или физико-химическую целостность) в течение длительного периода времени. Стабильность терапевтического агента и способность фармацевтической композиции поддерживать стабильность такого терапевтического агента, может быть оценена в течение длительного периода времени (например, предпочтительнее в течение, по меньшей мере, 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 месяцев и более). В данном контексте стабильный состав является таким составом, в котором терапевтический агент по существу сохраняет свою физическую и/или химическую целостность и биологическую активность при хранении и при проведении с ним различных операций (например, в ходе замораживания/оттаивания, механического перемешивания и лиофилизации). Стабильность белка может быть оценена на основании образования высокомолекулярных агрегатов, на основании потери ферментативной активности, формирования пептидных фрагментов и по сдвигу профилей заряда.

[0299] Стабильность терапевтического агента имеет особенно важное значение. Стабильность терапевтического агента может быть также оценена по биологической активности и физико-химической целостности терапевтического агента в течение длительного периода времени. Например, стабильность в данный момент времени может быть сопоставлена со стабильностью в более ранний момент времени (например, при составлении в день 0) или может быть сопоставлена со стабильностью терапевтического агента без вспомогательных веществ, и результаты этого сравнения выражены в процентах. Предпочтительно, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению сохраняют по меньшей мере 100%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% биологической активности терапевтического агента или физико-химической целостности в течение длительного периода времени (например, при измерении по меньшей мере 6-12 месяцев, при комнатной температуре или при специальных условиях хранения).

[0300] В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты (например, желаемые ферменты) являются растворимыми в составах согласно настоящему изобретению. Термин "растворимый" в отношении терапевтических агентов согласно настоящему изобретению, относится к способности таких терапевтических агентов образовывать гомогенный раствор. В предпочтительном варианте растворимость терапевтического агента в растворе, в котором его вводят и с которым он транспортируется к сайту-мишени действия (например, клеткам и тканям головного мозга), является достаточной для доставки терапевтически эффективного количества терапевтического агента к целевым участкам-мишеням. Несколько факторов могут повлиять на растворимость терапевтических агентов. Например, соответствующие факторы, которые могут повлиять на растворимость белка, включают ионную силу, аминокислотную последовательность и наличие других сопутствующих солюбилизирующих агентов или солей (например, солей кальция). В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции составлены таким образом, что из их состава исключены соли кальция.

[0301] Таким образом, подходящие составы для интратекального введения могут содержать целевой терапевтический агент (например, фермент), в различных концентрациях. В некоторых вариантах реализации подходящие составы могут содержать целевой белок или фермент в концентрации примерно до 300 мг/мл (например, примерно до 250 мг/мл, примерно до 200 мг/мл, примерно до 150 мг/мл, примерно до 100 мг/мл, примерно до 90 мг/мл, примерно до 80 мг/мл, примерно до 70 мг/мл, примерно до 60 мг/мл, примерно до 50 мг/мл, примерно до 40 мг/мл, примерно до 30 мг/мл, примерно до 25 мг/мл, примерно до 20 мг/мл, примерно до 10 мг/мл). В некоторых вариантах реализации подходящие составы могут содержать белок или фермент интереса в концентрации в диапазоне примерно 0-300 мг/мл (например, примерно 1-250 мг/мл, примерно 1-200 мг/мл, примерно 1-150 мг/мл, примерно 1-100 мг/мл, примерно 10-100 мг/мл, примерно 10-80 мг/мл, примерно 10-70 мг/мл, примерно 1-60 мг/мл, примерно 1-50 мг/мл, примерно 10-150 мг/мл, примерно 1-30 мг/мл). В некоторых вариантах реализации составы, пригодные для интратекальной доставки, могут содержать белок в концентрации примерно 1 мг/мл, 3 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 50 мг/мл, 75 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл или 300 мг/мл.

[0302] В некоторых вариантах реализации применяют изотонические растворы. В некоторых вариантах реализации слегка гипертонические растворы (например, примерно 300 мМ (например, примерно 250 мМ, 200 мМ, 175 мМ, 150 мМ, 125 мМ) хлорида натрия в 5 мМ фосфате натрия при pH 7,0) и сахаросодержащие растворы (например, примерно 3% (например, примерно 2,4%, 2,0%, 1,5%, 1,0%) сахарозы в 5 мМ фосфате натрия при pH 7,0) демонстрировали хорошую переносимость у обезьян. В некоторых вариантах реализации подходящий состав болюса для доставки в ЦНС представляет собой солевой раствор (например, 150 мМ NaCl в воде).

[0303] Многие терапевтические агенты, в частности, белки и ферменты согласно настоящему изобретению, требуют контролируемого pH и специфических вспомогательных веществ для поддержания их растворимости и стабильности в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. В Таблице 3 приведены некоторые аспекты примеров белковых составов, которые важны для поддержания растворимости и стабильности белковых терапевтических агентов согласно настоящему изобретению.

Таблица 3
Параметр	Показательный диапазон/Тип	Назначение
pH	5 до 7,5	Для стабилизации
Иногда также для стабилизации
Тип буфера	ацетат, сукцинат, цитрат, гистидин, фосфат или Трис	Для поддержания оптимального pH
Может также влиять на стабилизацию
Концентрация буфера	5-50 мМ	Для поддержания pH
	Может также стабилизировать и добавлять ионную силу
Регулятор тоничности	NaCl, сахара, маннитол	Для создания изоосмотического или изотонического растворов
Поверхностно-активное вещество	Полисорбит 20, полисорбит 80	Для придания устойчивости к поверхности раздела и при сдвиге
Другое	Аминокислоты (например, аргинин) примерно сотни мМ	Для увеличения растворимости и стабильности

[0304] pH фармацевтической композиции является дополнительным фактором, который способен изменить растворимость терапевтического агента (например, фермента или белка) в водной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит один или несколько буферов. В некоторых вариантах реализации композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат количество буферов, достаточное для поддержания оптимального pH указанной композиции примерно 4.0-8.0, примерно 5,0-7,5, примерно 5.5-7.0, 6,0-7.0 примерно и примерно 6,0-7,5. В других вариантах реализации буфер содержит примерно 50 мМ (например, примерно 45 мМ, 40 мМ, 35 мМ, 30 мМ, 25 мМ, 20 мМ, 15 мМ, 10 мМ, 5 мМ) натрий. Подходящие концентрации буфера включают, например, ацетат, сукцинат, цитрат, фосфат, другие органические кислоты и трис (гидроксиметил) аминометан ("Трис"). Подходящие концентрации буфера могут составлять от 1 мМ до 100 мМ или от 3 мМ до 20 мМ, в зависимости, например, от буфера и желаемой изотоничности состава. В некоторых вариантах реализации подходящий агент для буферизации присутствует в концентрации примерно 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ, 60 мМ, 65 мМ, 70 мМ, 75 мМ, 80 мМ, 85 мМ, 90 мМ, 95 мМ или 100 мМ.

[0305] В некоторых вариантах реализации композиции содержат изотонический агент, для поддержания изотоничности состава. При использовании в отношении ИТ доставки "изотонический" означает, что рассматриваемый состав, по существу имеет такую же осмолярность, как и СМЖ человека. Изотонические составы главным образом иметь осмолярность от 240 mOsm/кг до 350 mOsm/кг. Изотоничность можно измерить с использованием, например, давления паров или осмотической точки замораживания. Примеры изотоничных агентов, включают, но не ограничиваются, глицин, сорбит, маннит, хлорид натрия и аргинин. В некоторых вариантах реализации подходящие изотонические агенты могут присутствовать в композиции в концентрации от 0,01-5% (например, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,4, 0.5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0 или 5,0%) по весу.

[0306] В некоторых вариантах реализации составы могут содержать стабилизирующий агент для защиты белка. Как правило, подходящим агентом является стабилизирующий, невосстанавливающий сахар, такой как сахароза, раффиноза, трегалоза, или аминокислота, такая как глицин, аргинин и метионин. Количество стабилизирующего агента в составе является главным образом таким, что состав будет изотоническим. Тем не менее, гипертонические составы могут подходить. Кроме того, количество стабилизирующего агента не должно быть слишком низким, таким при котором имеет место неприемлемая деградация / агрегация терапевтического агента. Примерные концентрации стабилизирующего агента в композиции могут варьировать от 1 мМ до 400 мМ (например, от 30 мМ до 300 мМ, от 50 мМ до 100 мМ), или, наоборот, от 0,1% до 15% (например, от 1% до 10%, от 5% до 15%, от 5% до 10%) по весу. В некоторых вариантах реализации отношение массового количества стабилизирующего агента и терапевтического агента составляет примерно 1:1. В других вариантах реализации соотношение массы стабилизирующего агента и терапевтического агента может составлять примерно 0,1:1, 0,2:1, 0,25:1, 0,4:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 2,6: 1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или 20:1. В некоторых вариантах реализации, подходящий для лиофилизации стабилизирующий агент является лиопротектором.

[0307] Фармацевтические композиции, составы и связанных с ними способы согласно настоящему изобретению полезны для доставки различных терапевтических агентов в ЦНС субъекта (например, интратекально, интравентрикулярно или интрацистернально) и для лечения сопутствующих заболеваний. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению особенно полезны для доставки белков и ферментов для пациентов, страдающих от лизосомных болезней накопления.

[0308] В некоторых вариантах реализации желательно добавление поверхностно-активного вещества в составы. Примеры поверхностно-активных веществ включают неионные поверхностно-активные вещества такие как полисорбаты (например, полисорбат 20 или 80); полоксамеры (например, полоксамер, 188); тритон; додецилсульфат натрия (SDS); лаурил сульфаты натрия; октил гликозиды натрия; лаурилсульфат; миристил-, линолеил-, или стеариловый-сульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеариловый-саркозин; линолеил-, миристил- или цетил-бетаин; лауроамидопропил; кокамидопропил, линолеамидопропил; миристамидопропил; пальмидопропил или изостеарамидопропил-бетаины (например, лауроамидопропил); миристарнидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-диметиламины; метил натрия кокоил- или динатрия метил-офеил таураты и серии MONAQUATTM (Мопа Industries, Inc. Патерсон, штат Нью-Джерси), полиэтилен гликоль, полипропил гликоль и сополимеры этилена и пропилен гликоля (например, Pluronics, PF68 и т.д.). Как правило, количество поверхностно-активного вещества является таким, что он уменьшает агрегацию белка и сводит к минимуму образование частиц или вспенивание. Например, поверхностно-активное вещество может присутствовать в композиции в концентрации примерно 0,001-0,5% (например, примерно 0005-0,05%, или примерно 0,005-0,01%). В частности, поверхностно-активное вещество может присутствовать в композиции в концентрации примерно 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% или примерно 0,5%, и т.д.

[0309] В некоторых вариантах реализации, подходящие составы могут дополнительно включать один или более наполнителей, в частности, для лиофилизированных составов. "Наполнитель" представляет собой соединение, которое добавляет массу лиофилизированной смеси и участвует в формировании физической структуры лиофилизированной таблетки. Например, наполнитель может улучшать внешний вид лиофилизированной таблетки (например, по существу однородной лиофилизированной таблетки). Подходящие наполнители включают, но не ограничены перечисленными: хлорид натрия, лактозу, манит, глицин, сахарозу, трегалозу, гидроксиэтил крахмал. Показательные концентрации наполнителей составляют от 1% до 10% (например, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% и 10,0%).

[0310] Составы в соответствии с настоящим изобретением могут быть оценены на основе анализа качества продукции, времени восстановления (если состав лиофилизирован), качества восстановления (если состав лиофилизирован), высокого молекулярного веса, влажности и температуры стеклования. Как правило, анализ качества белка и продуктов включает анализ скорости разрушения продукта с использованием методов, включающих, но не ограниченных перечисленными: эксклюзионную ВЭЖХ (SE-HPLC), катионообменную ВЭЖХ (CEX-HPLC), рентгеновскую дифракцию (РД), модулируемую дифференциальную сканирующую калориметрию (ИДСК), ВЭЖХ с обратной фазой (RP-HPLC), многоугловое светорассеяние (MALS), флуоресценцию, поглощение в ультрафиолете, нефелометрию, капиллярный электрофорез (КЭ), электрофорез в ДСН-ПААГ, и их комбинации. В некоторых вариантах реализации оценка продукта в соответствии с настоящим изобретением может включать в себя этап оценки внешнего вида (внешний вид жидкости или таблетки).

[0311] Как правило, составы (лиофилизированные или водные) могут храниться в течение длительного времени при комнатной температуре. Температура хранения может колебаться от 0°C до 45°C (например, 4°C, 20°C, 25°C, 45°C и т.д.). Составы могут храниться в течение периода от нескольких месяцев до нескольких лет. Срок хранения, как правило, составляет 24 месяцев, 12 месяцев, 6 месяцев, 4,5 месяца, 3 месяца, 2 недели или 1 месяц. Составы могут храниться непосредственно в контейнере, применяемом для введения, что позволяет исключить этап переноса.

[0312] Составы могут храниться непосредственно в лиофилизационном контейнере (если они лиофилизированы), который может функционировать в качестве сосуда для восстановления, чтобы исключить этап передачи. Кроме того, лиофилизированный лекарственный состав может быть дозирован с небольшим инкрементом для хранения. В процессе хранения в целом необходимо избегать воздействий, которые приводят к разрушению белков, в том числе, без ограничений, воздействий солнечных лучей, ультрафиолетового излучения и других форм электромагнитного излучения, чрезмерного тепла или холода, быстрого теплового шока и механического шока.

[0313] В некоторых вариантах реализации составы в соответствии с настоящим изобретением находятся в жидкой или водной форме. В некоторых вариантах реализации составы настоящего изобретения лиофилизируют. Подобная лиофилизированная композиция может быть восстановлена путем добавления одного или более разбавителей перед введением субъекту. Подходящие растворители включают, но не ограничиваются перечисленными: стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекций и стерильный физиологический раствор. В предпочтительном варианте при восстановлении терапевтический агент, содержащийся в составе, является стабильным, растворимым и демонстрирует переносимость при введении субъекту.

[0314] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению характеризуются переносимостью. В настоящей заявке термины "переносимый" и "переносимость" относятся к способности фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению не вызвать нежелательной реакции у субъекта, которому вводят такую композицию, или, в альтернативном варианте, не вызывать серьезных побочных реакций у субъекта, которому вводят подобную композицию. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению хорошо переносимы субъектами, которым вводят подобные композиции.

Устройство для интратекального введения

[0315] Различные устройства можно применять для интратекальной доставки в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах реализации устройство для интратекального введения содержит порт ввода жидкости (например, инъекционный порт): полый резервуар (например, катетер), включающую первое отверстие для жидкости, сообщающееся с входным портом для жидкости и второе отверстие для жидкости, выполненную с возможностью введения в спинной мозг, и блокирующее приспособление для блокировки введения полой основной части в спинной мозг. В качестве примера, но не ограничения, на Фигуре 1 показано, что подходящий механизм блокировки приспособление для блокировки включает одну или более выпуклостей, выполненных на поверхности полой основной части, и блокирующее кольцо, выполненное с возможностью установки над одной или большим числом выпуклостей, для предотвращения выскальзывания полой основной части (например, катетера) из спинного мозга. В различных вариантах реализации, порт ввода жидкости включает резервуар. В некоторых вариантах реализации порт ввода жидкости включает механический насос (например, инфузионный насос). В некоторых вариантах реализации имплантированный катетер соединяют с резервуаром (например, для болюсной доставки) или с инфузионным насосом. Порт вводя жидкости может быть имплантируемым или быть внешним.

[0316] В некоторых вариантах реализации интратекальное введение может быть выполнено либо с использованием спинномозговой пункции (т.е. медленный болюс) или через система доставки порт-катетер (например, инфузия или болюс). В некоторых вариантах реализации катетер вводят между пластинками поясничных позвонков и наконечник вставлен в межоболочечное пространство до желаемого уровня (как правило, L3-L4) (На Фигуре 2).

[0317] Однократная доза, подходящая для интратекального введения обычно является небольшой по сравнению с внутривенным введением. Обычно интратекальная доставка в соответствии с настоящим изобретением поддерживает баланс состава СМЖ, а также внутричерепное давление субъекта. В некоторых вариантах реализации интратекальная доставка осуществляется в отсутствие соответствующего извлечения СМЖ у субъекта. В некоторых вариантах реализации, подходящий для однократной дозы объем может быть, например, менее 10 мл, 8 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1,5 мл, 1 мл, 0,5 мл или в некоторых вариантах реализации, подходящих для однократной дозы, может составлять примерно 0,5-5 мл, 0,5-4 мл, 0,5-3 мл, 0,5-2 мл, 0,5-1 мл, 1-3 мл, 1-5 мл, 1,5-3 мл, 1-4 мл или 0,5-1,5 мл. В некоторых вариантах реализации интратекальная доставка в соответствии с настоящим изобретением включает стадию предварительного извлечения необходимого количества спинномозговой жидкости. В некоторых вариантах реализации перед ИТ введением удаляют менее чем 10 мл (например, менее чем 9 мл, 8 мл, 7 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1 мл) СМЖ. В тех случаях, подходящий объем однократной дозы может составлять, например, более 3 мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл или 20 мл.

[0318] Различные другие устройства могут быть использованы для осуществления интратекального введения терапевтической композиции. Например, составы, содержащие желаемые ферменты, могут быть предоставлены для использования с резервуаром Оммайя, который обычно применяют для интратекального введения лекарственных средств при менингеальном карциноматозе (Lancet 2: 983-84, 1963). В частности, в этом способе вентрикулярную трубку вводят через отверстие, сформированное в переднем роге спинного мозга, и подключают к резервуару Оммайя, установленному под кожей головы, и резервуар прокалываю подкожно для интратекальной доставки замещающего фермента, который вводят в резервуар. Другие устройства для интратекального введения терапевтических композиций или составов, описаны в патентах США №6217552, включенных в настоящую заявку посредством ссылки. Кроме того, состав может быть введен интратекально, например, путем однократной инъекции или инфузии. Следует понимать, что лечебная доза может представлять собой либо однократную дозу, либо многократную дозу.

[0319] Для инъекции составы настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде жидких растворов. Кроме того, фермент может входить в состав состава в твердом виде и может быть повторно растворен или суспендирован непосредственно перед применением. Лиофилизированные формы также предусмотрены. Инъекция может быть, например, в виде болюсной инъекции или непрерывной инфузии фермента (например, с использованием инфузионных насосов).

[0320] В одном варианте реализации настоящего изобретения фермент вводят путем латеральной церебровентрикулярной инъекции в головной мозг субъекта. Инъекцию можно осуществить, например, через трепанационное отверстие в черепе субъекта. В другом варианте реализации фермент и/или другой фармацевтический состав вводят через хирургически введенные шунт в желудочек мозга субъекта. Например, инъекция может быть осуществлена в боковые желудочки, имеющие больший размер. В некоторых вариантах реализации может быть также осуществлена инъекция в третий и четвертый желудочки, размер которых меньше.

[0321] В еще одном варианте реализации фармацевтические композиции, применяемые в настоящем изобретении, вводят в виде инъекций в большую цистерну или поясничную область субъекта.

[0322] В другом варианте реализации способа согласно настоящему изобретению фармацевтически приемлемый состав обеспечивает непрерывную доставку субъекту, например, "медленное высвобождение" фермента или другой фармацевтической композиции, применяемой в настоящем изобретении, в течение по меньшей мере, одной, двух, трех, четырех недель или более длительного периода времени, после того как фармацевтически приемлемые составы вводят субъекту.

[0323] В настоящей заявке термин "непрерывная доставка" относится к непрерывной доставке фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению in vivo в течение продолжительного периода времени после введения, предпочтительно, по меньшей мере нескольких дней, недели или нескольких недель. Непрерывная доставка композиции может проявляться, например, в продолжительном терапевтическом эффекте вводимого фермента в течение продолжительного периода времени (например, устойчивая доставка фермента может проявляться в продолжающемся уменьшении объема запасных гранул у субъекта). Кроме того, непрерывная доставка фермента может проявляться в обнаружения присутствия фермента in vivo в течение продолжительного периода времени.

Доставка в ткани-мишени

[0324] Как уже говорилось выше, один из неожиданных и важных признаков настоящего изобретения состоит в том, что терапевтические агенты, в частности, замещающие ферменты, вводимые с использованием способов согласно настоящему изобретению, и композиции согласно настоящему изобретению, способны эффективно и широко диффундировать через поверхность мозга и проникать в различные слои или области мозга, в том числе в глубокие области мозга. Кроме того, способы согласно настоящему изобретению и композиции согласно настоящему изобретению относятся к эффективной доставке терапевтических агентов (например, замещающих ферментов) в различные ткани или нейроны спинного мозга, в том числе в поясничную область, в которую трудно осуществлять направленную доставку с использованием существующих способов доставки в ЦНС, таких как ИЦВ инъекция. Кроме того, способы согласно настоящему изобретению и композиции согласно настоящему изобретению обеспечивают доставку достаточного количества терапевтических агентов (например, замещающих ферментов) в кровь и различные периферические органы и ткани.

[0325] Таким образом, в некоторых вариантах реализации терапевтические белки (например, замещающие ферменты) поступают в центральную нервную систему субъекта. В некоторых вариантах реализации терапевтические белки (например, замещающие ферменты) поступают в одну или более ткань-мишень головного мозга, спинного мозга и/или периферического органа. В настоящей заявке термин "ткань-мишень/целевая ткань" относится к любой ткани, пораженной лизосомной болезнью накопления, которую лечат, или любой ткани, в которой лизосомных фермент, уровень которого понижен, экспрессируется в норме. В некоторых вариантах реализации ткани-мишени включают ткани, в которых обнаружено аномально высокое количество субстрата фермента, например, накопленного в лизосомах клеток ткани, у пациентов, страдающих или предрасположенных к лизосомной болезни накопления. В некоторых вариантах реализации ткани-мишени включают ткани, демонстрирующие патологии, симптомы или признаки, ассоциированные с такой болезнью. В некоторых вариантах реализации ткани-мишени включают ткани, в которых недостаточный лизосомальный фермент в норме эксперссируется на высоком уровне. В настоящей заявке ткань-мишень может представлять собой ткань-мишень головного мозга, ткань-мишень спинного мозга и/или периферическую ткань-мишень. Примеры тканей-мишеней подробно описаны ниже.

Ткани-мишени головного мозга

[0326] В целом, головной мозг может быть разделен на различные отделы, слои и ткани. Например, менингеальные ткани представляют собой систему мембран, включающую центральную нервную систему, в том числе головной мозг. Мозговые оболочки содержат три слоя, в том числе твердую мозговую оболочку, паутинную ткань и мягкую мозговую оболочку. Обычно основной функцией мозговых оболочек и спинномозговой жидкости является защита центральной нервной системы. В некоторых вариантах реализации терапевтический белок в соответствии с настоящим изобретением доставляют в один или несколько слоев мозговых оболочек.

[0327] Головной мозг состоит из трех основных отделов, в том числе полушарий головного мозга, мозжечка и ствола мозга. Полушария головного мозга расположены выше большинства других структур головного мозга и покрыты корковым слоем. Под полушариями головного мозга лежит ствол мозга, который напоминает стебель, к которому прикреплены полушария головного мозга. В задней части мозга под полушариями головного мозга и за стволом мозга находится мозжечок.

[0328] Промежуточный мозг, который находится недалеко от средней линии головного мозга и выше среднего мозга, включает таламус, метаталамус, гипоталамус, эпиталамус, преталамус и претектум. Средний мозг, который также называют мезенцефалон, содержит крышу, тегумент, вентрикулярный мезоцелий и церебральные ножки, красное ядро и черепные нервы III ядра. Средний мозг связан со зрением, слухом, управлением движением, сном/ бодрствованием, внимательностью и регуляцией температуры.

[0329] Области тканей центральной нервной системы, включая головной мозг, могут быть охарактеризованы на основании глубины тканей. Например, ткани ЦНС (например, головной мозг) могут быть охарактеризованы как поверхностные ткани или неглубокие, ткани средней глубины и/или глубокие ткани.

[0330] В соответствии с настоящим изобретением терапевтический белок (например, замещающий фермент) может быть доставлен в любую подходящую ткань-мишень мозга, связанную с болезнью субъекта, которую лечат. В некоторых вариантах реализации терапевтические белки (например, замещающие ферменты) в соответствии с настоящим изобретением доставляют к поверхностным или неглубоким тканям-мишеням мозга. В некоторых вариантах реализации терапевтические белки в соответствии настоящим изобретением доставляются к тканям-мишеням мозга на средней глубине. В некоторых вариантах реализации терапевтические белки в соответствии с настоящим изобретением доставляют в глубокие ткани-мишени мозга. В некоторых вариантах реализации терапевтические белки в соответствии настоящим изобретением доставляют в комбинацию поверхностных или неглубоких тканей-мишеней головного мозга, тканей-мишеней средней головного мозга глубины и/или глубоким тканям-мишеням мозга. В некоторых вариантах реализации терапевтические белки в соответствии настоящим изобретением доставляют в глубокие ткани мозга, лежащие по меньшей мере на 4 мм, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм, 10 мм и глубже (или внутренние) от внешней поверхности мозга.

[0331] В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют в одну или более поверхностных или неглубоких тканей головного мозга. В некоторых вариантах реализации целевые поверхностные или неглубокие ткани головного мозга находятся в пределах 4 мм от поверхности головного мозга. В некоторых вариантах реализации целевые поверхностные или неглубокие ткани головного мозга выбраны из тканей мягкой мозговой оболочки, коры головного мозга, гиппокампа, пространства Вирхова-Робина, кровеносных сосудов в пространстве ВР, гиппокампа, частей гипоталамуса на нижней поверхности мозга, зрительных нервов и путей, обонятельной луковицы и проекций и их комбинации.

[0332] В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют в одну или более глубоких тканей головного мозга. В некоторых вариантах реализации целевые поверхностные или неглубокие ткани головного мозга расположены на 4 мм (например, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм или 10 мм), глубже (или внутрь относительно) поверхности головного мозга. В некоторых вариантах реализации целевые глубокие ткани головного мозга включают кору головного мозга. В некоторых вариантах реализации целевые глубокие ткани головного мозга включают одну или более тканей промежуточного мозга (например, гипоталамус, таламус, вентральный таламус, субталамус и т.д.), заднего мозга, чечевицеобразные ядра, базальные ганглии, хвостатое ядро, скорлупу, миндалевидное тело, бледный шар и их комбинации.

[0333] В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют в одну или более тканей мозжечка. В некоторых вариантах реализации одна или более тканей-мишеней мозжечка выбраны из группы, включающей ткани молекулярного слоя, тканей слоя клеток Пуркинье, тканей зернистого слоя, ножки мозжечка, и их комбинации. В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют в одну или более глубоких тканей мозжечка, включая, без ограничений, ткани слоя клеток Пуркинье, ткани зернистого слоя клеток, глубокого белого вещества мозжечка (например, глубокие по отношению к зернистому слою клеток) и глубокие ткани ядер мозжечка.

[0334] В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют к одной или более ткани мозга. В некоторых вариантах реализации одна или более тканей-мишеней мозга включают ткани белого вещества ствола головного мозга и/или ткани ядер ствола мозга.

[0335] В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют в различные ткани мозга, включая, без ограничений, серое вещество, белое вещество, перивентрикулярные области, мягкую-паутинную оболочку, в мозговую оболочку, кору головного мозга, мозжечок, в глубокие ткани коры головного мозга, молекулярный слой, дорсальный стриатум, средний мозг, глубинные области моста и продолговатого мозга, а также их комбинации.

[0336] В некоторых вариантах терапевтические агенты (например, ферменты) поступают в различные клетки в мозге, включая, но не ограничиваясь перечисленными: нейроны, глиальные клетки, периваскулярные клетки и/или менингеальные клетки. В некоторых вариантах терапевтический белок доставляют в олигодендроциты глубокого белого вещества.

Спинной мозг

[0337] В целом, области или ткани спинного мозга можно охарактеризовать в зависимости от глубины тканей. Например, ткани спинного мозга могут быть охарактеризованы как поверхностные или неглубокие ткани, ткани средней глубины и/или глубокие ткани.

[0338] В некоторых вариантах реализации терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют в одну или более поверхностных или неглубоких тканей спинного мозга. В некоторых вариантах реализации целевые поверхностные или неглубокие ткани спинного мозга находятся в пределах 4 мм от поверхности спинного мозга. В некоторых вариантах реализации целевые поверхностные или неглубокие ткани спинного мозга включают мягкую оболочку и/или участки белого вещества.

[0339] В некоторых вариантах терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют в одну или более глубокую тканей спинного мозга. В некоторых вариантах реализации целевые глубокие ткани спинного мозга расположены внутри на глубине 4 мм от поверхности спинного мозга. В некоторых вариантах целевые глубокие ткани спинного мозга включают серое вещество спинного мозга и/или эпендимные клетки.

[0340] В некоторых вариантах терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют к нейронам спинного мозга.

Периферические ткани-мишени

[0341] В настоящей заявке периферические органы или ткани относятся к любому органу или ткани, которые не являются частью центральной нервной системы (ЦНС). Периферические ткани-мишени могут включать, без ограничений, кровеносную систему, печень, почки, сердце, эндотелий, костный мозг и клетки-производные костного мозга, селезенку, легких, лимфатические узлы, кости, хрящи, яичники и семенники. В некоторых вариантах терапевтические белки (например, замещающий фермент) в соответствии с настоящим изобретением доставляют в одну или более периферических тканей.

Биораспределение и биодоступность

[0342] В различных вариантах реализации после доставки в ткань-мишень терапевтический агент (например, замещающий фермент) локализуется внутриклеточно. Например, терапевтический агент (например, фермент) может локализоваться в экзонах, аксонах, лизосомах, митохондриях и вакуолях клетки-мишени (например, нейрона, такого как клетка Пуркинье). Например, в некоторых вариантах реализации интратекально вводимые ферменты характеризуются такой динамикой перемещения, что фермент движется по периваскулярному пространству (например, путем конвективных механизмов с пульсацией). Кроме того, распространение интратекально вводимого белка или фермента в более глубокие ткани центральной нервной системы может обеспечиваться или каким-либо способом облегчаться механизмами активного аксонного транспорта, связанных с ассоциацией вводимого белка или фермента с нейрофиламентами.

[0343] В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий фермент), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, может достигать терапевтически или клинически эффективного уровня или активности в различных тканях-мишенях, описанных в настоящей заявке. В настоящей заявке терапевтически или клинически эффективный уровень или активность представляет собой уровень или активность, которые достаточны для оказания терапевтического эффекта в ткани-мишени. Терапевтический эффект может быть объективным (то есть измеряемым с использованием ряда тестов или с использованием маркера) или субъективным (т.е. сам субъект сообщает об эффекте или ощущает такой эффект). Например, терапевтически или клинически эффективный уровень или активность могут представлять собой уровень или активность фермента, которые являются достаточными для облегчения симптомов, связанных с заболеванием в ткани-мишени (например, накопление ГАГ).

[0344] В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий ферментов), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, может достигать уровня или ферментативной активности, составляющей по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% от нормального уровня или активности соответствующего лизосомального фермента в ткани-мишени. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий фермент), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, может достигать уровня или ферментативной активности, которая увеличена по меньшей мере в 1 раз, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз, по сравнению с контролем (например, эндогенный уровень или активность без лечения). В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий фермент), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, может достигать повышенного уровня или ферментативной активности по меньшей мере приблизительно 10 нмоль/ч/мг, 20 нмоль/ч/мг, 40 нмоль/ч/мг, 50 нмоль/ч/мг, 60 нмоль/ч/мг, 70 нмоль/ч/мг, 80 нмоль/ч/мг, 90 нмоль/ч/мг, 100 нмоль/ч/мг, 150 нмоль/ч/мг, 200 нмоль/ч/мг, 250 нмоль/ч/мг, 300 нмоль/ч/мг, 350 нмоль/ч/мг, 400 нмоль/ч/мг, 450 нмоль/ч/мг, 500 нмоль/ч/мг, 550 нмоль/ч/мг или 600 нмоль/ч/мг в ткани-мишени.

[0345] В некоторых вариантах реализации способы согласно настоящему изобретению в особенности применимы для направленной доставки (таргетинга) в поясничную область. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий фермент), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, может достигать повышенного уровня или ферментативной активности в поясничной области, составляющей по меньшей мере приблизительно 500 нмоль/ч/мг, 600 нмоль/ч/мг, 700 нмоль/ч/мг, 800 нмоль/ч/мг, 900 нмоль/ч/мг, 1000 нмоль/ч/мг, 1500 нмоль/ч/мг, 2000 нмоль/ч/мг, 3000 нмоль/ч/мг, 4000 нмоль/ч/мг, 5000 нмоль/ч/мг, 6000 нмоль/ч/мг, 7000 нмоль/ч/мг, 8000 нмоль/ч/мг, 9000 нмоль/ч/мг или 10,000 нмоль/ч/мг.

[0346] В целом, терапевтические агенты (например, замещающий фермент), доставляемые в соответствии с настоящим изобретением, имеют достаточно длительный период полужизни в спинномозговой жидкости и тканях головного мозга, спинного мозга и периферических органов. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий фермент), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, может иметь период полужизни по меньшей мере, 30 минут, 45 минут, 60 минут, 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часа, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 16 часов, 18 часов, 20 часов, 25 часов, 30 часов, 35 часов, 40 часов, до 3 дней, до 7 дней, до 14 дней, до 21 дней или до месяца. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий фермент), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, может сохраняться на детектируемом уровне или при детектируемой активности в спинномозговой жидкости или крови после 12 часов, 24 часов, 30 часов, 36 часов, 42 часов, 48 часов, 54 часов, 60 часов, 66 часов, 72 часов, 78 часов, 84 часов, 90 часов, 96 часов, 102 часов или недели после введения. Детектируемый уровень или детектируемая активность может быть определена с использованием различных способов, известных в данной области.

[0347] В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий фермент), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, достигает концентрации по меньшей мере 30 мкг/мл в тканях и клетках ЦНС у субъекта после введения (например, одной недели, 3 дней, 48 часов, 36 часов, 24 часа, 18 часов, 12 часа, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 3 часов, 2 часа, 1 час, 30 минут или менее, после интратекального введения фармацевтической композиции субъекту). В некоторых вариантах реализации терапевтический агент (например, замещающий фермент), доставляемый в соответствии с настоящим изобретением, достигает концентрации по меньшей мере 20 мкг/мл, по меньшей мере 15 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 7.5 мкг/мл, по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 2,5 мкг/мл, по меньшей мере 1,0 мкг/мл или по меньшей мере 0,5 мкг/мл в целевых тканях или клетках субъекта (например, ткани мозга или нейронов) после введения такому субъекту (например, через одну неделю, 3 дня, 48 часов, 36 часов, 24 часа, 18 часов, 12 часа, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 3 часов, 2 часа, 1 час, 30 минут или менее после интратекального введения такой фармацевтической композиции субъекту).

Лечение лизосомных болезней накопления с использованием интратекального введения

[0348] Лизосомные болезней накопления представляют собой группу сравнительно редких наследственных нарушений обмена веществ, которые являются результатом дефектов функции лизосом. Лизосомные заболевания характеризуются накоплением нерасщепленных макромолекул, в том числе субстратов ферментов, в лизосомах (см. Таблицу 1), что приводит к увеличению размеров и количества таких лизосом и в конечном итоге - к клеточной дисфункции и клиническим аномалиям.

[0349] Способы согласно настоящему изобретению, описанные в настоящей заявке, могут эффективно облегчать доставку одного или более терапевтических агентов (например, одного или более замещающего фермента) к органеллам-мишеням. Например, поскольку лизосомные болезни накопления, такие как синдром Хантера, характеризуется накоплением гликозаминогликанов (ГАГ) в лизосомах пораженных клеток, лизосомы представляют собой желаемые органеллы-мишени для лечения лизосомных болезней накопления.

[0350] Способы и композиции согласно настоящему изобретению применимы, в частности, для лечения заболеваний, имеющих этиологию ЦНС или затрагивающие компоненты ЦНС. Лизосомные болезни накопления, имеющие этиологию ЦНС или затрагивающие компоненты ЦНС, включают, например, без ограничения синдром Санфилиппо типа А, синдром Санфилиппо типа В, синдромом Хантера, метахроматическую лейкодистрофию и лейкодистрофию глобоидных клеток. До настоящего изобретения традиционные способы терапии имели ограничение, заключающемся в том, что они включали только внутривенное введение состава субъекту, и, как правило, были эффективны только в лечении соматических симптомов основной ферментной недостаточности. Композиции и способы согласно настоящему изобретению можно применять непосредственно в ЦНС пациента, страдающего заболеванием с этиологией ЦНС, что обеспечивает достижение терапевтических концентраций в пораженных клетках и тканях центральной нервной системы (например, мозга), и таким образом, позволяет преодолеть ограничения, связанные с традиционным системным введением таких терапевтических агентов.

[0351] В некоторых вариантах реализации изобретения способы и композиции согласно настоящему изобретению применимы для лечения как неврологических, так и соматических осложнений или симптомов лизосомных болезней накопления. Например, в некоторых вариантах реализации изобретение относится к композициям и способам доставки одного или более терапевтического агента в ЦНС субъекта (например, интратекально, интравентрикулярно или интрацистернально) для лечения нарушений ЦНС или неврологических осложнений и проявлений лизосомных болезней накопления, а также лечения системных или соматических проявлений таких лизосомных болезней накопления. Например, некоторые композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены субъекту интратекально, что таким образом обеспечивает доставку одного или более терапевтического агента в ЦНС субъекта и лечение неврологических осложнений, связанных с внутривенным введением одного или более терапевтических агентов, для доставки такого терапевтического агента как в клетки, так и в ткани системного кровотока (например, клетки и ткани сердца, легких, печени, почек и лимфатических узлов), что способствует лечению таких соматических осложнений. Например, субъекту, страдающему или иным образом пораженному лизосомной болезнью накопления (например, синдром Хантера) можно вводить фармацевтическую композицию, содержащую один или более терапевтических агентов (например, идуронат-2-сульфатазу) интратекально по меньшей мере раз в неделю, раз в две недели, ежемесячно, раз в два месяца или больше, для лечения неврологических осложнений, тогда как другой терапевтический агент вводят субъекту внутривенно более часто (например, раз в день, через день, три раза в неделю или еженедельно) для лечения системных или соматических проявлений такого заболевания.

[0352] Например, у пациентов, страдающих синдромом Хантера, проявляются гистологические изменения в мозге, которые могут включать атрофию, вздутие корковых нейронов, уменьшение белого вещества головного мозга, расширение периваскулярного пространства и вздутие дендритов клеток Пуркинье. Исследования с использованием магнитно-резонансной визуализации/спектроскопии показали, что тяжелые диффузные поражения, затрагивающие белое вещество, атрофия мозга, гидроцефалия, в большей степени распространены у пациентов с когнитивными нарушениями, по сравнению с пациентами без таких нарушений. (Vedolin, L., et al., AJNR Am J Neuroradiol (2007) 28, 1029-1033). Даже у пациентов без крайне выраженных неврологических осложнений, таких как умственная отсталость или задержка развития, было показано наличие аномалий мозга, в том числе атрофии, вентрикуломегалии и увеличение периваскулярного пространства. (Matheus, MG, et al., Neuroradiology (2004) 46, 666-672.

[0353] В качестве н ограничивающего примера, мукополисахаридоз IIIA типа (MPS IIIA; синдром Санфилиппо типа А) является наиболее тяжелой формой синдрома Санфилиппо типа А и поражает примерно 1 на 100000 человек по всему миру. Синдром Санфилиппо типа А (Санфилиппо А) характеризуется дефицитом фермента гепаран N-сульфатазы (HNS), экзосульфатазы, участвующей в лизосомном катаболизме гликозаминогликана (ГАГ) гепарансульфата (Neufeld EF, et al. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001) pp.3421-3452). В отсутствие этого фермента, ГАГ гепарансульфат накапливается в лизосомах нейронов и глиальных клеток, с меньшим накоплением вне головного мозга.

[0354] В качестве неограничивающего примера, мукополисахаридоз IIIB типа (MPS IIIB; Санфилиппо синдром типа В) представляет собой аутосомно-рецессивное нарушение, характеризующееся дефицитом фермента альфа-N-ацетил-глюкозаминидазы (Naglu). В отсутствие этого фермента, ГАГ гепарансульфат накапливается в лизосомах нейронов и глиальных клеток, с меньшим накоплением вне головного мозга.

[0355] В качестве неограничивающего примера, лейкодистрофия глобоидных клеток (ЛГК) представляет собой редкую аутосомно-рецессивную болезнь накопления, вызванную дефектом функции галактоцереброзидазы (GALC). GALC представляет собой растворимый лизосомальный фермент - кислую гидролазу, расщепляющую галактозилцерамид, нормальный компонент миелина, на галактозу и церамид, и психозин (галактозилсфингозин), токсичный побочный продукт синтеза галактозилцерамида, на галактозу и сфингозин. Недостаток GALC приводит к неврологическим поражениям центральной и периферической нервной системы (ЦНС и ПНС, соответственно) по двум взаимосвязанным, но различным механизмам. Первый механизм ведет к чрезмерному накоплению психозина с последующим апоптозом миелинизированных клеток. Во втором механизме галактозилцерамид накапливается и фагоцитируется активированной микроглией с образованием характерных глобоидных клеток, которые и дали название этому заболеванию. В отличие от других лизосомных болезней накопления, при которых происходит накопление неразрушенного субстрата, при этом заболеваний, как правило, не происходит увеличения галактозилцерамидов в нервной ткани.

[0356] Определяющим клиническим признаком данного заболевания является дегенерация центральной нервной системы (ЦНС), которая приводит к утрате, или неспособности приобретения основных навыков развития. Прогрессирующее снижение когнитивных способностей завершается деменцией и преждевременной смертью. Болезнь может проявляться у маленьких детей (ранняя ЛГК) или у лиц любого возраста (поздняя ЛГК). Продолжительность жизни отдельных больных с ранним началом ЛГК, как правило, не превышает двух лет. Поздняя ЛГК может появиться у людей любого возраста, и характер развития этого заболевания может варьировать в значительной степени.

[0357] Метахроматическая лейкодистрофия (МЛ) представляет собой аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное недостаточностью фермента арилсульфатазы (ASA). ASA, кодируемая геном ARSA человека, представляет собой фермент, расщепляющий цереброзид-3-сульфат или сфинголипид 3-O-сульфогалактозилцерамид (сульфатид) на цереброзид и сульфат. В отсутствие фермента, сульфатиды накапливаются в нервной системе (например, в миелиновых оболочках, нейронах и глиальных клетках) и в меньшей степени в висцеральных органах. Следствием таких молекулярных и клеточных событий является прогрессирующая демиелинизация и потеря аксонов в ЦНС и ПНС, сопровождающиеся моторными и когнитивными нарушениями с тяжелым клиническим проявлением.

[0358] Определяющим клиническим признаком этого заболевания является дегенерация центральной нервной системы (ЦНС), которая приводит к когнитивным нарушениям (например, умственной отсталости, нервным расстройствам и слепоте, и др.).

[0359] Как неограничивающий пример, МЛ может проявляться у детей раннего возраста (поздняя инфантильная форма), при этом у больных детей симптомы проявляются обычно сразу после первого года жизни (например, примерно 15-24 месяцев), и, как правило, такие дети не живут более 5 лет. МЛ может проявляться у детей (ювенильная форма), при этом у больных детей когнитивные нарушения проявляются обычно примерно в возрасте 3-10 лет, а продолжительность жизни может варьировать (например, в диапазоне 10-15 лет после появления симптомов). МЛ может проявляться у взрослых (взрослая форма) и может появляться у людей любого возраста (например, обычно в возрасте 16 лет и старше), а прогрессирование заболевания может сильно варьировать.

[0360] Таким образом, в некоторых вариантах реализации способы и композиции согласно настоящему изобретению обеспечивают доставку одного или нескольких терапевтических агентов (например, одного или нескольких замещающих ферментов) в одну или более органеллу (например, лизосому) целевых тканей и клеток головного мозга, спинного мозга и/или периферических органов для осуществления лечения различных лизосомных болезней накопления. В настоящей заявке термины «лечить» или «лечение», используемые в настоящей заявке, относятся к улучшению одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием, предотвращению или задержке наступления одного или более симптомов заболевания и/или уменьшению тяжести или частоты одного или более симптома заболевания.

[0361] В некоторых вариантах лечение относится к частичному или полному улучшению, облегчению, торможению, задержке начала, снижению тяжести и/или частоты неврологических нарушений у пациента, страдающего или восприимчивого к лизосомной болезни. В настоящей заявке термин «неврологические нарушения» включает различные симптомы, связанные с нарушением центральной нервной системы (например, головного и спинного мозга). Симптомы неврологических нарушений могут включать, например, задержку развития, прогрессирующие когнитивные нарушения, ослабление слуха, нарушение развития речи, дефицит моторных навыков, гиперактивность, агрессивность и/или нарушение сна, наряду с другими симптомами.

[0362] В некоторых вариантах реализации лечение относится к уменьшению лизосомных отложений (например, макромолекул, таких как ГАГ) в различных тканях. В некоторых вариантах реализации лечение относится к уменьшению лизосомных отложений в тканях-мишенях мозга, в нейронах спинного мозга и/или периферической ткани-мишени. В некоторых вариантах реализации лизосомные отложения уменьшаются примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% и более, по сравнению с контролем. В некоторых вариантах реализации лизосомные отложения уменьшаются по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз, по сравнению с контролем. В некоторых вариантах реализации лизосомное накопление оценивают по наличию лизосомных накопительных гранул (например, характерная исчерченность).

[0363] В некоторых вариантах лечение относится к снижению вакуолизации в нейронах (например, нейронах, включающих клетки Пуркинье). В некоторых вариантах реализации вакуолизация в нейронах уменьшается примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% и более, по сравнению с контролем. В некоторых вариантах реализации вакуолизация уменьшается, по меньшей мере, в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз, по сравнению с контролем.

[0364] В некоторых вариантах реализации лечение согласно настоящему изобретению приводит к снижению (например, примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более) содержания или полному устранению, или, в альтернативном варианте, отложения одного или более патологического или биологического маркера, ассоциированного с лизосомными болезнями накопления. Такое снижение или устранение могут быть особенно заметны в клетках и тканях центральной нервной системы (например, нейронах и олигодендроцитах). Например, в некоторых вариантах реализации при введении субъекту фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению вызывает или обуславливает сокращение накопления биомаркера лизосомного белка, ассоциированного с мембраной, 1 (LAMP1) в клетках и тканях ЦНС у субъекта (например, в коре головного мозга, мозжечке, хвостатом ядре и скорлупе, белом веществе и/или таламусе). LAMP1 представляет собой гликопротеин, экспрессируемый на высоком уровне на мембранах лизосом, и его уровень повышен у многих пациентов с лизосомными болезнями накопления (Meikle, et al. Clin Chem. (1997) 43: 1325-1335.) Следовательно, присутствие или отсутствие LAMP1 у больных (например, определяемое с использованием окрашивания на LAMP1) с лизосомной болезнью накопления, может служить показателем лизосомной активности и маркером для диагностики и мониторинга лизосомных болезней накопления.

[0365] Таким образом, некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам снижения или устранения одного или более патологического или биологического маркера, ассоциированного с заболеванием (например, лизосомной болезнью накопления). Кроме того, некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам увеличения разрушения (или скорости разрушения) одного или более патологических или биологических маркеров (например, LAMP1), ассоциированных с лизосомными болезнями накопления.

[0366] В некоторых вариантах реализации лечение относится к снижению прогрессирования потери когнитивных способностей. В некоторых вариантах прогрессирование потери познавательной способности уменьшается примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% и более, по сравнению с контролем. В некоторых вариантах лечение относится к снижению задержки в развитии. В некоторых вариантах задержка развития уменьшается примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% и более, по сравнению с контролем.

[0367] В некоторых вариантах реализации лечение относится к увеличению выживаемости (например, продолжительности жизни). Например, лечение может приводить к увеличению продолжительности жизни пациентов. В некоторых вариантах реализации лечение согласно настоящему изобретению приводит к увеличению продолжительности жизни пациентов более чем на примерно 5%, примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 100%, примерно 105%, 110%, примерно 115%, примерно 120%, примерно 125%, примерно 130%, примерно 135%, примерно 140%, примерно 145%, примерно 150%, примерно 155%, примерно 160%, примерно 165%, примерно 170%, примерно 175%, примерно 180%, примерно 185%, примерно 190%, примерно 195%, 200% или более, по сравнению со средней продолжительностью жизни одного или более пациентов, страдающих таким же заболеванием, но не подвергавшихся лечению. В некоторых вариантах реализации лечение согласно настоящему изобретению приводит к увеличению продолжительности жизни пациента более чем на 6 месяцев, примерно на 7 месяцев, примерно на 8 месяцев, примерно на 9 месяцев, примерно на 10 месяцев, примерно на 11 месяцев, примерно на 12 месяцев, примерно на 2 года, примерно на 3 года, примерно на 4 года, примерно на 5 лет, примерно на 6 лет, примерно на 7 лет, примерно на 8 лет, примерно на 9 лет, примерно 10 лет или более, по сравнению со средней продолжительностью жизни одного или более пациентов, страдающих таким же заболеванием, но не подвергавшихся лечению. В некоторых вариантах реализации лечение в соответствии с настоящим изобретением приводит к длительной выживаемости пациента. В настоящей заявке термин "длительная выживаемость" относится к выживаемости или продолжительности жизни более 40 лет, 45 лет, 50 лет, 55 лет, 60 лет или дольше.

[0368] Термины "улучшить", "увеличить" или "уменьшить" в настоящей заявке указывают на значения относительно контроля. В некоторых вариантах реализации подходящий контроль представляет собой базовое (фоновое) измерение, например, измерение у того же самого индивида до начала лечения, описанного в настоящей заявке, или измерение у контрольного индивида (или нескольких контрольных индивидов) в отсутствие лечения, описанного в настоящей заявке. "Контрольный индивид" представляет собой индивида, страдающего таким же заболеванием, примерно такого же возраста и/или пола, как и индивид, получающего лечение (для того, чтобы стадии заболевания индивида, получающего лечение, и контрольного индивида (индивидов) были сопоставимыми).

[0369] Индивид (также называемый «пациентом» или «субъектом»), получающий лечение, представляет собой индивида (плод, младенец, ребенок, подросток или взрослый человек), имеющего заболевание или имеющего вероятность развития заболевания. Такой индивид может иметь остаточную эндогенную экспрессию и/или активность лизосомальных ферментов, либо измеряемая активность эндогенных лизосомальных ферментов может отсутствовать. Например, индивид, имеющий синдром Санфилиппо типа А, может иметь уровень экспрессии HNS, который составляет менее 30-50%, менее примерно 25-30%, менее примерно 20-25%, менее примерно 15-20%, менее примерно 10-15%, менее примерно 5-10%, менее примерно 0.1-5% от нормального уровня экспрессии HNS.

Иммунная толерантность

[0370] Как правило, интратекальное введение терапевтического агента (например, замещающего фермента) в соответствии с настоящим изобретением не вызывает тяжелых побочных эффектов у субъекта. В настоящей заявке, тяжелые побочные эффекты включают, но не ограничены перечисленным: значительный иммунный ответ, токсичность или смерть. В настоящей заявке термин «существенные иммунный ответ» относится к тяжелым или серьезным формам иммунных ответов, таким как адаптивный T-клеточный иммунный ответ.

[0371] Таким образом, во многих вариантах реализации способы в соответствии с настоящим изобретением не включают проведение сопутствующей терапии иммунодепрессантами (т.е. любой терапии иммунодепрессантами, используемой в качестве предварительного лечения/предварительной обработки или одновременно со способом настоящего изобретения). В некоторых вариантах реализации способы согласно настоящему изобретению не связаны с индукцией иммунной толерантности у субъекта, который проходит лечение. В некоторых вариантах реализации способы в соответствии с настоящим изобретением включают предварительное лечение или предварительную обработку субъекта с применением агентов, иммуносупрессирующих Т-клетки.

[0372] В некоторых вариантах реализации интратекальное введение терапевтических агентов может вызвать иммунный ответ против этих агентов. Таким образом, в некоторых вариантах реализации может быть необходимо вызвать у субъекта, получающего замещающий фермент, толерантность к фермент-заместительной терапии. Иммунная толерантность может быть индуцирована с применением различных способов, известных в данной области. Например, может быть назначен начальный 30-60-дневный режим приема агента, иммуносупрессирующего Т-клетки, такого как циклоспорин A (CsA), и антипролиферативного агента, такого как азатиоприн (Aza), в сочетании с еженедельными интратекальными инфузиями малых доз желаемого замещающего фермента.

[0373] В комбинированном лечении согласно настоящему изобретению можно применять любой иммуносупрессирующий агент, известный специалистам в данной области. Такие иммуносупрессирующие агенты включают, но не ограничены перечисленными циклоспорин, FK506, рапамицин, CTLA4-Ig, и агенты, действующий против TNF, такие как этанерцепт (см., например, Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kurlberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51, 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret al., 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1-24; Gaziev et al., 1999, Bone Marrow Transplant. 25, 689-696; Henry, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283).. В качестве иммуносупрессирующих агентов также можно применять антитело к рецептору IL2 (альфа-субъединице) - даклизумаб (например, Zenapax.™.), который показал эффективность у пациентов после трансплантации (см., например, Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999. Drugs R. D. 1, 55-60; Berard et al., 1999, Pharmacotherapy 19, 1127-1137; Eckhoffet al., 2000. Transplantation 69, 1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int. 13, 151-159). Другие иммуносупрессирующие агенты включают, но не ограничены перечисленными, лиганды, действующие против CD2 (Branco et al., 1999, Transplantation 68, 1588-1596; Przepiorka et al., 1998, Blood 92, 4066-4071), против CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishwild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 138-152), и против CD40 (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164, 1230-1235).

Введение

[0374] Способы согласно настоящему изобретению предусматривают как однократное, так и множественное введение терапевтически эффективного количества терапевтических агентов (например, замещающих ферментов), описанных в настоящей заявке. Терапевтические агенты (например, замещающие ферменты) можно вводить через регулярные промежутки времени, в зависимости от характера, степени тяжести и состояние субъекта (например, лизосомной болезни накопления). В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество терапевтического агента (например, замещающего фермента) согласно настоящему изобретению можно вводить интратекально периодически через равные промежутки времени (например, раз в год, раз в полгода, раз в пять месяцев, раз в три месяца, раз в два месяца, ежемесячно (раз в месяц), раз в две недели, еженедельно.

[0375] В некоторых вариантах интратекальное введение можно применять в сочетании с другими путями введения (например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, парентерально, трансдермально или через слизистую оболочку (например, перорально или назально)). В некоторых вариантах реализации такие другие способы введения (например, внутривенное введение) могут осуществляться не чаще, чем раз в две недели, один раз в месяц, раз в два месяца, раз в три месяца, раз в четыре месяца, раз в пять месяцев, раз в шесть месяцев, ежегодно.

[0376] В настоящей заявке термин «терапевтически эффективное количество» в основном определяют на основании общего количества терапевтического агента, содержащегося в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Как правило, терапевтически эффективное количество является достаточным для достижения значимого благоприятного эффекта у субъекта (например, лечение, модуляция, излечение, предотвращении и/или улучшение рассматриваемого заболевания или патологического состояния). Например, терапевтически эффективное количество может представлять собой количество, достаточное для достижения желаемого терапевтического и/или профилактического эффекта, например, количество, достаточное для модуляции лизосомных рецепторов, ферментов или их активности, для лечения лизосомной болезни накопления или ее симптомов (например, уменьшение или устранение наличия или распространения «полосатых телец» или клеточной вакуолизация после введения композиции согласно настоящему изобретению субъекту). Как правило, количество терапевтического агента (например, рекомбинантного лизосомального фермента), вводимого субъекту, нуждающемуся в этом, будет зависеть от характеристик субъекта. Такие характеристики включают состояние, степень тяжести заболевания, общее состояние здоровья, возраст, пол и массу тела субъекта. Специалист в данной области сможет легко определить нужных дозировки в зависимости от этих и других факторов. Кроме того, можно применять как объективные, так и субъективные тесты для определения оптимального диапазона дозы.

[0377] Терапевтически эффективное количество обычно вводят, используя введения, включающий множество однократных доз. Для любого конкретного терапевтического белка, терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая доза в пределах эффективного режима введения) может варьировать, например, в зависимости от пути введения, комбинации с другими фармацевтическими средствами. Кроме того, конкретное терапевтически эффективное количество (и/или доза) для каждого конкретного пациента может зависеть от различных факторов, в том числе от конкретного нарушения, которое лечат, и тяжести заболевания; активности конкретного применяемого фармацевтического средства; конкретной применяемой фармацевтической композиции, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и рациона пациента, времени введения, пути введения и/или скорости выведения или метаболизма конкретного применяемого гибридного белка, продолжительности лечения, и других подобных факторов, хорошо известных специалистам в области медицины.

[0378] В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективная доза находится в диапазоне от примерно 0,005 мг/кг веса головного мозга до 500 мг/кг веса головного мозга, например, от примерно 0,005 мг/кг веса головного мозга до 400 мг/кг веса головного мозга, от примерно 0,005 мг/кг веса головного мозга до 300 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 200 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 100 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг вес мозга до 90 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 80 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 70 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 60 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 50 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 40 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 30 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 25 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 20 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 15 мг/кг веса головного мозга, примерно от 0,005 мг/кг веса головного мозга до 10 мг/кг веса головного мозга.

[0379] В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективная доза больше чем примерно 0,1 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 0,5 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 1,0 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 3 мг/кг мозга вес, больше чем примерно 5 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 10 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 15 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 20 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 30 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 40 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 50 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 60 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 70 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 80 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 90 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 100 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 150 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 200 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 250 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 300 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 350 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 400 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 450 мг/кг веса головного мозга, больше чем примерно 500 мг/кг веса головного мозга.

[0380] В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективные дозы также могут быть определены в мг/кг веса тела. Как понятно специалисту в данной области, вес мозга и вес тела могут коррелировать. Dekaban AS. "Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights," Ann Neurol 1978; 4: 345-56. Таким образом, в некоторых вариантах реализации дозировки могут быть преобразованы, как показано в Таблице 4.

Таблица 4
Перевод дозировок
Корреляция между весом головного мозга, весом тела и возрастом у мужчин
Возраст (годы)	Вес головного мозга (кг)	Вес тела (кг)
3 (31-43 месяцев)	1,27	15,55
4-5	1,30	19,46

[0381] В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективные дозы также может быть определены в мг/15 см³ СМЖ. Как понятно специалисту в данной области терапевтически эффективные дозы, рассчитанные на основании веса головного мозга и веса тела, могут быть переведены в мг/15 см³ СМЖ. Например, объем СМЖ у взрослого человека составляет примерно 150 мл (Johanson СЕ, et al. "Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease," Cerebrospinal Fluid Res. 2008 May 14; 5:10). Таким образом, инъекция в дозе от 0,1 мг до 50 мг белка для взрослого человека будет составлять примерно 0,01 мг/15 см³ СМЖ (0,1 мг) до 5,0 мг/15 см³ СМЖ (50 мг) для взрослого.

[0382] Следует также понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы введения должны быть скорректированы с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями и мнением специалиста или лица, осуществляющего контроль за проведением фермент-заместительной терапии, и диапазоны дозировок, установленные в настоящем документе, приведены только для примера и не предназначены для ограничения объема или осуществления на практике заявленного изобретения.

Наборы

[0383] Настоящее изобретение также предусматривает наборы или другие изделия, содержащие состав согласно настоящему изобретению и инструкции по его восстановлению (если состав лиофилизирован) и/или применению. Наборы или другие изделия производства может включать в себя контейнер, УИДЛС, катетер и любые другие изделия, устройства или оборудование, применимые для интратекального введения и связанных с ним операций. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы (например, предварительно заполненные шприцы), ампулы, картриджи, резервуары или шприцы «lyo-jects». Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло или пластик. В некоторых вариантах реализации контейнер представляет собой предварительно заполненный шприц. Подходящие предварительно заполненные шприцы, включают, но не ограничены перечисленным: шприцы из боросиликатного стекла с термически обработанным силиконовым покрытием, шприцы из боросиликатного стекла с нанесенным слоем силикона или пластиковые шприцы без силикона.

[0384] Как правило, контейнер может включать состав и этикетку, прикрепленную или прилагаемую к контейнеру, на которой может быть указаны инструкции по восстановлению и/или применению составу. Например, на этикетке может быть указано, что состав необходимо восстановить до концентрации белка, описанной выше. Этикетка может также содержать информацию о том, для чего применим или предназначен состав, например, для ИТ введения. В некоторых вариантах реализации контейнер может содержать одну дозу стабильного состава, содержащего терапевтический агент (например, замещающий фермент). В различных вариантах реализации разовая доза стабильного состава присутствует в объеме менее 15 мл, 10 мл, 5,0 мл, 4,0 мл, 3,5 мл, 3,0 мл, 2,5 мл, 2,0 мл, 1,5 мл, 1,0 мл или 0,5 мл. Кроме того, контейнер, содержащий состав, может представлять собой флакон для многократного применения, позволяющий проводить повторные введения (например, от 2-6 введений) состава. Наборы или другие изделия могут дополнительно включать второй контейнер, содержащий подходящий растворитель (например, БВДИ, физиологический раствор, буферный раствор). После смешивания с растворителем и подготовки состава конечная концентрация белка в восстановленном составе, как правило, составляет не менее 1 мг/мл (например, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл). Наборы или другие изделия производства могут дополнительно включать другие вещества, желательные с коммерческой точки зрения и с точки зрения удобства пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, УИДЛС, катетеры, шприцы и вкладыши с инструкциями по применению.

[0385] Настоящее изобретение будет более понятным при рассмотрении следующих примеров. Примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Все процитированные источники включены посредством ссылок.

ПРИМЕРЫ

Примеры интратекальной доставки белка GalC

ПРИМЕР 1: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ GALC ДЛЯ ИНТРАТЕКАЛЬНОЙ ДОСТАВКИ

[0386] В настоящем примере описаны физико-химические свойства GalC, поскольку это помогает понять его поведение и стабильность в растворах в разных условиях во время интратекальной (ИТ) доставки указанного белка.

[0387] Среди прочего, в настоящем примере описана лекарственная форма GalC, которая требуется для успешной ИТ доставки GalC. Согласно некоторым вариантам реализации данная лекарственная форма содержит 5 мМ фосфата Na + 150 мМ NaCl, pH 6,0+0,005% полисорбата 20. Согласно некоторым вариантам реализации данная лекарственная форма содержит <5 мМ, <10 мМ, <15 мМ и <20 мМ фосфата Na. Согласно некоторым вариантам реализации данная лекарственная форма обладает pH ≥ 5,5 и ≤ pH 7,0 при концентрации NaCl 150 мМ.

[0388] Системы доставки на основе ФБР (фосфатного буферного раствора) с разной молярной концентрацией фосфатов и pH тестировали на взрослых длиннохвостых макаках (Фигура 3). Растворы с 5 мМ фосфата и pH в диапазоне 5,5-7,0 не оказывали никакого нежелательного действия, а растворы с 20 мМ фосфата и pH в диапазоне 7,0-7,5 и с 10-20 мМ фосфата и pH 7,5-8,0 оказывали нежелательное действие на обезьян (Фигура 3). Термостабильность hGalC (1 мг/мл) в буфере с 3 мМ цитрата, фосфата и бората с 50 мМ NaCl исследовали как функцию pH в диапазоне pH 5,0-8,0 (Фигура 4). Удельную активность hGalC измеряли в исходном состоянии (20-25°C) и после 2 недель хранения при 40°C, причем максимальная удельная активность сохранялась при pH 6,0-6,5 (Фигура 4). Кроме того, удельную активность hGalC измеряли после 3 месяцев хранения при 5°C, максимальная удельная активность сохранялась при pH 6,0-6,5 (Фигура 5). Температуру плавления hGalc измеряли как функцию pH (Таблица 5), а также измеряли в независимости от других параметров в разных лекарственных формах (Таблица 6).

Таблица 5
Температура плавления hGalC (1 мг/мл) как функция pH
pH универсального буфера	Тпл. (°C)
4,5*	61,6
5,0*	63,0
6,0	60,8
6,5	58,9
7,0	57,3
7,5	56,5
*[GalC]<1 мг/мл вследствие осаждения

Таблица 6
Температура плавления hGalC (1 мг/мл) в разных лекарственных формах
Лекарственная форма (рН 6,0)	Tm (°C)
5 мМ фосфата, 50 мМ NaCl	61,6
5 мМ фосфата, 150 мМ NaCl	60,2
5 мМ фосфата, 500 мМ NaCl	59,5
5 мМ фосфата, 5% декстроза	63,8
5 мМ фосфата, 150 мМ NaCl, 1% NaTC	56,8

[0389] Также термостабильность hGalC, определяемую по удельной активности hCalC приблизительно после 3 недель хранения при 5°C и после 2 недель хранения при 40°C, оценивали как функцию концентрации солей (Фигура б). Результаты показали, что hGalC сохраняет максимальную удельную активность после 3 недель хранения при 5°C при разных концентрациях соли в диапазоне от 5 мМ фосфата, 50 мМ NaCl (в настоящей заявке сокращенно обозначается как 5+50) до 50 мМ фосфата, 150 мМ NaCl (в настоящей заявке сокращенно обозначается как 5+50) при pH 6,5 (Фигура 6).

Анализ hGalC методом осаждения

[0390] Определение скорости осаждения представляет собой способ аналитического ультрацентрифугирования (АУЦ), при котором измеряют скорость, с которой молекулы перемещаются в ответ на центробежную силу, генерируемую в центрифуге, и данный способ полезен для определения ассоциированного состояния белка в растворе. В первом цикле определения скорости осаждения применяли серию разведении GalC человека в 5 мМ фосфате Na, pH 6,0 с 150 мМ NaCl (Фигура 7), чтобы оценить в указанной пробе самоассоциацию и/или неидеальность. Для указанной серии разведении строили нормированные g(s*) графики (зависимость g(s*) от s*) при каждой концентрации. Общий сдвиг кривых в сторону более низких значений s при разведении указывает на диссоциацию, и данная система является быстро обратимой самоассоциирующейся системой. Из сравнения разных значений ионной силы (Фигура 7А, В и С) видно, что при увеличении ионной силы наборы кривых сдвигаются в сторону более низких значений s, что указывает на то, что ионные взаимодействия также участвуют в процессе ассоциации, и что самоассоциация уменьшается при более высоких концентрациях соли.

[0391] Одновременно проводили цикл осаждения проводили одновременно и для GalC мыши при 150 мМ NaCl и сравнивали с hGalC. Из сравнения соответствующих значений ионной силы (150 мМ NaCl) видно, что свободная энергия самоассоциации mGalC ниже, чем энергия самоассоциации hGalC. Кривые на Фигуре 7 обрезали на уровне приблизительно 20S, чтобы более отчетливо показать диссоциацию; однако, когда указанные циклы анализировали с использованием анализа широкого распределения (АШР), а результаты строили в виде графиков на логарифмической шкале, можно было явно увидеть более крупные агрегаты (s*>20S). Агрегация с образованием крупных олигомеров (Фигура 8) особенно отчетливо видна при 50 мМ NaCl, несколько менее выражена - при 10 мМ NaCl и значительно снижается, но все еще есть, при 500 мМ NaCl при pH 6,0. Кривая АШР для максимальной концентрации для каждого из значений ионной силы представлена на Фигуре 8.

Самоассоциация в универсальном буфере при pH 6,0

[0392] При указанных условиях в универсальном буфере самоассоциация, по-видимому, имеет ту же величину, что и в фосфатном буфере, pH 6,0, что видно на Фигуре 9. Также изучалось действие pH на энергетику самоассоциации hGalC в универсальном буфере. Серийное разведение проводили при pH 4,5, 5,0, 6,0, 6,5, 7,0 и 7,5. Пробы при pH 4,5 и 5,0 были нерастворимы, и по существу осаждались 100% hGalC, и в надосадочной жидкости ничего не определялось.

[0393] Влияние pH четко проиллюстрировано на Фигуре 10, где наименьшая степень самоассоциации наблюдается при pH 7,5, а значительная самоассоциация наблюдается при pH 6,0. Эта тенденция аналогична тому, что наблюдалось при разных значениях ионной силы при более высоком pH. Повышение и ионной силы, и pH приводит к сдвигу равновесия в сторону более мелких олигомеров при максимальной концентрации (приблизительно при 1,0 мг/мл для всех). Снижение концентрации посредством серийных разведении 1/3 (см. Фигуру 7) приводит к сдвигу равновесия в самых маленьких молекул, которые, по-видимому, обладают коэффициентом седиментации около 5,2S. Пик, который появляется приблизительно на 10-13S вероятно соответствует тетрамеру типа 5S. Попытки аппроксимации указанных данных моделью самоассоциации до сих пор не увенчались успехом, вероятно, вследствие внутренней микрогетерогенности, возникающей из-за переменной степени гликозилирования.

Самоассоциация в универсальном буфере при pH 6,0

[0394] Подвергнутые воздействию и исходные пробы GalC при 5 мМ Na фосфата, pH 6,0, с 150 мМ NaCl сравнивали в эксперименте с серийными разведениями (красный → синий → зеленый → черный). Результаты для наименьшей концентрации (черный) ~0,03 мг/мл сглаживали, поэтому указанная кривая выглядит менее шумной. В пробе, подвергнутой воздействию, присутствует агрегат с размером приблизительно ln(s*)=3,0 (~20S), то есть он присутствует в значительно более высокой концентрации, чем в исходной пробе. Он составляет почти постоянную фракцию указанной пробы, на что указывает сохранение при разведении на нормированных графиках (Фигура 11, Фигура 12, Фигура 13). Следовательно, он является необратимым агрегатом с молярной массой 500 кг/моль.

hGalC с таурохлоратом в растворе

[0395] В таурохлорате натрия (NaTC) (1%) самоассоциация значительно уменьшается. Основная граница сдвигается в сторону более низких значений s, и подавляется более высокая олигомеризация (Фигура 14).

hGalC с 5% декстрозой

[0396] Добавление 5% декстрозы к GalC в 5 мМ Na фосфате, pH 6,0, приводило к образованию крупных агрегатов (Фигура 15). Пик на 18S соответствует минимальной молярной массе приблизительно 440 кДа, а пик на 56S соответствует минимальной молярной массе 2,4 кДа, причем «хвост» пика распространяется за 150S, что соответствует молярным массам более 10,0 МДа. При разведении от 1,0 до 0,3 мг/мл указанный характер кривой изменяется очень незначительно, что указывает на то, что образование данных олигомеров в основном не обратимы во временной шкале эксперимента с осаждением, т.е. в периоде 5-6 часов.

Собственная флуоресценция hGalC

[0397] Исследования собственной флуоресценции hGalC (с применением 23 Trp) проводили с целью оценки влияния pH и концентрации соли на молекулярные взаимодействия (Фигура 16 и Фигура 17). Молекулярные взаимодействия были минимальными (максимальная относительная флуоресценция на длине волны 330-350 нм) либо в 500 мМ NaCl, либо в 1% NaTC (Фигура 16). Наблюдались незначительные изменения вторичной структуры с зависимостью от pH. Осаждение наблюдалось при pH 4,5 и 5,0 (Фигура 17).

Заключение

[0398] Для оценки относительной растворимости hGalC и mGalC применяли способ с применением полиэтиленгликоль (ПЭГ)-индуцированной твердой фазы (Middaugh et al., J. Biol. Chem. 1979, 254, 367-370). Указанный способ позволяет количественно измерять относительную растворимость белков. Измерения растворимости проводили путем введения буферных растворов (5 мМ фосфата натрия с 150 мМ NaCl, pH 6,0) каждого GalC в растворы с разными концентрациями ПЭГ (10 кДа). Графики зависимости логарифма растворимости белка от концентрации ПЭГ демонстрировали линейный характер. Чтобы получить условное насыщение раствора каждого белка, проводили экстраполяцию условного насыщения раствора к нулевой концентрации ПЭГ. Сравнение условного насыщения раствора mGalC и hGalC не выявило никаких различий. В экспериментах по оценке растворимости hGalC после 3 недель хранения при 2-8°C (в 5 мМ фосфате натрия с разными концентрациями соли, pH 6,0-6,5), не отмечалось ни осаждения, ни потери активности. Для лекарственной формы 5 мМ фосфата Na + 150 мМ NaCl, pH 6,0, была получена растворимость ~30 мг/мл, и после 50 дней хранения при 2-8°C никакого осадка не наблюдалось.

[0399] Данные о AUC (площадь под кривой зависимости) указывают на то, что «нативное» состояние GalC - это зависимая от концентрации обратимая ассоциация с образованием олигомеров более высокого порядка. Биофизические данные указывают на функциональную и структурную значимость олигомеров более высокого порядка. При более высоких значениях pH активность сохраняется менее длительно, значения Tm ниже и более однородная система, что определяют по AUC. В 5 мМ фосфате натрия с 150 мМ NaCl, pH 6,0, вероятно, существует равновесие между мономерами, тримерами и олигомерами более высокого порядка. Кроме того, pH не оказывает серьезного влияния на профили AUC в диапазоне pH 6,5-7,5. В целом, система GalC является быстро обратимой системой с высокой степенью самоассоциации в тестируемых буферах.

ПРИМЕР 2: ФАРМАКОКИНЕТИКА И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ В ТКАНЯХ КРЫС СПРАГ-ДОУЛИ ПОСЛЕ ОДНОКРАТНОГО ИНТРАТЕКАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ИЛИ ОДНОКРАТНОЙ ВНУТРИВЕННОЙ БОЛЮСНОЙ ИНЪЕКЦИИ ¹²⁵I-HGALC

[0400] В настоящем примере приведены показательные результаты, иллюстрирующие фармакокинетику и распределение ¹²⁵I-hGALC в тканях крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения или однократной внутривенной болюсной инъекции. Измеряли концентрацию и содержание радиоактивности в цельной крови, сыворотке, эритроцитах, спинно-мозговой жидкости (СМЖ) и тканях, и по полученным данным проводили фармакокинетический анализ без компартментов. Были выбраны интратекальный и внутривенный пути введения, поскольку они являются предполагаемыми путями введения у человека. Уровень доз выбирали на основе потенциального воздействия у человека, существующих данных о токсичности и фармакокинетике, и на основании некоторых ограничений, накладываемых тестируемым веществом. Для исследования выбрали крыс, поскольку они являются общепринятым видом для исследований фармакокинетики и распределения в тканях. Количество животных, применяемых в данном исследовании, было минимально необходимым для адекватной оценки ожидаемой вариабельности в каждый момент времени и для решения экспериментальных задач.

Материалы и методы

Система для проведения исследований

[0401] 82 самца крыс Спраг-Доули (Rams norvegicus) были получены от компании «Charles River Canada Inc.» (Сент-Констант, Квебек, Канада) 15 апреля 2009 г. В начале лечения возраст животных составлял приблизительно 10-11 недель. Еще 9 самцов крыс были получены от компании «Charles River Canada» 28 апреля 2009 г.; возраст указанных животных составлял приблизительно 9 недель по прибытии; их наличие требовалось, чтобы обеспечить достаточное количество канюлированных животных для завершения введения препарата в исследовании.

[0402] Масса тела самцов крыс в начале лечения варьировала в диапазоне от 342 до 453 г. Масса тела всех самцов крыс, за исключением одного, при введении препарата выходила за пределы диапазона, установленного в протоколе (250-350 г), однако сочли, что это незначительное отклонение не должно повлиять на получаемые данные, поскольку животные были здоровы, а вводимая доза основывалась на реальной массе тела.

Содержание животных

[0403] После прибытия в PCS-MTL всех животных подвергали общему физикальному осмотру, которое проводил квалифицированный член ветеринарной бригады. У поступивших животных не выявили никаких значимых аномалий. Животных размещали отдельно в клетки из нержавеющей стали с дном из проволочной сетки и автоматическим клапаном подачи воды. Программа улучшения среды соответствовала надлежащей стандартной операционной процедуре. На каждой клетке была четкая маркировка с цветной кодировкой исследования, группы, номеров и пола животных. Каждое животное однозначно идентифицировали с использованием системы для татуирования AIMS®. Условия окружающей среды во время проведения исследования находились под контролем, и целевая температура и влажность составляли 19-25°C и 30-70%, соответственно. Световой период составлял 12 часов света и 12 часов темноты за исключением тех случаев, когда его прерывали в связи с запланированными действиями.

Рацион

[0404] Все животные имели свободный доступ к стандартной сертифицированной гранулированной лабораторной пище (Сертифицированная пища для грызунов 5002 PMI: «PMI Nutrition International Inc.») за исключением времени проведения назначенных процедур. Максимально допустимую концентрацию примесей в рационе (например, тяжелых металлов, афлатоксина, органических фосфатов, хлорпроизводных углеводородов, полихлорированных бифенилов) контролировали, и ее стандартный анализ проводили производители. Воду из городского водопровода, подходящую для потребления людьми (профильтрованную через бактериостатический поликарбонатный фильтр с диаметром пор 0,5 мкм), животные получали в неограниченном количестве за исключением моментов времени, когда проводились назначенные процедуры. Предполагалось, что среди поступающих с пищей веществ нет известных примесей, которые могли бы препятствовать достижению целей данного исследования.

Акклиматизация и рандомизация

[0405] Между поступлением животных и проведением операции по установке интратекального катетера проходило по меньшей мере 6 дней (для животных, поступивших 15 апреля 2009 г.) или 3 дня (для животных, поступивших 28 апреля 2009 г.), что обеспечивало акклиматизацию животных к физическим условиям и условиям окружающей среды. Во время периода акклиматизации всех животных взвешивали и рандомизировали на основе компьютерной процедуры рандомизации. Рандомизацию проводили после разделения на категории по массе тела. Животные с крайними значениями массы тела в группы не распределяли.

[0406] Животных распределили в группы исследования, как показано в Таблице 7.

Таблица 7
Номер группы	Путь введения и доза	Предполагаемый объем введения	Номер животного
Внутривенный	Интратекальный	Внутривенный (мл/кг)	Интратекальный (мл)	Самцы
1	-	60 мкг	-	0,02	1001-1024
2	1 мг/кг	-	3,33	-	2001-2024
3a	1 мг/кг	60 мкг	3,33	0,02	3001-3024
а: В/в препарат вводили в пределах 5 минут от момента интратекального введения препарата.

Каждая крыса в группах 1 и 2 получала номинальную дозу радиоактивного вещества приблизительно 3 мкКи/животное. Каждая крыса в группе 3 получала номинальную дозу радиоактивного вещества приблизительно 6 мкКи/животное.

Лекарственная форма для интратекального введения

[0407] Лекарственную форму для интратекального введения готовили в день первого введения интратекальной дозы. Отмеряли требуемое количество раствора ¹²⁵I-hGALC и добавляли к требуемому количеству раствора hGALC без метки. Добавляли отмеренный объем основы, и всю смесь аккуратно перемешивали. Готовили раствор с концентрацией 3 мг/мл и с целевым уровнем радиоактивности приблизительно 150 мкКи/мл. Получаемую лекарственную форму фильтровали через фильтр с низким связыванием белков (фильтровальная установка GV PVDF 0,22 мкм) в стерильный сосуд и хранили в холодильнике (2-8°C), защищая от действия света, до момента применения для введения.

Лекарственная форма для внутривенного введения

[0408] Лекарственную форму для внутривенного введения готовили в день первого введения внутривенной дозы. Отмеряли требуемое количество раствора ¹²⁵I-hGALC и добавляли к требуемому количеству раствора hGALC без метки. Добавляли отмеренный объем основы, и всю смесь аккуратно перемешивали. Готовили раствор с концентрацией 0,3 мг/мл и с целевым уровнем радиоактивности приблизительно 3 мкКи/мл. Получаемую лекарственную форму фильтровали через фильтр с низким связыванием белков (фильтровальная установка GV PVDF 0,22 мкм) в стерильный сосуд и хранили в холодильнике (2-8°C), защищая от действия света, до момента применения для введения.

Анализ лекарственных форм

[0409] Каждую лекарственную форму с радиоактивной меткой анализировали в лаборатории PCS-MTL в каждый из дней введения препарата методом жидкостной сцинтилляционной спектроскопии с целью определения концентрации радиоактивного вещества до лечения и после лечения. Концентрацию радиоактивного вещества определяли путем приготовления соответствующих разведении указанной лекарственной формы в основе, и анализировали аликвоты каждого разведения в двойном экземпляре. После завершения анализа (включая повторный анализ) оставшиеся лекарственные формы выбрасывали.

Расчет удельной активности тестируемого препарата

[0410] Удельную активность тестируемого препарата в лекарственной форме рассчитывали по среднему (перед введением и после введения) измеряемому уровню радиоактивности и общей массе тестируемого препарата (на основании предложенной концентрации) в лекарственной форме.

Клиническое наблюдение

[0411] Всех животных осматривали два раза в день для оценки смертности и ухудшения состояния здоровья, а также для выявления реакций на лечение в период акклиматизации и в периоды лечения, за исключением дней прибытия и окончания исследования, в которые животных осматривали один раз в день. Раз в неделю проводили расширенные обследования.

Масса тела

[0412] Массу тела отдельных животных измеряли один раз во время акклиматизации, перед операцией и за один день до введения препарата. Сообщалась только масса тела, зарегистрированная за один день до введения препарата.

Операция

[0413] Между поступлением животных и операцией проходило по меньшей мере 6 дней (или 3 дня для 9 дополнительных животных), чтобы животные успели адаптироваться к условиям окружающей среды в лаборатории. Всем животным, включая резервных животных, делали внутримышечную инъекцию антибиотика бензатин-пенициллина G + прокаин-пенициллина G в день проведения операции и повторно - через 2 дня после операции. Как правило, перед операцией и приблизительно через 8 часов после первого введения, а также в дальнейшем, если представлялось необходимым, подкожно вводили 0,05 мг/кг бупренорфина. Некоторым животным бупренорфин вводили приблизительно через 6 часов, а не через 8-12 часов после первого введения. С учетом времени полувыведения бупренорфина у крыс данное отклонение от протокола не должно влиять на здоровье указанных животных, и, следовательно, не должно влиять на достоверность данных, полученных в данном исследовании.

[0414] Животных готовили к операции, сбривая шерсть от черепа до задне-грудного отдела шеи. Перед операцией животных подвергали анестезии с использованием газовой смеси изофлурана/кислорода и держали под изофлурановой анестезией на протяжении всего хирургического вмешательства. Перед операцией и после окончания хирургического вмешательства, еще под анестезией, в каждый глаз вводили мягкое увлажняющее глазное средство. Перед операцией и еще два раза приблизительно с 24-часовым интервалом после первого введения каждому животному вводили противовоспалительный препарат (карпрофен в дозе 5 мг/кг) посредством подкожной инъекции.

[0415] Животное помещали на стереотаксический стол. Разрез кожи длиной приблизительно 2 см делали, начиная с заднего края черепа по направлению к шее. Мышцы в дорсальном отделе шеи разделяли, чтобы добраться до атлантозатылочной мембраны. Для более легкого доступа к мембране применяли ретрактор. В атлантозатылочной мембране делали разрез и медленно вводили интратекальный катетер по направлению назад до тех пор, пока катетер не достигал положения в поясничном отделе. Избыточную жидкость удаляли с использованием ватных палочек, и высушивали атлантозатылочную мембрану. Сразу же после этого для закрепления груши катетера на мембрану наносили клеящее вещество. Когда клей подсыхал, и катетер был прочно закреплен, ретрактор убирали. Делали небольшую петлю для закрепления катетера на черепе, а грушу катетера фиксировали швом из нерассасывающегося материала. Когда катетер был закреплен, его проводили через поясничный отдел дорсально, где делали разрез, чтобы установить порт доступа. Его фиксировали к указанному месту швом из нерассасывающегося материала.

[0416] Перед зашиванием мышц шеи рану промывали 2 мл теплого физиологического раствора (т.е. приблизительно 37,5°C). Мышцы зашивали с использованием простых узловых швов из рассасывающегося материала. Область расположения порта доступа промывали 2 мл теплого физиологического раствора, и кожу зашивали с использованием непрерывного подкожного шва из рассасывающегося материала. После операции и раз в день в дальнейшем на операционное поле наносили мазь с антибиотиком до тех пор, пока в этом не отпадала необходимость.

[0417] Мертвый объем катетера и порта доступа определяли во время операции. Проходимость катетера проверяли один раз во время предлечебного периода, продолжающегося со дня операции до дня введения препарата.

Лечение

[0418] Между хирургической установкой катетера/порта доступа и началом лечения проходило по меньшей мере 7 дней, чтобы произошло адекватное восстановление. Перед интратекальным введением препарата при необходимости область расположение порта доступа обривали. Участок прокола мыли хлоргексидина глюконатом и водой, и протирали его марлей, смоченной в стерильной воде, после чего три раза протирали 10% повидон-йодом. Порт доступа прокалывали иглой, присоединенной к дозировочному шприцу, и медленно вводили исследуемый препарат. После введения участок протирали йодом, чтобы ограничить загрязнение.

[0419] В 1-й день исследования животным группы 1 вводили составленную как указано форму ¹²⁵I-hGALC путем медленной интратекальной болюсной инъекции в порт доступа, расположенный под кожей в поясничном отделе, после чего порт промывали 0,04 мл физиологического раствора, чтобы доставить целевую дозу 60 мкг/животное и дозу радиоактивности приблизительно 3 мкКи/животное.

[0420] В 2-й день исследования животным группы 3 вводили составленную как указано форму ¹²⁵I-hGALC путем медленной интратекальной болюсной инъекции в порт доступа, расположенный под кожей в поясничном отделе, после чего порт промывали 0,04 мл физиологического раствора, чтобы доставить целевую дозу 60 мкг/животное и дозу радиоактивности приблизительно 3 мкКи/животное. Во время медленной интратекальной болюсной инъекции, продолжающейся 5 минут, животные группы 3 также получали препарат внутривенно через внутривенный катетер в хвостовой вене (3,33 мл/кг), после чего катетер промывали 0,6 мл физиологического раствора, чтобы доставить целевую дозу 1 мг/животное и дозу радиоактивности приблизительно 3 мкКи/животное.

[0421] В 3-й день исследования животным группы 2 вводили составленную как указано форму ¹²⁵I-hGALC путем внутривенной инъекции через внутривенный катетер в хвостовой вене (3,33 мл/кг), после чего катетер промывали 0,6 мл физиологического раствора, чтобы доставить целевую дозу 1 мг/животное и дозу радиоактивности приблизительно 3 мкКи/животное.

[0422] Вводимый объем рассчитывали на основании самого последнего практически измеренного показателя массы тела каждого животного. Регистрировали массу шприцов, заполненных составленной как указано формой ¹²⁵I-hGALC, а также массу пустых шприцов после введения препарата животному. Дозу, введенную каждому животному, рассчитывали на основании массы нетто лекарственной формы, выдавленной из шприца, и измеренной концентрации радиоактивности в дозе препарата.

[0423] Во время введения препарата под руками всегда была марля, чтобы промакивать любые небольшие количества лекарственной формы, вытекающие обратно, и потери тестируемого препарата учитывались посредством жидкостной сцинтилляционной спектроскопии в соответствии с особым способом, применяемым в данном проекте. Шприцы и внутривенные катетеры, применяемые при введении составленной как указано формы тестируемого препарата, сохраняли. Внутривенные катетеры и выбранные порты доступа/катетеры для интратекального введения анализировали, определяя уровень радиоактивности в соответствии с особым способом, применяемым в данном проекте.

Отбор проб

Кровь/сыворотка и ткани

[0424] Терминальную пробу крови (максимально возможный объем) отбирали через 10 минут, 30 минут и 1, 3, 6, 24, 48 и 96 часов после введения препарата у 3 животных/группу для групп 1 и 3. В группе 3 интратекальное введение предшествовало внутривенному введению, и время отбора терминальных проб крови отсчитывалось от времени внутривенного введения. Терминальные пробы крови отбирали из брюшного отдела аорты крыс (группы 1, 2 и 3, и у 3 резервных животных), которых до этого подвергли эвтаназии посредством изофлурановой анестезии, путем кровопускания из брюшного отдела аорты. Приблизительно 3 мл крови (группы 1, 2 и 3) переносили в соответствующую пробирку с K₃-ЭДТА, для получения проб цельной крови, и хранили на сухом льде до обработки. Для групп 2 и 3, а также у резервных животных еще 1,5 мл крови переносили в пробирки с цитратом натрия для оценки протромбинового времени (ПТВ), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и фибриногена. Пробы крови хранили на сухом льде до проведения центрифугирования при 2700 об/мин и 4°C в течение 15 минут. Пробы плазмы хранили замороженными приблизительно при -80°C до транспортировки и анализа в лаборатории, назначенной заявителем. Плазма, отобранная у резервных животных, должна была выступать в роли пустой пробы при оценке ПТВ, АЧТВ и фибриногена. В тех случаях, когда полученного объема крови было недостаточно для проведения всех оценок (группы 1, 2 и 3), приоритетом было определение радиоактивности в крови.

[0425] Оставшуюся кровь (группы 1, 2 и 3) переносили в пробирки с активатором свертывания для получения сыворотки, и перед центрифугированием крови давали свернуться, при комнатной температуре, в течение периода приблизительно 30 минут. Пробы, отобранные при комнатной температуре, применяли для оценки свертывания крови от животных, не получавших препарат.

[0426] После обескровливания у 3 животных/момент времени из групп 1-3 отбирали следующие ткани: жировую ткань (почечный жир), надпочечники, костную ткань (бедренная кость), головной мозг, глаза, уши, почки, толстую кишку, содержимое толстой кишки, печень, легкие, мышцы (скелетные), седалищный нерв, тонкую кишку, содержимое тонкой кишки, спинной мозг (из поясничного, грудного, шейного отделов), селезенку, желудок, содержимое желудка, щитовидную/паращитовидную железу, содержимое мочевого пузыря.

[0427] При заборе ткани взвешивали, затем обрабатывали и анализировали для оценки общей радиоактивности. Все перечисленные выше ткани, а также терминальную пробу крови и сыворотки также отбирали у резервных животных, и применяли их для оценки фонового уровня радиоактивности. Оставшуюся часть тушек хранили замороженными (-10°C - -20°C) в предназначенном для этого морозильнике, что обеспечивало распад радиоактивности перед утилизацией как биологических отходов. Тушки первого животного для каждого момента времени из группы 1 и 3 доставали из морозильника, размораживали, удаляли порт доступа и катетер, промывали водой и проверяли на остаточную радиоактивность.

Спинномозговая жидкость

[0428] Пробы спинномозговой жидкости (СМЖ) отбирали у всех животных при вскрытии непосредственно перед эвтаназией. Трех животных/момент времени из групп 1-3 подвергали эвтаназии через 10 минут, 30 минут и 1, 3, 6, 24, 48 и 96 после введения препарата. Пробу (максимально возможное количество) отбирали через мостомозжечковую цистерну, чтобы удерживать голову соосно требовалось применение стереотаксического стола. СМЖ переносили в плоскую пробирку и помещали на сухой лед. Часть пробы (приблизительно 20 мкл) обрабатывали и анализировали, оценивая общее содержание радиоактивности. Также пробы СМЖ отбирали у резервных животных для определения фонового уровня радиоактивности.

Определение фонового уровня радиоактивности

[0429] Кровь, сыворотку и ткани, отобранные у резервного животного, применяли для определения фонового уровня радиоактивности для проб крови, сыворотки и тканей от животных из групп 1, 2 и 3. СМЖ, отобранную у резервного животного, применяли для определения фонового уровня радиоактивности для проб СМЖ.

Обработка проб для измерения радиоактивности

[0430] После отбора все пробы взвешивали, за исключением крови, плазмы, сыворотки и СМЖ. Для всех групп для анализа радиоактивности брали по две взвешенных аликвоты по 100 мкл цельной крови, отобранной в K₃-ЭДТА. Осаждение белков с применением трихлоруксусной кислоты (ТХУ) в цельной крови проводили следующим образом: эквивалентный объем 15% водного раствора ТХУ добавляли к двум взвешенным аликвотам цельной крови по 100 мкл. Пробы (100 мкл цельной крови + 100 мкл ТХУ) перемешивали посредством встряхивания, затем центрифугировали при 4°C приблизительно в течение 15 минут при 10000 об/мин и сливали над осадочную жидкость в отдельную пробирку. И надосадочную жидкость, и осадок анализировали на содержание радиоактивности.

[0431] Кровь для отбора сыворотки выдерживали при комнатной температуре приблизительно в течение 30 минут, чтобы произошло свертывание, перед тем как центрифугировать при 4°C и 2700 об/мин (относительная центробежная сила 1250) приблизительно в течение 10 минут, чтобы отделить сыворотку. Пробы сыворотки затем хранили на сухом льде до разлива аликвот для анализа радиоактивности (2×100 мкл отвешенных аликвот). Эритроцитарную массу (полученную после отделения плазмы) хранили на сухом льде до обработки в целях анализа радиоактивности. Оставшуюся сыворотку хранили замороженной (-10°C - -20°C). По две взвешенных аликвоты по 100 мкл цельной крови и эритроцитов (полученных после отделения сыворотки, смешанных с эквивалентным объемом деионизированной воды (масса/объем) и гомогенизированых с использованием эмульгатора Политрон) растворяли в Солуене-350, обесцвечивали перекисью водорода (30% масса/объем) и смешивали с жидкостью для сцинтилляционного анализа радиоактивности.

[0432] Осадок, полученный из цельной крови при обработке ТХУ, растворяли в 35% гидроксиде тетраметиламмония (ГТМА), обесцвечивали перекисью водорода (30% масса/объем) и смешивали с жидкостью для сцинтилляционного измерения радиоактивности. Содержимое мочевого пузыря, надосадочную жидкость из крови, обработанной ТХУ, по две взвешенных аликвоты лекарственных форм (разведенных) и сыворотки смешивали непосредственно с жидкостью для сцинтилляционного измерения радиоактивности. По две взвешенных аликвоты СМЖ (приблизительно 10 мкл/аликвоту) растворяли в 35% ГТМА перед смешиванием с жидкостью для сцинтилляционного измерения радиоактивности.

[0433] Пробы ткани растворяли в 35% ГТМА. Затем по две аликвоты смешивали непосредственно с сцинтиллирующей жидкостью перед измерением радиоактивности. Содержимое кишечника гомогенизировали с известным объемом воды. По две взвешенных аликвоты гомогенатов содержимого толстой кишки (СТК), содержимого желудка (СЖ) и содержимого тонкой кишки (СТНК) растворяли в 35% ГТМА и смешивали с жидкостью для сцинтилляционного измерения радиоактивности.

Измерения радиоактивности

[0434] Измерение радиоактивности проводили методом жидкостной сцинтилляционной спектроскопии в соответствии со стандартной операционной процедурой (СОП). В каждой пробе подсчет импульсов проводили в течение 5 минут или до достижения ошибки двух сигма порога 0,1%, в зависимости от того, что наступало раньше. Все импульсы переводили в абсолютную радиоактивность (число распадов в минуту) посредством автоматической коррекции на тушение на основании сдвига спектра внешнего стандарта. Из значений числа распадов в минуту для всех проб вычитали соответствующие фоновые значения числа распадов в минуту. После вычитания фоновой активности пробы, которые проявляли радиоактивность меньше либо равную фоновым значениям, рассматривали как нулевые при всех последующих манипуляциях.

Анализ данных

Концентрация радиоактивности

[0435] Все измерения радиоактивности вводили в стандартную компьютерную программу для работы с базами данных (Debra, версия 5.2) для расчета концентрации радиоактивности (число распадов в минуту/г и экв. массы/г) и процента от введенной радиоактивности в пробе. Объемную радиоактивность в крови, сыворотке, тканях и СМЖ в распадах в минуту/г и экв. массы/г рассчитывали на основании измеряемой удельной активности (число распадов в минуту/г или соответствующие единицы массы) тестируемого препарата с радиоактивной меткой в растворах лекарственной формы. Объемную радиоактивность в пробах крови переводили в экв. масс/мл на основании плотности крови крыс. Общее содержание в тканях рассчитывали для полной массы органов.

Фармакокинетика

[0436] Фармакокинетический (ФК) профиль общей радиоактивности в крови, сыворотке, СМЖ и тканях исследовали с использованием анализа без деления на компартменты, и при этом анализировали зависимость концентрации от времени с использованием прошедшей валидизацию компьютерной программы (WinNonlin, версия 3.2, «Pharsight Corp.», Маунтин-Вью, Калифорния, США). Модели выбирали на основании внутривенного и внесосудистого пути введения. Значения концентрации, зафиксированные как не детектируемые или не поддающиеся количественному определению, не оценивали; их обрабатывали как отсутствующие пробы. В каждый момент времени данные о концентрациях получали на разных животных, и для генерации составного фармакокинетического профиля применяли средние значения.

Отбор проб через 10 минут в Группе 1 (№ животных 1001, 1002, 1003) и Группе 2(№ животных 2001, 2002, 2003), а также отбор проб через 48 часов в Группе 1 (№ животных 1019, 1020) произвели с отклонением более чем на 10% или 6 минут от номинального момента времени. Указанное отклонение от протокола не повлияло на достоверность исследования или полученных данных, поскольку при анализе фармакокинетики рассчитывали и применяли среднее время.

[0437] Площадь под кривой зависимости концентрации радиоактивности от времени (AUC) рассчитывали с использованием линейного метода трапеций (линейной интерполяции). На практике фазу конечного выведения в профиле ФК определяли на основании линии наилучшего соответствия (R²), применяя по меньшей мере три конечных наблюдаемых значения концентраций. Наклон фазы конечного выведения рассчитывали на основании логарифмической регрессии с применением невзвешенных значений концентраций. Параметры, основанные на определении k_el, не приводились, если коэффициент смешанной корреляции (R²) был менее 0,8, или если экстраполяция AUC в бесконечность давала более чем 20% от общей площади.

Результаты

Анализ лекарственных форм (Таблица 8)

[0438] В каждый из дней введения препарата аликвоты каждой лекарственной формы анализировали методом жидкостной сцинтилляционной спектроскопии до введения препарата всем группам и после введения, и в ходе указанного анализа рассчитывали удельную активность тестируемого вещества. Суммарная средняя концентрация радиоактивности (±СО) в лекарственной форме для интратекального введения составляла для группы 1 - 345,4×10⁶±4,92×10⁶ распадов в минуту/г (155,60 мкКи/г), а для группы 3 - 334,4×10⁶±5,87×10⁶ распадов в минуту/г (150,62 мкКи/г). Суммарная средняя концентрация радиоактивности в лекарственной форме для внутривенного введения составляла для группы 2 - 4,4×10⁶±4,22×10⁵ распадов в минуту/г (1.97 мкКи/г), а для группы 3 - 4,7×10⁶±2,31×10⁵ распадов в минуту/г (2,11 мкКи/г). Расчетная удельная активность тестируемого вещества в лекарственной форме для интратекального введения составила 51,16 мкКи/мг для дозы в группе 1 и 49,53 мкКи/мг для дозы в группе 3. Расчетная удельная активность тестируемого вещества в лекарственной форме для внутривенного введения составила 6,53 мкКи/мг для дозы в группе 2 и 6,99 мкКи/мг для дозы в группе 3.

Таблица 8
Итоговые результаты оценки концентрации радиоактивности в лекарственных формах методом жидкостной сцинтилляционной спектроскопии
№ группы	Путь введения	Отбор	Средняя концентрация радиоактивности
			(число распадов в минуту/г)	(мкКи/г)
Среднее ± СО	KB	Среднее
1	Интратекально	До введения	348445137±3391878	0,97%	156,96
		После введения	342426851±4484476	1,31%	154,25
Суммарно	345435994±4924300	1,43%	155,60
2	Внутривенная болюсная инъекция	До введения	4091887±61669	1,51%	1,84
		После введения	4672629±430335	9,21%	2,10
Суммарно	4382258±421765	9,62%	1,97
3	Интратекально	До введения	332418463±3013337	091%	149,74
		После введения	336332353±7582128	2,25%	151,50
Суммарно	334375408±5868250	1,75%	150,62
3	Внутривенная болюсная инъекция	До введения	4Е27255±92785	1,92%	2,17
		После введения	4545578±247903	5,45%	2,05
Суммарно	4686417±231271	4,93%	2,11

Масса тела животных и вводимая доза (Таблица 9)

[0439] Средняя масса тела крыс в группах 1, 2 и 3 за один день до введения препарата составляли 405 г (разброс 373 г - 452 г), 410 г (разброс 367 г - 453 г) и 395 г г (разброс 342 г - 444 г), соответственно. Расчетная средняя доза ¹²⁵I-hGALC, вводимая интратекально животным из группы 1, составила 41±0,014 мкг/животное, что было эквивалентно дозе радиоактивного вещества 2,12±0,72 мкКи/животное. Средняя доза ¹²⁵I-hGALC, вводимая внутривенным путем животным из группы 2, составила 1,00±0,02 мкг/животное (2,69±0,14 мкКи/животное). Для группы 3 расчетная средняя доза ¹²⁵I-hGALC, вводимая интратекально и внутривенно, составила 1,08±0,04 мкг/животное (5,72±0,31 мкКи/животное).

Таблица 9
Средняя по группе масса тела и указание доз 125I-hGALC, вводимых самцам крыс Спраг-Доули
Группа	Масса тела (кг)	Путь введения	Радиоактивность
Распадов в минуту/г	мкКи/животное	мкКи/кг	мг/животное	мг/кг	Мкг/ животное
1	0,405±0,022	ИТ	1715,057±1,600,366	2,12±0,72	5,26±1,86	0041±0,014	0,102±0,037	41
2	0,410±0,021	ВВ	5,961,365=306,654	269±014	6,55±0,15	0,411±0,022	1,00±0,023
3b	0,395±0,027	ИТ и ВВ	12698,351±686,160	5,72±031	14,5±0,62	0,425±0,034	1,08±0,042

[0440] Средняя доза вещества и радиоактивного вещества у крыс из группы 1 была ниже (приблизительно на 32% и 29%, соответственно), чем целевой уровень доз, и это является отклонением от протокола. Однако поскольку во всех расчетах применяли реальные дозы, данные более низкие значения, как предполагается, не должны повлиять на достоверность исследования и полученных в нем данных.

Клинические наблюдения

[0441] Ни у одной из крыс после интратекального введения ¹²⁵I-hGALC в дозе 60 мкг/животное и/или внутривенного введения в дозе 1 мг/кг никаких связанных с препаратом клинических признаков не отмечалось.

Оценка свертывания крови

[0442] В ранние моменты времени (10 минут и 6 часов после введения препарата) было отмечено, что кровь, отобранная у животных, получивших препарат, в течение 30 минут свертывается не полностью. Однако кровь, отобранная у 3 не получавших препарат резервных животных, легко сворачивалась, что указывает на определенное препятствование процессу свертывания со стороны тестируемого вещества. Время свертывания меньше или больше 30 минут является отклонением от протокола. Однако для некоторых проб требовалось более длительное время на свертывание, чтобы получить некоторое количество сыворотки для анализа. Анализ полученных результатов не выявил корреляции между значениями концентрации, полученными в сыворотке, и временем, необходимым для свертывания крови. Следовательно, такое увеличенное или уменьшенное время свертывания не влияло на достоверность исследования и полученных в нем данных.

Фармакокинетика суммарной радиоактивности в крови, сыворотке, эритроцитах, СМЖ и тканях

Суммарная концентрация радиоактивности в крови, сыворотке и эритроцитах (Таблицы 10а-10в, Таблицы 11а-11е, Таблицы 12а-12в, Фигуры 18-21)

[0443] Средние концентрации вещества с радиоактивной меткой в сыворотке самцов крыс после интратекального и/или внутривенного введения ¹²⁵I-hGALC приведены в Таблицах 10а-10в. Средние концентрации вещества с радиоактивной меткой в цельной крови и эритроцитах приведены в Таблицах 11а-11е. Графически усредненные данные представлены на Фигуре 18. Средний процент радиоактивности, восстановленной в надосадочной жидкости и осадке крови после осаждения ТХУ, приведены в Таблицах 12а-12в.

Группа 1 (Средняя доза, вводимая интратекально, 41 мкг/животное)

[0444] После интратекального введения максимальная средняя концентрация (C_max) вещества с радиоактивной меткой в сыворотке и крови наблюдалась через 3 часа после введения (0,108±0,026 мкг экв/г и 0,093±0,023 мкг экв/г, соответственно). Уровень радиоактивности в крови оставался практически постоянным от 3 до 6 часов после введения, уровень радиоактивности в сыворотке немного снижался. Впоследствии концентрация радиоактивности в сыворотке и крови падала и становилась ниже предела определения (ПО) через 48 часов после введения препарата. Что касается эритроцитов, C_max наблюдалась через 6 часов после введения и составляла 0,089±0,024 мкг экв/г. Впоследствии концентрация радиоактивности в эритроцитах падала и становилась ниже ПО через 48 часов после введения препарата. Среднее отношение радиоактивности в крови и сыворотке при интратекальном введении было меньше 1 на протяжении всего периода исследования (разброс от 0,7 до 0,9), что указывает на то, что вещество с радиоактивной меткой не было связано главным образом с эритроцитами. Значения отношения радиоактивности в эритроцитах и сыворотке (разброс от 0,8 до 0,9) также подтвердили, что радиоактивность не была связана главным образом с эритроцитами. Процент дозы, обнаруживаемой в крови, оценивали на основании стандартного отношения объема крови/массе тела (т.е. 0,64 мл/кг). При t_max (время, при котором имеет место максимальная концентрация радиоактивности) с эритроцитами было связано приблизительно 6% введенной дозы.

Группа 2 (Средняя доза, вводимая внутривенно, 1,00 мг/кг)

[0445] После внутривенного введения максимальная средняя концентрация (C_max) вещества с радиоактивной меткой в сыворотке (14,864±0,853 мкг экв/г) и крови (10,228±0,447 мкг экв/г) наблюдалась через 10 минут после введения (т.е. первый анализируемый момент времени). Впоследствии концентрация радиоактивности в сыворотке и крови медленно падала, но все еще определялась через 96 часов после введения (сыворотка: 0,088±0,006 мкг экв/г, 0,59% от C_max; кровь: 0,051±0,002 мкг экв/г, 0,50% от C_max), причем оцениваемый Процент дозы снижался с 68,4% до 0,3%. Что касается эритроцитов, C_max 5,136±1,529 мкг экв/г наблюдалась через 10 минут после введения. Впоследствии концентрация радиоактивности в эритроцитах падала и становилась ниже ПО через 96 часов после введения препарата. Среднее отношение радиоактивности в крови и сыворотке после внутривенного введения было меньше 1 на протяжении всего периода исследования (разброс от 0,6 до 0,8), что указывает на то, что вещество с радиоактивной меткой не было связано главным образом с эритроцитами. Значения отношения радиоактивности в эритроцитах и сыворотке (разброс от 0,4 до 0,6) также подтвердили, что радиоактивность не была связана главным образом с эритроцитами.

Группа 3 (Доза, вводимая интратекально, после внутривенного введения: 1,08 мг/кг (суммарная доза))

[0446] После интратекального введения (целевая доза 60 мкг/животное) и внутривенного введения (1 мг/кг), максимальная средняя концентрация (C_max) вещества с радиоактивной меткой в сыворотке (14,675±0,810 мкг экв/г) и крови (9,974±0,558 мкг экв/г) наблюдалась через 10 минут после введения (т.е. первый анализируемый момент времени). Впоследствии концентрация радиоактивности в сыворотке и крови медленно падала, но все еще определялась через 96 часов после введения (сыворотка: 0,077±0,010 мкг экв/г, 0,52% от C_max; кровь: 0,037±0,033 мкг экв/г, 0,37% от C_max), причем экстраполированный процент дозы снижался с 32,6% до 0,1%. Что касается эритроцитов, C_max 6,113±1,748 мкг экв/г наблюдалась через 10 минут после введения. Впоследствии концентрация радиоактивности в эритроцитах падала и становилась ниже предела количественного определения через 96 часов после введения препарата. Вещество с радиоактивной меткой не было связано главным образом с эритроцитами, на что указывает среднее отношение радиоактивности в крови и сыворотке и среднее отношение радиоактивности в эритроцитах и сыворотке, которое было меньше 1 (варьировало от 0,7 до 0,8, и от 0,4 до 0,7, соответственно).

Таблица 10а
Среднегрупповая концентрация радиоактивности в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Группа 1: При средней дозе 41 мкг/животное
Момент времени	Концентрация радиоактивности
Распадов в минуту/г	мкг экв/г
10 мин	504±462	0,004±0,004
30 мин	4125±2327	0,036±0,020
1 ч	5705±1535	0,050±0,014
3 ч	12311±2960	0,108±0,026
6 ч	11473±2596	0,101±0,023
24 ч	884±122	0,008±0,001
48 ч	0±0	0,000±0,000
96 ч	0±0	0,000±0,000

Таблица 10б
Среднегрупповая концентрация радиоактивности в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 2: При средней дозе 1,00 мг/кг
Момент времени	Концентрация радиоактивности
Распадов в минуту/г	мкгэкв/г
10 мин	215632±12377	14,864±0,853
30 мин	157259±14339	10,840±0,988
1 ч	106804±6790	7,362±0,468
3 ч	47009±3754	3,240±0259
6 ч	31898±2417	2,199±0,167
24 ч	6584±194	0,454±0,013
48 ч	3523±503	0,243±0,035
96 ч	1278±86	0,088±0,006

Таблица 10в
Среднегрупповая концентрация радиоактивности в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократной интратекальной дозы и внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
	Группа 3: При средней дозе 1,08 мг/кг
Момент времени	Концентрация радиоактивностиa
Распадов в минуту/г	мкг экв/г
10 мин	227675±12574	14,675±0,810
30 мин	171721±10165	11,069±0,655
1 ч	127621±77Е5	3,226±0,502
3 ч	66561±1164	4,290±0,075
6 ч	54374±4044	3,505±0261
24 ч	8894±686	0,573±0,044
48 ч	36221458	0,233±0,030
96 ч	1199±157	0,077±0,010

Таблица 11а
Среднегрупповая концентрация радиоактивности и содержание радиоактивности в крови и отношение радиоактивности в крови/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Группа 1: При средней дозе 41 мкг/животное
Момент времени	Концентрация радиоактивности3
Распадов в минут/г	мкг экв/г	мкг экв/мл	Отношение в крови/в сыворотке	Процент дозы
10 мин	210±364	0,002±0,003	0,002±0,003	0,696b	0,074±0,128
30 мин	3579±1918	0,032±0,017	0,033±0,013	0,878±0,029	1,822±0351
1 ч	4933±1446	0,043±0,013	0,046±0,013	0,860±0,027	3,890±0,253
3 ч	10617±2586	0,093±0,023	0,098±0,024	0,862±0,006	5,582±0,554
6 ч	10530±2507	0,093±0,022	0,097±0,023	0,917±0,035	4,664±0,576
24 ч	677±118	0,006±0,001	0,006±0,001	0,764±0,032	0,600±0,114
48 ч	0±0	0,000±0,000	0,000±0,000	н/п	0,000±0,000
96 ч	0±0	0,000±0,000	0,000±0,000	н/п	0,000±0,000

Таблица 11б
Среднегрупповая концентрация радиоактивности и содержание радиоактивности в крови и отношение радиоактивности в крови/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 2: При средней дозе 1,00 мг/кг
Момент времени	Концентрация радиоактивности3
Распадов в минут/г	мкг экв/г	мкг экв/мл	Отношение в крови/в сыворотке	Процент дозы
10 мин	148373±6430	10,228±0,447	10,739±0,469	0,688±0,012	68,393±3,453
30 мин	107195±5739	7,389±0,396	7,759±0,415	0,6S3±0,036	49,317±1,788
1 ч	77163±694	5,319±0,048	5,585±0,051	0,724±0,040	36,460±0,174
3 ч	35469±3124	2,445±0,215	2,567±0,226	0,754±0,007	16,355±1,166
6 ч	24364±1639	1,679±0,113	1,763±0,119	0,764±0,007	11,184±0,612
24 ч	4794±160	0,330±0,011	0,347±0,011	0,729±0,030	2,218±0,076
48 ч	2259±233	0,156±0,016	0,163±0,017	0,644±0,028	1,042±0,141
96 ч	738±29	0,051±0,002	0,053±0,003	0,579±0,052	0,341±0,011

Таблица 11в
Среднегрупповая концентрация радиоактивности и содержание радиоактивности в крови и отношение радиоактивности в крови/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократной интратекальной дозы и внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 3: При средней дозе 1,08 мг/кг
Момент времени	Концентрация радиоактивности3
Распадов в минуту/г	мкг экв/г	мкг экв/мл	Отношение в крови/в сыворотке	Процент дозы
10 мин	154742±8651	9,974±0,558	10,473±0,586	0,680±0,009	32,599±1,331
30 мин	117563±4922	7,578±0,317	7,957±0,333	0,685±0,013	24,596±1,523
1 ч	92086±2812	5,936±0,181	6,233±0,191	0,723±0,022	19,132±1,432
3 ч	52419±244	3,379±0,016	3,548±0,016	0,788±0,017	11,283±0,344
6 ч	43097±4071	2,778±0,262	2,917±0,276	0,792±0,019	9,263±0,836
24 ч	6561±78	0,423±0,005	0,444±0,006	0,740±0,054	1,345±0,080
48 ч	2362±398	0,152±0,026	0,160±0,027	0,650±0,029	0,465±0,083
96 ч	581±5 13	0,037±0,033	0,039±0,035	0,684±с	0,124±0,109

Таблица 11г
Среднегрупповая концентрация радиоактивности и содержание радиоактивности в эритроцитах и отношение радиоактивности эритроцитах/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Группа 1: При средней дозе 41 мкг/животное
Момент времени	Концентрация радиоактивности3
Распадов в минуту/г	мкг экв/г	Отношение в эритроцитах/в	Процент дозы
10 мин	0±0	0,000±0,000	н/п	0,000±0,000
30 мин	3044±1261	0,027±0,011	0,793±0,148	0,213±0,067
1 ч	4454±1396	0,039±0,012	0,773±0,059	0,357±0,336
3 ч	9768±2664	0,086±0,023	0,789±0,031	0,734±0,300
6 ч	10086±2682	0,089±0,024	0,876±0,083	0,616±0,200
24 ч	287±497	0,003±0,004	0,841b	0,044±0,075
48 ч	0±0	0,000±0,000	н/п	0,000±0,000
96 ч	0±0	0,000±0,000	н/п	0,000±0,000

Таблица 11д
Среднегрупповая концентрация радиоактивности и содержание радиоактивности в эритроцитах и отношение радиоактивности эритроцитах/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 2: При средней дозе 1,00 мг/кг
Момент времени	Концентрация радиоактивности3
Распадов в минуту/г	мкг экв/г	Отношение в эритроцитах/в	Процент дозы
10 мин	74506±22185	5,136±1,529	0,350±0,119	4,110±2,794
30 мин	59201±14694	4,081±1,013	0,377±0,086	2,600±1,087
1 ч	52799±23155	3,639±1,596	0,487±0,196	3,229±2,403
3 ч	28039±3432	1,933±0,237	0,599±0,083	1,709±0,734
6 ч	19662±2540	1,355±0,175	0,616±0,057	1,143±0,315
24 ч	3714±292	0,256±0,020	0,564±0,040	0,164±0,111
48 ч	1619±482	0,112±0,033	0,453±0,082	0,076±0,064
96 ч	0±0	0,000±0,000	н/п	0,000±0,000

Таблица 11е
Среднегрупповая концентрация радиоактивности и содержание радиоактивности в эритроцитах и отношение радиоактивности эритроцитах/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократной интратекальной дозы и внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 3; При средней дозе 1,08 мг/кг
Момент времени	Концентрация радиоактивности3
Распадов в минуту/г	мкг экв/г	Отношение в эритроцитах/в	Процент дозы
10 мин	94843±27122	6,113±1,748	0,414±0,104	3,640±1,162
30 мин	65477±23687	4,220±1,527	0,378±0,117	2,266±1,583
1 ч	61906±14623	3,990±0,943	0,489±0,130	2,253±1,300
3 ч	38985±8524	2,513±0,549	0,586±0,128	0,992±0,458
6 ч	37327±4497	2,406±0,290	0,685±0,038	1,479±0,417
24 ч	5250±334	0,338±0,022	0,591±0,032	0,139±0,070
48 ч	2109±319	0,136±0,021	0,581±0,022	0,060±0,017
96 ч	0±0	0,000±0,000	н/п	0,000±0,000

Таблица 12а
Средний процент радиоактивности, восстанавливающейся в надосадочной жидкости и осадке при центрифугировании крови, отобранной у самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Группа 1: При средней дозе 0,10 мг/кг
Момент времени	Процент восстанавливающейся радиоактивности3
Осадок	Надосадочная жидкость
10 мин	100±0	0±0
30 мин	75,1±10,7	24,9±10,7
1 ч	71,8±11,7	28,2±11,7
3 ч	81,2±2,38	18,8±2,38
6 ч	67,3±13,5	32,7±13,5
24 ч	100±0	0±0
48 ч	100±0	0±0
96 ч	100±0	0±0

Таблица 12б
Средний процент радиоактивности, восстанавливающейся в надосадочной жидкости и осадке при центрифугировании крови, отобранной у самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 2: При средней дозе 1,00 мг/кг
Момент времени	Процент восстанавливающейся радиоактивности3
Осадок	Надосадочная жидкость
10 мин	99,2±0,03	0,85±0,03
30 мин	97,5±0,32	2,48±0,32
1 ч	95,8±0,56	4,23±0,56
3 ч	92,5±0,17	7,49±0,17
6 ч	90,7±0,45	9,26±0,45
24 ч	100±0	0±0
48 ч	10010	0±0
96 ч	10010	0±0

Таблица 12в
Средний процент радиоактивности, восстанавливающейся в надосадочной жидкости и осадке при центрифугировании крови, отобранной у самцов крыс Спраг-Доули после однократной интратекальной дозы и внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 3: При средней дозе 1,08 мг/кг
Момент времени	Процент восстанавливающейся радиоактивности3
Осадок	Надосадочная жидкость
10 мин	99,0±0,11	1,02±0,11
30 мин	95,9±0,49	4,07±0,49
1 ч	94,5±0,56	5,55±0,56
3 ч	88,1±5,34	11,9±5,34
6 ч	88,9±1,03	11,1±1,03
24 ч	90,7±3,48	9,33±3,48
48 ч	100±0	±0
96 ч	100±0	0±0

Осаждаемый ¹²⁵I в цельной крови

[0447] Средние значения восстановления радиоактивности в осадке и надосадочной жидкости после осаждения цельной крови с использованием тетрауксусной кислоты (ТХУ) для групп 1, 2 и 3 приведены в Таблицах 12а-12в. При применении 15% водного раствора ТХУ для осаждения белков в цельной крови радиоактивность определялась главным образом в осадке крови (в диапазоне от 100% до 67% в группе 1; от 100% до 91% в группе 2; от 100% до 88% в группе 3), что указывает на то, что большая часть радиоактивности в циркулирующей крови была ассоциирована с белком, и, следовательно, не соответствует свободному ¹²⁵йоду.

Концентрация радиоактивности в тканях и спинномозговой жидкости (СМЖ)

(Таблицы 13а-13в, Таблицы 14а-14в, Таблицы 15а-15в, фигуры 19-30)

[0448] Средние значения концентрации радиоактивности в тканях и СМЖ крыс после введения однократного введения дозы интратекально и/или внутривенно ¹²⁵I-hGALC приведены в Таблицах 13а-13в. Усредненные данные графически представлены на Фигурах 19-30. Среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке приведены в Таблицах 14а-14в, а восстановление введенной дозы в тканях, СМЖ, а также в содержимом желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря приведено в Таблицах 15а-15в.

Таблица 13а
Среднегрупповая концентрация радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Группа 1: При средней дозе 41 мкг/животное
Проба	Концентрация радиоактивности, мкг экв/гa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000	0,005±0,004
Надпочечники	0,000±0,000	0,014±0,006	0,017±0,006	0,021±0,005
Бедренная кость	0,000±0,000	0,011±0,006	0,016±0,005	0,040±0,012
Головной мозг	0,000±0,000	0,003±0,003	0,004±0,004	0,005±0,001
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,000b	0,000b	0,000b	0,000±0,000
Глаза	0,000±0,000	0,006±0004	0,011±0,003	0,027±0,006
Сердце	0,001±0,002	0,014±0006	0,017±0,005	0,028±0,006
Почки	0,004±0,004	0,042±0023	0,052±0,014	0096±0,018
Толстая кишка	0,000±0,000	0,009±0004	0,011±0,003	0024±0,010
Печень	0,000±0,000	0,012±0,007	0,015±0,006	0,029±0,008
Легкие	0,002±0,003	0,020±0,010	0,027±0,008	0058±0,014
Мышцы (скелетные)	0,000±0,000	0,007±0003	0,010±0,002	0014±0,003
Седалищный нерв	0,000±0,000	0,008±0,008	0,012±0,011	0043±0,017
Тонкая кишка	0,000±0,000	0,011±0,005	0016±0,005	0046±0,013
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,000±0,000	0,004±0004	0,006±0,002	0,009±0,001
Селезенка	0,000±0,000	0,014±0,005	0,019±0,006	0,040±0,010
Желудок	0,003±0,002	0,022±0,010	0,037±0,017	0,203±0,101
Щитовидная/паращитовидная железа	0,020±0,019	0,149±0,083	0,278±0,147	2,031±1,228
Проба	Концентрация радиоактивности, мкг экв/гa
6 ч	24 ч	48 ч	96 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,006±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Надпочечники	0,020±0,002	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Бедренная кость	0,041±0,007	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Головной мозг	0,004±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,000b	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Глаза	0,024±0,003	0,001±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000
Сердце	0,026±0,004	0,001±0,002	0,000±0,000	0,000±0,000
Почки	0,082±0,012	0,01210,001	0,008±0,002	0,000±0,000
Толстая кишка	0,024±0,003	0,002±0,002	0,000±0,000	0,000±0,000
Печень	0,030±0,005	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Легкие	0,055±0,012	0,004±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Мышцы (скелетные)	0,012±0,002	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Седалищный нерв	0,050±0,013	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Тонкая кишка	0,041±0,015	0,004-±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,008±0,003	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Селезенка	0,036±0,007	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Желудок	0,163±0,060	0,008±0,001	0,003±0,000	0,002±0,001
Щитовидная/паращитовидная железа	2,453±0,554	4,126±1,073	4,127±1,635	1527±1,585

Таблица 13б
Среднегрупповая концентрация радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 2: При средней дозе 1,00 мг/кг
Проба	Концентрация радиоактивности, мкг экв/гa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,138±0,054	0,158±0,019	0,128±0,007	0,092=0,008
Надпочечники	8,827±2,435	7,090±0,547	4,360±0,574	1,873+0,070
Бедренная кость	1,568±0,013	1,584±0,223	1,286±0,166	0,887±0,090
Головной мозг	0,252±0,041	0,236±0,017	0,195±0,018	0,083±0,002
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,137±0,238	0,000±0,000	0,000b	0,210±0,363
Глаза	0,110±0,010	0,307±0,016	0,406±0,027	0,344±0,049
Сердце	1,215±0,122	1,108±0039	0,999±0,052	0,558±0,093
Почки	3,027±0,330	2,072±0,139	2,288±0,149	1,657±0,190
Толстая кишка	0,320±0,072	0,467±0,110	0,492±0,103	0,397±0,031
Печень	11,335±1,436	8,688±0,788	5,904±0,367	3,590±0,192
Легкие	11,584±0,906	20,529±2,125	18,436±3,906	8,52610,815
Мышцы (скелетные)	0,120±0,011	0,261±0,039	0,275±0,025	0,189±0,007
Седалищный нерв	0,173±0,023	0,336±0,108	0,584±0,059	0,689±0,056
Тонкая кишка	0,424±0,004	0,591±0031	0,786±0,125	0,832±0,166
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,293±0,028	0,272±0,000	0,277±0,008	0,142±0010
Селезенка	6,595±0,625	5,952±1,316	4,18710,311	2,010±0,333
Желудок	0,433±0,088	0,939±0,204	1,430±0,076	2,404±0,139
Щитовидная/паращитовидная железа	4,485±1,194	22,335±2,598	37,990±11,900	147,644±56,596
Проба	Концентрация радиоактивности, мкг экв/гa
6 ч	24 ч	48 ч	96 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,077±0,007	0,000±0000	0,000±0,000	0 000±0,008
Надпочечники	1,213±0,031	0,339±0,033	0,142±0,013	0,074±0,010
Бедренная кость	0,726±0,053	0,106±0,016	0,034±0,030	0,000±0,000
Головной мозг	0,066±0,009	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,185±0321	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Глаза	0,336±0,080	0033±0,006	0,000±0,000	0,000±0,000
Сердце	0,440±0,032	0,075±0,011	0,040±0,002	0,000±0,000
Почки	1,41810,108	0,337±0,021	0,199±0,009	0099±0,010
Толстая кишка	0,376±0,077	0,054±0,009	0026±0,003	0,000±0,000
Печень	3,179±0,188	1,020±0091	0,506±0,046	0,126±0,014
Легкие	3,187±0,079	2,958±1,012	0,325±0,114	0,069±0,003
Мышцы (скелетные)	0,153±0,018	0,008±0,014	0,000±0,000	0,000±0,000
Седалищный нерв	0,643±0,063	0,025±0,043	0,000±0,000	0,000±0,000
Тонкая кишка	0,69110,121	0,094±0,025	0041±0,012	0,000±0,000
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,128±0,017	0,014±0,013	0,000±0,000	0,000=0,000
Селезенка	1,667±0,091	0,565±0,046	0,250±0,038	0,111±0,009
Желудок	1,638±0,310	0,180±0,057	0,047±0,005	0,015±0,013
Щитовидная/паращитовидная железа	287,423±177,568	280,829=84,988	294,521±52,953	218,917±45,098

Таблица 13в
Среднегрупповая концентрация радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости самцов крыс Спраг-Доули после однократной интратекальной дозы и внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 3: При средней дозе 1,08 мг/кг
Проба	Концентрация радиоактивности, мкг экв/гa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,140±0029	0,176±0,051	0,188±0,020	0,161±0,008
Надпочечники	9,567±1,678	5,487±1,129	4,368±0,930	2,010±0,331
Бедренная кость	1,227±0,137	1,707±0,160	1,571±0,071	1,261±0,030
Головной мозг	0,283±0,062	0,276±0,010	0,230±0,008	0,153±0,023
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	2,087±2512	0,380±0,371	0,598±1,035	0,05±0,182
Глаза	0,110±0,018	0,372±0,042	0,539±0,019	0,611±0,079
Сердце	1,034±0,049	1,315±0,156	1,188±0,028	0,845±0,039
Почки	2,864±0,353	3,324±0,265	3390±0,183	2,822±0,020
Толстая кишка	0,261±0,026	0,567±0,051	0,716±0,098	0,681±0,102
Печень	10,181±0,600	8,475±0,204	6,237±0,341	3,740±0,055
Легкие	3,13310,350	5,162±0,564	5,305±0,194	2,727±0,198
Мышцы (скелетные)	0,11910,006	0,297±0,011	1,041±0,009	0,298±0,015
Седалищный нерв	0,244±0,037	0,558±0,023	0,994±0,096	1,043±0,057
Тонкая кишка	0,304±0,093	0,778±0,037	1,149±0,110	1,401±0,152
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,327±0,062	0,319±0,025	0,285±0,044	0,227±0,019
Селезенка	5,042±0,902	4,721±0,302	3,740±0,406	2,186±0,218
Желудок	0,465±0,068	1028±0,175	2,450±0,569	4,454±1,455
Щитовидная/паращитовидная железа	1,191±1,542	21,727±8,873	30,411±18,766	139,771±37,999
Проба	Концентрация радиоактивности, мкг экв/гa
6 ч	244	48 ч	964
Жировая ткань (Жир почек)	0,131±0005	0,000±0000	0,000±0,000	0,000±0,000
Надпочечники	1,412±0,137	0,301±0,014	0,118±0,013	0,069±0,016
Бедренная кость	1,165±0,066	0,148±0,012	0,029±0,026	0,000±0,000
Головной мозг	0,098±0,012	0,000±0000	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,000b	0,000b	0,000b	0,000=0,000
Глаза	0,574±0,085	0,064±0006	0,010±0,009	0,000=0,000
Сердце	0,723±0,057	0,101±0,008	0,038±0,007	0,006±0,011
Почки	2,046±0,229	0,515±0,019	0,249±0,029	0,124±0,005
Толстая кишка	0,726±0,173	0,074±0,014	0,027±0,004	0,000±0,000
Печень	3,156±0,143	0,996±0,035	0,418±0,036	0,137±0,018
Легкие	1,830±0,133	0,223±0,007	0,076±0,020	0,033±0,008
Мышцы (скелетные)	0,253±0,029	0,032±0,002	0,000±0,000	0,000±0,000
Седалищный нерв	1,039±0,133	0,056±0,098	0,000±0,000	0,000±0,000
Тонкая кишка	1,102±0,101	0,136±0,027	0033±0,008	0,000±0,000
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,202±0,032	0,026±0,003	0,000±0,000	0,000±0,000
Селезенка	1,648±0,109	0,395±0,017	0,152±0,009	0,083±0,009
Желудок	4,242±1,361	0,463±0,357	0,064±0,014	0,031±0,005
Щитовидная/паращитовидная железа	182,099±38,422	296,957±57,793	199,316±26,285	43,962±23,164

Таблица 14а
Среднегрупповое отношение радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Группа 1: При средней дозе 41 мкг/животное
Проба	Отношение радиоактивности в тканях и СМЖ/в сывороткеa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Жировая ткань (Жир почек)	н/п	н/п	н/п	0,071b
Надпочечники	н/п	0,421±0,116	0,324±0,033	0,196±0,012
Бедренная кость	н/п	0,305±0,010	0,319±0,038	0,369±0,028
Головной мозг	н/п	0,097b	0,110±0,018	0,045±0,006
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	н/п	н/п	н/п	н/п
Глаза	н/п	0,177±0,032	0,216±0,020	0253±0,007
Сердце	0,333	0,412±0076	0,329±0,008	0,265±0,012
Почки	0,976	1,157±0040	1,036±0,062	0,895±0,058
Толстая кишка	н/п	0,249±0,027	0,220±0,023	0,220±0,048
Печень	н/п	0,351±0028	0,302±0,036	0,265±0,015
Легкие	0576	0,565±0,050	0,533±0,034	0,532±0,003
Мышцы (скелетные)	н/п	0,197±0,032	0,192±0,011	0,134±0,021
Седалищный нерв	н/п	0,249b	0,317b	0,382±0,074
Тонкая кишка	н/п	0,315±0035	0,312±0,035	0,426±0,018
Спинной мозг (поясничный,	н/п	0,144b	0,117±0,017	0,082±0,010
грудной, шейный отделы)
Селезенка	н/п	0,395±0,036	0,382±0,013	0,368±0,007
Желудок	0,577	0,627±0,072	0,723±0,252	1,801±0,619
Щитовидная/паращитовидная железа	4,443	4,035±0,750	5,680±2,612	17,423=8,215
Проба	Отношение радиоактивности в тканях и СМЖ/в сывороткеa
6 ч	24 ч	48 ч	96 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,057±0,012	н/п	н/п	н/п
Надпочечники	0.197±0,026	н/п	н/п	н/п
Бедренная кость	0.407±0,022	н/п	н/п	н/п
Головной мозг	0,040±0,005	н/п	н/п	н/п
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	н/п	н/п	н/п	н/п
Глаза	0.245±0,023	0284b	н/п	н/п
Сердце	0.258±0,022	0343b	н/п	н/п
Почки	0.821±0,066	1.491±0128	н/п	н/п
Толстая кишка	0.250±0,074	0395b	н/п	н/п
Печень	0.293±0,029	н/п	н/п	н/п
Легкие	0.547±0,009	0.489±0.105	н/п	н/п
Мышцы (скелетные)	0.115±0,013	н/п	н/п	н/п
Седалищный нерв	0.496±0,030	н/п	н/п	н/п
Тонкая кишка	0.400±0,059	0.550±0,021	н/п	н/п
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,079±0,009	н/п	н/п	н/п
Селезенка	0.357±0,009	н/п	н/п	н/п
Желудок	1.604±0.478	1,08510155	н/п	н/п
Щитовидная/паращитовидная железа	24297±0831	527,002±100 186	н/п	н/п

Таблица 14б
Среднегрупповое отношение радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 2: При средней дозе 1,00 мг/кг
Проба	Отношение радиоактивности в тканях и СМЖ/в сывороткеa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,009±0,003	0,015±0,003	0,017±0,001	0028±0,003
Надпочечники	0,589±0,133	0,654±0,010	0,594±0,089	0,580±0,039
Бедренная кость	0,106±0,006	0,146±0,019	0,174±0,012	0273±0,008
Головной мозг	0,017±0,002	0,022±0,003	0,027±0,002	0,026±0,002
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,028b	н/п	н/п	0,188b
Глаза	0,007±0,001	0,02S±0,002	0,055±0,008	0,106±0,009
Сердце	0,082±0,004	0,103±0,006	0,136±0,007	0,171±0,016
Почки	0,203±0,011	0,266±0,019	0,311±0,015	0,512±0,043
Толстая кишка	0,022±0,004	0,043±0,009	0,067±0,012	0,123±0,019
Печень	0,766±0,119	0,802±0,026	0,805±0,085	1,110±0,055
Легкие	0,781±0,070	1,903±0,100	2,496±0,452	2,642±0,316
Мышцы (скелетные)	0,008±0,001	0,024±0,004	0,037±0,002	0,059±0,004
Седалищный нерв	0,012±0,002	0,032±0,012	0,080±0,009	0213±0,007
Тонкая кишка	0,029±0,002	0,064±0,007	0,107±0,019	0,255±0,032
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,019±0,002	0,025±0,002	0,038±0,001	0,044±0,007
Селезенка	0,443±0,016	0,547±0,090	0,571±0,075	0,618±0,065
Желудок	0,029±0,004	0,086±0,013	0,194±0,012	0,743±0,028
Щитовидная/паращитовидная железа	0,305±0,092	2,074±0,319	5,106±1,355	46,707±21,839
Проба	Отношение радиоактивности в тканях и СМЖ/в сывороткеa
6 ч	24 ч	48 ч	96 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,035±0,003	н/п	н/п	н/п
Надпочечники	0,554±0,045	0,747±0061	0,593±0,104	0,845±0,120
Бедренная кость	0,330±0,004	0,234±0030	0,225b	н/п
Головной мозг	0,030±0,002	н/п	н/п	н/п
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0232b	н/п	н/п	н/п
Глаза	0,152±0,024	0,073±0,012	н/п	н/п
Сердце	0,200±0,010	0,165±0024	0,167±0,025	н/п
Почки	0,649±0,086	0,741±0,025	0,833±0,169	1,118±0,086
Толстая кишка	0,171±0,035	0,119±0,020	0,109±0,008	н/п
Печень	1,449±0,096	2,245±0,142	2,109±0,302	1,440±0,229
Легкие	1,453±0,071	6,505±2,210	1,345±0,431	0,780±0,033
Мышцы (скелетные)	0,069±0,005	0,052»	н/п	н/п
Седалищный нерв	0,292±0,011	0169b	н/п	н/п
Тонкая кишка	0,316±0,065	0,207±0,057	0,175±0,070	н/п
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,058±0,003	0,047b	н/п	н/п
Селезенка	0,762±0,084	1,247±0,134	1,030±0,098	1,263±0,069
Желудок	0,774±0,176	0,397±0,129	0,197±0,047	0,263b
Щитовидная/паращитовидная железа	124,616±86,507	615,613±169,527	1231,684±285,895	2484,660±471,907

Таблица 14в
Среднегрупповое отношение радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости/в сыворотке самцов крыс Спраг-Доули после однократной интратекальной дозы и внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 3: При средней дозе 1,08 мг/кг
Проба	Отношение радиоактивности в тканях и СМЖ/в сывороткеa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,010±0,002	0,016±0005	0,023±0,003	0,037±0,002
Надпочечники	0,649±0,076	0,493±0,072	0,589±0,077	0468±0,069
Бедренная кость	0,083±0,006	0,155±0,012	0,191±0,013	0,294±0,005
Головной мозг	0,019±0,003	0,025±0,001	0,028±0,003	0,035±0,005
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,204b	0053b	0,221b	0,072b
Глаза	0,007±0,001	0,034±0,005	0,066±0,007	0,143±0,021
Сердце	0,071±0,001	0,119±0,015	0,145±0,011	0,197±0,012
Почки	0,195±0,013	0,302±0,041	0,413±0,022	0,658±0,016
Толстая кишка	0,018±0,002	0,051±0,005	0,087±0,011	0,159±0,023
Печень	0,694±0,007	0,768±0,061	0,759±0,023	0,872±0,024
Легкие	0,214±0,030	0,465±0,025	0,646±0,045	0,635±0,036
Мышцы (скелетные)	0,008±0,001	0,027±0,002	0,050±0,003	0,070±0,005
Седалищный нерв	0,017±0,003	0,050±0,004	0,122±0,018	0,243±0,012
Тонкая кишка	0,021±0,007	0,071±0,007	0,140±0,016	0,326±0,029
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,022±0,005	0,029±0,001	0,035±0,007	0,053±0,004
Селезенка	0,342±0,044	0,427±0,036	0,455±0,044	0,510±0,049
Желудок	0,032±0,005	0,094±0,020	0,300±0,078	1,039±0,348
Щитовидная/паращитовидная железа	0,217±0,108	1,960±0,776	3,781±2,521	32,561±8,787
Проба	Отношение радиоактивности в тканях и СМЖ/в сывороткеa
6 ч	24 ч	48 ч	96 Ч
Жировая ткань (Жир почек)	0,038±0,003	н/п	н/п	н/п
Надпочечники	0,405±0,059	0,527±0,029	0,514±0,108	0,918±0,317
Бедренная кость	0,333±0,006	0,258±0026	0,183b	н/п
Головной мозг	0,028±0,001	н/п	н/п	н/п
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	н/п	н/п	н/п	н/п
Глаза	0,163±0,012	0,113±0019	0,063b	н/п
Сердце	0,206±0,001	0,177±0,018	0,164±0,008	0,246b
Почки	0,583±0,022	0,900±0,037	1,071±0,104	1,623±0,270
Толстая кишка	0,207±0,044	0,131±0,031	0,116±0,018	н/п
Печень	0,902±0,028	1,74410,121	1,815±0,316	1,770±0,023
Легкие	0,522±0,009	0,391±0040	0,321±0,044	0,428±0,084
Мышцы (скелетные)	0,072±0,011	0,056±0,008	н/п	н/п
Седалищный нерв	0,296±0,016	0,293b	н/п	н/п
Тонкая кишка	0,314±0,008	0,239±0,063	0,140±0,019	н/п
Спинной мозг (поясничный,	0,057±0,007	0,046±0,009	н/п	н/п
грудной, шейный отделы)
Селезенка	0,471±0,033	0,692±0,067	0,661±0,104	1,087±0,230
Желудок	1,206±0,373	0,807±0,616	0,274±0,032	0,405±0,112
Щитовидная/паращитовидная железа	52,475±13,382	525,335±143,883	854,144±52,674	571,341±305,367

Таблица 15а
Среднегрупповое содержание радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости, содержимом желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря у самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Группа 1: При средней дозе 41 мкг/животное
Проба	Процент дозыa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Надпочечники	0,000±0,000	0,002±0,000	0,004±0,000	0,003±0001
Головной мозг	0,000±0,000	0,010±0,009	0,027±0,024	0,023±0,003
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,000b	0,000b	0,000b	0,000±0000
Глаза	0,000±0,000	0,000±0,000	0,011±0,002	0,017±0001
Сердце	0,002±0,003	0,037±0,003	0,066±0,009	0,077±0,004
Почки	0,027±0025	0,252±0,086	0,553±0,057	0,632±0,104
Печень	0,000±0,000	0,417±0,057	0,748±0,108	0,907±0,181
Легкие	0,003±0,005	0,055±0,009	0,122±0,021	0,166±0,013
Седалищный нерв	0,000±0,000	0,001±0,001	0,002±0,002	0,003+0001
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,000±0,000	0,004±0,004	0,013±0,001	0,012±0,000
Селезенка	0,000±0,000	0,024±0,009	0,054±0,010	0,066±0,011
Щитовидная/паращитовидная	0,001±0,001	0,007±0,002	0,024±0,012	0,108±0,021
Желудочно-кишечный тракт:
Тонкая кишка	0,000±0,000	0,193±0054	0,364±0,069	0,763±0,107
Содержимое тонкой кишки	0,000±0,000	0,399±0,062	0,778±0,084	2,611±0,291
Толстая кишка	0,000±0,000	0,090±0018	0,165±0,037	0,238±0,070
Содержимое толстой кишки	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000	0,598±0,114
Желудок	0,008±0,007	0,086±0,009	0,216±0,094	0,836±0,336
Содержимое желудка	0,000±0,000	0,489±0,052	1,774±0,326	5,004±0,346
Содержимое мочевого пузыря	0,003±0,003	0,110±0,030	0,156±0,077	1,207±1,029
Проба	Процент дозыa
6 ч	24 ч	48 ч	964
Надпочечники	0,002±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Головной мозг	0,015±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,000b	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Глаза	0,013±0,003	0,001±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000
Сердце	0,056=0,006	0,005±0,008	0,000±0,000	0,000±0,000
Почки	0,452±0,115	0,130±0,034	0,059±0,007	0,029±0,006
Печень	0,775±0,078	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Легкие	0,132±0,019	0,019±0,005	0,000±0,000	0,000±0000
Седалищный нерв	0,003±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,009±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Селезенка	0,048±0,007	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0000
Щитовидная/паращитовидная	0,125±0,037	0,348±0,013	0,195±0,075	0,086±0,023
Желудочно-кишечный тракт:
Тонкая кишка	0,571±0,165	0,117±0,027	0,000±0,000	0,000±0,000
Содержимое тонкой кишки	1,740±0,925	0,385±0,045	0,000±0,000	0,000±0,000
Толстая кишка	0,199±0,022	0,029±0,025	0,000±0,000	0,000±0,000
Содержимое толстой кишки	0,864±0,100	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Желудок	0,557±0,117	0,059±0,023	0,015±0,002	0,009±0,007
Содержимое желудка	3,996±1,013	0,758±0,167	0,122±0,107	0,000±0,000
Содержимое мочевого пузыря	0,525±0,264	0,178±0,130	0,014b	0,021±0,028

Таблица 15б
Среднегрупповое содержание радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости, содержимом желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря у самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 2: При средней дозе 1,00 мг/кг
Проба	Процент дозыa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Надпочечники	0,113±0,023	0,117±0,022	0,059±0,009	0,026±0,002
Головной мозг	0,129±0,022	0,120±0,011	0,098±0,005	0,044±0,001
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,001±0,002	0,000±0,000	0,000b	0001±0,001
Глаза	0,007±0,001	0,021±0,001	0,028±0,007	0,024±0,005
Сердце	0,382±0,055	0,319±0,018	0,292±0,025	0,161±0,024
Почки	2,168±0,172	1,966±0,081	1,658±0,014	1,168=0,068
Печень	41,711±3,901	31,161±1,934	20,702±1,140	13,029±0,875
Легкие	4,024±0,305	7,047±0,512	6,456±1,094	2,842±0,245
Седалищный нерв	0,001±0,001	0,003±0,003	0,004±0,001	0,006±0,003
Спинной мозг (поясничный,	0,045±0,005	0,042±0,008	0,039±0,003	0,023+0,002
грудной, шейный отделы)
Селезенка	1,234±0,045	1,014±0,093	0,784±0,123	0,393±0,013
Щитовидная/паращитовидная	0,024±0,001	0,100±0,009	0,186±0,050	0,947±0,340
Желудочно-кишечный тракт:
Тонкая кишка	0,749±0,121	1,477±0,237	1,548±0,186	1,535±0,191
Содержимое тонкой кишки	0,530±0,056	1,921±0,346	3,737±1,427	5,446±2,102
Толстая кишка	0,327±0,072	0,470±0,076	0,529±0,065	0,412=0,008
Содержимое толстой кишки	0,000±0,000	0,345±0,029	0,517±0,135	0,782±0,083
Желудок	0,176±0,032	0,437±0,050	0,632±0,047	0,992±0,059
Содержимое желудка	0,343±0,127	1,537±0,287	5,330±0,937	10,263±1,971
Содержимое мочевого пузыря	0,100=0,041	0,409±0,179	0,675±0,660	0,943=0,571
Проба	Процент дозыa
6 ч	24 ч	48 ч	96 ч
Надпочечники	0,019±0,002	0,005±0,001	0,002±0,000	0,001±0,000
Головной мозг	0,034±0,004	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,003±0,005	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Глаза	0,023±0,007	0,002±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000
Сердце	0,121±0,007	0,022±0,003	0,012±0,001	0,000±0,000
Почки	0,909±0,076	0,251±0,006	0,140±0,003	0,072±0,002
Печень	10,311±0,361	3,891±0,283	1,980±0,065	0,498±0,016
Легкие	1,027±0,037	0,991±0,289	0,112±0,037	0,023±0,001
Седалищный нерв	0,004±0,000	0,000±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,017±0,002	0,002±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000
Селезенка	0,362±0,028	0,100±0003	0,046±0,010	0,022±0,001
Щитовидная/паращитовидная	1,405±0,830	1,333±0,115	1,440±0,604	0,997±0,329
Желудочно-кишечный тракт:
Тонкая кишка	1,537±0,436	0,175±0,033	0074±0,031	0,000±0000
Содержимое тонкой кишки	3,051±0,706	0,500±0,184	0254±0,101	0,000±0,000
Толстая кишка	0,380±0,063	0,054±0,007	0,030±0,003	0,000±0,000
Содержимое толстой кишки	1,055±0,116	0,396±0,058	0,155±0,134	0,000±0,000
Желудок	0,744±0,196	0,078±0,023	0,021±0,003	0,00610,005
Содержимое желудка	8,294±0,670	1,055±0,057	0,296±0,159	0,000±0,000
Содержимое мочевого пузыря	1,531=1,303	0,079b	0,019±0,021	0,007±0,002

Таблица 15в
Среднегрупповое содержание радиоактивности в тканях, спинномозговой жидкости, содержимом желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря у самцов крыс Спраг-Доули после однократной интратекальной дозы и внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 3: При средней дозе 1,08 мг/кг
Проба	Процент дозыa
10 мин	30 мин	1 ч	3 ч
Надпочечники	0,066±0,013	0,037±0010	0,032±0,003	0,015±0,002
Головной мозг	0,071±0,009	0,071±0,007	0,058±0,002	0,039±0,008
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,046±0,071	0,002±0,002	0010±0,017	0,002±0,003
Глаза	0,004-±0,001	0,012±0,002	0,018±0,001	0,021±0,003
Сердце	0,147±0,008	0,138=0,020	0,165±0,008	0,136±0,014
Почки	1,005±0,107	1,157±0,073	1,179±0,061	0,985±0,006
Печень	18,955±0,723	14,647±0,420	10,032±1,037	6,754±0,213
Легкие	0,506±0,053	0,811±0,104	0,371±0,037	0,457±0,031
Седалищный нерв	0,001±0,000	0,002±0,000	0,003±0,001	0,003±0,002
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,028±0,007	0,025±0,005	0,023±0,005	0,018±0,004
Селезенка	0,468±0,027	0,435±0,037	0,329±0,032	0,217±0,007
Щитовидная/паращитовидная	0,008±0,004	0,055±0,019	0073±0,041	0,392±0,071
Желудочно-кишечный тракт:
Тонкая кишка	0286±0,046	0,641±0,033	1,118±0,264	1,176±0,044
Содержимое тонкой кишки	0,288±0,037	1,150±0013	2,414±0,038	4,314±1,755
Толстая кишка	0,131±0,013	0,272±0,015	0,360±0,032	0,335±0,051
Содержимое толстой кишки	0,000=0,000	0,212±0,070	0,351±0,059	0,696±0,181
Желудок	0,100±0,017	0,206=0,034	0,493±0,124	0,931±0,293
Содержимое желудка	0,161±0,029	0,806±0,191	2,870±1,090	8,7S9±1,443
Содержимое мочевого пузыря	0,029±0,021	0,182±0,251	0,334±0,663	0,273±0,087
Проба	Процент дозыa
6 ч	24 ч	48 ч	96 ч
Надпочечники	0,010±0,002	0,002±0,000	0,001±0,000	0,001±0,000
Головной мозг	0,024±0,003	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0,000b	0,000b	0,000b	0,000±0,000
Глаза	0,019±0,004	0,002±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Сердце	0,106±0,008	0,015±0,001	0,005±0,001	0,001±0,002
Почки	0,689±0,063	0,183±0,013	0,081±0,007	0,048±0,002
Печень	5,085±0,292	1,653±0,097	0,757±0,043	0,281±0,022
Легкие	0,2Р7±0,011	0,038±0,001	0,012±0,003	0,006±0,002
Седалищный нерв	0,004±0,001	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0,016±0,003	0,002±0,000	0,000±0,000	0,000±0,000
Селезенка	0,146±0,020	0,039±0,003	0,015±0,003	0,009±0,000
Щитовидная/паращитовидная	0,496±0,064	0,973±0,162	0,567±0,088	0,124±0,088
Желудочно-кишечный тракт:
Тонкая кишка	0,954±0,153	0,125±0,046	0,032±0,007	0,000±0,000
Содержимое тонкой кишки	2,054±0,707	0,298±0,019	0,113±0,039	0,000±0,000
Толстая кишка	0,359±0,097	0,036±0,009	0,013±0,002	0,000±0,000
Содержимое толстой кишки	0,971±0,095	0,290=0,115	0,041±0,071	0,000±0,000
Желудок	0,943±0,323	0,102±0,084	0,014±0,004	0,008±0,002
Содержимое желудка	3,501±3,698	0,610±0,365	0,175±0,053	0,000±0,000
Содержимое мочевого пузыря	0,114±0,034	0,199±0,266	0,003±0,002	0,005±0,008

Группа 1 (средняя доза для интратекального введения - 41 мкг/животное)

[0449] После интратекального введения исследовали общее распределение ¹²⁵I-меченого вещества во всех тканях, однако уровень радиоактивности в СМЖ был ниже предела количественного определения (ПКО). Максимальная средняя концентрация ¹²⁵I-меченого вещества в тканях самцов крыс наблюдалась через 48 часов после введения в щитовидной/паращитовидной железе (4,127±1,635 мкг экв/г) и через 3 часа после введения в желудке 3 (0,203±0,101 мкг экв/г), почках (0,096±0,014 мкг экв/г) и легких (0,058±0,014 мкг экв/г). В других тканях уровень радиоактивного вещества был ниже, и значения t_max, которые обычно наблюдались, составляют 3 и 6 часов после введения. Минимальные значения C_max наблюдались в головном мозге (0,005±0,001 мкг экв/г) и жировой ткани почек (0,006±0,000 мкг экв/г). Через 48 и 96 часов после введения уровень радиоактивности в большинстве тканей был ниже предела определения, и исключение составили только щитовидная/паращитовидная железа, почки и желудок. Через 96 часов после введения максимальная средняя концентрация наблюдалась в щитовидной/паращитовидной железе (1,927±1,585 мкг экв/г, 46,7% от C_max), далее шли почки (0,005±0,001 мкг экв/г, 5,2% от C_max) и желудок (0,002±0,001 мкг экв/г, 1% от C_max).

[0450] Отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке в основном было ниже 1 для указанных тканей до 24 часов после интратекального введения препарата. Исключение составили щитовидная/паращитовидная железа, почки и желудок. Через 48 и 96 часов после введения отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке рассчитать не удавалось, поскольку концентрации в сыворотке были ниже ПКО.

[0451] Уровень радиоактивности, определенной во всех тканях, составлял меньше 1% от введенной дозы, и максимальная из наблюдаемых доля была в печени (0,91%) через 3 часа после введения. Через 1 час после введения доли выше 1% от введенной дозы обнаруживались только в содержимом желудка (1,8%). Через 3 часа после введения доли выше 1% от введенной дозы определялись в содержимом тонкой кишки (2,6%), содержимом желудка (5,0%) и содержимом мочевого пузыря (1,2%). Через 6 часов после введения доли выше 1% от введенной дозы обнаруживались в содержимом тонкой кишки (1,7%) и содержимом желудка (4,0%). Через 96 часов после введения небольшое количество связанной с ¹²⁵I-hGALC радиоактивности (менее 0,1%) все еще определялась в почках, щитовидной/паращитовидной железе, содержимом желудка и мочевого пузыря, и максимальное значение наблюдалось в щитовидной/паращитовидной железе (0,09%).

Группа 2 (средняя доза для внутривенного введения 1,00 мг/кг)

[0452] После внутривенного введения максимальная средняя концентрация (C_max) радиоактивно-меченого вещества в тканях крыс группы 2 наблюдалась в щитовидной/паращитовидной железе (294,521±52,953 мкг экв/г; через 48 часов после введения), далее шли легкие (20,629±2,125 мкг экв/г; 30 минут после введения), печень (11,335±1,436 мкг экв/г; 10 минут после введения), надпочечники (8,827+2,435 мкг экв/г; 10 минут после введения), селезенка (6,595±0,625 мкг экв/г; 10 минут после введения) и почки (3,027±0,330 мкг экв/г; 10 минут). Значения t_max для указанных тканей составляли 10 минут и 3 часа после введения, за исключением щитовидной/паращитовидной железы (48 часов после введения). Минимальные значения C_max радиоактивности наблюдались в жире почек (0,158±0,019 мкг экв/г), СМЖ (0,210±0,363 мкг экв/г), головном мозге (0,252±0,041 мкг экв/г), скелетных мышцам (0,275±0,025 мкг экв/г) и спинном мозге (0,293±0,028 мкг экв/г). Через 96 часов после введения радиоактивность все еще определялась в 7 из 18 анализируемых тканей, и максимальные средние концентрации определялись в щитовидной/паращитовидной железе (218,917±45,098 мкг экв/г, 74,3% от C_max), далее шли почки (0,126±0,014 мкг экв/г, 1,1% от C_max), селезенка (0,111±0,009 мкг экв/г, 1,7% от C_max) и почки (0,099±0,010 мкг экв/г, 3,3% от C_max).

[0453] Через 10 минут после введения среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было ниже 1 для всех анализируемых тканей. Через 30 минут и 1 час после введения среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было выше 1 в легких и щитовидной/паращитовидной железе. Через 3 и 6 часов после введения среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было выше 1 в печени, легких и щитовидной/паращитовидной железе. Через 24 и 48 часов после введения в печени, легких, селезенке и щитовидной/паращитовидной железе среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было выше 1. Через 96 часов после введения среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было выше 1 в почках, печени, селезенке и щитовидной/паращитовидной железе. Максимальное отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке наблюдалось в щитовидной/паращитовидной железе (2485 через 96 часов), легких (6,5 через 24 часа) и печени (2,2 через 24 часа).

[0454] Что касается доли от введенной радиоактивности, максимальные средние значения среди указанных тканей наблюдались в печени (41,7% через 10 минут после введения), легких (7,0% через 30 минут), почках (2,2% через 10 минут), тонкой кишке (1,5% через 1 час) и щитовидной/паращитовидной железе (1,4% через 48 часов). В содержимом желудочно-кишечного тракта максимальные средние значения составляли 10,3% от дозы в содержимом желудка (через 3 часа после введения), 5,4% в содержимом тонкой кишки (через 3 часа после введения), и 1,1% в содержимом толстой кишки (через 3 часа). Через 96 часов после введения максимальная доля от введенной дозы определялась в щитовидной/паращитовидной железе (1,0%), печени (0.5%) и почках (0,1%). В указанный момент времени после введения препарата в содержимом желудка и мочевого пузыря оставалось менее 0,01% от введенной дозы.

Группа 3 (интратекальное введение и последующее внутривенное введение: 1,08 мг/кг (суммарная доза))

[0455] После интратекального и внутривенного введения максимальная средняя концентрация (C_max) радиоактивно-меченого вещества в тканях крыс группы 3 наблюдалась в щитовидной/паращитовидной железе (296,957±57,793 мкг экв/г; через 24 часа после введения), далее шла печень (10,181+0,600 мкг экв/г; 10 минут после введения), надпочечники (9,567±1,678 мкг экв/г; 10 минут после введения), легкие (5,305±0,194 мкг экв/г; 1 час после введения), селезенка (5,042±0,902 мкг экв/г; 10 минут после введения), желудок (4,454±1,455 мкг экв/г; 3 часа после введения), почки (3,390±0,183 мкг экв/г; 1 час) и СМЖ (2,087±2,912 мкг экв/г; 10 минут). Значения t_max для указанных тканей составляли 10 минут и 3 часа после введения, за исключением кишечника (6 часов после введения) и щитовидной/паращитовидной железы (24 часа после введения). Минимальные значения C_max радиоактивности наблюдались в жире почек (0,188±0,020 мкг экв/г), головном мозге (0,283±0,062 мкг экв/г), спинном мозге (0,327±0,062 мкг экв/г) и скелетных мышцах (0,411±0,009 мкг экв/г). Через 96 часов после введения радиоактивность все еще определялась в 8 из 18 анализируемых тканей, и максимальные средние концентрации определялись в щитовидной/паращитовидной железе (43,962±23,164 мкг экв/г, 14,8% от C_max), далее шла печень (0,137±0,018 мкг экв/г, 1,3% от C_max), почки (0,124±0,005 мкг экв/г, 3,7% от C_max), селезенка (0,083±0,009 мкг экв/г, 1,6% от C_max) и надпочечники (0,069±0,016 мкг экв/г, 0,7% от C_max).

[0456] Через 10 минут после введения среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было ниже 1 для всех анализируемых тканей. Через 30 минут и 1 час после введения среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было выше 1 в щитовидной/паращитовидной железе. Через 3 и 6 часов после введения среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было выше 1 в желудке и щитовидной/паращитовидной железе. Через 24 часа после введения в печени и щитовидной/паращитовидной железе среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было выше 1. Через 48 и 96 часов после введения среднее отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке было выше 1 в почках, печени и щитовидной/паращитовидной железе, а также в селезенке (96 часов). Максимальное отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке наблюдалось в щитовидной/паращитовидной железе (854 через 96 часов), печени (1,8 через 48 часов). И почках (1,6 через 96 часов).

[0457] Что касается доли от введенной радиоактивности, максимальные средние значения среди указанных тканей наблюдались в печени (19,0% через 10 минут после введения), почках (1,2% через 1 час) и тонкой кишке (1,2% через 3 часа). В содержимом желудочно-кишечного тракта максимальные средние значения составили 8,8% от введенной дозы в содержимом желудка (через 3 часа после введения), 4,3% в содержимом тонкой кишки (через 3 часа после введения) и 1,0% в содержимом толстой кишки (6 часов). Через 96 часов после введения максимальная доля от введенной дозы определялась в печени (0,3%), в щитовидной/паращитовидной железе (0,1%) и почках (0,05%). В указанный момент времени после введения препарата в надпочечниках, сердце, легких, селезенке, содержимом желудка и мочевого пузыря оставалось менее 0,01% от введенной дозы.

Фармакокинетика радиоактивности в крови, сыворотке, эритроцитах, СМЖ и тканях (Таблицы 16а-16в и Таблицы 17а-17в)

[0458] Усредненные фармакокинетические показатели радиоактивности в крови, сыворотке, эритроцитах, СМЖ и тканях крыс после однократного интратекального и/или внутривенного введения ¹²⁵I-hGALC приведены в Таблицах 16а-16в и Таблицах 17а-17в.

Таблица 16а
Кинетический профиль суммарной радиоактивности в крови, сыворотке и эритроцитах самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Сыворотка Группа 1: При средней дозе 41 мкг/животное
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч-1)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞
3	0,108	24	1,48	0,130	0,988	5,34	1,54	4,00
Кровь
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч-1)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞
3	0,0930	24	1,33	0,138	0,983	5,02	1,37	3,16
Эритроциты
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч-1)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞
6	0,0890	24	1,24	0,170	0,980	4,08	1,25	1,41

Таблица 16б
Кинетический профиль суммарной радиоактивности в крови, сыворотке и эритроцитах самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Сыворотка
Группа 2: При средней дозе 1,00 мг/кг
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞	Vx (мл/кг)	CL (мл/ч/кг)
0	20,1	96	71,1	0,0226	0,997	30,7	75,0	5,21	591	133
Кровь
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞	Vx (мл/кг)	CL (мл/ч/кг)
0	14,0	96	51,2	0,0256	0,994	27,1	53,2	3,75	735	18,8
Эритроциты
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞	Vx (мл/кг)	CL (мл/ч/кг)
0	6,40	48	33,9	0,0635	0,941	10,9	35,7	4,94	441	28,0

Таблица 16в
Кинетический профиль суммарной радиоактивности в крови, сыворотке и эритроцитах самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального и внутривенного болюсного введения 125I-hGALC
Сыворотка
Группа 3: При средней дозе 1,08 мг/кг
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞	Vx (мл/кг)	CL (мл/ч/кг)
0	16,9	96	89,8	0,0272	0,983	25,5	92,6	3,06	429	11,7
Кровь
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞	Vx (мл/кг)	CL (мл/ч/кг)
0	11,4	96	66,9	0,0332	0,990	20,9	68,0	1,64	478	15,9
Эритроциты
tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞	Vx (мл/кг)	CL (мл/ч/кг)
0	7,36	48	49,2	0,0721	0,947	9,61	51,0	3,69	293	21,2

Таблица 17а
Кинетический профиль суммарной радиоактивности в тканях и спинномозговой жидкости самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального введения 125I-hGALC
Группа 1: При средней дозе 41 мкг/животное
	tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞
Жировая ткань (Жир почек)	6	0,0060	6	0,0215	a	а	а	a	a
Надпочечники	3	0,0210	6	0,109	a	а	а	a	a
Кость(бедренная)	6	0,0410	6	0,136	a	а	а	a	a
Головной мозг	3	0,0050	6	0,0247	a	а	а	a	a
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	b	0,000	b	0,000	b	b	b	b	b
Глаза	3	0,0270	24	0,345	0,164	0,990	4,23	0,351	1,74
Сердце	3	0,0280	24	0,379	0,167	0,9S7	4,16	0.3S5	1,56
Почки	3	0,0960	96	1,S4	0,0118	0,979	58,6	2,27	18,6
Толстая кишка	3	0,0240	24	0,347	0,125	0,933	5,54	0,363	4,40
Печень	6	0,0300	6	0,141	а	a	а	a	a
Легкие	3	0,0580	24	0,801	0,134	0,937	5,18	0,831	3,60
Мышцы (скелетные)	3	0,0140	6	0,0983	а	a	а	a	a
Седалищный нерв	6	0,0500	6	0,201	а	a	а	a	a
Тонкая кишка	3	0,0460	24	0,606	0,121	0,992	5,74	0,639	5,18
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	3	0,0090	6	0,0436	а	а	а	а	а
Селезенка	3	0,0400	6	0,133	а	а	а	а	а
Желудок	3	0,203	96	2,60	0,0177	0,831	39,1	2,71	4,16
Щитовидная/паращитовидная железа	48,1	4,13	96	313	с	0,892	с	с	35,2
a Подлежащих регистрации результатов нет, поскольку конечная фаза не идентифицирована
b Показатели ФК не оцениваются, поскольку пробы были < ПКО.
с Значения не приводятся, поскольку AUC0-∞ экстраполированные более чем на 20% или R2, были <0,8.

Таблица 17б
Кинетический профиль суммарной радиоактивности в тканях и спинномозговой жидкости самцов крыс Спраг-Доули после однократной внутривенной болюсной инъекции 125I-hGALC
Группа 2: При средней дозе 1 мг/кг
	tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞
Жировая ткань (Жир почек)	0,5	0,158	6	0,617	а	0,920	а	а	56,0
Надпочечники	0	10,9	96	43,1	0,0201	0,927	34,6	46,8	7,89
Кость (бедренная)	0,5	1,58	48	15,3	0,0777	0,965	8,92	15,7	2,79
Головной мозг	0	0,268	6	0735	а	0,897	а	а	26,8
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	3	0,210	6	0,854	b	b	b	b	b
Глаза	1	0,406	24	5,35	0,113	0,981	6,15	5,64	5,19
Сердце	0	1,33	48	10,2	0,0726	0909	9,54	10,8	5,12
Почки	0	3,18	96	40,7	0,0167	0,988	41,6	46,7	12,7
Толстая кишка	1	0,492	48	7,30	0,0658	0,938	10,5	7,70	5,14
Печень	0	14,6	96	1,00	0,0290	1,00	23,9	105	4,15
Легкие	0,5	20,6	96	165	0,0497	0,939	13,9	167	0,832
Мышцы (скелетные)	1	0,275	24	2,64	0,154	0,996	4,50	2,69	1,93
Седалищный нерв	3	0,689	24	9,62	0,166	0,987	4,18	9,77	1,54
Тонкая кишка	3	0,832	48	13,2	0,0693	0,932	10,0	13,8	4,29
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0	0,315	24	2,39	0,115	0,991	6,04	2,51	4,87
Селезенка	0	7,27	96	56,1	0,0218	0,964	31,8	61,2	8,33
Желудок	3	140	96	31,9	0,0330	0,945	21,0	32,3	1,41
Щитовидная/паращитовидная железа	48	295	96	249S9	b	b	b	b	b
а Значения не приводятся, поскольку AUC0-∞ экстраполированные более чем на 20% или R2, были <0,8.
b Подлежащих регистрации результатов нет, поскольку конечная фаза не идентифицирована

Таблица 17в
Кинетический профиль суммарной радиоактивности в тканях и спинномозговой жидкости самцов крыс Спраг-Доули после однократного интратекального и внутривенного болюсного введения 125-hGALC
Группа 3: При средней дозе 1,08 мг/кг
	tmax (ч)	Cmax (мкг экв/г)	tlast (ч)	AUC0-tlast (мкг экв⋅ч/г)	k (ч-1)	R2	t1/2 (ч)	AUC0-∞ (мкг экв⋅ч/г)	% Экстраполяции AUC0-∞
Жировая ткань (Жир почек)	1	0,188	6	0,954	а	0,999	а	а	65,6
Надпочечники	0	12,6	96	43,9	0,0354	0,835	19,6	45,8	4,25
Кость (бедренная)	0,5	1,71	48	21,9	0,0869	0,985	7,98	22,3	1,50
Головной мозг	0	0,287	6	1,03	а	0,992	а	а	36,1
Спинномозговая жидкость (СМЖ)	0	4,89	6	1,94	а	0,775	а	а	5,95
Глаза	3	0,611	48	9,88	0,0947	0,988	7,32	9,99	1,06
Сердце	0,5	1,32	96	15,7	0,0391	1,00	17,7	15,9	0,967
Почки	1	3,39	96	57,9	0,0190	0,960	36,4	64,4	10,1
Толстая кишка	6	0,726	48	12,4	0,0764	0,911	9,07	12,8	2,77
Печень	0	11,2	96	96,5	0,0269	0,986	25,7	102	5,00
Легкие	1	5,31	96	44,1	0,0252	0,932	27,5	45,4	288
Мышцы (скелетные)	1	0,411	24	4,37	0,110	0,997	6,31	4,66	6,25
Седалищный нерв	3	1,04	24	15,6	0,147	0,983	4,71	16,0	2,38
Тонкая кишка	3	1,40	48	20,2	0,0851	0,974	8,14	20,6	1,88
Спинной мозг (поясничный, грудной, шейный отделы)	0	0,331	24	3,52	0,105	0,994	6,58	3,77	6,55
Селезенка	0	5,21	96	46,9	0,0347	0,860	20,0	49,3	4,85
Желудок	3	4,45	96	72,1	0,0557	0,353	12,4	72,6	0,766
Щитовидная/паращитовидная железа	24	297	96	16776	0,0272	0,982	25,4	18390	8,78
а Значения не приводятся, поскольку АЧС0-∞ экстраполированные более чем на 20% или R2, были <0,8.

Кровь, сыворотка и эритроциты

[0459] После интратекального введения (группа 1: 41 мкг/животное) средняя расчетная площадь под кривыми зависимости радиоактивности от времени от нуля до последней измеряемой точки (AUC_0-tlast) для сыворотки, цельной крови и эритроцитов составила 1,48 мкг экв⋅ч/г, 1,33 мкг экв⋅ч/г и 1,24 мкг экв⋅ч/г, соответственно. Сообщаемые для радиоактивности в сыворотке, цельной крови и эритроцитах значения кажущегося терминального t_1/2 составили 5,34, 5,02 и 4,08 часов, соответственно. Расчетная константа скорости элиминации, k, составила,130 ч^-1, 0,138 ч^-1 и 0,170 ч^-1 в сыворотке, цельной крови и эритроцитах, соответственно. Расчетные AUC_0-∞ в сыворотке, цельной крови и эритроцитах составили 1,54 мкг экв⋅ч/г, 1,37 мкг экв⋅ч/г и 1,25 мкг экв⋅ч/г, соответственно. Период элиминации радиоактивности из сыворотки, цельной крови и эритроцитов был четко определенный, на что указывали очень низкие значения процента экстраполяции (4,0, 3,2 и 1,4%, соответственно), требуемые для расчета AUC_0-∞.

[0460] После внутривенного введения (группа 2: 1,00 мг/кг) средние значения AUC_0-tlast для сыворотки, цельной крови и эритроцитов составили 71,1 мкг экв⋅ч/г, 51,2 мкг экв⋅ч/г и 33,9 мкг экв«ч/г, а значения кажущегося терминального t_1/2 составили 30,7, 27,1 и 10,9 часов, соответственно. Расчетное значение k составило 0,0226 ч^-1, 0,0256 ч^-1 и 0,0635 ч^-1 в сыворотке, цельной крови и эритроцитах, соответственно. Период элиминации радиоактивности из сыворотки, цельной крови и эритроцитов был четко определенный, и расчетные AUC_0-∞ составили 75,0 мкг экв⋅ч/г (экстраполяция 5,21%), 53,2 мкг экв⋅ч/г (экстраполяция 3,75%) и 35,7 мкг экв⋅ч/г (экстраполяция 4,94%) в сыворотке, цельной крови и эритроцитах, соответственно. Кажущийся объем распределения (V_z) был наибольшим в цельной крови (735 мл/кг), несколько меньше - в сыворотке (591 мл/кг) и эритроцитах (441 мл/кг). Клиренс исследуемого вещества по оценкам составил 13,3 мл/ч/кг для сыворотки и 18,8 мл/ч/кг для цельной крови.

[0461] После интратекального и внутривенного введения (суммарная доза - 1,08 мг/кг) животным группы 3 средние значения AUC_0-tlast для сыворотки, цельной крови и эритроцитов составили 89,8 мкг экв⋅ч/г, 66,9 мкг экв⋅ч/г и 49,2 мкг экв⋅ч/г, соответственно. Значения кажущегося терминального t_1/2 радиоактивности в сыворотке, цельной крови и эритроцитах составили 25,5, 20,9 и 9,61 часов, соответственно, а значения k составили 0,0272 х^-1, 0,0332 х^-1 и 0,0721 х^-1. В этом случае также период элиминации радиоактивности для всех трех матриц был четко определенный, и расчетные AUC_0-∞ составили 92,6 мкг экв⋅ч/г, 68,0 мкг экв⋅ч/г и 51,0 мкг экв⋅ч/г (экстраполяция 3,06%, 1,64% и 3,69%) в сыворотке, цельной крови и эритроцитах, соответственно. V_z был наибольшим в цельной крови (478 мл/кг), несколько меньше - в сыворотке (429 мл/кг) и эритроцитах (293 мл/кг). Значения клиренса составили 15,9 мл/ч/кг для цельной крови и 11,7 мл/ч/кг - для сыворотки.

Ткани

[0462] Максимальные значения AUC_0-tlast в тканях у крыс после интратекального введения ²⁵I-hGALC (группа 1: 41 мкг/животное) наблюдались в щитовидной/паращитовидной железе (313 мкг экв⋅ч/г), далее следовали желудок (2,60 мкг экв⋅ч/г) и почки (1,84 мкг экв⋅ч/г). Для нескольких тканей оценить k или любые показатели, вычисляемые на основании k (т.е. t_1/2 и AUC_0-∞), было невозможно, поскольку % экстраполяции AUC к бесконечности был более 20% или из-за отсутствия данных в терминальной фазе. Для тех тканей, где k можно было определить (глаза, сердце, почки, толстая кишка, легкие, тонкая кишка и желудок), она варьировала в диапазоне от 0,01 до 0,17 ч^-1, а t_1/2 как правило варьировали в диапазоне от 4 до 6 ч, и исключение составили почки - 58,6 ч и желудок - 39,1 ч.

[0463] После внутривенного введения (группа 2; 1,00 мг/кг) максимальные значения AUC_0-tlast наблюдались в щитовидной/паращитовидной железе (24989 мкг экв⋅ч/г), далее шли легкие (165 мкг экв⋅ч/г), печень (100 мкг экв⋅ч/г), селезенка (56,1 мкг экв⋅ч/г), надпочечники (43,1 мкг экв⋅ч/г) и почки (40,7 мкг экв⋅ч/г). Минимальные значения AUC_0-tlast наблюдались в жировой ткани почек (0,617 мкг экв⋅ч/г) и головном мозге (0,735 мкг экв⋅ч/г). Показатели, рассчитываемые на основании k, не приводились для тканей, в которых фаза элиминации была не четко определенной (щитовидная/паращитовидная железа и СМЖ), или где экстраполяция AUC_0-∞ составляла более 20% (жировая ткань почек и головной мозг). Только для печени и легких значения AUC_0-∞ были выше, чем значения для сыворотки (75 мкг экв⋅ч/г). Максимальные из зафиксированных значений AUC_0-∞ были обнаружены в легких (167 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 0,832%), далее шли печень (105 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 4,15%), селезенка (61,2 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 8,33%), надпочечники (46,8 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 7,89%) и почки (46,7 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 12,7%).

[0464] Минимальные расчетные значения AUC_0-∞ были в спинном мозге (2,51 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 4,87%), далее шли мышцы (2,69 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 1,93%) и глаза (5,64 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 5,19%). Самое большое из рассчитываемых значений t_1/2 среди тканей было в почках - 41,6 часов, далее шли надпочечники - 34,6 часов и селезенка - 31,8 часов. Наименьшее из зафиксированных значений t_1/2. было в седалищном нерве - 4,18 часа.

[0465] В группе 3, после интратекального и внутривенного введения (1,08 мг/кг, суммарная доза) максимальные значения AUC_0-tlast наблюдались в щитовидной/паращитовидной железе (16776 мкг экв⋅ч/г), далее шли печень (96,5 мкг экв⋅ч/г), желудок (72,1 мкг экв⋅ч/г), почки (57,9 мкг экв⋅ч/г), селезенка (46,9 мкг экв⋅ч/г), легкие (44,1 мкг экв⋅ч/г) и надпочечники (43,9 мкг экв⋅ч/г). Минимальные значения AUC_0-tlast наблюдались в жировой ткани почек (0,954 мкг экв⋅ч/г) и головном мозге (1,03 мкг экв⋅ч/г). Показатели, рассчитываемые на основании k, не приводились для тканей, в которых экстраполяция AUC_0-∞ составляла более 20% (жировая ткань почек и головной мозг) или R² был ниже 0,8 (СМЖ). Только для щитовидной/паращитовидной железы и печени значения AUC_0-∞ были выше, чем значения для сыворотки (92,6 мкг экв⋅ч/г). Максимальные из зафиксированных значений AUC_0-∞ были обнаружены в щитовидной/паращитовидной железе (18390 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 8,78%), далее шли печень (102 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 5,0%), желудок (72,6 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 0,766%), почки (64,4 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 10,1%), селезенка (49,3 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 4,85%), надпочечники (45,8 мкг экв»ч/г; экстраполяция 4,25%) и легкие (45,4 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 2,88%). Минимальные расчетные значения AUC_0-∞ были в спинном мозге (3,77 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 6,55%), далее шли мышцы (4,66 мкг экв⋅ч/г; экстраполяция 6,25%). Самое большое из рассчитываемых значений t_1/2 среди тканей было в почках - 41,6 часов, далее шли легкие - 27,5 часов, печень - 25,7 часов и щитовидная/паращитовидная железа - 25,4 часов. Наименьшее из зафиксированных значений t_1/2 было в седалищном нерве - 4,71 часа.

Обсуждение

[0466] После интратекального введения максимальные средние значения концентрации радиоактивности в сыворотке и цельной крови наблюдались через 3 часа после введения, что указывает на относительно быстрое распределение связанного с дозой вещества по большому кругу кровообращения. После внутривенного введения максимальные средние значения концентрации радиоактивности в сыворотке и цельной крови наблюдались в первый момент времени, в который производили измерения. Концентрация в сыворотке всегда была выше, чем в цельной крови, что отразилось на отношении радиоактивности в крови/в сыворотке выше чем 1. Это указывает на то, что ни в одной из групп ни в один из моментов времени после введения связанное с дозой вещество не было связано главным образом с эритроцитами. После осаждения белков крови с использованием ТХУ радиоактивность определялась главным образом в осадке, что указывает на то, что большая часть радиоактивности в циркулирующей крови была связана с белками, и, значит, наблюдаемое распределение радиоактивности в основном не отражало кинетики свободного йода-125.

[0467] Сравнение группы 2 (доза для внутривенного введения 1,00 мг/кг) и группы 3 (суммарная доза для интратекального и внутривенного введения 1,08 мг/кг) показало, что концентрации в цельной крови в группе 3, по-видимому, были довольно близки концентрациям в группе 2. Уменьшение радиоактивности в обеих матрицах для обеих групп также было весьма сходным, что оценивали по отношению радиоактивности в крови/в сыворотке. Сравнение AUC_0-tlast и AUC_0-∞ для сыворотки и крови группы 2 и группа 3 показало, что воздействие связанного с дозой вещества было немного выше у животных группы 3.

[0468] В группе 1 уровень радиоактивности в СМЖ был очень низким, результат, который, как представляется, не согласуется с результатом прямого введения тестируемого вещества в интратекальное пространство, хотя в головном мозге наблюдался очень низкий уровень. Однако радиоактивность выявлялась в большом кругу кровообращения и в системных тканях, вскоре после введения, что указывает на то, что связанное с дозой вещество достаточно быстро распределялось из интратекального пространства после введения. Более высокий уровень радиоактивности в содержимом желудка и кишечника указывает на то, что связанное с дозой вещество экскретировалось с калом, хотя прямое измерение в экскретах в данном исследовании не проводили. Кроме того, высокий уровень радиоактивности в содержимом мочевого пузыря также указывает на экскрецию с мочой. Помимо высокого уровня радиоактивности в щитовидной/паращитовидной железы, который, как предполагается, отражает утрату йодной метки и сохранение метки в данной ткани, а не распределение/сохранение самого тестируемого вещества, высокий уровень радиоактивности наблюдался в печени, легких, надпочечниках, селезенке и почках - тканях, которые, вероятно, участвуют в метаболизме и/или экскреции тестируемого вещества.

[0469] В группах 2 и 3 распределение радиоактивности было общим и обширным к первому моменту времени после введения препарата. Максимальная концентрация обычно была связана с печенью, легкими, почками, селезенкой, надпочечниками и, в особенности, со щитовидной/паращитовидной железой. Таким образом, характер распределения радиоактивности в тканях всех трех групп был в основном схожим. Также высокий уровень радиоактивности наблюдался в щитовидной/паращитовидной железе всех животных, особенно с учетом заметного нарастания концентрации при увеличении времени после введения, что, вероятно, указывает на утрату йодной метки и сохранение метки в данной ткани, а не распределение/сохранение самого тестируемого вещества. В ранние моменты времени после введения уровень радиоактивности в СМЖ был выше в указанных группах, чем в группе 1, что указывает на то, что радиоактивно меченное вещество способно проходить через гематоэнцефалический барьер. В этой группе уровень радиоактивности был несколько выше, чем в группе 2 также в ранние моменты времени после введения, что указывает на то, что указанная концентрация обусловлена тестируемым веществом, распределившимся из внутривенной дозы, и веществом, непосредственно введенным в интратекальное пространство. Следовательно, значения ниже ПКО, наблюдаемые в группе 1, могут объясняться очень низкими концентрациями в очень маленьких объемах проб, которые оказываются ниже чувствительности данного метода анализа.

[0470] Отношение радиоактивности в тканях/в сыворотке через 96 часов после введения препарата обычно было меньше 1 в большинстве тканей, что указывает на то, что связанное с дозой вещество распределялось в ткани и обычно выводилось более легко из тканей, чем из сыворотки. Для всех групп воздействие связанного с дозой вещества в большинстве тканей (оцениваемое по AUC_0-tlast) было меньше, чем в сыворотке.

Выводы

[0471] Концентрацию радиоактивности в крови, сыворотке, эритроцитах, СМЖ и тканях определяли после однократного интратекального введения (номинальная доза 60 мкг/животное) и/или внутривенного болюсного введения ¹²⁵I-hGALC самцам крыс (номинальные концентрации 1 мг/кг).

[0472] Максимальные наблюдаемые значения концентрации радиоактивности как в сыворотке, так и в цельной крови имели место через 3 часа после интратекального введения препарата, что указывает на относительно быстрое проникновение в большой круг кровообращения, или в первый момент времени после введения (10 минут) после внутривенного введения. Концентрация в сыворотке была выше, чем в крови, что указывает на то, что связанное с дозой вещество не ассоциировано главным образом с эритроцитами. Распределение радиоактивности было общим и обширным к первому моменту времени после введения препарата, и, в целом, характер распределения в ткани был сходным во всех трех группах. Во всех группах воздействие в большинстве тканей связанного с дозой вещества (оцениваемое по AUC_0-tlast) было меньше, чем в сыворотке. Высокая концентрация радиоактивности в щитовидной/паращитовидной железе для всех трех групп, как предполагается, отражает потерю йодной метки и сохранение метки в данной ткани, а не распределение/сохранение самого тестируемого вещества в указанной ткани. Через 96 часов после внутривенного введения радиоактивность все еще определяется в нескольких из исследуемых тканей.

ПРИМЕР 3: ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТРАЦЕРЕБРОВЕНТРИКУЛЯРНОГО/ВНУТРИБРЮШИННОГО ВВЕДЕНИЯ RMGALC И ДЛИТЕЛЬНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ У МЫШЕЙ ЛИНИИ TWITCHER

[0473] В настоящем примере продемонстрирован один вариант реализации доклинического исследования, иллюстрирующий длительную выживаемость у мышей линии Twitcher, обеспеченную еженедельными ВБ (внутрибрюшинными) инъекциями rmGALC. В этом варианте реализации была отмечена усиленная миелинизация седалищного нерва наряду со снижением уровня психозина и улучшением общей моторики (т.е. походки). Согласно некоторым вариантам реализации мыши линии Twitcher, которых лечили путем однократного интрацеребровентрикулярного (ИЦВ) или ИЦВ/ВБ введения rmGALC, демонстрировали повышенную выживаемость, и уровень психозина у них снижался до 63%. Положительные результаты по важным конечным показателям (т.е. выживаемость, уровень психозина в головном мозге) после однократного только ИЦВ введения rmGALC, и самое минимальное улучшение указанных конечных точек при добавлении системного введения (ИЦВ/ВБ) указывают на то, что при лечении глобоидно-клеточной лейкодистрофии (ГКД) единственным целесообразным вариантом является режим введения только в ЦНС.

Введение

[0474] Глобоидно-клеточная лейкодистрофия (ГКД) представляет собой аутосомно-рецессивную лизосомную болезнь накопления, которая возникает с частотой 1:100000 новорожденных (1,9:100000 новорожденных в Скандинавских странах). Будучи прогрессирующим расстройством периферической (ПНС) и центральной нервной системы (ЦНС) ГКД является следствием генетической мутации, вызывающей недостаточность активности фермента галактоцереброзидазы (GALC), расщепляющего липидные субстраты [т.е. галактозилцерамиды до галактозы и церамида, галактозилсфингозин (психозин) до галактозы и сфингозина]. Указанное расстройство характеризуется полной утратой олигодендроцитов и миелина, а также наличием галактозилцерамиды-поглощающих макрофагов («глобоидных» клеток).

[0475] Клинические признаки указанного заболевания проявляются в двух формах: инфантильной и поздней. Инфантильная форма ГКД (также называемая болезнью Краббе) возникает у 90% от всех пациентов с диагнозом недостаточности GALC, и симптомы обычно наблюдаются в первые 3-6 месяцев после рождения; есть сообщения о проявлении симптомов в первые 2-3 недели жизни (Wenger, D.A. et al., 2001, Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic и Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A.L., Sly, W.S., и Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p.3669-3687; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Поздний вариант указанного заболевания обычно проявляется клинически в возрасте 10 лет, однако есть сообщения о пациентах, которым диагноз был поставлен в 40 лет (Wenger, D.A. et al., 2001, Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic и Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A.L., Sly, W.S., и Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p.3669-3687; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Снижение функции у пациентов с поздней формой заболевания происходит постепенно в течение нескольких лет.

[0476] Пациентам, страдающим лизосомальными болезнями накопления (ЛБН), такими как болезнь Гоше, болезнь Фабри и синдром Хантера приносит пользу системная заместительная ферментная терапия (ЗФТ) (Wenger, D.A. et al., 2001, Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic и Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A.L., Sly, W.S., и Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p.3669-3687; Neufeld, E.F., 2004, Enzyme Replacement therapy. Lysosomal disorders of the Brain, ed. F.M.a. W. Platt, S.V. 2004: Ohford University Press. 327-338; Desnick, R.J., 2004. J. Inherit. Metab. Dis., 27(3): p.385-410; все публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). ЗФТ при ГКД не позволяла справиться с дрожанием, вероятно, из-за того, что указанное заболевание поражает и ПНС, и ЦНС. Современные способы лечения пациентов с ГКД включают трансплантацию гематопоэтических клеток (ТГК), однако указанная процедура имеет свои ограничения из-за существенных нежелательных явлений (т.е. 30% смертность в связи с лечением, пожизненная иммуносупрессивная терапия) и обладает эффективностью только у пациентов, у которых еще не развились симптомы.

[0477] Мыши линии Twitcher являются наиболее распространенной экспериментальной моделью для изучения ГКД на животных, и большинство работ по данному заболеванию сделано именно на них (Wenger, D.A., 2000, Mol. Med. Today, 6(11): p.449-451; включена в настоящую заявку посредством ссылки), но есть и другие модели ГКД на основе существующих в природе животных, охарактеризованных в разной степени. Спонтанная мутация имеет место у вест-хайленд-уайт/керн-терьеров (Kobayashi Т., et al., 1980, Brain Res., 202: 479-83; включена в настоящую заявку посредством ссылки), у овец дорсет (Pritchard D., et al., 1980, Vet. Pathol., 17: 399-405), домашних кошек (Johnson К., 1970, J. Am. Vet. Med. Assoc., 157: 2057-64; включена в настоящую заявку посредством ссылки) и низших приматов (Baskin G., et al., 1998, Lab Anim. Sci., 48: 476-82; включена в настоящую заявку посредством ссылки).

[0478] Первые исследования с аллогенными трансплантатами нервов продемонстрировали, что способность к улучшению функции шванновских клеток в периферических нервах у мышей линии Twitcher была обусловлена восполнением фермента в аллогенном трансплантате клеток линии Twitcher in situ, и что возможно долгосрочное восстановление поврежденных периферических миелинизирующих клеток у линии Twitcher. Однако указанную методику не удалось распространить на лечение мышей линии Twitcher (Baskin G., et al., 1998, Lab Anim. Sci., 48: 476-82; включена в настоящую заявку посредством ссылки). У больных мышей ЗГТ продемонстрировала значительное увеличение продолжительности жизни, однако была зарегистрирована различная эффективность, от 44 дней до более чем 100 дней (у мышей, выдерживаемых в условиях, способствующих продукции миелина) (Lin, D., el al., 2007, Mol. Ther., 15(1): p.44-52; hoogerbrugge, P.M., et al., 1998, J. din. Invest., 81(6): p.1790-4; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). Типичная продолжительность жизни мышей без лечения в данных исследованиях составляет приблизительно 40 дней.

[0479] В этом и других исследованиях ни скорость повторной миелинизации, ни наличие патологии головного мозга у мышей, подвергшихся лечению, не улучшались по сравнению с контролем без лечения (Yeager A., et al., 1984, Science, 225: 1052-4; Toyoshima, E., et al., 1986, J. Neurol. Sci., 74(2-3), p.307-18; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). Субстратное ингибирование, направленное на синтез сфингозина, с использованием L-циклосерина, либо одно, либо в сочетании с пересадкой гематопоэтических клеток, увеличивает продолжительность жизни у мышей линии Twitcher (LeVine S., et al., 2000, J. Neurosci. Res., 60: 231-6; Biswas S., et al., 2003, Neurosci. Lett., p347: 33-6; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). L-циклосерин слишком токсичен для применения у человека в отличие от D-циклосерина, который показан при лечении тревожности. Эксперименты с генной терапией показали возможность генерирования фермента в трансфецированных клетках и увеличения продолжительности жизни у мышей линии Twitcher, либо при монотерапии, либо в сочетании с пересадкой гематопоэтических клеток (Lin, D., et al., 2007, Mol. Ther., 15(1): р.44-52; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Снижение уровня субстрата, пересадка гематопоэтических клеток и генная терапия обладают наибольшей эффективностью, когда их применяют у животных до развития симптомов, и не оказывают влияния или оказывают лишь ограниченное влияние на заболевание с проявившимися симптомами. Следовательно, ЗФТ может быть целесообразным вариантом выбора при лечении ГКД, особенно у пациентов, у которых симптомы еще не развились.

Результаты

[0480] Заместительная ферментная терапия с системным введением мышиного GALC, полученного из hEK 293 (rmGALC; 5 мг/кг), который вводили периферически путем многократных внутрибрюшинных (ВБ) инъекций, увеличивала продолжительность жизни мышей линии Twitcher и снижала накопление психозина на 15% по сравнению с животными, получавшими только основу (Таблица 18, Фигура 31).

Таблица 18
ВБ введение rmGALC увеличивает выживаемость у мышей линии Twitcher
Группы по уровню доз	Среднее	Выживаемость (дни)	Анализ Манна-Уитни (по сравнению с основой)
		Разброс
Мин.	Макс.
Без лечения	42,6	39	45	0,49
Основа	43,2	37	48	н/п
1 мг/кг	43,0	40	46	0,61
5 мг/кг	48,9	46	54	0,0003
10 мг/кг	49,2	47	54	0,0003

[0481] Мыши, которым ВБ вводили rmGALC, демонстрировали лучшие результаты при тестировании походки, и результаты гистопатологического исследования седалищного нерва также были лучше по сравнению с животными, не подвергавшимися лечению. Периферическое (ВБ) введение rmGALC приводило к минимальной доставке в головной мозг, вызывающей легкое снижение уровня психозина в головном мозге, и, по-видимому, не происходило никаких изменений результатов гистопатологического исследования головного мозга. Следовательно, результаты, наблюдаемые у мышей линии Twitcher при многократном системном введении rmGALC (ВБ) раз в неделю (5 мг/кг) приводило к благоприятному действию на выживаемость, небольшому снижению уровня психозина в головном мозге и улучшению общей моторики.

Однократное ИЦВ и комбинированное ИЦВ/ВБ введение rmGALC у мышей линии Twitcher

[0482] Результаты показывают, что животные группы, получавшей высокие дозы ИЦВ/ВБ, выживали в среднем в течение 50 дней (120 мкг/5 мг/кг), тогда как животные, получавшие только основу, выживали только в течение 36 дней (Фигура 32). Мыши, получавшие rmGALC только ИЦВ, демонстрировали дозозависимое среднее время выживания - 42 дня (40 мкг) и 48 дней (120 мкг). Однократная ИЦВ инъекция дозы 120 мкг приводила к снижению уровня психозина в головном мозге (Фигура 33). Хотя ИЦВ/ВБ введение не давало никакого дополнительного благоприятного эффекта в отношении снижения уровня психозина по сравнению с только ИЦВ введением, снижение уровня психозина на 48%, наблюдаемое при комбинированном режиме, было значимо ниже, чем снижение, наблюдаемое только при ВБ введении раз в неделю (15%). Кроме того, при введении 40 мкг ИЦВ наблюдалось улучшение результатов гистологического исследования головного мозга в участках дистальнее участка инъекции (Фигура 34). Указанные результаты подтверждают активность и биораспределение rmGALC в головной мозг после прямого ИЦВ введения. Однако мыши, получавшие rmGALC ИЦВ путем, не демонстрировали восстановления морфологии или миелинизации волокон седалищного нерва, и демонстрировали лишь слабое улучшение общей моторики (т.е. анализ походки). Значимое улучшение в отношении важных конечных точек (т.е. выживаемость, уровень психозина в головном мозге) после однократного только ИЦВ введения rmGALC указывает на то, что достаточной концентрации фермента в большом кругу кровообращения не создается.

Параметры введения в клинических условиях: скорость повторного накопления психозина у мышей линии Twitcher

[0483] В попытке определить подходящий диапазон доз на мышах линии Twitcher проводили следующие исследования:

- Определение скорости повторного накопления психозина в головном мозге у мышей линии Twitcher после однократной ИЦВ инъекции в 19-й день после рождения (ДПР).

- Исследования по подбору доз с применением комбинированного внутрибрюшинного (ВБ) и интрацеребровентрикулярного (ИЦВ) введения rmGALC мышам линии Twitcher.

[0484] Чтобы оценить скорость повторного накопления психозина в центральной нервной системе мышам линии Twitcher однократно ИЦВ вводили 12 мкг или 40 мкг rmGALC в 19-й ДПР. Группы мышей (n=3) умерщвляли через 24 часа после инъекции (20-й ДПР) и затем далее каждые три дня. Ткани головного мозга отбирали и передавали для определения уровня психозина, гистопатологического исследования и анализа активности ферментов. Подгруппу животных оставляли для наблюдения для оценки выживаемости (n=8), а анализ общей моторики (анализ походки) проводили на 40-й ДПР.

[0485] Уровень психозина в гомогенате головного мозга после однократной ИЦВ инъекции оценивали посредством масс-спектрометрии («LCMS Ltd.», Северная Каролина), и результаты показали быстрое снижение уровня психозина в первые 24 ч после введения rmGALC (Фигура 35). Тенденция к снижению уровня психозина сохранялась в течение 24 ч после введения фермента. Кроме того, снижение концентрации психозина, по-видимому, было дозозависимым на протяжении указанного периода по сравнению с животными, получавшими только основу: животные, получавшие основу (средняя концентрация психозина: 4,5 нг/мл); животные, получавшие 12 мкг rmGALC (средняя концентрация психозина: 2,5 нг/мл); животные, получавшие 40 мкг rmGALC (средняя концентрация психозина: 1,6 нг/мл). Интересно, что повышение уровня психозина, наблюдаемое в группах обеих доз к концу исследования (дни 28-32 после лечения) указывают на то, что ЗФТ не успешна, если препарат вводить раз в месяц. Возможно, необходимо более частое введение препарата. Из-за малого количества животных в каждый момент отбора проб вариабельность результатов была очевидной. Однако на основании указанных результатов ясно, что повторное накопление психозина возникает приблизительно через 4 недели (28 дней).

[0486] Результаты анализа времени выживания показали, что животные и в группе получавшей 12 мкг/мл, и в группе, получавшей 40 мкг/мл, демонстрировали медиану выживаемости 48 дней (12 мкг/мл) и 50,5 дней (40 мкг/мл), животные, получавшие только основу, - 40 дней (Фигура 36). Неожиданно мыши, получавшие 40 мкг GALC человека (rhGALC) продемонстрировали положительную выживаемость только 42 дня по сравнению с выживаемостью животных, получавших только основу, 40 дней. Причины такой пониженной эффективности rhGALC неизвестны, но будут обсуждаться в следующем разделе. Однако на основании результатов данного исследования очевидно, что даже при более низких дозах rmGALC эффективен в отношении увеличения выживаемости в модели на мышах линии Twitcher.

Показатели введения в клинических условиях: исследования по подбору доз rmGALC и rhGALC на мышах линии Twitcher

[0487] Предыдущие результаты показали, что мыши линии Twitcher, получавшие ИЦВ/ВБ rmGALC (120 мкг и 5 мкг/кг), жили на 14 дней дольше, чем животные, получавшие только основу. Однако мыши линии Twitcher, получавшие препарат только в форме инъекций непосредственно в ЦНС, демонстрировали дозозависимое увеличение средней выживаемости на 12 дней (120 мкг ИЦВ) и 6 дней (40 мкг ИЦВ). Доза 120 мкг, вводимая в мозг мыши, переводится в дозу 300 мкг/кг, вводимую в мозг пациента; следовательно, было важно исследовать эффективность более низких доз rmGALC. Кроме того, на мышах линии Twitcher оценивали эффективность начальной партии rhGALC. Группам мышей раз в неделю делали ВБ инъекции rmGALC (5 мг/кг), начиная с 10-го ДПР, плюс однократную ИЦВ инъекцию либо 12 мкг (30 мг/кг массы мозга), либо 26 мкг (60 мг/кг массы мозга) rmGALC или rhGALC в 19-й ДПР. В 39-й ДПР подгруппу мышей (n=3/группу) умерщвляли для отбора тканей (головного мозга, седалищного нерва, печени, сыворотки). Ткань головного мозга передавали для оценки уровня психозина, гистопатологического исследования и количественной оценки активности фермента. Часть животных оставляли (n=8) для наблюдения за выживаемостью и анализа походки.

Обсуждение

[0488] Результаты данного исследования по подбору доз указывают на положительный эффект введения rmGALC с тенденцией к зависимости от дозы(Фигура 37). Комбинированные дозы rmGALC 12 мкг/5 мкг/кг и 26 мкг/5 мкг/кг увеличивают среднюю продолжительность жизни мышей линии Twitcher до 44,5 и 45,5 дней соответственно, при продолжительности жизни 40,5 дней у животных, получавших только основу. Положительного влияния на выживаемость доз rhGALC 12 мкг/5 мкг/кг (38 дней) и 26 мкг/5 мкг/кг (39,5 дней) не было. Доза rhGALC 26 мкг/5 мкг/кг увеличивала продолжительность жизни больных мышей линии Twitcher на 1,5 дня, однако ни одна из доз rhGALC не увеличивала выживаемость животных ни на один день по сравнению с животными, получавшими только основу (Фигура 37). Как наблюдалось ранее у животных, получавших rmGALC системно (ВБ), улучшение походки наблюдалось у всех животных, которым rmGALC вводили в комбинации ИЦВ/ВБ, тогда как животные, получавшие однократную ИЦВ инъекцию, демонстрировали менее выраженное положительное влияние на двигательную функцию (Фигура 38). Как и в случае положительного влияния на продолжительность жизни, у мышей, получавших rhGALC, не отмечалось положительного влияния на походку. Однако было показано, что удельная активность rhGALC составляла приблизительно 33% от активности rmGALC in vitro (Таблица 19). Следовательно, данные результаты указывают, что даже при более низких дозах rmGALC имеет место положительный эффект как на выживаемость, так и на двигательную функцию, и подтверждают возможность ЗФТ при ГКД. Очевидно, что повторное накопление психозина наступает приблизительно через 4 недели (28 дней).

Таблица 19
Активность rmGALC и rhGALC
Партия	Средняя активность (мкмоль/ч/мг)	% rmGALC
rmGALC R5(3,44 мг/мл)	154,48±87,5	н/п
rhGALC Lot 73(8,74 мг/мл)	51,35±16,2	33

Следует ожидать антигенности rmGALC и rhGALC, поскольку мыши линии Twitcher являются нулевой моделью [т.е. они представляют собой иммунологический материал с отрицательной перекрестной реакцией/ (СК1М)-отрицательные]. В целом максимальный титр антител в сыворотке у мышей, получавших rhGALC (ИЦВ/ВБ режим) был значительно выше, чем у мышей, получавших rmGALC (сопоставимый ИЦВ/ВБ режим) (Фигура 39). Хотя антитела также присутствовали у мышей, получавших инъекции непосредственно в ЦНС, максимальный титр был у них в несколько раз ниже, чем у животных, получавших препарат ИЦВ/ВБ. Существует возможность того, что будут продуцироваться нейтрализующие антитела.

[0489] Были начаты исследования на собаках с недостаточностью GALC, чтобы охарактеризовать антигенность rhGALC. В данном исследовании больные животные (6 недель от рождения) получали 2 мг/кг раз в неделю ВВ и/или 2,25 мг (30 мг/кг массы мозга) интратекально GALC человека или только основу. Дополнительно препарат вводили через 8 недель и далее раз в месяц до конца исследования (приблизительно до возраста 16 недель). Перед эвтаназией отбирали СМЖ для оценки образования антител и уровня психозина (Фигура 40).

[0490] Предшествующие исследования с рекомбинантной гепарин-N-сульфатазой человека в модели MPSIIIA на овчарках продемонстрировали значимый гуморальный ответ на эндогенный фермент, что привело к необходимости толеризации животных в указанном исследовании. Однако предварительные результаты анализа СМЖ животных, ранее не леченных и получавших rhGALC, демонстрируют явное снижение уровня психозина по сравнению с контрольными группами без лечения (Фигура 40).

ПРИМЕР 4: ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПЕЧЕНИ / МЕЧЕНИЕ ВВОДИМОГО МЫШАМ ИТ GALC

[0491] В настоящем примере описан один вариант реализации hGalC и mGalC, вводимого мышам интратекально, и соответствующее определение и локализация антитела к GalC в разных тканях.

Схема эксперимента:

Группа	N	Препарат	Доза (мкг)	Вводимый объем (мкл)	Путь	Частота	Умерщвление
А	6	Контроль - основа	0
В	6	hGalC (исследование)		10 мкл	ИТ	Три инъекции раз в неделю	Через 24 часа после последней инъекции
С	6	hGalC (PD)	100
D	6	mGalC

Отбор тканей и гистологическое окрашивание

[0492] Для гистологического анализа были доступны ткани только от трех животных из группы В и С, соответственно. Пробы из головного мозга и печени фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине с последующим заключением в парафин. Для иммуногистохимического окрашивания (ИГХ) I2S с целью определения вводимых белков готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм. Для ИГХ окрашивания GalCA применяли три анти-GalC антитела.

1. Мышиное моноклональное антитело (сгенерированное в лаборатории д-ра Экмана)

2. Поликлональное антитело кролика (сгенерированное группой 1)

3. Поликлональное антитело кролика (сгенерированное группой 2)

Для мечения целевых белков применяли высоко чувствительный способ усиления флуоресценции с использованием АВС (авидин-биотин-пероксидазный комплекс) + тирамида. Результаты окрашивания были представлены как зеленое окрашивание GalC-положительных клеток и синие контрастное окрашивание ядер, а фоновые области были черными.

Результаты

[0493] Поликлональные антитела группы 1 обладали сильной перекрестной реактивностью с эндогенными белками в головном мозге мышей. Даже в головном мозге контрольных животных, получавших только основу, все клетки в ЦНС имели сильную положительную окраску. Вводимые белки не идентифицировались на таком сильно окрашенном фоне (Фигура 41). Поликлональные антитела группы 2 обладали более слабой перекрестной реактивностью с эндогенными белками в головном мозге мышей, но клетки в ЦНС контрольных животных, получавших только основу, все же имели положительную окраску. Вводимые белки не определялись на указанном фоне (Фигура 42). Мышиные моноклональные антитела обладали приемлемой специфичностью, и в головном мозгу контрольных животных (только основа) сигналы были гораздо ниже (данные не показаны). После ИТ инъекции все белки определялись в оболочках на поверхности головного мозга. В клетках ЦНС (нейроны и клетки глии) hGalC и группы 1, и группы 2 определялись в областях под оболочками мозга, и относительно более сильный сигнал был у животных, получавших hGalC группы 1. В головном мозге животных, получавших mGalC, не определялось никаких положительно окрашенных нейронов или клеток глии (Фигура 43). В мозжечке hGalC вызывал окрашивание в оболочках и на поверхности зернистой зоны, тогда как mGalC такого окрашивания не вызывал (Фигура 44). Мышиные моноклональные антитела работали в головном мозге мышей, но проявляли сильную перекрестную реактивность с синусоидальными клетками печени, и их нельзя было применять для оценки клеточного захвата белков, водимых ИТ, в печени (Фигура 45). Поликлональные антитела группы 2 демонстрировали специфичность в тканях печени, и в головном мозге контроля, получавшего только основу, сигнал был гораздо ниже. Все вводимые ИТ белки определялись как в синусоидальных клетках, так и в гепатоцитах печени после введения препарата, а количество положительно окрашенных клеток и сигнал у животных, получавших hGalC группы 1, были меньше (Фигура 46). Хотя ни в одной из групп, получавших препарат, не было выявлено более высокой активности GalC, положительное окрашивание обнаруживалось в оболочках мозга и в клетках ЦНС в окружающих областях, что указывает на то, что ИГХ чувствительна при определении вводимых белков, которые были захвачены на клеточном уровне (Фигура 47). В печени mGalC демонстрировал более высокую активность, однако ИГХ окрашивание с использованием антитела группы 2 выявило очень незначительные различия между mGalC и hGalC (Фигура 48). Низкая определяемая активность антитела группы 1 в отношении hGalC согласовывалась с низким наблюдаемым уровнем ИГХ окрашивания.

Выводы

[0494] После ИТ введения все вводимые белки определялись в оболочках мозжечка при ИГХ окрашивании. В клетках ЦНС (нейроны и клетки глии) определялся клеточный захват вводимого hGalC и группы 1, и группы 2, и относительно более сильный сигнал был в головном мозге животных, получавших hGalC группы 1. Никаких положительно окрашенных нейронов и клеток глии в головном мозге животных, получавших mGalC, не выявлялось. В мозжечке помимо положительного сигнала в оболочках вводимый hGalC и группы!, и группы 2, обнаруживался в слоях клеток на поверхности зернистой зоны. В печени животных всех групп, получавших активный препарат, вводимые белки определялись в синусоидальных клетках и гепатоцитах, что указывает на итоговый захват интратекально введенной I2S системой кровообращения. mGalC и hGalC группы 2 давали одинаково сильный сигнал при окрашивании по сравнению с hGalC группы 1.

ПРИМЕР 5: ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПЕЧЕНИ / МЕЧЕНИЕ ВВОДИМОГО ИТ СОБАКАМ GALC

[0495] В настоящем примере описан один вариант реализации GalC, вводимого собакам интратекально, и соответствующее определение и локализация антитела к GalC в головном мозге. Согласно данному варианту реализации вводимый ИТ белок определялся в оболочках мозга и области поверхностного слоя коры под оболочками. Вводимый ИЦВ белок обнаруживался в перивентрикулярных областях (Фигура 49). ИГХ окрашивание на GalC показало диффузный внеклеточный характер окрашивания в коре после ИТ введения, причем в нейронах сигнал был отрицательный (обведено кружками) (Фигура 50). В перивентрикулярных областях после ИЦВ введения и в коре после ИТ введения наблюдалось ограниченное уменьшение числа активированных клеток микроглии с положительным Iba-окрашиванием (Фигура 51). В коре при окрашивании красителем luxol-fast-blu/парааминосалициловой кислотой в группе, получавшей только основу, никаких морфологических изменений (глобоидные клетки) не выявлялось, и между группами никаких различий не наблюдалось. Количество глобоидных клеток (стрелка), маркированных путем окрашивания Iba снижалось после ИЦВ введения препарата в 4 ограниченных участках перивентрикулярных областей (Фигура 52).

Примеры ИТ доставки белка I2S

ПРИМЕР 6: БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЕ I2S, ДОСТАВЛЯЕМОГО ИТ

[0496] Основная задача данного исследования состояла в том, чтобы определить, можно ли доставить рекомбинантную I2S (идуронат-2-сульфатазу) человека в головной мозг взрослых мышей с МБД (миофасциальным болевым дисфункциональным синдромом) II при интратекальном введении в поясничный отдел (см. Таблицу 20).

Таблица 20
ШЕСТЬ ГРУПП САМЦОВ МЫШЕЙ В ВОЗРАСТЕ 8-12 НЕДЕЛЬ ПОЛУЧАЛИ СЛЕДУЮЩЕЕ ЛЕЧЕНИЕ
Группа	Кол-во	Штамм	Лечение	Объем	Доза	Доза/массу мозга	Путь введения
А	3	IKO	I2S	10 мкл	260 мкг	520 мг/кг	ИТ-поясничный
В	3	IKO	I2S	10 мкл	260 мкг	520 мг/кг	ИТ-поясничный
С	3	IKO	Без лечения	н/п	н/п	н/п	н/п
D	1	IKO	I2S	10 мкл	260 мкг	520 мг/кг	ит-поясничный
Е	3	IKO	Без лечения	н/п	н/п	н/п	н/п
F	3	C57BI/6	Без лечения	н/п	н/п	н/п	н/п
Схема введения: животным делали до 3 инъекций идурсульфазы (10 мкл) интратекальным путем в поясничный отдел:
- группы А&D: были введены 3 дозы I2S в дни 1, 8 и 15
- группа В: были введены 2 дозы I2S в дни 1 и 8
- группы С&Е: контрольные мыши (IKO), не подвергавшиеся лечению
- группа F: контрольные мыши дикого типа, не подвергавшиеся лечению

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные:

[0497] Мышей размещали в группах до 4 особей в клетке в помещении для содержания с 12-часовым циклом свет-темнота. На протяжении всего эксперимента мыши получали корм для грызунов (LabDiet-5001, Сент-Луис, Миссури) и воду (Lehington, вода из городского водопровода Массачусетса, очищенная путем обратного осмоса) в неограниченном количестве. Уход за животными соответствовал рекомендациям, описанным в Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных (National Academy Press, Washington D.C., 1996). Используемую колонию молодняка IKO получали от четырех гетерозиготных самок мышей - носителей мутации IKO, которых получили из лаборатории д-ра Джозефа Мюнзера (Университет Северной Каролины). Самок-носителей скрещивали с самцами мышей исходной линии C57BL/6 (C57BL/6NTac, Taconic, Гудзон, Нью-Йорк), получая гетерозиготных самок и гемизиготных самцов с нокаутом, а также однопометных самцов и самок дикого типа. Генотип всего потомства определяли посредством ПЦР тканевой ДНК. Все животные, применяемые в данном эксперименте, были самцами, у которых был идентифицирован гемизиготный IKO (-/0) или однопометными самцами дикого типа (ДТ) (+/0) в возрасте от 8 до 12 недель.

Идурсульфаза:

[0498] Двадцать два мл I2S [рекомбинантной идурсульфазы человека] диализировали посредством четырех смен 2 л физиологического раствора на фосфатном буфере (ФБР). Затем I2S концентрировали на колонке Vivaspin и повторно суспендировали в конечном объеме ФБР 1 мл, после чего подвергали стерильной фильтрации с применением фильтра с диаметром пор 0,2 мкм. Конечная концентрация составляла 51 мг/мл.

Интратекальные инъекции в поясничный отдел:

[0499] Взрослых мышей подвергали анестезии посредством внутрибрюшинной инъекции 1,25% 2,2,2-трибромэтанола (авертина) в концентрации 200-300 мл/10 грамм массы тела (250-350 мг/кг). Шерсть на спине удаляли от основания хвоста до области лопаток, и обритую область протирали тампоном со скрабом на основе повидина/бетадина, и далее - спиртом. Над пояснично-крестцовым отделом позвоночника делали маленький разрез кожи по срединной линии (1-2 см), и находили место пересечения срединной линии спины и ближнего к голове края крыльев подвздошной кости (одиночная подвздошная кость). Мышца в подвздошной ямке (средняя ягодичная) представляет собой мышцу в форме сердца и две стороны верхушки «сердца» указывают приблизительное расположение крыльев подвздошной кости. Иглу 32 калибра, присоединенную к герметичному стеклянному шприцу Гамильтона объемом 10-20 мкл, вводили до тех пор, пока не возникало сопротивление со стороны нижележащей кости. Затем проводили инъекцию 10 мкл тестируемого вещества с приблизительной скоростью 2 мкл/20 секунд (10 мкл/2 минуты). Разрез кожи зашивали путем наложения клипс, как надлежит, и животному давали восстановиться в реабилитационной камере перед возвращением в соответствующую клетку.

Гистологическое исследование:

[0500] Животных умерщвляли через час после последней инъекции.

[0501] Ткани головного мозга и печени отбирали и фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине, затем обрабатывали и заключали в парафин. Для окрашивания гематоксилином/эозином (Г и Э) и иммуногистохимического окрашивания (ИГХ) готовили парафиновые срезы толщиной пять мкм.

Окрашивание гематоксилином и эозином:

[0502] Срезы головного мозга окрашивали Г и Э. В результате окрашивания ядра выглядели пурпурными, а цитоплазма - от розовой до красной. Препараты, окрашенные Г и Э, применяли для гистопатологической морфологической оценки.

Иммуногистохимия:

[0503] Для оценки биораспределения I2S депарафинизированные и регидратированные срезы головного мозга и печени инкубировали в течение ночи с моноклональными антителами мыши 2С4-2В2 (Maine Biotechnology Services, Портленд, Мэн) к рекомбинантной I2S человека, чтобы определить введенную I2S (или несоответствующий IgG в качестве антитела отрицательного контроля; Vector Laboratories, Барлингейм, Калифорния). После инкубации в течение ночи при 2-8°C добавляли антимышиный IgG овцы, конъюгированный с пероксидазой хрена. После дополнительной инкубации в течение 30 минут при 37°C добавляли раствор с меткой Тирамид Алекса фтор 488 (Invitrogen Corp., Карлсбад, Калифорния) и инкубировали смесь еще 10 минут. Срезы накрывали покровными стеклами с применением среды для заключения с защитой от выцветания (VectaShield; Vector Laboratories), содержащей 1,5 мкг/мл 4’-6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в качестве контрастного красителя для ядер, и рассматривали под многоканальным флуоресцентным микроскопом Nikon. В результате окрашивания 125-положительные клетки выглядели зелеными, с синими ядрами, а фоновые области выглядели черными.

[0504] Для анализа эффективности срезы головного мозга и печени окрашивали анти-LAMP-1 (ассоциированный с лизосомами мембранный белок в качестве маркера лизосом) IgG крысы (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния) в качестве первичного антитела. В качестве отрицательного контроля применяли несоответствующее антитело IgG крысы. Для амплификации целевого маркера применяли способ на основе АВС (наборы с авидин-биотин-пероксидазным комплексом от компании Vector Labs Барлингейм, Калифорния).

[0505] Если кратко, депарафинизированные срезы регидратировали и инкубировали с указанным первичным антителом. После инкубации в течение ночи при 2-8°C добавляли вторичный биотинилированный антикрысиный IgG кролика (Vector Labs Барлингейм, Калифорния) и инкубировали 30 минут при 37°C, затем пробы промывали и обрабатывали авидин-биотин-пероксидазным комплексом (Vector Laboratories) в течение 30 минут. Для развития окраски в качестве хромагена применяли 3,3-диаминобензидин тетрахлорид (ДАБ). Срезы затем подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином и накрывали покровными стеклами. В результате окрашивания LAMP-1-положительные клетки выглядели коричневыми, а ядра - синими.

[0506] Отбирали показательные фотографии и анализировали площадь LAMP-1-положительных клеток с использованием программы Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Вифезда, Мэриленд), затем проводили сравнительный статистический анализ с применением критерия Стьюдента.

Способ электронной микроскопии:

[0507] Ткани головного мозга от животных, получивших 3 дозы I2S, фиксировали в 2,5% параформальдегида (ПФА)/2,5% глутаральдегида в 0,1М натрий-какодилатного буфера (рН 7,4) при 4 градусах в течение ночи. Затем пробы отмывали в какодилатном буфере (0,1М, pH 7,4) и затем фиксировали в тетроксиде осмия, дегидратировали в спиртах и пропиленоксиде и заключали в смолу Epon. Ультратонкие срезы нарезали с толщиной 100 нм, окрашивали цитратом свинца и анализировали под просвечивающим электронным микроскопом Tecnai™ G² Spirit BioTWIN.

Результаты

[0508] В головном мозге животных, получавших только основу, I2S методом иммуногистохимии (ИГХ) не обнаруживалась. В отличие от этого у животных, получавших I2S, клетки оболочек мозга, нейроны больших полушарий и мозжечка были окрашены на I2S положительно. Сигнал окрашивания был сильнее у животных, получивших 3 дозы (Фигура 53).

[0509] В тканях головного мозга мышей IKO, получавших только основу, во всем головном мозге обнаруживалась вакуолизация клеток - гистопатологический признак лизосомальной болезни накопления, в отличие от животных дикого типа. У мышей IKO, получавших I2S имело место повсеместное снижение вакуолизации клеток от поверхности коры больших полушарий, хвостатого ядра, таламуса, мозжечка до белого вещества по сравнению с животными, не получавшими препарата (Фигура 54). Окрашивание на ассоциированный с лизосомами мембранный белок-1 (LAMP-1) в качестве маркера активности лизосом и болезненного состояния, выявило повышенную активность лизосом в клетках микроглии, оболочек мозга и периваскулярных клетках мышей IKO, получавших только основу, по сравнению с животными дикого типа (Фигура 55). У мышей, получавших I2S интратекально, имело место выраженное снижение иммунного окрашивания на LAMP-1. Указанное снижение характеризовалось уменьшением числа LAMP-1-положительных клеток и более светлым окрашиванием. Указанное снижение обнаруживалось во всем головном мозге от поверхности коры больших полушарий, хвостатого ядра, таламуса, мозжечка до белого вещества (Фигура 56) у животных, получивших как 2, так и 3 дозы I2S. Морфометрический анализ иммунного окрашивания на LAMP-1 разных областей головного мозга подтвердил, что имело место значимое снижение LAMP-1-положительного окрашивания во всех исследуемых областях головного мозга (Фигура 56).

[0510] Электронно-микроскопическое исследование клеток головного мозга у мышей IKO, получавших только основу, выявило увеличенные вакуоли, содержащие аморфные гранулы с накопленным веществом и включения с пластинчатыми и зебравидными структурами. Указанные типичные патологические признаки лизосомального накопления на ультраструктурном уровне снижались у мышей, получавших I2S интратекально (Фигура 57).

[0511] В печени у животных, получавших только основу, положительного окрашивания на I2S не было. У мышей, получавших I2S интратекально, большое количество введенной I2S явно обнаруживалось синусоидальных клетках (Фигура 58), что указывает на то, что I2S, введенная в интратекальное пространство, циркулировала в СМЖ и затем всасывалась путем арахноидальной грануляции в кровеносную систему.

[0512] В тканях печени мышей IKO, получавших только основу, на основании Г и Э окрашивания и сильного иммунного окрашивания на LAMP-1 были продемонстрированы выраженная вакуолизация клеток и аномально высокая активность лизосом по сравнению с мышами дикого типа. После интратекального введения I2S было выявлено значимое снижение вакуолизации клеток и иммунное окрашивание на LAMP-1 в печени. Окрашивание Г и Э выявило внутрицитоплазматическую вакуолизацию, которая почти полностью исчезала, и структура клеток печени была почти нормальной (Фигура 59).

[0513] Мышам IKO рекомбинантную I2S человека вводили интратекально в поясничный отдел для доставки в головной мозг, и вводимая I2S вызывала повсеместное улучшение гистопатологических признаков в разных отделах головного мозга.

- Вводимая I2S определялась в клетках оболочек мозга и в нейронах головного мозга.

- Снижала вакуолизацию клеток во всем головном мозге, что определялось посредством как световой, так и электронной микроскопии.

- Снижала уровень лизосомального маркера LAMP-1 во всем головном мозге.

- Вводимая интратекально I2S проходила в периферические кровеносные сосуды и вызывала улучшение в печени как по морфологии, так и по уровню гистологического маркера.

ПРИМЕР 7: ТОКСИКОЛОГИЯ ИНТРАТЕКАЛЬНОЙ ДОСТАВКИ I2S

[0514] В настоящем примере проиллюстрированы клинические признаки, ассоциированные с идурсульфазой, которую вводили раз в месяц в форме интратекальной болюсной инъекции длиннохвостым макакам. Для достижения данного результата 14 самцов яванским макак случайным образом распределяли в пять лечебных групп, как указано в следующей ниже Таблице 21.

Таблица 21
Схема эксперимента
Группа	Количество животных	Номинальная доза (мг)	Объем дозы (мл
1	3	0	1
2	3	3	1
3	3	30	1
4	3	150	1
5	2	100	1

[0515] Животные из всех групп получали препарат с частотой три раза в месяц ИТ на уровне поясничного отдела позвоночника. Дозу в объеме 1 мл вымывали из системы катетера 0,3 мл ФБР. За один-два дня до каждого введения препарата из ИТ порта доступа на уровне мостомозжечковой цистерны отбирали приблизительно 2 мл СМЖ. В указанное время также отбирали пробы крови (2 мл). У животных из группы 5 кровь (2 мл) и СМЖ (0,1 мл) отбирали перед введением препарата, а также через 0,5, 1, 2, 4, 8, 24 и 48 часов после введения первой дозы препарата. Клинические признаки регистрировали по меньшей мере два раза в день. Вскрытие проводили приблизительно через 24 часа после введения третьей дозы, при этом отбирали и сохраняли выбранные ткани.

[0516] В 1-й день все три животных из группы 4 (150 мг) проявляли минимальное подтягивание задних конечностей в первые 3-12 минут после введения, что продолжалось в течение 5-15 минут; указанный признак, как предполагается, связан с тестируемым веществом. Изменений массы тела, потребления пищи и показателей неврологического/физикального обследования, которые можно было бы связать с тестируемым веществом, не возникало.

[0517] Представлен анализ проб сыворотки и СМЖ, а также анализ вводимого раствора препарата. В разных тканях, полученных от длиннохвостых макак, наблюдался разброс активности эндогенной идурсульфазы; в головном и спинном мозге эндогенная активность была выше, чем в исследуемых периферических органах, включая печень, сердце и почки. Введение идурсульфазы было ассоциировано с дозозависимым повышением активности идурсульфазы в разных областях головного мозга, а также в стволе головного мозга и спинном мозге. ИТ доставка не приводила к определяемым различиям между правым и левым полушариями мозга. Имело место явное дозозависимое увеличение активности идурсульфазы в следующих органах: головной мозг, печень, сердце и почки. Иммунное окрашивание на идурсульфазу в головном мозге продемонстрировало дозозависимое повышение интенсивности окрашивания. В группе, получавшей 3 мг, наблюдалось окрашивание клеток оболочек мозга и ограниченного числа клеток глии под оболочками; у животных лечебной группы, получавшей 3 мг, не наблюдалось явного окрашивания нейронов. В спинном мозге окрашивание на идурсульфазу было положительным и дозозависимым, и максимальная интенсивность окрашивания была в поясничном отделе, где производили ИТ введение идурсульфазы. Интенсивность окрашивания на идурсульфазу в печени, почках и сердце была дозозависимой и согласовывалась с повышенной активностью идурсульфазы в указанных органах.

[0518] В заключение следует отметить, что ИТ введение идурсульфазы в дозах до 150 мг с частотой раз в месяц не вызывает нежелательных эффектов. Таким образом, уровнем отсутствия наблюдаемых нежелательных эффектов (NOAEL) был признан уровень 150 мг - максимальная доза, тестируемая в данном исследовании. Введение идурсульфазы было связано с дозозависимым повышением активности идурсульфазы в ЦНС и развивающимся как следствие повышением уровня в печени, почках и сердце.

[0519] Тестируемое вещество - идурсульфаза - поставляли в форме растворов для введения в 154 мМ NaCl, 0,005% полисорбата 20, pH 5,3-6,1. Номинальные концентрации в поставляемых растворах для введения составляли 0,3, 30 или 150 мг/мл. Тестируемое вещество хранили в морозильнике при температуре от -82° до -79°C. В качестве агента для промывки катетера после введения дозы и после последовательного отбора проб СМЖ применяли фосфатно-солевой буфер (ФБР) pH 7,2. ФБР получали от компании Gibco, Invitrogen Corporation.

Подготовка тестируемого вещества

[0520] В первый день введения препарата в каждый интервал времени по одному флакону каждой концентрации вынимали из морозильного шкафа (-80°C) и давали разморозиться на рабочем столе при комнатной температуре. Как только раствор размораживался, флаконы для групп 1, 2 и 3 маркировали, взвешивали и по 1 мл раствора отбирали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкл для каждого животного, которому планировали сделать инъекцию. После того как все дозы были введены, указанные флаконы взвешивали повторно и убирали в холодильник.

[0521] В следующий день (день введения препарата для животного 003, группа 4 и группа 5) раствор для введения для групп 1 и 4 брали из холодильника и оставляли на рабочем столе, чтобы препарат достиг комнатной температуры. При достижении комнатной температуры флаконы с препаратом для групп 1 и 4 взвешивали, флакон для группы 4 маркировали, и по 1 мл раствора отбирали через фильтр для каждого животного, которому планировали сделать инъекцию в группах 1 и 4. Раствор для введения для группы 5 затем готовили путем введения соответствующего количества раствора для группы 4 и группы 1 (основы) в полипропиленовый флакон. Количество, добавляемое из растворов для групп 1 и 4, регистрировали. Указанный раствор перемешивали путем аккуратного переворачивания флакона, и дозы объемом 1 -2 мл для животных из группы 5 отбирали через фильтр. Флаконы с препаратом для групп 1 и 4 повторно взвешивали после завершения введения препарата, и флаконы (группы 1-5) убирали в морозильник.

[0522] Четырнадцать животных случайным образом распределяли в группы лечения, описанные в Таблице 21.

[0523] ИТ путь введения был выбран, поскольку данный путь предполагается применять у человека. Дозы идурсульфазы, которые были выбраны для данного исследования (3, 30, 100, и 150 мг/мл), выбирали, чтобы оценить биораспределение разных доз фермента в центральной нервной системе (ЦНС) низших приматов после трех последовательных ИТ болюсных инъекций в поясничный отдел с частотой раз в месяц.

Клинические наблюдения

[0524] Общая частота клинических признаков была минимальной. На протяжении всего исследования ни у одного животного из группы 1 (контроль), группы 2 (2 мг), группы 3 (30 мг) или группы 5 (100 мг) не было клинических признаков, которые рассматривались бы как связанные с тестируемым веществом.

[0525] В день 1 все животные из группы 4 (150 мг) (012-014) проявляли минимальное подтягивание задних конечностей в первые 3-12 минут после введения, что продолжалось в течение 5-15 минут. Указанный признак, как предполагается, был связан с тестируемым веществом, и он не наблюдался ни в одной из групп, получавших более низкие дозы. Не было никаких других клинических признаков, возникавших непосредственно после введения первой дозы или в указанные дни непосредственно после введения тестируемого вещества. Единственным дополнительным признаком, наблюдаемым у животных группы 4, был единственный эпизод рвоты у животного 013 в день 35.

[0526] Введение тестируемого вещества в форме однократной интратекальной болюсной инъекции не было связано с какими-либо макроскопическими или микроскопическими изменениями, если не учитывать изменения, присущие имплантации устройств для доставки лекарственных препаратов. Все группы, включая контрольную группу, демонстрировали микроскопические изменения в оболочках мозга, отражающие собой воспалительные реакции на систему доставки лекарственных препаратов. У животных, получавших дозы тестируемого вещества 30 мг и более, была тенденция к более выраженному эозинофильному компоненту в воспалительной реакции в оболочках мозга, но данное различие не было сочтено биологически значимым.

[0527] Поскольку различия между животными, получавшими только основу и тестируемое вещество, были такими слабыми, уровнем отсутствия наблюдаемых нежелательных эффектов (NOAEL) был признан уровень 150 мг - максимальная доза, тестируемая в данном исследовании.

[0528] Общая воспалительная реакция в оболочках мозга во всех группах (включая контроль) была несколько более выраженная, чем та, что наблюдалась ранее в исследовании интратекального пути введения такой же длительности у обезьян. Однако было сделано предположение, что возможно это было связано с некоторыми свойствами основы или влиянием введения препарата за 24 часа до вскрытия.

[0529] Окрашивание головного мозга на идурсульфазу было положительным у всех животных, получавших препарат, за исключением животных из группы 3 мг, и максимальная интенсивность окрашивания обнаруживалась в группе, получавшей 150 мг (Фигуры 60, 61, 62 и 63). В группе, получавшей 3 мг, положительное окрашивание наблюдалось только в клетках оболочек мозга и небольшом числе клеток глии под оболочками; в нейронах введенной индурсульфазы не обнаруживалось. В группах, получавших более высокие дозы (30, 100 и 150 мг) сильное положительное окрашивание на идурсульфазу демонстрировали крупные популяции нейронов больших полушарий, а также клетки оболочек мозга, клетки глии и периваскулярные клетки. Иммунное окрашивание на идурсульфазу выявило широкое распределение введенной идурсульфазы в нейронах больших полушарий, начиная от нейронов в слое I на поверхности рядом с оболочками мозга, и заканчивая нейронами в более глубоком слое VI, соседним с белым веществом (Фигуры 64, 65 и 66). Выраженное окрашивание нейронов наблюдалось в группе, получавшей 150 мг (Фигура 67). У всех животных (группы доз 30-150 мг) не выявлялось выраженных различий в результатах иммунного окрашивания на нейрональную идурсульфазу между передним, средним и задним отделами головного мозга.

[0530] Окрашивание на идурсульфазу было положительным в спинном мозге всех животных, и максимальная интенсивность окрашивания была в поясничном отделе (Фигуры 68 и 69). Иммунное окрашивание на идурсульфазу также было дозозависимым. В группе, получавшей 150 мг, сильную положительную окраску на идурсульфазу демонстрировали нейроны, клетки оболочек мозга, клетки глии, периваскулярные клетки и клетки эпи/пери/эндоневрия (соединительные клетки), окружающего нервные волокна (Фигуры 70 и 71).

[0531] В печени у всех животных положительное окрашивание на идурсульфазу обнаруживалось в синусоидальных клетках (купферовских клетках и клетках эндотелия). Однако в гепатоцитах животных из группы, получавшей 3 мг препарата (Фигура 72), идурсульфаза не определялась, тогда как в группах, получавших более высокие дозы, положительное окрашивание на идурсульфазу в гепатоцитах обнаруживалось, и максимальная интенсивность окрашивания была у животных группы, получавшей 150 мг (Фигуры 73, 74 и 75).

[0532] В группе, получавшей 3 мг препарата, положительного окрашивания на идурсульфазу не было (Фигура 76). В отличие от этого в группах, получавших 30, 100 и 150 мг, клетки интерстиция демонстрировали положительное окрашивание на идурсульфазу, и выраженная окраска наблюдалась в группе, получавшей 150 мг - в том, что касается числа положительно-окрашенных клеток и интенсивности окрашивания (Фигуры 77, 78 и 79).

Почки

[0533] У животных из группы, получавшей 3 мг, идурсульфаза либо не определялась, либо определялись малые ее количества (Фигура 80). Однако в группах, получавших 30 и 100 мг, положительное окрашивание на идурсульфазу демонстрировали клетки клубочков и клетки интерстиция (Фигуры 81 и 82). В группе, получавшей 150 мг, помимо выраженного окрашивания клеток клубочков и клеток интерстиция, иммунное окрашивание на идурсульфазу выявило дополнительно окрашивание клеток проксимальных канальцев (Фигура 83).

ОБСУЖДЕНИЕ

[0534] Связанных с тестируемым веществом клинических признаков или влияния на массу тела, потребление пищи и показатели неврологического/физикального обследования не было.

В 1-й день животные из группы 4 (150 мг) проявляли минимальное подтягивание задних конечностей в первые 3-12 минут после введения, что продолжалось в течение 5-15 минут; указанный признак, как предполагается, был связан с тестируемым веществом. Введение идурсульфазы было ассоциировано с дозозависимым повышением активности идурсульфазы в разных областях головного мозга, а также в стволе головного мозга и спинном мозге. Максимальный уровень интенсивности окрашивания в спинном мозге наблюдался в поясничном отделе, где происходило ИТ введение идурсульфазы.

[0535] ИТ введение идурсульфазы приводило также к системному воздействию с дозозависимым увеличением интенсивности окраски в печени, почках и сердце. У животных, получавших дозы тестируемого вещества 30 мг и более, была тенденция к более выраженному эозинофильному компоненту в воспалительной реакции в оболочках мозга.

[0536] ИТ введение идурсульфазы в дозах до 150 мг с частотой раз в месяц не вызывало нежелательных эффектов. Таким образом, уровнем отсутствия наблюдаемых нежелательных эффектов (NOAEL) был признан уровень 150 мг - максимальная доза, тестируемая в данном примере. Введение идурсульфазы было связано с дозозависимым повышением активности идурсульфазы в ЦНС и развивающимся как следствие повышением уровня в печени, почках и сердце.

ПРИМЕР 8: ФК (в сыворотке и СМЖ) I2S, доставляемой интратекально

[0537] В настоящем примере описан анализ сыворотки и спинномозговой жидкости (СМЖ), проводимый в рамках 6-месячного исследования токсичности идурсульфазы, вводимой раз в месяц в форме болюсной интратекальной инъекции в поясничный отдел и раз в неделю в форме болюсной внутривенной инъекции длиннохвостым макакам, с целью определения концентрации тестируемого вещества (ТВ).

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

[0538] Цель настоящего исследования состояла в оценке многократного интратекального (ИТ) введения идурсульфазы (I2S) в течение шести месяцев с точки зрения токсикологии и фармакологической безопасности. Схема эксперимента показана в Таблице 22.

Таблица 22
Схема эксперимента
№ группы	Количество животных	ВВ доза (мг/кг)	Количество ВВ доз	ИТ доза (мг/кг)	Количество ИТВ доз
1	6	DC (физиологический раствор)	23	DC (ФБР)	6
2	12	0(ВВ основа)	23	0 (ИТ основа)	6
3	12	0,5	23	3	6
4	6	0,5	23	30	6
5	12	0,5	23	100	6
DC = контроль устройства: животные в группе 1 не получали ни основы, ни тестируемого вещества.

Тестируемое вещество

Идентификация: Идурсульфаза для ВВ введения № серии FDC06-001 (2,0 мг/мл)

ИТ введение - идурсульфаза (0 мг/мл)

идурсульфаза (3 мг/мл)

идурсульфаза (30 мг/мл)

идурсульфаза (100 мг/мл)

Способы количественного определения:

[0539] Анализы с целью определения концентрации идурсульфазы проводили методом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). До умножения на коэффициент разведения Предел определения (ПО)=1,25 нг/мл. Скрининг проб проводили при разведении 1:50, следовательно, чувствительность анализа составила 62,5 нг/мл. Пробы, выходящие за пределы калибровки, также разводили и тестировали повторно при соответствующем разведении, которое давало значение в пределах калибровочной кривой. Выбранные пробы анализировали дополнительно путем определения активности ферментов. ПО для указанного определения составляет 0,18 мЕ/мл при минимальном разведении пробы 1:150.

[0540] У всех животных из групп 1 и 2, которые получали физиологический раствор или основу, соответственно, уровень идурсульфазы в крови был в диапазоне от 138 нг/мл и <62,5 нг/мл (или<ПО) на протяжении всего ВВ и Ит введения. Из 200 протестированных проб СМЖ, отобранных у животных из групп 1 и 2, в 62 был продемонстрирован уровень I2S выше ПО определения. Из них 7 значений были высокими (>1000 нг/мл). В еще одной пробе, отобранной перед 3-ей ИТ дозой, уровень I2S был выше 1000 нг/мл. Затем пробы тестировали на активность идурсульфазы. В каждом случае результаты определения активности указывали на наличие I2S, и когда рассчитали приблизительную концентрацию I2S на основании уровней активности, результаты были в пределах 20% разброса относительно полученных с использованием ELISA с антигеном (см. Таблицу 23). Также посредством определения активности фермента тестировали дополнительные выбранные случайным образом пробы СМЖ с результатами ELISA с антигеном ниже ПО, чтобы исключить любую неспецифическую активность.

Таблица 23
Результаты исследования проб СМЖ
Номер животного	группа	Доза	Количество доз	Путь введения	Момент времени	Результаты ELISA (мг/мл)	Результаты определения активности (мЕ/мл)	Расчетные нг/мл на основании активности	Расчетный % от измеренного
003	1	Физ. раствор	5	ИТ	Перед введением	1392	4,7	1173	119%
003	1	Физ. раствор	6	ИТ	Перед введением	7322	29,9	7469	96%
004	1	Физ. раствор	2	ИТ	Через 2 ч	17045	62,1	15527	110%
006	1	Физ. раствор	6	ИТ	Через 4 ч	16435	70,7	17682	93%
006	1	Физ. раствор	1	ИТ	Перед введением	1320	5,3	1319	100%
0016	2	Основа	1	ИТ	Через 2 ч	3070	11	2743	112%
017А	2	Основа	mo. 3	ВВ	Через 4 ч	2236	8,8	2194	102%
046	5	100 мг/кг	3	ИТ	Перед введением	2086	7	1750	119%

[0541] В указанном исследовании пробы сыворотки и СМЖ анализировали с целью определения концентрации идурсульфазы. Пробы сыворотки отбирали по следующему графику:

ВВ дозы: перед введением препарата и через 2 часа после введения дозы 1-10, перед введением препарата и через 4 часа после введения дозы 11-23, и при вскрытии.

ИТ дозы: перед введением препарата и через 2 часа после введения дозы 1 и 2, перед введением препарата и через 4 часа после введения дозы 3-6, и при вскрытии.

Пробы СМЖ отбирали по следующему графику:

ВВ дозы: перед введением препарата и через 2 часа после введения дозы 1, и через 4 часа после введения дозы 3 и 6.

ИТ дозы: перед введением препарата и через 2 часа после введения дозы 1 и 2, перед введением препарата и через 4 часа после введения дозы 3-6, и при вскрытии.

[0542] В целом представляется, что из сыворотки идурсульфаза выводится быстрее, чем из СМЖ. Уровень идурсульфазы у животных из групп 1 и 2, которые получали физиологический раствор или основу, соответственно, во все тестируемые моменты времени был ниже либо равен 138 нг/мл. У некоторых животных указанный уровень был ниже предела определения (ПО).

[0543] Меньшее число проб СМЖ от животных из групп 1 и 2 демонстрировали значения выше ПО определения, 7 проб составили заметное исключение - уровень в них был высоким (>1000 нг/мл). В одной из проб, отобранных у одного животного перед ИТ введением дозы 3, уровень идурсульфазы также был выше 1000 нг/мл.

[0544] Пробы, продемонстрировавшие такие не соответствующие общей тенденции результаты, подвергли повторному анализу и подтвердили результат. Кроме того, в указанных пробах проводили анализ активности фермента идурсульфазы. Результаты измерения активности также подтвердили высокий уровень идурсульфазы с отклонением не более 20% от результата, полученного способом определения массы идурсульфазы (Таблица 23).

[0545] Специфичность определения активности верифицировали в данной когорте проб путем случайного тестирования проб СМЖ с результатами определения массы идурсульфазы ниже ПО, и подтвердили, что уровень идурсульфазы в указанных пробах действительно был ниже ПО (данные не показаны).

ПРИМЕР 9: БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЕ I2S ПОСЛЕ ИТ ДОСТАВКИ

[0546] После успешной демонстрации того, что интратекальное введение является эффективным путем доставки I2S к тканям ЦНС были проведены дополнительные исследования с целью определения, способна ли вводимая ИТ I2S распределяться в глубокие ткани головного мозга, и какова клеточная локализация введенной ИТ I2S. Лекарственную форму рекомбинантной идуронат-2-сульфатазы (I2S) человека готовили и разводили в основе из 154 мМ NaCl, 0,005% полисорбата 20 при pH 6,0.

[0547] Дозы 3 мг, 30 мг или 100 мг I2S вводили приматам, отличным от человека, раз в месяц через имплантируемый интратекальный порт в течение шести месяцев подряд. Схема исследования в общем виде представлена в Таблице 24 ниже.

Таблица 24
группа	n	ВВ доза (мг/кг)a	ИТ доза (мг)a	Последний день исследования (количество животных)
6 месяцев	Восстановление
1	6	ОС(ФР)	DC (ФБР)	6	-
2	12	0 (основа)	0 (ИТ основа)	6	6
3	12	0.5	3	6	6
4	6	0.5	30	6	-
5	12	0.5	100	6	6
aИдурсульфаза, если не указано другое. DC (контроль устройства); ИТ (интратекально); ВВ (внутривенно); ФР (физиологический раствор); ФБР (фосфатно-солевой буфер, pH 7,2).

[0548] Многократное введение I2S приматам, отличным от человека, раз в месяц в течение 6 месяцев хорошо переносилось при максимальной из тестируемых доз, и с ним не было связано никаких значимых нежелательных токсических явлений. Через двадцать два часа после введения шестой и последней дозы I2S испытуемых низших приматов умерщвляли и отбирали ткани ЦНС, которые в дальнейшем исследовали.

[0549] Как было определено иммуногистохимическим (ИГХ) методом, имело место обширное внутриклеточное отложение I2S во всех клетках и тканях ЦНС. Белок I2S определялся во всех тканях головного мозга ИГХ методом, и имел место градиент отложения от коры больших полушарий до белого вещества желудочков. В сером веществе I2S определялась в нейронах больших полушарий, мозжечка, ствола мозга и спинного мозга у всех групп с зависимостью от дозы. В поверхностном сером веществе групп, получавших более высокие дозы, большое число нейронов в поверхностной коре демонстрировали положительное окрашивание на I2S (Фигура 84А). Также I2S определялась в нейронах таламуса (Фигура 84 В), гипокампа (Фигура 84С), хвостатого ядра (Фигура 84D) и спинного мозга (Фигура 84Е). Клетки оболочек мозга и периваскулярные клетки также демонстрировали положительное окрашивание на I2S (Фигура 84F).

[0550] Как показано на Фигуре 85 и Фигуре 86, явно присутствует распределение введенной ИТ I2S в тканях ЦНС и, в частности, отложение в сером веществе, таламусе, коре больших полушарий испытуемых низших приматов. Кроме того, Фигура 86 и Фигура 87 иллюстрируют, что введенная ИТ I2S дозозависимо накапливается в обозначенных тканях ЦНС испытуемых низших приматов. Окрашивание на совместную локализацию также выявило, что ИТ введение I2S ассоциировано с нейронами и олигодендроцитами. Также введенная ИТ I2S распределяется и локализуется по всему мозжечку испытуемых низших приматов, что подтверждается на Фигуре 88. В частности, Фигуры 89A-D иллюстрируют захват I2S нейронами и ее ассоциацию с аксонами после ИТ введения испытуемым приматам, отличным от человека,, на что указывает окрашивание филаментов. Также особый интерес представляет то, что настоящее исследование иллюстрирует, что I2S селективна в отношении нейронов, и такие нейроны облегчают распределение введенной интратекально I2S в глубокие ткани головного мозга и, по-видимому, ассоциирована с аксональными структурами, что указывает на антероградный аксональный транспортI2S.

[0551] В Таблице 25 ниже представлены фармакокинетические данные для разных путей введения и доз в отдельном исследовании на животных.

Таблица 25
Доза	AUClast	Масса тела	Масса головного мозга	Доза
единицы	ч*нг/мл	кг	кг	мг/кг МТ	мг/кг МГМ
0.5 мг/кг	8331	2,7	0,1	0,5	5
1 мг, ИТ	1933	3,1	0,1	0,32	10
10 мг, ИТ	31316	2,7	0,1	3,66	100
30 мг, ИТ	140345	2,9	0,1	10,34	300

[0552] ¹²⁴I-меченую I2S вводили тестируемым животным, как указано в Таблице 26 ниже, а результаты ПЭТ-сканирования представлены на Фигуре 106.

Таблица 26
группа	животных/ группу	Путь введения	Тестируемое вещество	Доза
1	1	ИЦВ	[124I]-идурсульфаза	3 мг
2	4	ИТ-П	[124I]-идурсульфаза	3 мг
3	4	ВВ	[124I]-идурсульфаза	0,1 мг/кг
4	4	ВВ	[124I]-идурсульфаза	1мг/кг

[0553] Также настоящие исследования продемонстрировали идентификацию введенной ИТ I2S в клетках ткани белого вещества головного мозга вблизи желудочков испытуемых низших приматов после ИТ введения. Хотя плотность окрашивания на I2S в белом веществе была в целом ниже, чем в сером вещества, I2S определялась в олигодендроцитах (Фигура 90). В частности Фигура 90 иллюстрирует идентификацию введенной ИТ I2S в клетках ткани белого вещества головного мозга, а также демонстрирует, что I2S, по-видимому, не ассоциирована с миелином.

[0554] Помимо того, что было продемонстрировано распределение введенной ИТ I2S в глубоких тканях головного мозга, настоящие исследования также подтвердили локализацию I2S в целевых органеллах и, что важно, локализацию I2S в лизосомах, т.е. органеллах, которые поражаются при лизосомальной болезни накопления, такой как синдром Хантера. В частности I2S была локализована в лизосомах, а также определялась в аксонах. Фигура 90 иллюстрирует локализацию введенной ИТ I2S в лизосомах олигодендроцитов испытуемых низших приматов, что подтверждает, что введенная ИТ I2S может распределяться в глубокие ткани головного мозга и способна к клеточной локализации.

[0555] Чтобы определить, сохраняет ли доставленная I2S биологическую активность, уровень I2S в головном мозге измеряли путем определения удельной активности. Активность в головном мозге у группы, получавшей ИТ 3 мг, через 24 часа после введения последней дозы явно не отличалась от фонового уровня в у животных из группы контроля устройства и из группы, получавшей только основу. Активность фермента в головном мозге животных, получавших ИТ 30 мг и 100 мг, был выше фонового уровня на момент вскрытия (через 24 часа после введения). Дополнительное тестирование, проводимое для определения локализации доставки I2S в головном мозге, представлено на Фигуре 104 и в Таблице 27 ниже.

Таблица 27
Локализация проб
Номер пробы	Структура	Количество препаратов	Номер пробы	Структура	Количество препаратов
1	Кора больших полушарий-поверхностный (L)	4	14	Таламус (L)	8
2	Кора больших полушарий-поверхностный (R)	4	15	Таламус(R)	8
3	Хвостатое ядро (R)	6	16	Гипоталамус (L)	8
4	Хвостатое ядро (L)	6	17	Гипоталамус (R)	8
5	Corpus callosum	6	18	Гиппокамп (L)	8
6	Кора больших полушарий (лобная)-поверхностный (L)	8	19	Гиппокамп (R)	8
7	Кора больших полушарий (лобная) -поверхностный (R)	8	20	Белое вещество-глубокий (L)	10
8	Белое вещество-поверхностный (L)	8	21	Белое вещество-поверхностный (R)	10
9	Белое вещество-поверхностный (R)	8	22	Мозолистое тело	10
10	Белое вещество-глубокий (L)	8	23	Белое вещество-глубокий (L)	12
11	Белое вещество-глубокий (R)	8	24	Белое вещество-глубокий (R)	12
12	Кора больших полушарий (височная)-поверхностный (L)	8	25	Мозжечок (R)	14
13	Кора больших полушарий (височная)-поверхностный (R)	8

ПРИМЕР 10: БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕ ИТ ДОСТАВКИ У СОБАК ПОРОДЫ БИГЛЬ

[0556] Характер распределения I2S, наблюдаемый в вышеизложенном примере, также подтвердился у здоровых собак породы бигль, получавших однократные дозы ИТ или ИЦВ путем. Самцов собак породы бигль случайным образом распределяли в две группы с использованием генерируемых компьютером чисел (группа 1 ИЦВ), N=3; группа 2 (ИТ); N=4). Всем животным вживляли катетеры в субарахноидальное пространство в поясничном отделе позвоночника или в левый боковой желудочек головного мозга (для введения препарата) и в мостомозжечковую цистерну (для отбора проб). Все катетеры заканчивались в подкожном титановом порте доступа. Для контроля хирургического вмешательства без введения препарата служила еще одна собака.

[0557] Однократную болюсную инъекцию 1 мл I2S (30 мг/мл в 20 мМ фосфата натрия, pH 6,0; 137 мМ хлорида натрия; 0,02% полисорбата-20) производили ИТ или ИЦВ, после чего промывали катетер 0,3 мл фосфатно-солевого буфера (ФБР pH 7,2). Проводили наблюдение за клиническими признаками и производили умерщвление через 24 часа после введения препарата. Отбирали пробы ткани из головного и спинного мозга для количественного определения I2S, который проводили посредством ELISA, оценки активности фермента I2S и ИГХ, и сравнивали результаты для разных групп исследования.

[0558] I2S демонстрировала широкое распределение в сером веществе в группах с ИТ и ИЦВ введением, что определили посредством ИГХ. В коре больших полушарий нейроны демонстрировали положительную окраску на I2S во всех шести слоях нейронов, от поверхностного молекулярного слоя до глубокого внутреннего слоя в группах с ИТ и ИЦВ введением, что проиллюстрировано на Фигуре 91 (изображения а и с). В коре больших полушарий в группах с ИТ и ИЦВ введением I2S определялась в нейронах, включая клетки Пуркинье, что проиллюстрировано на Фигуре 91 (изображения с и d). В группах, получавших препарат как ИТ, так и ИЦВ, большая популяция нейронов в гиппокампе демонстрировала положительную окраску на I2S, что проиллюстрировано на Фигуре 91 (изображения е и f). I2S-положительные нейроны также обнаруживались в таламусе и хвостатом ядре обеих групп, что проиллюстрировано на Фигуре 91 (изображения g и h).

[0559] Таким образом настоящие исследования подтверждают, что ферменты, доставляемые ИТ, способны распределяться в глубокие слои клеток и тканей головного мозга, а также подтверждают применимость доставляемых ИТ ферментов, таких как I2S, для лечения проявлений лизосомных болезней накопления со стороны ЦНС, таких как синдром Хантера.

ПРИМЕР 11: ЭФФЕКТИВНОСТЬ I2S IN VIVO ПРИ ИТ ДОСТАВКЕ

Модель мышей с недостаточностью идуронат-2-сульфатазы

[0560] После демонстрации того, что вводимая ИТ I2S способна распределяться в в глубокие ткани головного мозга, и что возможна клеточная локализация I2S, были проведены дополнительные исследования, чтобы определить терапевтическую эффективность вводимой ИТ I2S. Для изучения способности вводимой ИТ I2S модифицировать прогрессирование заболевания была создана модель синдрома Хантера на мышах с нокаутом по идуронат-2-сульфатазе (IKO), созданным способами генной инженерии. Модель мышей с нокаутом по I2S разрабатывали с использованием направленного разрушения локуса I2S, которое приводило к накоплению гликозаминогликанов (ГАГ) в тканях и органах. Модель мышей IKO проявляет многие из физических особенностей синдрома Хантера, наблюдаемых у людей, включая характерные грубые черты лица и дефекты скелета. Кроме того, модель мышей IKO демонстрирует повышенный уровень гликозаминогликанов (ГАГ) в моче и тканях во всех организме, а также масштабную вакуолизацию в клетках, которая выявляется гистопатологически.

[0561] В настоящем исследовании коммерческую I2S (Элапраза®) концентрировали и повторно суспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФБР). I2S (10 мкл; 26 мг/мл) вводили шести группам самцов мышей IKO в возрасте 8-12 недель. Группам А и В (N=3) интратекально вводили три дозы 260 мкг I2S (в дни 1, 8 и 15) и две дозы 260 мкг I2S (в дни 1 и 8) соответственно. Группе D также интратекально вводили три дозы 260 мкг в дни 1, 8 и 15. Группы С и Е (N=3) служили контролем без введения препарата, а группа F (N=3) служила контролем дикого типа без введения препарата. Контрольным мышам вводили основу без I2S. Мышей умерщвляли через 1 час после последней инъекции, после чего готовили ткани для иммуногистохимического (ИГХ) исследования и гистопатологического анализа.

[0562] После третьей инъекции у мышей, получавших I2S, происходило обширное снижение вакуолизации клеток в поверхностном слое коры больших полушарий, хвостатом ядре, таламусе и мозжечке, по сравнению с мышами, получавшими только основу. После ИТ введения снижение вакуолизации также наблюдалось в белом веществе. Распределение I2S в ткани головного мозга мышей IKO было явным после ИТ введения.

[0563] У мышей IKO, получавших три дозы I2S ИТ путем, значимое снижение вакуолизации в клетках ЦНС также было продемонстрировано как методом световой, так и электронной микроскопии. После ИТ введения I2S значимое снижение вакуолизации в клетках было явным по сравнению с мышами IKO, не получавшими лечения, что указывает на то, что ИТ вводимая I2S способна модифицировать прогрессирование заболевания. Как проиллюстрировано на Фигуре 92, в мозолистом теле и своде головного мозга мышей IKO после ИТ введения I2S имело место явное снижение вакуолизации клеток.

[0564] Кроме того, электронная микроскопия продемонстрировала уменьшение присутствующих включений накопления в нейронах серого вещества и вакуолизации в олигодендроцитах белого вещества. В частности, мыши IKO после ИТ введения I2S демонстрировали уменьшение числа окруженных стенкой пластинчатых телец («зебровидных» телец), которые характерны для некоторых лизосомных болезней накопления. В частности, на Фигуре 57 представлена электронограмма, иллюстрирующая снижение числа характерных зебровидных телец в нейронах мышей ГКО, которым вводили I2S по сравнению с мышами IKO, не получавшими лечение. Аналогично на Фигуре 57 представлена электронограмма олигодендроцитов в мозолистом теле.

[0565] Кроме того, ИТ введение I2S мышам IKO также продемонстрировало выраженное снижение иммунного окрашивания на патологический биомаркер лизосомных болезней - ассоциированный с лизосомами мембранный белок-1 (LAMP1) - показатель активности лизосом и статуса заболевания, в поверхностном слое коры больших полушарий, хвостатом ядре, таламусе, мозжечке и белом веществе. Как проиллюстрировано на Фигуре 93А, значимое снижение иммунного окрашивания на LAMP1 очевидно в ткани на поверхности коры больших полушарий мышей IKO, получавших лечение, по сравнению с поверхностью коры больших полушарий контрольных мышей IKO, которая представлена на Фигуре 93 В. Это отражает улучшение гистопатологических признаков заболевания.

[0566] На Фигуре 56 даны количественные характеристики и сравнение концентрации LAMP1, измеренной в мкм² площади ткани головного мозга. Морфометрический анализ иммунного окрашивания на LAMP1 разных отделов мозга подтвердил, что имеет место значимое снижение положительного окрашивания на LAMP-1 во всех оцениваемых областях головного мозга. Как показано на Фигуре 56, в ткани каждой оцениваемой области головного мозга (кора, хвостатое ядро и скорлупе (СР), таламусе (ТН), мозжечке (CBL) и белом веществе (WM)) у мышей IKO, получавших препарат, площадь LAMP-положительного окрашивания уменьшалась по сравнению с контрольными IKO мышами, не получавшими препарат, и приближалась к площади LAMP-положительного окрашивания у мышей дикого типа. Особенно примечательно, что площадь LAMP-положительного окрашивания в каждой анализируемой области головного мозга далее снижалась при увеличении продолжительности лечения.

[0567] Снижение аномально высокой активности лизосом коррелирует с существенным улучшением морфологических показателей во всех областях головного мозга. Указанные результаты подтверждают, что вводимая ИТ I2S способна модифицировать прогрессирование лизосомных болезней накопления в модели мышей IKO, полученных способами генной инженерии, а также дают дополнительное подтверждение способности вводимого ИТ фермента, такого как I2S, бороться с проявлениями лизосомных болезней накопления со стороны ЦНС, таких как синдром Хантера.

ПРИМЕР 12: ЛЕЧЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ С СИНДРОМОМ ХАНТЕРА

[0568] Для эффективного лечения пациентов с синдромом Хантера можно применять введение лекарственных препаратов непосредственно в ЦНС, например, ИТ доставку. Настоящий пример иллюстрирует многоцентровое исследование с увеличением дозы, направленное на оценку безопасности 3 уровней доз I2S, вводимых раз в две недели (р/2 нед) в течение 40 недель через устройство интратекальной доставки лекарственных препаратов (IDDD) пациентам с инфантильной формой болезни Хантера. Разные варианты устройств интратекальной доставки лекарственных препаратов, применимых для лечения людей, показаны на Фигурах 89-92.

[0569] Всего в исследование было включено до 20 пациентов:

Когорта 1: 5 пациентов (Минимальная доза)

Когорта 2: 5 пациентов (Средняя доза)

Когорта 3: 5 пациентов (Максимальная доза)

5 пациентов были рандомизированы в группу, не получающую препарат.

[0570] Для участия в исследовании пациентов отбирали на основании следующих критериев включения: (1) наличие первых симптомов до наступления возраста 30 месяцев; (2) ходячее состояние на момент скрининга (определяется как способность самостоятельно вставать и проходить вперед 10 шагов (при поддержке за одну руку); (3) наличие неврологических признаков в момент скрининга. Обычно включают пациентов с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток в анамнезе.

[0571] Определяли безопасность увеличивающихся доз I2S, вводимой путем ИТ инъекций, в течение 40 недель детям с поздним началом инфантильной формы болезни Хантера. Кроме того, оценивали клиническую активность I2S в отношении общей моторики, а также фармакокинетику препарата в сыворотке и концентрации в спинномозговой жидкости (СМЖ).

ИТ доставка белка rhASA

ПРИМЕР 13: ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДОСТАВЛЯЕМОЙ ИТ РЕКОМБИНАНТНОЙ ASA

[0572] Чтобы оценить способность других вводимых интратекально ферментов к распределению в клетки и ткани ЦНС, проводили исследование в соответствии с GLP (надлежащей лабораторной практикой), в котором оценивали многократное интратекальное (ИТ) введение рекомбинантной арилсульфатазы А человека (rhASA) с точки зрения токсикологии и фармакологической безопасности в течение одного месяца у молодых (моложе 12 месяцев) длиннохвостых макак. Лекарственную форму rhASA готовили и составляли с применением основы из 154 мМ NaCl, 0,005% полисорбата 20 при pH 6,0.

[0573] Для достижения цели исследования девять самцов и девять самок молодых длиннохвостых макак случайным образом распределяли в зависимости от массы тела в одну из трех групп, как указано в Таблице 28. Указанные животные (за исключением 1 самца в группе дозы 1) получали краткосрочную инфузию объемом 0,6 мл с 0, 3 или 31 мг/мл rhASA (суммарная доза 0, 1,8 или 18,6 мг) раз в две недели - всего три дозы на одно животное. Следили за массой тела, клиническими признаками, показателями неврологического и физикального обследования, данными лабораторной диагностики, данными офтальмологического обследования и токсикокинетическими пробами. Всех указанных животных подвергали вскрытию в День 29, 30 или 31 (~24 часа после последнего ИТ введения препарата). Выбранные ткани отбирали, сохраняли и подвергали микроскопическому исследованию.

Таблица 28
Группа	Количество животных	Номинальная концентрация в дозе (мг/мл)	Объем дозы (мл)	Вводимая доза (мг)
1	3М, 3Ж	0	0,6	0
2	3М, 3Ж	3	0,6	1,8
3	3М, 3Ж	31	0,6	18,6

[0574] Концентрации rhASA, определяемые в тканях ЦНС длиннохвостых макак, определяли посредством ELISA и сравнивали с терапевтическим целевым значением 10% от нормальной концентрации rhASA у человека, что соответствует приблизительно 2,5 нг/мг ткани. Пробы ткани или биопсические образцы извлекали из разных областей головного мозга длиннохвостых макак и далее анализировали на наличие rhASA. Фигуры 133-138 иллюстрируют ткани, из которых брали биопсию. Полученные при биопсии пробы ткани продемонстрировали увеличение концентрации rhASA, что отражено на Фигуре 139A-G, и был выявлен градиент отложения от коры больших полушарий до глубоких слоев белого вещества и глубоких слоев серого вещества.

[0575] Концентрации rhASA, определяемые с использованием одинаковой биопсии, как и при ИТ, так и при ИЦВ пути введения у 6 обезьян, получавших дозу rhASA 18,6 мг, проиллюстрированы на Фигуре 140А-В. Концентрации rhASA, определяемые в глубоких слоях белого вещества (Фигура 140А) и в глубоких слоях серого вещества (Фигура 140В) головного мозга взрослых и молодых длиннохвостых макак, получавших rhASA интратекально (ИТ) или интрацеребровентрикулярно (ИЦВ), были сопоставимы.

[0576] Затем полученные при биопсии пробы ткани головного мозга взрослых и молодых длиннохвостых макак анализировали с целью определения концентрации rhASA, отложившейся в извлеченной пробе ткани, и сравнивали полученные концентрации с терапевтической целевой концентрацией 2,5 нг rhASA на мг белка (соответствует 10% от нормальной концентрации rhASA у здорового человека).

Как проиллюстрировано на Фигуре 141А, в каждой анализируемой пробе ткани, полученной при биопсии, ИТ введение rhASA в дозе 18,6 мг приводило к концентрации rhASA, превосходившей целевую терапевтическую концентрацию 2,5 нг/мг белка. Аналогично, когда rhASA в дозе 1,8 мг ИТ вводили молодым длиннохвостым макакам, в каждой анализируемой пробе ткани, полученной при биопсии, концентрация rhASA была в пределах либо превышала целевую терапевтическую концентрацию 2,5 нг/мг белка, а медианы концентрации rhASA были выше терапевтического целевого уровня для тестируемых тканей, полученных при биопсии (Фигура 141В).

[0577] Чтобы определить, распределилась ли введенная ИТ rhASA в соответствующие клетки, анализировали ткань из глубоких слоев белого вещества яванской макаки, получавшей rhASA в дозе 1,8 мг ИТ, из области, показанной на Фигуре 142А. Иммунное окрашивание глубоких слоев белого вещества выявило распределение rhASA в олигодендроциты длиннохвостых макак, что иллюстрирует Фигура 142В. Аналогично, Фигура 142С иллюстрирует, что введенная ИТ rhASA демонстрирует совместную локализацию в глубоких слоях белого вещества длиннохвостых макак. В частности, при окрашивании явно видна совместная локализация с целевыми органеллами, такими как лизосома (Фигура 142С), что подтверждает вывод о том, что вводимая ИТ rhASA способна распределяться в соответствующие клетки, ткани и органеллы ЦНС, включая лизосомы олигодендроцитов.

ПРИМЕР 14: СРАВНЕНИЕ ИЦВ И ИТ ВВЕДЕНИЯ

[0578] rhASA, меченную излучателем позитронов - ¹²⁴I, готовили и составляли с применением основы из 154 мМ NaCl, 0,005% полисорбата 20 при pH 6,0. Взрослым длиннохвостым макакам интрацеребровентрикулярно (ИЦВ) и интратекально (IT) вводили объем лекарственной формы, эквивалентный 3 мг rhASA (соответствующий приблизительно 38 мг/кг головного мозга). Длиннохвостых макак подвергали позитронно-эмиссионной томографии с высоким разрешением (микроПЭТ Р4) с целью оценки распределения введенной ¹²⁴I-меченой rhASA.

[0579] Данные ПЭТ (Фигура 143) подтверждают, что вводимая ИТ ¹²⁴I-меченая rhASA эффективно распределялась в ткани ЦНС и, в частности, ¹²⁴I^-меченая rhASA, вводимая через ИТ-катетер в поясничном отделе незамедлительно и равномерно распространялась по спинномозговой жидкости (СМЖ) по всей длине позвоночника. В частности, как показано на Фигуре 143 после ИЦВ и ИТ введения в тканях ЦНС испытуемых длиннохвостых макак, включая головной мозг, спинной мозг и СМЖ, определялись терапевтические концентрации ¹²⁴I-меченой rhASA. Концентрации rhASA, определяемые в указанных тканях ЦНС, и в частности, в тканях головного мозга, превышали целевую терапевтическую концентрацию 2,5 нг/мг белка.

[0580] Хотя распределение белка rhASA было сопоставимым при ИТ и ИЦВ пути введения. ИЦВ путь введения приводил к значительно меньшему отложению в позвоночном столбе, что подтверждается Фигурой 143.

[0581] Через двадцать четыре часа после введения лекарственной формы вводимая как ИЦВ, так и ИТ ¹²⁴I^-меченая rhASA эффективно распределялась в ткани ЦНС. В частности, через двадцать четыре часа после ИТ введения 12,4% введенной дозы обнаруживалось в головном отделе, тогда как при ИЦВ введении в головном отделе обнаруживалось 16,7% от введенной дозы. Соответственно, концентрации rhASA определяемые в указанных тканях ЦНС, и в частности, в тканях головного мозга, в случае ИТ введения rhASA приближались к концентрациям, определяемым после ИЦВ введения такой же дозы.

[0582] ИЦВ инъекция ¹²⁴I-меченой rhASA приводит к незамедлительному переносу вводимого объема к мостомозжечковой цистерне, мостовой цистерне, межножковой цистерне и проксимальному отделу позвоночника, как проиллюстрировано на Фигуре 144. На Фигуре 144 также проиллюстрирован тот факт, что через 2-5 часов после ИТ введения ¹²⁴I-меченая rhASA доставляется к тем же начальным компартментам (цистернам и проксимальному отделу позвоночника), доставка к которым была показана и при ИЦВ введении. Через двадцать четыре часа после как ИЦВ, так и ИТ введения распределение ¹²⁴I-меченой rhASA в области цистерн и проксимального отдела позвоночника было сопоставимым, что проиллюстрировано на Фигуре 145.

[0583] Указанные результаты подтверждают, что rhASA можно доставлять в организм субъекта с применением менее инвазивного ИТ пути введения и при этом достигать терапевтических концентраций в клетках и тканях-мишенях.

[0584] Лизосомальные болезни накопления представляют собой семейство генетических нарушений, вызываемых отсутствием или дефектом ферментом, которые приводят к аномальному накоплению субстратов. Хотя периферические симптомы, связанные с некоторыми из указанных заболеваний, можно эффективно облегчать путем внутривенного введения рекомбинантных ферментов, нельзя ожидать, что внутривенное введение таких рекомбинантных ферментов значительно повлияет на проявления со стороны ЦНС, связанные с большинством лизосомных болезней накопления. Например, рекомбинантная идуронат-2-сульфатаза человека (идурсульфаза, Элапраза®; «Shire Human Genetic Therapies, Inc.» Лексингтон, Массачусетс) одобрена для лечения соматических симптомов синдрома Хантера, но не является средством медикаментозной терапии неврологических проявлений синдрома Хантера, которые включают задержку развития и прогрессирующее снижение умственной деятельности. Отчасти это связано с природой I2S, которая представляет собой крупный фермент с высокой степенью гликозилирования и с молекулярной массой приблизительно 76 кДа, который не проходит через гематоэнцефалический барьер после внутривенного введения.

[0585] Таким образом, авторы настоящего изобретения разработали программу для изучения интратекальной доставки лекарственных форм для интратекального введения рекомбинантных ферментов человека, например, таких как идуронат-2-сульфатаза (I2S), арилсульфатаза (rhASA) и альфа-N-ацетилгликозамидаза (Naglu). Результаты, представленные в настоящей заявке, обнародуются впервые, чтобы продемонстрировать, что ИТ введение рекомбинантных лизосомальных ферментов в поясничный отдел приводит к доставке существенной доли вводимого белка в головной мозг, и, в частности, приводит к масштабному отложению таких белков в нейронах головного мозга и спинного мозга как у длиннохвостых макак, так и у собак. Иммуногистохимический анализ тканей ЦНС продемонстрировал, что белки направляются в лизосомы, - участок патологического накопления гликозаминогликанов при лизосомальных болезнях накопления. Кроме того, морфологические улучшения, продемонстрированные в модели синдрома Хантера на мышах IKO, в модели болезни Санфилиппо типа В на Naglu-дефицитных мышах и в модели метахроматической лейкодистрофии (МЛД) на нокаутных мышах, подтверждают тот экспериментальный факт, что вводимый ИТ фермент распределяется в соответствующие ткани и транспортируется в соответствующие компартменты и органеллы клетки.

[0586] Сходства характера распределения, наблюдаемого после ИТ и ИЦВ введения I2S, позволяют предположить массовое передвижение и активное перемешивание СМЖ. Таким образом в клинических условиях и ИТ, и ИЦВ путь введения потенциально применимы, однако, наблюдаемое отложение I2S в спинном мозге после ИТ введения обеспечивает явное преимущество данного пути введения при борьбе со спинномозговыми последствиями и компонентами лизосомных болезней накопления, таких как синдром Хантера. Кроме того, порты для инъекций в спинной мозг менее инвазивны, и предполагается, что они больше подходят для длительного применения, особенно у педиатрических пациентов.

[0587] Данные, полученные при окрашивании периваскулярных клеток и при оценке динамики транслокации белков, наблюдаемые при вышеупомянутых ПЭТ исследованиях, указывают на то, что фермент движется по периваскулярному пространству, предположительно посредством конвекционных механизмов, сопровождающихся пульсацией. На основании наблюдаемой взаимосвязи I2S с нейрофиламентами можно предположить, что дополнительным механизмом транспорта является аксональный транспорт. Последний, предположительно, начинается с взаимодействия белка с нейрональными рецепторами манноза-6-фосфата (М6Р), которые повсеместно экспрессируются в клетках спинного и головного мозга и которые при прямом введении в паренхиму головного мозга могут приводить к тому, что фермент I2S будет легко всасываться в клетки-мишени. (Begley, et al., Curr Pharm Des (2008) 14: 1566-1580).

[0588] Хотя указания на аксональный транспорт лизосомальных ферментов ранее уже получали косвенными методами in vivo и путем визуализации in vitro, в настоящих исследованиях были получены первые прямые подтверждения аксонального транспорта невирусных или экспрессируемых ферментов, доставляемых через СМЖ. Таким образом, доставка белков из СМЖ к поверхности головного мозга из более глубоких тканей головного мозга, по-видимому, зависит от процессов активного переноса, ни один из которых ранее не был описан или объяснен для доставки белков или ферментов к клеткам, тканям и органеллам головного мозга.

[0589] В противоположность преобладающей точке зрения о том, что динамика потока в интерстиции паренхимы и СМЖ может препятствовать распределению вводимых интратекально в поясничный отдел белков в белое вещество головного мозга, настоящие исследования явно демонстрируют, что ИТ доставка лизосомальных ферментов приводит к распределению и накоплению белка во всех тканях головного мозга и к отложению их в лизосомальном компартменте клеток-мишеней, которые являются участком патологического накопления гликозаминогликанов. (См., например, Fenstermacher et al., Ann N Y Acad Sci (1988) 531: 29-39 and DiChiro et al., Neurology (1976) 26:1-8.) В совокупности с менее инвазивным характером ИТ-поясничной доставки данный путь введения обеспечивает клинически значимый способ доставки биопрепаратов к головному мозгу, в частности, у детей.

ПРИМЕР 15: ТОКСИКОЛОГИЯ

[0590] В данном примере проиллюстрировано многократное интратекальное (ИТ) введение rhASA в течение 6 месяцев с точки зрения токсикологии и фармакологической безопасности. В данном исследовании тестируемым веществом, вводимым ИТ, была rhASA. 36 самцов и 36 самок длиннохвостых макак случайным образом распределяли в пять лечебных групп. Животные группы 1 служили контролем вживления устройства (порт и катетер) без введения препарата, и им не вводили ни основу, ни тестируемое вещество, указанным животным вводили 0,6 мл ФБР по графику, соответствующему графику введения тестируемого вещества. Животным групп 2-5 производили ИТ инфузии 0,6 мл раствора с 0, 3, 10 или 31 мг/мл rhASA (суммарная доза 0, 1,8, 6,0 или 18,6 мг) раз в две недели (т.е. всего 12 доз). Животных подвергали вскрытию через 6 месяцев (через 24 часа после последнего ИТ введения препарата), а оставшихся 4 животных/пол/группу подвергали вскрытию в конце 4-недельного периода восстановления. Выбранные ткани отбирали, сохраняли и подвергали микроскопическому исследованию.

[0591] В целом, вызываемые тестируемым веществом изменения можно было отнести к двум основным типам, и возникали они при всех уровнях доз (1,8, 6,0 или 18,6 мг/дозу). Увеличение инфильтратов (лейкоцитов, обычно с выраженным эозинофильным компонентом) в оболочках мозга, паренхиме головного мозга, паренхиме спинного мозга, тройничном узле и редко в корешках спинномозговых нервов/спинальных ганглиях (или эпиневрии, окружающем указанные структуры). Указанное увеличение интерпретировали как связанное с наличием тестируемого вещества (белка) в интратекальном пространстве и в тканях нервной системы. Легкое, очаговое увеличение числа клеток микроглии в спинном и головном мозге у некоторых животных (микроглиоз не наблюдался ни у одного животного, получавшего высокую дозу). Обе категории морфологических изменений интерпретировали как реакцию на наличие тестируемого вещества. Ни у одного животного не было признаков некроза нейронов. Никакие связанные с тестируемым веществом изменения не были связаны с какими-либо биологически значимыми нежелательными реакциями в головном и спинном мозге, корешках спинномозговых нервов или ганглиях. Более конкретно, не было выявлено никаких признаков некроза нейронов или биологически значимой реакции со стороны глии. В тканях вне нервной системы никаких связанных с тестируемым веществом поражений не было.

[0592] После месячного периода восстановления (период без введения препарата) вызываемые тестируемым веществом изменения либо полностью разрешались, либо сводились к остаточному увеличению воспалительной реакции, связанному с наличием тестируемого вещества. У животных, прошедших период восстановления, никаких нежелательных морфологических эффектов не было. По данным слепого микроскопического исследования, в котором полуколичественно оценивали степень окрашивания, иммуногистохимическое окрашивание на арилсульфатазу А (rhASA; тестируемое вещество) при конечном вскрытии увеличивалось в головном и спинном мозге в клетках разных типов, за исключением нейронов, во всех группах, получавших тестируемое вещество. Указанное увеличение также было явным в купферовских клетках печени. После месячного периода восстановления окрашивание на rhASA у животных, получавших тестируемое вещество (группы всех доз), возвращалось к контрольному уровню (контроль введения устройства/контроль с введением основы). У одного самца из группы, получавшей низкую дозу, обнаруживались множественные очаги астроцитоза и потери нейронов, что указывает на множественные области предшествующей ишемии, в коре больших полушарий. Хотя точный патогенез указанных поражений у данного животного не ясен, отсутствие аналогичных поражений у каких-либо других животных, получавших тестируемое вещество, включая тех животных, которые получали в 10 раз более высокую дозу, говорит о том, что указанные поражения не были связаны с тестируемым веществом.

[0593] В данном исследовании вводимым ИТ тестируемым веществом была rhASA. 36 самцов и 36 самок длиннохвостых макак случайным образом распределяли в пять лечебных групп. Животные группы 1 служили контролем вживления устройства (порт и катетер) без введения препарата, и им не вводили ни основу, ни тестируемое вещество; однако указанным животным вводили 0,6 мл ФБР по графику, соответствующему графику введения тестируемого вещества. Животным групп 2-5 производили ИТ инфузии 0,6 мл раствора с 0, 3, 10 или 31 мг/мл rhASA (суммарная доза 0, 1,8, 6,0 или 18,6 мг) раз в две недели (т.е. всего 12 доз). Животных подвергали вскрытию через 6 месяцев (через 24 часа после последнего ИТ введения препарата), а оставшихся 4 животных/пол/группу подвергали вскрытию в конце 4-недельного периода восстановления. Выбранные ткани отбирали, сохраняли и подвергали микроскопическому исследованию. В нижеследующей таблице представлена схема эксперимента, поскольку она имеет отношение к патологическому аспекту настоящего исследования.

[0594] Во время вскрытия освобождали матрикс головного мозга, срезая фронтальный срез толщиной приблизительно 3 мм. Первый срез и далее каждый последующий срез фиксировали в формалине для гистопатологической оценки и иммуногистохимического анализа. С головным мозгом работали в форме полных фронтальных срезов. Указанные срезы включали по меньшей мере следующие отделы головного мозга.

- Срезы новой коры головного мозга (включая лобные, теменные, височные и затылочные доли): от 1 до 8 (и срез 9, если присутствовал)

- Срезы древней коры головного мозга (обонятельные луковицы и/или грушевидная доля): от 1 до 3

- Срезы базальных ганглиев головного мозга (включая хвостатое ядро и скорлупу): от 1 до 3

- Срезы лимбической системы головного мозга (включая гиппокамп и поясные извилины): 4 и 5

- Срезы таламуса/гипоталамуса и областей среднего мозга головного мозга: 4 и 5

- Срезы мозжечка, моста и продолговатого мозга головного мозга: от 6 до 8 (и срез 9, если присутствовал)

[0595] Срезы головного мозга перечислены в таблице данных под номерами 1-8/9 (срез 9 предоставлялся тестирующей лабораторией для некоторых животных). Получение срезов несколько различалось у разных животных. Срезы головного мозга (1-8/9), указанные выше, имели приблизительное расположение в разных анатомических областях. Срезы головного мозга перечислены в таблице данных как отдельные срезы, с указанием диагноза, относящегося к данному срезу, чтобы облегчить возможный дальнейший анализ срезов (если таковой будет проводиться). Во время интерпретации данных индивидуальные анатомические участки головного мозга (перечисленные выше) сравнивали, чтобы идентифицировать уникальные эффекты тестируемого вещества (то есть уникальные для конкретного отдела головного мозга). Для исследования токсичности все срезы головного мозга от всех животных заключали в парафин, нарезали с шагом 5 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином (Г и Э) и проводили микроскопическое исследование. Кроме того, головной мозг контрольных животных и животных из группы, получавшей высокую дозу, окрашивали Fluoro-Jade В (краситель, повышающий чувствительность оценки на дегенерацию нейронов в головного мозге) и серебряным красителем Бильшовского (способ, который позволяет прямо визуализировать аксоны, дендриты и филаменты нейронов) и проводили оценку.

[0596] Из спинного мозга (шейный, грудной и поясничный отделы) изготавливали срезы толщиной один сантиметр. Первый срез и каждый последующий срез фиксировали в формалине для гистопатологической оценки и иммуногистохимического анализа. Срезы спинного мозга (шейный, грудной (включая кончик катетера) и поясничный отдел) у всех животных разрезали с шагом приблизительно 5 микрон, окрашивали Г и Э и исследовали поперечный и косой срез, полученный на каждом уровне. Серии срезов спинного мозга от контрольных животных и животных, получавших высокие дозы, дополнительно окрашивали серебряным красителем Бильшовского (иммуногистохимический краситель, который позволяет прямо визуализировать звездчатые клетки и их отростки).

[0597] Задние корешки спинномозговых нервов и ганглии (взятые из середины шейного, середины грудного и середины поясничного отдела) заключали в парафин, и серии срезов окрашивали Г и Э. Кроме того, серии срезов, полученных от контрольных животных и животных, получавших высокие дозы, окрашивали серебряным красителем Бильшовского.

[0598] Для срезов седалищного, большеберцового и икроножного нерва, полученных от всех животных: продольный срез каждого нерва заключали в парафин, получали срезы с приблизительным шагом 5 микрон и окрашивали Г и Э. Поперечный срез каждого нерва впоследствии фиксировали в осмии, заключали в смолу Спурра, получали срезы с приблизительным шагом 1-2 микрона и окрашивали толлуидиновым синим. Последующая фиксация в осмии и заключение в смолу обеспечивает более надежное сохранение миелина в периферических нервах, а, значит, возможно более подробное исследование нерва.

[0599] Все отобранные ткани и очаги макроскопических поражений, отобранные при вскрытии у всех животных, также заключали в парафин, окрашивали Г и Э, и подвергали микроскопическому исследованию. Гистопатологическая обработка и оценка, а также иммуногистохимический анализ проводили посредством TPS.

Методы: Окрашивание на арилсульфатазу A (rhASA)

[0600] Срезы для положительного контроля предоставлял спонсор. Указанные срезы представляли собой срезы печени мышей, которым вводили rhASA. На срезах для положительного контроля были получены достаточные подтверждения того, что rhASA присутствует в купферовских клетках (синусоидальных макрофагах) в печени. Срезы для положительного контроля хранили с другими срезами, полученными в ходе данного исследования. Все виды оценки окрашенных на rhASA срезов сначала проводили слепым способом в отношении лечебной группы, к которой принадлежало животное. Это достигалось благодаря тому, что патоморфолог сначала регистрировал показатели окрашивания на rhASA на срезах, и при этом маркировка с указанием номера животного была от него скрыта (с использованием ассистента, который знал, срез какого животного анализируется), диктовал балл (степень тяжести) во время оценки, а тот же ассистент сразу же записывал балл окрашивания (степень тяжести) в таблицы данных. Чтобы гарантировать точность ввода данных, затем идентификационный номер животного сверяли невропатолог исследования и указанный ассистент. Данную процедуру проводили так, чтобы не вносить никакой необъективности в оценку общей интенсивности окрашивания иммуногистохимическим красителем при определении внутриклеточной rhASA. Во всех срезах головного и спинного мозга оценивали относительную степень окрашивания нейронов, оболочечных макрофагов, периваскулярных макрофагов и клеток глии (астроцитов и клеток микроглии, но, вероятно, преимущественно клеток микроглии). Средние баллы тяжести на каждом уровне головного и спинного мозга для каждой группы суммировали (по группам) и регистрировали в виде суммы в графе тканей головного мозга, общее окрашивание на rhASA, и в графе спинного мозга, общее окрашивание на rhASA.

[0601] В целом, окрашивание на rhASA в нейронах головного мозга служило показателем в отношении нейронов коры больших полушарий и других ядер в головном мозге. Окрашивание на rhASA в оболочечных макрофагах указывало на захват тестируемого вещества оболочечными макрофагами и/или на эндогенную rhASA в оболочечных макрофагах. Окрашивание на rhASA периваскулярных макрофагов служило показателем захвата rhASA макрофагами в головном/спинном мозге (или эндогенной rhASA), хотя следует отметить, что периваскулярное пространство в головном и спинном мозге (пространство Вирхова - Робена) сообщается с оболочками головного мозга. В целом, оценка интенсивности окрашивания на rhASA в клетках глии преимущественно служила показателем захвата тестируемого вещества/проникновения тестируемого вещества в серое и/или белое вещество, особенно, в кору больших полушарий (лучистый венец в белом веществе под корой больших полушарий). Окрашивание на rhASA в белом веществе, по-видимому, соответствовало астроцитам и клеткам микроглии.

[0602] Для оценки степени окрашивания на rhASA клеток разных типов (нейронов, клеток глии, макрофагов), применяли следующую оценочную шкалу.

Пояснения к шкале (% от возможной окраски клеток)

1 Меньше 10%

2 Более 10, до 25%

3 Более 25, до 50%

4 Более 50, до 75%

5 Более 75%

[0603] Следует отметить, что указанная шкала не является строго количественной. Ее применяли в качестве эффективного полуколичественного способа оценки окрашивания на rhASA тканей головного и спинного мозга. Невропатолог исследования заметил, что не все области нейронов проявляли одинаковое окрашивание на rhASA. Также было отмечено, что у некоторых контрольных животных имело место эндогенное окрашивание нейронов, и что клетки сосудистого сплетения и нейроны ганглиев задних корешков имели тенденцию к сильному окрашиванию на rhASA даже у контрольных животных. Окрашивание сосудистого сплетения и ганглиев задних корешков не оценивали по указанной шкале, но невропатолог исследования отметил, что оно было выраженным, даже у контрольных животных.

[0604] Примечание: группы, получавшие все дозы: низкая доза = 1,8 мг/дозу; средняя доза = 6,0 мг/дозу; высокая доза = 18,6 мг/дозу. В тканях вне нервной системы не было поражений, связанных с тестируемым веществом, за исключением повышенного окрашивания на rhASA в печени в группах, получавших все дозы (самцы и самки; см. ниже).

УМЕРЩВЛЕНИЕ ЖИВОТНЫХ В КОНЦЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (ВВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТА В ТЕЧЕНИЕ 6 МЕСЯЦЕВ РАЗ В ДВЕ НЕДЕЛИ): ОКРАШИВАНИЕ СРЕЗОВ НА rhASA

[0605] В следующих типах тканей/клеток имела место повышенная интенсивность окрашивания на rhASA. При оценке действия тестируемого вещества на степень окрашивания на rhASA в конкретном типе клеток в группе, получавшей конкретную дозу, для сравнения оценивали уровень окрашивания в сопутствующем контроле основы и контроле вживления устройства (умерщвленные одновременно с животными, которые прошли период восстановления).

[0606] Головной мозг, оболочки мозга, макрофаги (группы, получавшие все дозы, самцы и самки)

- Головной мозг, периваскулярное пространство, макрофаги (группы, получавшие все дозы, самцы и самки)

- Головной мозг, клетки глии (группы, получавшие все дозы, самцы и самки)

- Спинной мозг, оболочки мозга, макрофаги (группы, получавшие все дозы, самцы и самки)

- Спинной мозг, периваскулярное пространство, макрофаги (группы, получавшие все дозы, самцы и самки)

- Спинной мозг, клетки глии (группы, получавшие среднюю и высокую дозы, самцы и самки)

- Печень, купферовские клетки (группы, получавшие все дозы, самцы и самки)

[0607] Из-за эндогенного окрашивания уровень окрашивания на ARSA в нейронах головного и спинного мозга определить точно было наиболее трудно. Был продемонстрирован неизменно повышенный уровень rhASA в макрофагах оболочек мозга и периваскулярных макрофагах головного/спинного мозга, а также в клетках глии. Заметных различий в окрашивании на rhASA нейронов у контрольных и получавших тестируемое вещество животных выявлено не было.

УМЕРЩВЛЕНИЕ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ПЕРИОДА ВОССТАНОВЛЕНИЯ (ВВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТА В ТЕЧЕНИЕ 6 МЕСЯЦЕВ РАЗ В ДВЕ НЕДЕЛИ И ПОСЛЕДУЮЩИЙ ПЕРИОД ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЛИТЕЛЬНОСТЬЮ ОДИН МЕСЯЦ БЕЗ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА)

[0608] В целом у животных, которые перед вскрытием восстанавливались в течение одного месяца без введения препарата, изменения, связанные с тестируемым веществом, либо полностью разрешались, либо заметно уменьшались. Присутствовали следующие микроскопические изменения с частотой/тяжестью, которая указывает на возможную взаимосвязь с тестируемым веществом.

[0609] Микроскопические изменения, связанные с тестируемым веществом (животные, прошедшие период восстановления)

- Головной мозг, оболочки мозга, инфильтраты (группы, получавшие среднюю и высокую дозы, оба пола) (Фигура 111 и Фигура 112)

- Головной мозг, оболочки мозга, инфильтраты, % эозинофилов (самцы, получавшие среднюю дозу; самки, получавшие высокую дозу)

- Головной мозг, периваскулярное пространство, инфильтраты (самцы, получавшие среднюю дозу; самки, получавшие высокую дозу) (Фигура 113)

- Головной мозг, периваскулярное пространство, инфильтраты, % эозинофилов (самцы, получавшие среднюю дозу; самки, получавшие высокую дозу)

- Головной мозг, серое вещество, инфильтраты (группы, получавшие все дозы, оба пола)

- Головной мозг, серое вещество инфильтраты, % эозинофилов (самцы, получавшие низкую дозу)

- Головной мозг, серое вещество, эозинофилы, некроз (самцы, получавшие низкую дозу)

- Спинной мозг, оболочки мозга, инфильтраты (самцы, получавшие среднюю и высокую дозы; самки, получавшие низкую и высокую дозы)

- Спинной мозг, оболочки мозга, инфильтраты, % эозинофилов (самцы, получавшие среднюю дозу; самки, получавшие низкую дозу)

- Спинной мозг, серое вещество, инфильтраты (самки, получавшие низкую дозу)

- Спинной мозг, серое вещество, инфильтраты, % эозинофилов (самки, получавшие низкую дозу)

- Задние корешки и ганглии спинномозговых нервов, эпиневрий, инфильтраты (самки, получавшие среднюю дозу)

- Корешки и ганглии спинномозговых нервов, инфильтраты, эозинофилы (самцы, получавшие среднюю и высокую дозы; самки, получавшие все дозы)

- Тройничный узел, инфильтраты, эозинофилы (самцы и самки, получавшие среднюю дозу)

[0610] Все указанные изменения интерпретировали как остаточные явления выраженных воспалительных изменений, выявляемых у животных, умерщвленных после окончания введения препарата. Хотя у животных, умерщвленных после окончания введения препарата, не было признаков выраженных инфильтратов воспалительных клеток, они все же присутствовали у некоторых животных, прошедших период восстановления, указывая на морфологические изменения, которые вызывали какие-то нежелательные эффекты, В тканях вне нервной системы поражений, связанных с тестируемым веществом, не обнаруживалось.

УМЕРЩВЛЕНИЕ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ПЕРИОДА ВОССТАНОВЛЕНИЯ (ВВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТА В ТЕЧЕНИЕ 6 МЕСЯЦЕВ РАЗ В ДВЕ НЕДЕЛИ И ПОСЛЕДУЮЩИЙ ПЕРИОД ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЛИТЕЛЬНОСТЬЮ ОДИН МЕСЯЦ БЕЗ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА): ОКРАШИВАНИЕ НА ARSA

[0611] У самцов и самок, прошедших период восстановления, по сравнению с контролем вживления устройства и контролем основы никаких указаний на более сильное окрашивание на rhASA не было. В головном мозге самцов, получавших низкую, среднюю и высокую дозы и прошедшие период восстановления, в некоторых типах клеток (они варьировали среди лечебных групп) были реальные указания на более сильное окрашивание на rhASA по сравнению с контролем вживления устройства и контролем основы. Причина этого не ясна, в том числе не ясно, оказывало ли это реальное действие. Одно из возможных объяснений может состоять в том, что введение экзогенной rhASA может приводить к снижению выработки эндогенной rhASA. В спинном мозге указанных самцов аналогичного результата не было. У самцов и самок, прошедших период восстановления, окрашивание серебром давало результат, аналогичный результату в контролях.

[0612] В целом, изменения, связанные с тестируемым веществом, можно было отнести к двум основным типам, и присутствовали они при всех уровнях доз (1,8, 6,0 и 18,бмг/дозу).

[0613] Увеличение инфильтратов (лейкоциты, обычно с выраженным эозинофильным компонентом) в оболочках мозга, паренхиме головного мозга, паренхиме спинного мозга, тройничном узле и редко - в корешках/ганглиях спинномозговых нервов (или эпиневрии, окружающем указанные структуры). Указанное увеличение интерпретировали как связанное с наличием тестируемого вещества (белка) в интратекальном пространстве и в тканях нервной системы.

[0614] Легкое, очаговое увеличение числа клеток микроглии в спинном и головном мозге у некоторых животных (микроглиоз не наблюдался ни у одного животного, получавшего высокую дозу). Обе категории морфологических изменений интерпретировали как реакцию на наличие тестируемого вещества. Ни у одного животного не было признаков некроза нейронов. На момент написания данного промежуточного отчета оценка окрашенных на rhASA срезов еще производится. Никакие связанные с тестируемым веществом изменения не были связаны с какими-либо биологически значимыми нежелательными реакциями в головном и спинном мозге, корешках спинномозговых нервов или ганглиях. Более конкретно, не было выявлено никаких признаков некроза нейронов или биологически значимой реакции со стороны глии. В тканях вне нервной системы никаких связанных с тестируемым веществом поражений не было. После месячного периода восстановления (период без введения препарата) вызываемые тестируемым веществом изменения либо полностью разрешались, либо сводились к остаточному увеличению воспалительной реакции, связанному с наличием тестируемого вещества. У животных, прошедших период восстановления, никаких нежелательных морфологических эффектов не было.

[0615] По данным слепого микроскопического исследования, в котором полуколичественно оценивали степень окрашивания, иммуногистохимическое окрашивание на арилсульфатазу А (rhASA; тестируемое вещество) увеличивалось в головном и спинном мозге в клетках разных типов, за исключением нейронов, во всех группах, получавших тестируемое вещество. Указанное увеличение также было явным в купферовских клетках печени. После месячного периода восстановления окрашивание на rhASA у животных, получавших тестируемое вещество (группы всех доз), возвращалось к контрольному уровню (контроль введения устройства/контроль с введением основы). У одного самца из группы, получавшей низкую дозу, обнаруживались множественные очаги астроцитоза и потери нейронов, что указывает на множественные области предшествующей ишемии, в коре больших полушарий. Хотя точный патогенез указанных поражений у данного животного не ясен, отсутствие аналогичных поражений у каких-либо других животных, получавших тестируемое вещество, включая тех животных, которые получали дозу в 10 раз выше, говорит о том, что указанные поражения не были связаны с тестируемым веществом. На момент выпуска настоящего предварительного отчета и строго основываясь на макроскопических и микроскопических результатах (на срезах тканей, заключенных в парафин, окрашенных гематоксилином и эозином), полученных в настоящем исследовании, уровнем отсутствия наблюдаемых нежелательных эффектов (NOAEL) был признан уровень 18,6 мг.

ПРИМЕР 16: ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ

Результаты 6-месячного введения

[0616] В настоящем примере описан интерпретированный анализ концентраций rhASA и сывороточных анти-rhASA антител (от компании «Northern Biomedical Research, Inc.») в сыворотке и СМЖ.

[0617] Цель настоящего примера состояла в оценке многократного интратекального (ИТ) введения rhASA токсикологии и фармакологической безопасности у молодых (моложе 12 месяцев) длиннохвостых макак. Всего за период шесть месяцев вводили 12 доз. Животных подвергали вскрытию через 24 часа после введения последней дозы препарата. Схема эксперимента показана в Таблице 29.

Таблица 29
Схема эксперимента в исследовании 047-021 (rhASA 1-09-015)
Схема эксперимента
Группа	Кол-во животных	Номинальная концентрация в дозе (мг/мл)	Вводимая доза(мг)	Кол-во животных, умерщвленных через 6 месяцев	Кол-во животных, умерщвленных после месячного периода восстановления
1	4М, 4Ж	DC	0	-	4М, 4Ж
2	8М, 8Ж	0	0	4М, 3Жa	4М, 4Ж
3	8М, 8Ж	3	1,8	4М, 4Ж	4М, 4Ж
4	8М, 8Ж	10	6,0	4М, 4Ж	4М, 4Ж
5	8М, 8Ж	31	18,6	4М, 4Ж	4М, 4Ж
DC = контроль устройства; животные в группе 1 не получали ни основы, ни тестируемого вещества.
aЖивотное из группы контроля введения основы №044 было умерщвлено в день 50 из-за утечки в катетере.

Способы количественного определения - анализ антител

[0618] Количественное определение анти-rhASA антител в сыворотке и СМЖ длиннохвостых макак проводили с использованием способа, прошедшего валидацию. Если кратко, количественное определение начинали с блокирования планшета, покрытого стрептавидином MSD, после чего проводили инкубацию с rhASA, меченной биотином. После этапа отмывки в планшет добавляли разведенные пробы, калибровочные стандарты и стандарты для контроля качества, и инкубировали его. После дополнительного этапа промывки добавляли лекарственное вещество, меченное SULFO TAG, и инкубировали. Проводили окончательный этап отмывки и добавляли буфер считывания MSD. Считывание показателей с планшета проводили незамедлительно. Данные о сигнале в относительных единицах люминесценции (RLU) анализировали с использованием шаблонов SOFTMax Pro.

Концентрации в сыворотке и СМЖ

[0619] Количественное определение анти-rhASA антител в сыворотке и СМЖ длиннохвостых макак проводили с использованием метода, прошедшего валидацию. Указанный способ основан на технологии твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Если кратко, титрационный микропланшет покрывали поликлональными антителами кролика (SH040), образовавшимися на рекомбинантную арилсульфатазу А человека (rhASA). После инкубации со стандартным образцом rhASA и тестируемыми пробами связавшийся белок rhASA определяли с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена (ПХ) анти- ASA моноклонального антитела (клон 19-16-3). Затем планшет инкубировали с субстратом ПХ, ТМВ. Указанную реакцию «фермент-субстрат» останавливали путем добавления 2Н серную кислоту (H₂SO₄), и поглощение каждой лунки определяли на длине волны 150 нм с опорной длиной волны 655 нм. Концентрации rhASA в пробах рассчитывали на основании калибровочной кривой для rhASA, зарегистрированной в том же планшете.

[0620] Итоговые данные о концентрациях rhASA в сыворотке приведены в Таблице 30.

[0621] Итоговые данные о концентрациях rhASA в СМЖ приведены в Таблице 31.

[0622] Итоговые данные о концентрациях анти-rhASA антител в сыворотке приведены в Таблице 32.

[0623] Итоговые данные о концентрациях анти-rhASA антител в СМЖ приведены в Таблице 33.

[0624] Частоты обнаружения антител в зависимости от группы и пола приведены в Таблице 36.

Таблица 30
Итоговые данные о концентрациях rhASA в сыворотке длиннохвостых макак
Группа 1: Контроль с введением основы	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 2	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 4	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 4	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 6	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 6	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 8	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 8	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 10	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 10	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 12	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 12	0	0	4	0	0	4
Середина периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Группа 2: 0 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	CO	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	7
После введения дозы 2	0	0	8	0	0	7
Перед введением дозы 4	0	0	8	0	0	7
После введения дозы 4	0	0	8	0	0	7
Перед введением дозы 6	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 6	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 8	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 8	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 10	0	0	8	0	0	7
После введения дозы 10	0	0	8	0	0	7
Перед введением дозы 12	0	0	8	0	0	7
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	8	0	0	8
Середина периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4

Таблица 30 (продолжение)
Итоговые данные о концентрациях rhASA в сыворотке длиннохвостых макак
Группа 3: 1,8 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 2	49,2	46,8	8	40,3	27,3	8
Перед введением дозы 4	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 4	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 6	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 6	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 8	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 8	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 10	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 10	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 12	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	8	0	0	8
Середина периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Группа 4: 6,0 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 2	173,6	69,5	8	143,2	89,0	8
Перед введением дозы 4	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 4	17	49	8	63,8	119,9	8
Перед введением дозы 6	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 6	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 8	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 8	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 10	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 10	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 12	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	8	0	0	8
Середина периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4

Таблица 30 (продолжение)
Итоговые данные о концентрациях rhASA в сыворотке длиннохвостых макак
Группа 5: 18,6 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 2	348,0	272,9	8	562,3	204,3	8
Перед введением дозы 4	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 4	105,7	274,6	8	172,0	141,3	8
Перед введением дозы 6	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 6	20,4	38,4	8	88,6	121,4	8
Перед введением дозы 8	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 8	0	0	8	54,0	89,4	8
Перед введением дозы 10	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 10	0	0	8	6	18	8
Перед введением дозы 12	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	8	0	0	8
Середина периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4

Таблица 31
Итоговые данные о концентрациях rhASA в СМЖ длиннохвостых макак
Группа 1: Контроль с введением основы	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 2	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 4	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 4	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 6	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 6	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 8	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 8	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 10	0	0	4	0	0	4
После введения дозы 10	0	0	3	0	0	4
Перед введением дозы 12	0	0	3	0	0	4
После введения дозы 12	0	0	3	0	0	4
Середина периода восстановления	0	0	3	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Группа 2: 0 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	6	0	0	7
После введения дозы 2	0	0	5	0	0	7
Перед введением дозы 4	0	0	5	0	0	6
После введения дозы 4	0	0	5	0	0	5
Перед введением дозы 6	0	0	5	0	0	5
После введения дозы 6	0	0	5	0	0	5
Перед введением дозы 8	0	0	5	0	0	5
После введения дозы 8	0	0	5	0	0	5
Перед введением дозы 10	0	0	4	0	0	5
После введения дозы 10	0	0	4	0	0	5
Перед введением дозы 12	0	0	4	0	0	5
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	5	0	0	5
Середина периода восстановления	0	0	2	0	0	3
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4

Таблица 31 (продолжение)
Итоговые данные о концентрациях rhASA в СМЖ длиннохвостых макак
Группа 3: 1,8 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	42491	59255	7	42217	47300	6
После введения дозы 2	95886	22626	7	125717	61723	6
Перед введением дозы 4	17664	24372	6	50829	41891	6
После введения дозы 4	106783	42823	6	138400	49908	6
Перед введением дозы 6	39400	50105	4	45817	38404	6
После введения дозы 6	95275	12836	4	104080	37423	5
Перед введением дозы 8	25799	31589	4	58086	43821	5
После введения дозы 8	148750	34664	4	119200	66556	5
Перед введением дозы 10	25927	31380	4	30380	30328	5
После введения дозы 10	89975	29494	4	105200	44603	5
Перед введением дозы 12	29746	34267	4	82780	65906	5
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	32030	39155	7	47331	49015	6
Середина периода восстановления	0	0	3	0	0	2
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Группа 4: 6,0 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	75203	67002	8	146979	233673	6
После введения дозы 2	360000	179276	8	267667	103369	6
Перед введением дозы 4	58064	77210	8	53285	73340	5
После введения дозы 4	369250	241251	8	305517	152232	6
Перед введением дозы 6	77253	91407	8	97987	146762	6
После введения дозы 6	418600	200098	5	369000	232238	5
Перед введением дозы 8	66342	80374	5	11592	23072	4
После введения дозы 8	329400	209841	5	340500	135128	4
Перед введением дозы 10	119420	148408	5	74031	104609	2
После введения дозы 10	412000	149278	5	245500	161927	2
Перед введением дозы 12	68651	92902	5	74577	105251	2
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	141833	173933	7	58986	99016	4
Середина периода восстановления	0	0	3	0	НП	1
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4

Таблица 31 (продолжение)
Итоговые данные о концентрациях rhASA в СМЖ длиннохвостых макак
Группа 5: 18,6 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	289917	291188	7	201339	250774	8
После введения дозы 2	734429	298352	7	920143	448409	7
Перед введением дозы 4	150238	210302	7	169895	185675	6
После введения дозы 4	984857	570039	7	965167	425924	6
Перед введением дозы 6	265479	252067	7	288879	226889	6
После введения дозы 6	758143	102009	7	1270000	558533	6
Перед введением дозы 8	190529	240081	7	196021	199396	6
После введения дозы 8	1003429	538271	7	989800	585072	5
Перед введением дозы 10	176297	272500	7	168864	191087	6
После введения дозы 10	1013000	390673	7	773400	103717	5
Перед введением дозы 12	142334	196793	5	430542	436534	6
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	291525	350251	7	252142	381200	6
Середина периода восстановления	0	0	3	0	0	2
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4

Таблица 32
Итоговые данные о концентрациях анти-rhASA антител в сыворотке
Группа 1: Контроль с введением основы	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 4	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 6	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 8	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 10	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 12	0	0	4	0	0	4
Середина периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Группа 2: 0 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 4	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 6	0	0	8	0	0	7
Перед введением дозы 8	0	0	8	0	0	7
Перед введением дозы 10	0	0	8	0	0	7
Перед введением дозы 12	0	0	8	0	0	7
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	0	0	4	0	0	4
Середина периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Группа 3: 1,8 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	N
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 4	18409	21371	8	27648	37504	8
Перед введением дозы 6	75913	64863	8	85625	79871	8
Перед введением дозы 8	132163	95576	8	151900	97818	8
Перед введением дозы 10	392338	606626	8	290675	186213	8
Перед введением дозы 12	499438	735028	8	524438	569523	8
Вскрытие (через 24 часа после	261625	157865	4	733550	928411	4
введения последней дозы)
Середина периода восстановления	339250	265888	4	377175	218955	4
Вскрытие после периода восстановления	712500	1107129	4	295525	174718	4

Таблица 32 (продолжение)
Итоговые данные о концентрациях анти-rhASA антител в сыворотке
Группа 4: 6,0 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	N
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 4	30419	30561	8	64000	89510	8
Перед введением дозы 6	143693	128094	8	191750	150511	8
Перед введением дозы 8	325750	190651	8	305850	224707	8
Перед введением дозы 10	669125	515458	8	832188	846241	8
Перед введением дозы 12	946125	651530	8	1060775	1088889	8
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	713500	598812	4	1047568	1132048	4
Середина периода восстановления	1566000	708132	4	975500	1149734	4
Вскрытие после периода восстановления	1113250	554510	4	793000	991450	4
Группа 5: 18,6 мг	Самцы	Самки
	Среднее	CO	n	Среднее	СО	N
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 4	56873	39107	8	39994	53411	8
Перед введением дозы 6	311638	237796	8	193263	208952	8
Перед введением дозы 8	482875	270130	8	399363	360425	8
Перед введением дозы 10	1006750	857916	8	866875	894776	8
Перед введением дозы 12	1419000	1382276	8	1341500	1373771	8
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	165000	147463	4	407300	268570	4
Середина периода восстановления	2884250	1363128	4	2101500	2090420	4
Вскрытие после периода восстановления	2504250	1118042	4	1506000	1524682	4

Таблица 33
Итоговые данные о концентрациях анти-rhASA антител в СМЖ
Группа 1: Контроль с введением основы	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 2	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 4	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 6	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 8	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 10	0	0	4	0	0	4
Перед введением дозы 12	0	0	3	0	0	4
Середина периода восстановления	0	0	3	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Группа 2: 0 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция	0	0	7	0	0	6
Перед введением дозы 2	0	0	6	0	0	7
Перед введением дозы 4	0	0	5	0	0	6
Перед введением дозы 6	0	0	5	0	0	5
Перед введением дозы 8	0	0	5	0	0	5
Перед введением дозы 10	0	0	4	0	0	5
Перед введением дозы 12	0	0	4	0	0	5
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	0	0	3	0	0	2
Середина периода восстановления	0	НП	1	0	0	3
Вскрытие после периода восстановления	0	0	4	0	0	4
Группа 3: 1,8 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция	0	0	7	0	0	8
Перед введением дозы 2	0	0	7	0	0	6
Перед введением дозы 4	0	0	6	41	101	6
Перед введением дозы 6	685	1317	4	632	1413	5
Перед введением дозы 8	2238	2596	4	2180	4875	5
Перед введением дозы 10	3393	5038	4	5560	12433	5
Перед введением дозы 12	6436	8266	4	12700	28398	5
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	14848	12401	4	21442	32382	4
Середина периода восстановления	29307	40617	3	18700	283	2
Вскрытие после периода восстановления	21060	30010	3	13078	7181	4

Таблица 33 (продолжение)
Итоговые данные о концентрациях анти-rhASA антител в СМЖ
Группа 4: 6,0 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция	0	0	7	0	0	8
Перед введением дозы 2	0	0	7	0	0	6
Перед введением дозы 4	99	172	7	84	187	5
Перед введением дозы 6	1117	1862	8	1473	2775	6
Перед введением дозы 8	3987	5580	5	20824	27320	4
Перед введением дозы 10	6600	9679	5	2715	1237	2
Перед введением дозы 12	5285	7279	5	955	1237	2
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	16870	16350	4	63000	63000	3
Середина периода восстановления	66233	42238	3	16800	НП	1
Вскрытие после периода восстановления	53600	14388	3	28880	29890	4
Группа 5:18,6 мг	Самцы	Самки
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция	0	0	7	0	0	6
Перед введением дозы 2	0	0	7	0	0	8
Перед введением дозы 4	102	192	7	0	0	6
Перед введением дозы 6	233	351	7	1506	3234	6
Перед введением дозы 8	3378	5931	7	6367	9865	6
Перед введением дозы 10	16327	24035	7	19567	27542	6
Перед введением дозы 12	11596	16406	5	15143	24351	6
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	5168	7427	4	12135	10341	4
Середина периода восстановления	54700	26439	3	46315	62770	2
Вскрытие после периода восстановления	50725	29217	4	37790	35967	4

Таблица 34
Концентрации rhASA в сыворотке и СМЖ, объединенные данные по самцам и самкам (нг/мл)
Группа 1: Контроль с введением основы	rhASA в сыворотке (нг/мл)	rhASA в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
Момент времени	Среднее	СО	n	Среднее	СО	N
	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 2	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 4	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 4	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 6	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 6	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 8	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 8	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 10	0	0	8	0	0	8
После введения дозы 10	0	0	8	0	0	7
Перед введением дозы 12	0	0	8	0	0	7
После введения дозы 12	0	0	8	0	0	7
Середина периода восстановления	0	0	8	0	0	7
Вскрытие после периода восстановления	0	0	8	0	0	8
Группа 2: 0 мг	rhASA в сыворотке (нг/мл)	rhASA в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
Момент времени	Среднее	СО	n	Среднее	СО	N
	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	16	0	0	13
После введения дозы 2	0	0	16	0	0	12
Перед введением дозы 4	0	0	16	0	0	11
После введения дозы 4	0	0	16	0	0	10
Перед введением дозы 6	0	0	15	0	0	10
После введения дозы 6	0	0	15	0	0	10
Перед введением дозы 8	0	0	15	0	0	10
После введения дозы 8	0	0	15	0	0	10
Перед введением дозы 10	0	0	15	0	0	9
После введения дозы 10	0	0	15	0	0	9
Перед введением дозы 12	0	0	15	0	0	9
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	15	0	0	10
Середина периода восстановления	0	0	8	0	0	5
Вскрытие после периода восстановления	0	0	8	0	0	8

Таблица 34 (продолжение)
Концентрации rhASA в сыворотке и СМЖ, объединенные данные по самцам и самкам (нг/мл)
Группа 3:1,8 мг	rhASA в сыворотке (нг/мл)	rhASA в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
Момент времени	Среднее	СО	n	Среднее	СО	N
	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	16	42365	51844	13
После введения дозы 2	44.7	37.3	16	109654	45639	13
Перед введением дозы 4	0	0	16	34247	36982	12
После введения дозы 4	0	0	16	122592	47311	12
Перед введением дозы 6	0	0	16	43250	40831	10
После введения дозы 6	0	0	16	100167	27992	9
Перед введением дозы 8	0	0	16	43736	40298	9
После введения дозы 8	0	0	16	132333	53926	9
Перед введением дозы 10	0	0	16	28401	28890	9
После введения дозы 10	0	0	16	98433	37220	9
Перед введением дозы 12	0	0	16	59209	58253	9
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	16	39092	42786	13
Середина периода восстановления	0	0	8	0	0	5
Вскрытие после периода восстановления	0	0	8	0	0	8
Группа 4: 6,0 мг	rhASA в сыворотке (нг/мл)	rhASA в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
Момент времени	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	16	105964	157408	14
После введения дозы 2	158,4	78,7	16	320429	153832	14
Перед введением дозы 4	0	0	16	56226	72638	13
После введения дозы 4	40,6	91,7	16	341936	203284	14
Перед введением дозы 6	0	0	16	86139	113563	14
После введения дозы 6	0	0	16	393800	206033	10
Перед введением дозы 8	0	0	16	42009	65286	9
После введения дозы 8	0	0	16	334333	169995	9
Перед введением дозы 10	0	0	16	106452	130375	7
После введения дозы 10	0	0	16	364429	160707	7
Перед введением дозы 12	0	0	16	70344	87227	7
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	16	111707	151129	11
Середина периода восстановления	0	0	8	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	8	0	0	8

Таблица 34 (продолжение)
Концентрации rhASA в сыворотке и СМЖ, объединенные данные по самцам и самкам (нг/мл)
Группа 5:18,6 мг	rhASA в сыворотке (нг/мл)	rhASA в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
Момент времени	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Перед введением дозы 2	0	0	16	242676	264338	15
После введения дозы 2	455,1	257,8	16	827286	378379	14
Перед введением дозы 4	0	0	16	159311	191264	13
После введения дозы 4	138,8	213,7	16	975769	488021	13
Перед введением дозы 6	0	0	16	276279	231010	13
После введения дозы 6	54,5	93,8	16	994385	453568	13
Перед введением дозы 8	0	0	16	193064	213058	13
После введения дозы 8	27,0	67,1	16	997750	531567	12
Перед введением дозы 10	0	0	16	172866	228817	13
После введения дозы 10	3,2	13	16	913167	319975	12
Перед введением дозы 12	0	0	16	299538	365275	11
После введения дозы 12 (перед вскрытием по истечении 6 месяцев)	0	0	16	273348	349718	13
Середина периода восстановления	0	0	8	0	0	5
Вскрытие после периода восстановления	0	0	8	0	0	8

Таблица 35
Концентрация анти- rhASA антител в сыворотке и СМЖ, объединенные данные по самцам и самкам (нг/мл)
Группа 1: Контроль с введением основы	Анти-rhASA антитела в сыворотке (нг/мл)	Анти-rhASA антитела в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция				0	0	8
Перед введением дозы 2	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 4	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 6	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 8	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 10	0	0	8	0	0	8
Перед введением дозы 12	0	0	8	0	0	7
Середина периода восстановления	0	0	8	0	0	7
Вскрытие после периода восстановления	0	0	8	0	0	8
Группа 2: 0 мг	Анти-rhASA антитела в сыворотке (нг/мл)	Анти-rhASA антитела в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
	Среднее	CO	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция				0	0	13
Перед введением дозы 2	0	0	16	0	0	13
Перед введением дозы 4	0	0	16	0	0	11
Перед введением дозы 6	0	0	15	0	0	10
Перед введением дозы 8	0	0	15	0	0	10
Перед введением дозы 10	0	0	15	0	0	9
Перед введением дозы 12	0	0	15	0	0	9
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	0	0	8	0	0	5
Середина периода восстановления	0	0	8	0	0	4
Вскрытие после периода восстановления	0	0	8	0	0	8

Таблица 35 (продолжение)
Концентрация анти- rhASA антител в сыворотке и СМЖ, объединенные данные по самцам и самкам (нг/мл)
Группа 3:1,8 мг	Анти-rhASA антитела в сыворотке (нг/мл)	Анти-rhASA антитела в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция				0	0	15
Перед введением дозы 2	0	0	16	0	0	13
Перед введением дозы 4	23028	29871	16	21	72	12
Перед введением дозы 6	80769	70467	16	656	1284	9
Перед введением дозы 8	142031	93979	16	2206	3796	9
Перед введением дозы 10	341506	436656	16	4597	9386	9
Перед введением дозы 12	511938	635340	16	9916	20970	9
Вскрытие (через 24 часа после введения последней Дозы)	497588	666122	8	18145	22972	8
Середина периода восстановления	358213	226397	8	25064	29302	5
Вскрытие после периода восстановления	504013	766860	8	16499	18552	7
Группа 4: 6,0 мг	Анти-rhASA антитела в сыворотке (нг/мл)	Анти-rhASA антитела в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
	Среднее	СО	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция				0	0	15
Перед введением дозы 2	0	0	16	0	0	13
Перед введением дозы 4	47209	66899	16	93	170	12
Перед введением дозы 6	167721	137276	16	1269	2205	14
Перед введением дозы 8	315800	201572	16	11470	19344	9
Перед введением дозы 10	750656	682110	16	5490	8143	7
Перед введением дозы 12	1003450	868860	16	4048	6328	7
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	880534	857199	8	36640	45439	7
Середина периода восстановления	1270750	938646	8	53875	42430	4
Вскрытие после периода восстановления	953125	763122	8	39474	26274	7

Таблица 35 (продолжение)
Концентрация анти- rhASA антител в сыворотке и СМЖ, объединенные данные по самцам и самкам (нг/мл)
Группа 5: 18,6 мг	Анти-rhASA антитела в сыворотке (нг/мл)	Анти-rhASA антитела в СМЖ (нг/мл)
	Группа в совокупности	Группа в совокупности
	Среднее	CO	n	Среднее	СО	n
Момент времени	нг/мл	нг/мл		нг/мл	нг/мл
Операция				0	0	13
Перед введением дозы 2	0	0	16	0	0	15
Перед введением дозы 4	48433	46054	16	55	146	13
Перед введением дозы 6	252450	224723	16	821	2204	13
Перед введением дозы 8	441119	310702	16	4757	7781	13
Перед введением дозы 10	936813	849893	16	17822	24652	13
Перед введением дозы 12	1380250	1331905	16	13531	20189	11
Вскрытие (через 24 часа после введения последней дозы)	286150	238760	8	8652	9129	8
Середина периода	2492875	1686472	8	51346	36819	5
восстановления
Вскрытие после периода восстановления	2005125	1347857	8	44258	31114	8

Таблица 36
Частота обнаружения антител при вскрытии
Группа	Животные с сывороткой, положительной по антителам (положительные/всего протестировано)	Животные с СМЖ, положительной по антителам (положительные/всего протестировано)
	М	Ж	М	Ж
Вскрытие по истечении 6 месяцев	Вскрытие после периода восстановления	Вскрытие по истечении 6 месяцев	Вскрытие после периода восстановления	Вскрытие по истечении 6 месяцев	Вскрытие после периода восстановления	Вскрытие по истечении 6 месяцев	Вскрытие после периода восстановления
1 (DC)	НП	0/4	НП	0/4	НП	0/4	НП	0/4
2 (основа)	0/4	0/4	0/4	0/4	0/3	0/4	0/2	0/4
3 (1,8 мг ИТ)	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	3/3	3/4	4/4
4 (6,0 мг ИТ)	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	3/3	2/3	4/4
5 (18,6 мг ИТ)	4/4	4/4	4/4	4/4	3/4	4/4	4/4	4/4

[0625] Предел количественного определения rhASA в сыворотке длиннохвостых макак составляет 39,1 нг/мл, и во всех пробах сыворотки из групп 1 и 2 концентрации были выше предела количественного определения (BQL), см. Таблицу 30. Уровень rhASA в сыворотке определяли перед введением доз 2, 4, 6, 8, 10 и 12 и через 24 часа после введения указанных проб (вскрытие по истечении 6-месячного периода), в середине периода восстановления и перед вскрытием после периода восстановления. Уровень rhASA в группе 3 (1,8 мг/дозу), группе 4 (6,0 мг/дозу) и группе 5 (18,6 мг/дозу) был неопределимым перед введением доз 2, 4, 6, 8, 10 и 12, после введения дозы 12, в середине периода восстановления и перед вскрытием после периода восстановления. После введения дозы 2 уровень rhASA был дозозависимым. После введения дозы 4 (группа 3), доза 6 (группы 3 и 4) и дозы 8 и 10 (группы 3 и 4, и самцы группы 5) уровень rhASA был неопределимым. Уровень rhASA в сыворотке снижался в группе 4 (6,0 мг/дозу) после введения дозы 4 и в группе 5 (18,6 мг/дозу) после доз 4 и 6 у самцов, и после введения доз 4, 6, 8 и 10 у самок. Указанное кажущееся снижение уровня rhASA в сыворотке могло быть связано с увеличением концентрации анти-hASA антител. Явных половых различий в уровне rhASA в сыворотке выявлено не было с учетом вариабельности между пробами и малого числа групп в данном исследовании.

[0626] Предел количественного определения rhASA в СМЖ длиннохвостых макак составляет 19,5 нг/мл, и во всех пробах СМЖ из групп 1 и 2 концентрации были BQL, см. Таблицу 31. Концентрация rhASA была определимой в СМЖ перед введением доз 2, 4, 6, 8, 10 и 12 и после введения всех указанных доз (вскрытие по истечении 6-месячного периода) во всех группах, получавших препарат. Указанный уровень был выше после введения доз (приблизительно через 24 часа после введения) и зависел от дозы. Уровень rhASA в СМЖ был гораздо выше, чем в сыворотке. Явных половых различий в уровне rhASA в сыворотке выявлено не было с учетом вариабельности между пробами и малого числа групп в данном исследовании. Во всех группах, получавших препарат, в середине периода восстановления и перед вскрытием после периода восстановления rhASA не определялась. Уровень rhASA в СМЖ при отборе во время дозы 12 (вскрытие) в группах, получавших rhASA, был ниже, чем уровень после дозы 8 и 11. Возможные причины более низкого уровня rhASA при вскрытии включают взятие объема (~2,25 мл всего для определения лейкоцитарной формулы, биохимии, уровня rhASA и анти-rhASA антител) при вскрытии, большего чем объем, отбираемый в моменты времени прижизненного отбора проб (до 0,5 мл перед или после введения дозы для оценки концентрации rhASA). Кроме того, у некоторых животных при вскрытии просвет катетера был закрыт, и пробы отбирали посредством спинномозговой пункции, а не через катетер. В пробах, отобранных таким путем, определяемые концентрации rhASA были неизменно ниже, чем в пробах, отобранных через катетер. Вероятно, это связано с ограниченным рострокаудальным направлением объемного потока СМЖ, который, как предполагается, имеет место у животных с вертикальной ориентацией тела, таких как обезьяны и человек (например, хорошо известно, что компоненты СМЖ проявляют выраженный рострокаудальный градиент на протяжении всей жизни особи).

[0627] У каждого животного, получавшего rhASA, в какой-либо момент времени в сыворотке определялись анти-rhASA антитела, см. Таблицу 32. Животных считали положительными по анти-rhASA антителам, если уровень анти-rhASA антител был выше предела количественного определения (78,1 нг/мл). После того, как животные становились сероконвертированными, они оставались положительными по анти-rhASA антителам. В момент времени перед введением дозы 2 ни одно животное не было положительным по анти-rhASA антителам. Все животные, получавшие rhASA, за исключением самца №026 (группа 4; 6,0 мг/дозу) демонстрировали анти-rhASA антитела в сыворотке в момент времени перед введением дозы 4. Самец №026 был положительным по анти-rhASA антителам в сыворотке в момент времени перед введением дозы 6. В группе 5 (18,6 мг/кг) в пробах, отобранных при вскрытии, уровень антител был ниже. Указанное кажущееся снижение может быть связано с присутствием rhASA, препятствующим количественному определению. В целом титр был выше в группах, получавших высокие и средние дозы (6,0 и 18,6 мг/дозу), чем у животных, получавших низкую дозу (1,8 мг/дозу). Присутствие анти-rhASA антител - результат, ожидаемый на основании данных лечения длиннохвостых макак рекомбинантными белками человекаⁱ. С учетом вариабельности результатов явных половых различий выявлено не было.

[0628] У всех животных с определимым уровнем анти-rhASA антител в СМЖ был также определимый уровень анти-rhASA антител в сыворотке за исключением самок №049 (группа 3; 18,6 мг/дозу) и 057 (группа 4; 6,0 мг/дозу). Вариабельность концентрации антител и частота их образования препятствовала определению зависимости «доза-ответ». Животных считали положительными по анти-rhASA антителам, если уровень анти-rhASA антител был выше предела количественного определения (78,1 нг/мл).

[0629] Объединенные для самцов и самок значения уровня rhASA в сыворотке и СМЖ и уровня анти-rhASA антител приведены в Таблице 34 и Таблице 35. Объединенные для самцов и самок результаты сходны с результатами для отдельных полов, которые обсуждались выше.

ПРИМЕР 17: ЭФФЕКТИВНОСТЬ

[0630] В данном примере 11 контрольных мышей дикого типа (mASA+/+ hASA-/-) распределили в группу А, которая не получала препарата. Тридцать четыре (34) мыши hASAC69S/ASA -/- распределили в 5 разных групп, получавших основу (группа В) или rhASA в дозах 20 мг/кг (внутривенно [ВВ]; группа С), 0,04, 0,012 и 0,21 мг (Группы D, Е и F, соответственно) в дни 1, 9, 15/16 и 22. Все внутривенные дозы вводили в хвостовую вену. Все интратекальные (ИТ) дозы вводили в виде инфузии в объеме 12 мкл с приблизительной скоростью 2 мкл/20 секунд (Таблица 37).

Таблица 37
Схема эксперимента
Группа	Кол-во животных	Тип животных	Препарат	Доза	Путь введения	Общее кол-во инъекций	Умерщвление	Доза в мг/кг массы головного мозгаa
А	11	Контроль дикого типа (mASA+/+ hASA -/-)	Нет	н/п	н/п	н/п	н/п	н/п
В	9	hASAC69S/ ASA -/-	Контроль с введением наполнителя	Наполнитель	ИТ поясничный отдел		Через 24 часа после введения четвертой дозы	0
С	5		rhASA	20 мг/кг	ВВ (хвостовая вена)	4		н/п
D	5		rhASA	0,04 мг	ИТ поясничный отдел	(Дни 1,9, 15/16b и 22)		100
Е	5		rhASA	0,12 мг	ИТ поясничный отдел			300
F	10	rhASA	0,21 мг	ИТ поясничный отдел	520
Н/п = не применимо; ИТ = интратекально; ВВ = внутривенно.
а Масса головного мозга у мыши составляет приблизительно 0,0004 кг.
b Группы С, D и Е получали препарат в день 15; Группы В и Е получали препарат в день 16.

[0631] Мыши с нокаутированным геном ASA - hASAC69S/ASA(-/-) являются общепринятой моделью метахроматической лейкодистрофии, и их широко применяют для тестирования потенциальных средств лечения указанного заболевания. Интратекальный путь введения является планируемым путем введения у человека. Внутривенный путь введения тестировали для данного соединения и аналогичного соединения у мышей с метахроматической лейкодистрофией. Контрольную группу с внутривенным введением добавили в качестве положительного контроля для оценки гистологических изменений, ожидаемых в периферических органах. Животные получали 100, 300 или 520 мг/кг массы головного мозга (0,04, 0,12, 0,21 мг, соответственно) rhASA. Выбранный для данного исследования уровень доз, нормированный на массу головного мозга, соответствует дозам, которые планируется применять у человека, или применялся в токсикологических исследования или в предшествующих моделях лизосомных болезней накопления для оценки эффективности. Ожидается, что указанные дозы не обладают какой-либо токсичностью.

Объект

Вид	Мышь (Mus musculus)
Линия	мыши hASAC69S/ASA (-/-) и контроль дикого типа
Возраст	по прибытии приблизительно 14-17 месяцев
Кол-во групп	6
Кол-во животных типа	34 мыши, нокаутные по ASA+11 контрольных животных дикого

После прибытия каждое животное осматривали, оценивая состояние его здоровья. Содержание

Животных содержали по группам в клетках из поликарбоната с верхом-фильтром, подстилка была выполнена из бумаги CareFresh, в клетках стояли флаконы с водой. Каждую клетку четко маркировали с использованием таблички с указанием проекта, группы, номеров животных и их пола. Каждое животное идентифицировали уникальным кодом с применением системы прокалывания ушной раковины.

Целевые условия окружающей среды в помещении, где содержали животных, и Световой период были следующие:

Температура	22°C±3°C
Влажность	50%±20%
Цикл свет-темнота	12 часов света и 12 часов темноты

[0632] Всех имеющихся в распоряжении животных дикого типа (11) распределили в группу А, и им присвоили номера от 35 до 45. Животным с генотипом ASA(-/-) hASA(+/-) присвоили номера по порядку (от 1 до 34), для чего их брали из их клеток, взвешивали и проводили прокалывание ушной раковины в период акклиматизации. Затем животных распределяли в группы лечения с использованием инструмента Research Randomizer (www.randomizer.org) 3 января 2011 г. Первые 9 номеров были присвоены группе В, последующие 5 - группе С, последующие 5 - группе D, последующие 5 - группе Е, и последние 10 номеров - группе F. Животных распределили в группы согласно Таблице 38.

Таблица 38
Распределение животных в группы
Группа	N	Номера животных
А	11	35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,45
В	9	7, 13, 17, 22, 23, 24, 28, 29, 30
С	5	6, 16, 19a, 21, 32
D	5	5, 9, 14, 18, 27
Е	5	1, 2, 4, 8, 11
F	10	3b, 10, 12, 15, 20, 25, 26, 31, 33, 34
aЖивотное №19 не могли найти во время введения препарата. bЖивотное №3 погибло до начала введения препарата.

Тестируемое вещество и основа

Тестируемое вещество
Наименование	rhASA
Описание	рекомбинантная арилсульфатаза А человека (ARSA)
Условия хранения	приблизительно 4°C
Основа
Наименование	основа для rhASA (154 мМ NaCl, 0,005% полисорбат 20, pH ~6,0)
Условия хранения	приблизительно 4°C

Приготовление основы

[0633] Указанную основу применяли в установленном порядке. Ее нагревали на поверхности рабочего стола (комнатная температура). Как только основа нагревалась, вещество смешивали посредством аккуратного вращения и переворачивания флаконов. Флаконы не взбалтывали и не встряхивали. Перед отбором вещества флакон высушивали. Любой остаток основы возвращали в холодильник (1°C-8°C).

Приготовление лекарственной формы для введения

[0634] rhASA разводили в основе с получением требуемой концентрации.

Тестируемое вещество нагревали на поверхности рабочего стола (комнатная температура).

Как только тестируемое вещество нагревалось, вещество смешивали посредством аккуратного вращения и переворачивания флаконов. Флаконы не взбалтывали и не встряхивали.

Красители для отслеживания вводимого вещества:

[0635] Для отслеживания вводимого вещества применяли краситель, поглощающий в инфракрасной области (такой как IRDye®, «LI-COR Biosciences», Линкольн, Небраска). Такие красители широко применялись при интратекальных инъекциях в качестве способа оценки «выживаемости» вещества после интратекального введения. Указанный краситель смешивали с тестируемым веществом перед введением; к тестируемому веществу добавляли 1 нМ красителя в объеме 1 мл. Для отслеживания вводимого вещества помимо красителя, поглощающего в инфракрасной области, применяли 1 мкл FD&C blue №1 (0,25%). Указанный синий краситель является общепринятой пищевой добавкой и, в целом, считается безопасным и нетоксичным.

ИТ введение rhASA или основы в пояснично-крестцовый отдел

[0636] Животным из групп В, D, Е и F производили интратекальные инъекции в дни 1,9, 15 или 16, и 22.

[0637] Взрослых мышей подвергали анестезии посредством внутрибрюшинной инъекции 1,25% 2,2,2-трибромэтанола (авертина) в концентрации 200-300 мл/10 грамм массы тела (250-350 мг/кг). Шерсть на спине срезали от основания хвоста до области лопаток с использованием ножниц. Обритую область протирали тампоном со скрабом на основе повидина/бетадина, и далее - изопропиловым спиртом. Над пояснично-крестцовым отделом позвоночника делали маленький разрез кожи по срединной линии (1-2 см), и находили место пересечения срединной линии спины и ближнего к голове края крыльев подвздошной кости (одиночная подвздошная кость). Мышца в подвздошной ямке (средняя ягодичная) представляет собой мышцу в форме сердца. Две стороны верхушки «сердца» указывают приблизительное расположение крыльев подвздошной кости. Иглу 32 калибра, присоединенную к герметичному стеклянному шприцу Гамильтона объемом 10-20 мкл, вводили до тех пор, пока не возникало сопротивление со стороны нижележащей кости. Затем проводили инъекцию 10 мкл тестируемого вещества, 1 мкл красителя, поглощающего в инфракрасной области и 1 мкл FD&C blue #1 (суммарный вводимый объем 12 мкл) с приблизительной скоростью 2 мкл/20 секунд (12 мкл/2 минуты). Разрез кожи зашивали путем наложения клипс. Успешность введения оценивали посредством визуализации, определяя, распределился ли краситель, поглощающий в инфракрасной области, а также синий краситель по ЦНС. После визуализации животному давали восстановиться в реабилитационной камере.

Внутривенная инъекция rhASA

[0638] Животным из группы С производили внутривенные инъекции в дни 1, 9, 15 и 22.

[0639] Для проведения ВВ инъекций животных подвергали анестезии с использованием изофлурана, при необходимости, и помещали в ограничитель. Для расширения хвостовой вены, хвост разогревали, аккуратно постукивая по нему пальцем. Участок инъекции протирали 70% этанолом. В качестве альтернативы животное помещали в теплую камеру (40°C) на 1-1,5 минут. Для введения тестируемого вещества применяли иглу 28-30 калибра. Вводимый объем составлял 5-10 мл/кг.

[0640] Приблизительно через 24 часа после введения четвертой дозы животных из групп B-F подвергали эвтаназии. Далее проводили разные процедуры отбора тканей у животных, как описано ниже. Животным из группы А никакие препараты не вводили; однако их подвергли эвтаназии 27 или 28 января 2011 г., и были выполнены процедуры отбора тканей, как описано ниже.

Сыворотка (все животные)

[0641] Терминальную пробу крови (приблизительно 0,5 мл) отбирали у всех животных (группы A-F) посредством ретроорбитальной пункции под изофлуорановой анестезией. В глазницу вводили стеклянную трубку, аккуратно проводили ее в область за глазным яблоком и, тем самым, нарушали венозный отток позади глазного яблока. Кровь собиралась благодаря капиллярному эффекту и/или движению самотеком. После отбора крови на глазницу надавливали, чтобы прекратить кровотечение.

[0642] Пробы цельной крови обрабатывали, получали сыворотку и замораживали ее при <-80°C. Сыворотку хранили при -80°C и анализировали на наличие антител.

Ткани для исследования под световым микроскопом (Группы A-F; 5 мышей на группу)

[0643] После отбора крови животных подвергали эвтаназии посредством удушения CO₂. Перед перфузией отбирали фрагмент хвоста и замораживали его для возможного генотипирования. Полость перикарда подвергали обработке. Трем (3) мышам на группу проводили транскардиальную перфузию гепаринизированным физиологическим раствором (1 Е/мл гепарина натрия в 0,9% NaCl, после стерильной фильтрации), охлажденным на льду, а затем 4% параф ормальдегидом приблизительно при 4°C. Извлекали головной мозг и вскрывали брюшную полость для последующей работы с внутренними органами. Головной мозг и тушку помещали в параформальдегид, за исключением фрагмента хвоста, который замораживали.

Ткани для анализа липидного состава (группы А, В и F; животные 6, 4 и 5, соответственно)

[0644] После отбора крови животных подвергали эвтаназии посредством удушения СО₂. Перед перфузией отбирали фрагмент хвоста и замораживали его для возможного генотипирования. Полость перикарда подвергали обработке. Для анализа липидного состава 4-6 мышам на группу проводили транскардиальную перфузию гепаринизированным физиологическим раствором (1 Е/мл гепарина натрия в 0,9% NaCl, после стерильной фильтрации), охлажденным на льду. Ткани, отбираемые для анализа липидного состава представлены в Таблице 39.

Таблица 39
Ткани, отбираемые для анализа липидного состава
Головной мозг (разделенный на левое и правое полушарие и взвешенный)	Почки (2)
Спинной мозг (извлеченный из позвоночника)
Седалищный нерв (2) (отделенный от мышц)	Фрагмент хвоста(перед перфузией)

При отборе ткани взвешивали, а затем замораживали, либо на сухом льде, либо помещая в морозильник с температурой -80°C. Головной мозг разделяли на левое и правое полушарие. Правое полушарие применяли для анализа липидного состава методом МС. Левое полушарие предназначалось для возможного анализа на N-ацетил-L-аспартат (NAA). Ткани хранили при -80°C до проведения анализа. Условия хранения проб представлены в Таблице 40.

Таблица 40
Условия хранения проб
Тип пробы	Температура хранения
сыворотка	заморожена приблизительно при -80°C
ткани для анализа липидного состава	заморожены приблизительно при -80°C
фрагменты хвоста	заморожены приблизительно при -80°C
ткани для световой микроскопии	приблизительно 4°C

[0645] rhASA снижала накопление сульфатидов в спинном мозге мышей с МЛД, особенно в белом веществе, Фигура 114. Морфометрический анализ спинного мозга продемонстрировал, что оптическая плотность окрашивания альциановым синим статистически значимо снижалась после введения rhASA, Фигура 115. У мышей с МЛД, получавших rhASA, также была снижена активность лизосом в головном мозге. Фигура 116. Указанное снижение было статистически значимым в группе, получавшей высокую дозу (0,21 мг - 520 мг/кг массы головного мозга) по сравнению с мышами, получавшими только основу. Фигура 117.

[0646] Иммунотолерантные мыши с МЛД (hASAC69S/ASA(-/-)) старше 1 года получали rhASA интратекально в поясничный отдел один раз в неделю в течение 4 недель (всего 4 дозы). Дозы включали основу (154 мМ NaCl, 0,005% полисорбата 20, pH ~6,0), 0,04, 0,12, 0,21 мг/дозу (нормированные дозы составляли 100, 300 и 520 мг/кг массы головного мозга, соответственно). В терминальные моменты времени эффективность определяли посредством иммуногистохимической оценки клиренса сульфатидов и активности лизосом в головном и спинном мозге. Срезы спинного и головного мозга окрашивали альциановым синим, который нацелен на сульфатиды в тканях. Срезы головного мозга также окрашивали на наличие ассоциированного с лизосомами мембранного белка (LAMP) в качестве индикатора лизосомальных процессов. Кроме того, на срезах спинного и головного мозга, окрашенных альциановым синим и LAMP, проводили морфометрический анализ.

[0647] Указанные предварительные результаты демонстрируют эффективность интратекального введения rhASA в поясничный отдел. По сравнению с мышами, получавшими только основу, у мышей с МЛД, получавших rhASA, были получены подтверждения улучшения на основании гистологических маркеров заболевания, таких как сокращение накопления сульфатидов (выявляется по окрашиванию альциановым синим) и лизосомальной активности в головном мозге. Указанные гистопатологические изменения наблюдались вблизи участка введения (поясничный отдел спинного мозга), в дистальных отделах спинного мозга, а также в дистальных отделах головного мозга.

ПРИМЕР 18: БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЕ 2

Краткий обзор

[0648] В данном исследовании 36 самцов и 36 самок молодых длиннохвостых макак (возраст <12 месяцев в начале исследования) случайным образом распределяли в 5 лечебных групп, и они получали rhASA в дозах 0 (контроль вживления устройства; животные получали 0,6 мл ФБР), 0 (контроль с введением основы) 1,8, 6,0 или 18,6 мг (группы 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно) раз в две недели в течение 6 месяцев: всего 12 доз. Все дозы вводили в форме инфузии в объеме 0,6 мл, после чего устройство введения промывали 0,5 мл ФБР приблизительно в течение 10 минут (Таблица 41).

Таблица 41
Схема эксперимента
Группа	Кол-во животных	Номинальная концентрация в дозе (мг/мл)	Вводимая доза (мг)	Кол-во животных, умерщвленных через 6 месяцев	Кол-во животных, умерщвленных после месячного периода восстановления
1	4М, 4Ж	DC	0	-	4М, 4Ж
2	8М, 8Ж	0	0	4М, 3Жa	4М, 4Ж
3	8М, 8Ж	3	1.8	4М, 4Ж	4М, 4Ж
4	8М, 8Ж	10	6,0	4М, 4Ж	4М, 4Ж
5	8М, 8Ж	31	18,6	4М, 4Ж	4М, 4Ж
DC = контроль устройства; животные в группе 1 не получали ни основы, ни тестируемого вещества.
aЖивотное из группы контроля введения основы №044 было умерщвлено в день 50 из-за утечки в катетере.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Отбор тканей

[0649] Головни мозг нарезали в специальной среде с толщиной фронтального среза приблизительно 3 мм. Из каждого головного мозга получали полные фронтальные срезы, включающие новую кору (включая кору лобных, теменных, височных и затылочных долей), древнюю кору (обонятельные луковицы и/или грушевидную долю), базальные ганглии (включая хвостатое ядро и скорлупу), лимбическую систему (включая гиппокамп и поясные извилины), таламус, гипоталамус, отделы среднего мозга (включая черное вещество), мозжечок, мост и продолговатый мозг. Места, откуда были получены индивидуальные пробы ткани (через биопсический прокол 4 мм), показаны на Фигурах 133-138. Изображения на Фигурах 133-138 получены из Университета Висконсина и Мичиганской Государственной Сравнительной Коллекции Мозга Млекопитающих (также называемой Национальным музеем здоровья и медицины). Образец из прокола №22 не отбирали, поскольку данной структуры не было во время вскрытия. Все пробы тканей головного мозга замораживали и хранили при -60°C или ниже до проведения анализа на rhASA с использованием твердофазного иммуноферментного анализа.

[0650] Первый срез головного мозга и далее каждый последующий срез фиксировали в формалине для гистопатологической оценки и иммуногистохимического анализа. Второй срез головного мозга и каждый последующий второй срез замораживали для анализа тестируемого вещества. Перед замораживанием пробы тканей головного мозга для анализа биораспределения брали из правой части срезов головного мозга для анализа тестируемого вещества под четными номерами. Локализацию проб головного мозга фотографировали при вскрытии и записывали номера срезов головного мозга. Пробы отбирались либо через 4 мм круговой прокол, либо через разрез, выполненный скальпелем, чтобы оптимизировать количество отбираемого белого вещества. Все биопсические образцы замораживали при -60°C или ниже для проведения анализа тестируемого вещества. Остаток среза головного мозга замораживали и хранили при -60°C или ниже для возможного проведения анализа тестируемого вещества.

[0651] Из спинного мозга (шейный, грудной и поясничный отделы) изготавливали срезы толщиной один сантиметр. Первый срез и каждый последующий срез фиксировали в формалине для гистопатологической оценки и иммуногистохимического анализа. Второй срез спинного мозга и каждый последующий второй срез замораживали и хранили при -60°C или ниже для анализа тестируемого вещества. Распределение срезов корректировали так, чтобы срез с кончиком интратекального катетера (срез 0) можно было фиксировать в формалине и подвергнуть гистопатологическому анализу.

Приготовление экстрактов головного мозга, печени и спинного мозга и определение концентрации rhASA

[0652] Биопсические образцы головного мозга, пробы спинного мозга и печени анализировали с использованием прошедшего валидацию способа в соответствии с принципами Надлежащей лабораторной практики (GLP) Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами США (PDA) 21 CFR, Часть 58, и в соответствии с применимыми Стандартными операционными процедурами биологических исследований на Среднем Западе. Пробы ткани гомогенизировали в лизирующем буфере, центрифугировали для удаления обломков тканей и хранили при -80°C до проведения анализа. Концентрацию rhASA в растворимых фракциях гомогенатов определяли с использованием ELISA с применением поликлонального антитела кролика SH040 в качестве иммобилизованного антитела, и конъюгированного с ПХ (пероксидазой хрена) моноклонального анти-ASA антитела 19-16-3 в качестве детекторного антитела. После этапа отмывки, направленного на удаление несвязавшегося вещества, раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМВ) реагировал с пероксидазой в присутствии ПХ-конъюгированного антитела, формируя колориметрический сигнал, который был пропорционален количеству rhASA, связанному анти-ASA антителом на первом этапе. Итоговое количество rhASA в гомогенате каждой ткани вычисляли путем интерполяции стандартной кривой.

[0653] Пробы также анализировали с использованием способа определения белков с участием бицинхониновой кислоты (ВСА), чтобы узнать концентрацию белка в пробе. Концентрацию белка в каждой пробе определяли путем интерполяции стандартной кривой для альбумина. Затем результаты определения концентрации rhASA нормировали на общее содержание белка в экстрактах ткани, которое определили помощи способа с участием бицинхониновой кислоты.

[0654] Уровень rhASA во всех биопсических образцах для групп, получавших основу, 1,8 мг/дозу, 6,0 мг/дозу и 18,6 мг/дозу, показаны на Фигуре 118, Фигуре 119, Фигуре 120 и Фигуре 121, соответственно. Уровень rhASA во всех биопсических образцах у животных, прошедших период восстановления из групп контроля введения устройства, основы, 1,8 мг/дозу, 6,0 мг/дозу и 18,6 мг/дозу, показаны на Фигуре 122, Фигуре 123, Фигуре 124, Фигуре 125 и Фигуре 126, соответственно.

[0655] Уровень rhASA в избранных биопсических образцах, которые отбирали вблизи поверхности (оболочки мозга) головного мозга показаны на Фигуре 127. Уровень rhASA в избранных биопсических образцах, которые, как предполагается, должны содержать в основном глубокие слои белого вещества головного мозга, показаны на Фигуре 128. Белое вещество состоит из пучков миелинизированных нервных клеток (или аксонов). Выбранные пучки, которые содержат в основном глубокие слои белого вещества головного мозга, показаны на Фигуре 129. Серое вещество содержит тела нервных клеток, в отличие от белого вещества. Значения концентрации rhASA в избранных биопсических образцах с поверхности, из глубоких слоев белого вещества и глубоких слоев серого вещества для каждой группы показаны на Фигуре 130.

[0656] Данные о концентрации в спинном мозге приведены на Фигуре 131.

[0657] Данные о концентрации в печени приведены на Фигуре 132.

[0658] В некоторых случаях уровень rhASA в печени, спинном и головном мозге группы контроля устройства и контрольной группы, получающей основу, был определимым. Уровень в печени и спинном мозге был ниже, чем в любой из групп, получавших rhASA. Уровень rhASA в группе контроля устройства и контрольной группе, получающей основу, отражает перекрестную реактивность между анти-rhASA антителом, применяемым в ELISA, с нативным белком длиннохвостых макак. Приводимые значения в тканях группы контроля устройства и контрольной группы, получающей основу, не отражает количественные показатели rhASA в тканях длиннохвостых макак, поскольку степень перекрестной реактивности между антителом и rhASA длиннохвостых макак неизвестен, и в связи с тем фактом, что в стандартах анализа применяется rhASA. Однако колебания уровня rhASA, определяемые между тканями группы контроля устройства и контрольной группы, получающей основу, можно интерпретировать как демонстрируемую вариабельность относительных количеств rhASA у длиннохвостых макак в разных тканях и анатомических отделах.

[0659] Уровень rhASA в срезах спинного мозга варьировал в диапазоне 160-2352, 1081-6607 и 1893-9252 нг/мг белка у самцов и в диапазоне 0-3151, 669-6637 и 1404-16424 у самок из групп, получавших 1,8, 6,0 и 18,6 мг/дозу, соответственно (Фигура 127). Уровень rhASA был выше в поясничном отделе спинного мозга, чем в шейном отделе. Уровень белка rhASA, определяемый в печени, в группах, получавших rhASA, зависел от дозы и был очень низким в группе, получавшей основу. Средний уровень rhASA составлял 88, 674 и 2424 у самцов и 140, 462 и 1996 нг/мг белка у самок для групп, получавших 1,8, 6,0 и 18,6 мг/дозу, соответственно (Фигура 128).

[0660] В целом, представляется, что уровень rhASA зависит от дозы в пробах, приготовленных из срезов спинного мозга и печени животных из групп, получавших rhASA. Во многих из тестируемых отделов спинного мозга была продемонстрирована зависимость уровня rhASA от вводимой дозы, хотя в других отделах зависимость от дозы была менее определенной. В целом, уровень rhASA в головном мозге повышался с увеличением дозы rhASA.

ПРИМЕР 19: ФАРМАКОКИНЕТИКА (ФК) И БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЕ rhASA. СРАВНЕНИЕ ИТ И ВВ ВВЕДЕНИЯ.

[0661] Цель данного исследования состояла в оценке фармакокинетики (ФК) и биораспределения разных ферментов для заместительной ферментной терапии после интратекального (ИТ) и внутривенного (ВВ) введения длиннохвостым макакам.

[0662] В данном исследовании всего двенадцать самцов и самок длиннохвостых макак с интратекальном катетером в поясничном отделе (ИТ-П) случайным образом распределяли в зависимости от массы тела в четыре лечебных группы для Фазы 1а (введение I2S) и Фазы 1b (введение rhASA).

[0663] В обеих фазах пробы крови и СМЖ (из ИТ-П катетера) отбирали через заданные интервалы времени после введения препарата. После отбора последних проб в Фазе 1а животных оставляли на 7-дневный период отмывки, после чего начинали Фазу 1b.

[0664] После отбора последних проб в Фазе 1b животных оставляли на 7-дневный период отмывки, после чего начинали Фазу 2. Всего 12 самцов и самок длиннохвостых макак из Фазы 1b случайным образом распределяли в зависимости от массы тела в двенадцать лечебных групп для получения I2S (группы 1а-6а) и rhASA (группы 1b-6b).

[0665] Абсолютная биодоступность rhASA в сыворотке после ИТ-П введения составила ~30-40%. В отличие от этого, при ВВ ведении биодоступными в СМЖ были лишь 0,5% от введенной дозы.

[0666] Воздействие rhASA в сыворотке после ИТ-П введения увеличивалось более чем пропорционально дозе.

[0667] После ИТ-П введения воздействие rhASA в СМЖ при увеличении дозы возрастало менее чем пропорционально дозе. Результаты представлены в Таблицах 42-45.

Таблица 42
Итоговые ФК показатели rhASA в сыворотке длиннохвостых макак
Среднее (КВ %)	Арилсульфатаза А в сыворотке
	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ВВ 1 мг/кг)	Арилсульфатаза A (Фаза 1b: ИТ-П 1,8 мг)	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ИТ-П6 мг)	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ИТ-П 18,6 мг)
N	8	6	8	8
AUC0-t (нг⋅ч/мл)	10505 (16,9)	2219 (41,9)	10352 (31,9)	17583 (28,2)
AUC0-∞ (нг⋅ч/мл)	11069 (17,2)	НО (НО)Ь	9634 (28,9)с	20789 (27,8)d
Cmax (нг/мл)	11911 (20,0)	363 (40,4)	1160 (29,9)	1621 (25,1)
Tmax (ч)	0,08 (0,08, 0,08)	4,00 (2,00, 4,00)	4,00 (1,00, 4,00)	3,00 (1,00, 4,00)
t1/2 (ч)	6,55 (31,8)	НО (НО)b	6,77 (21,4)с	7,40 (32,8)d
CL или CL/F мл/ч)	261 (17,0)	НО (НО)b	654 (25,0)с	944 (25,4)d
Vz или Vz/F (мл)	2418 (32,4)	НО (НО)b	6523 (41,3)с	9686 (25,8)d

Таблица 43
Итоговые ФК показатели rhASA в СМЖ длиннохвостых макак
Среднее (КВ%)	Арилсульфатаза А в СМЖ
	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ВВ 1 мг/кг)	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ИТ-П 1,8 мг)	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ИТ-П 6 мг)	Арилсульфатаза A (Фаза 1b: ИТ-П 18,6 мг)
AUC0-t (нг⋅ч/мл)	4	5	8	8
AUC0-∞ (нг⋅ч/мл)	1629 (179,8)	1267266 (86,6)	5334329 (68,8)	8028775 (71,2)
Cmax (нг/мл)	8221 (H0)b	1595942 (79,1)с	4291829 (84,2)d	9406664 (64,5)е
Tmax (ч)	69,3 (94,2)	345167 (48,7)	1039079 (73,6)	1841125 (62,8)
Tmaxa (ч)	6,00 (1,00, 8,00)	0,08 (0,08, 4,00)	0,29 (0,08, 4,00)	2,04 (0,08, 4,00)
t1/2 (ч)	37,6 (HO)b	23,6 (68,3)с	17,1 (31,3)d	13,4 (29,3)е
CL или CL/F (мл/ч)	392 (HO)b	1,95 (74,1)с	38,1 (214,8)d *	3,04 (66,1)е
Vz или Vz/F (мл)	21237 (НО)b	80,6 (110,4)с	1090 (215,1)d	67,6 (81,2)е

Таблица 44
Биодоступность rhASA в сыворотке и СМЖ
	Сравнение абсолютной биодоступности
	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ИТ-П 1,8 мг)	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ИТ-П 6 мг)	Арилсульфатаза A (Фаза 1b: ИТ-П 18,6 мг)
Fabs (%)	НО	39,9	27,3

[0668] Биодоступность rhASA в сыворотке после ИТ-П введения составила ~30-40%. В отличие от этого, при ВВ ведении био доступными в СМЖ были лишь 0,5% от введенной дозы.

Таблица 45
Распределение СМЖ: сыворотка
Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ВВ 1 мг/кг)	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ИТ-П 1,8 мг)	Арилсульфатаза А (Фаза 1b: ИТ-П 6 мг)	Арилсульфатаза A (Фаза 1b: ИТ-П 18,6 мг)
0,74	НО	445	452

ПРИМЕР 20: ЛЕЧЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ С МЛД

[0669] Прямое введение в ЦНС, например, посредством ИТ доставки, можно применять для эффективного лечения пациентов с МЛД. Данный пример иллюстрирует многоцентровое исследование с увеличением дозы, направленное на оценку безопасности 3 уровней доз rhASA, вводимых раз в две недели (р/2 нед.) в течение 40 недель через устройство интратекальной доставки лекарственных препаратов (IDDD) пациентам с инфантильной формой МЛД. Разные варианты устройств интратекальной доставки лекарственных препаратов, применимых для лечения людей, показаны на Фигуре 94, Фигуре 95, Фигуре 96 и Фигуре 97.

[0670] Всего в исследование было включено до 20 пациентов:

Когорта 1: 5 пациентов (Минимальная доза)

Когорта 2: 5 пациентов (Средняя доза)

Когорта 3: 5 пациентов (Максимальная доза)

5 пациентов были рандомизированы в группу, не получающую препарат.

[0671] Для участия в исследовании пациентов отбирали на основании следующих критериев включения: (1) наличие первых симптомов до наступления возраста 30 месяцев; (2) ходячее состояние на момент скрининга (определяется как способность самостоятельно вставать и проходить вперед 10 шагов (при поддержке за одну руку); (3) наличие неврологических признаков в момент скрининга. Обычно пациентов с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток в анамнезе исключают.

[0672] Определяют безопасность увеличивающихся доз rhASA, вводимой путем ИТ инъекций, в течение 40 недель детям с поздним началом инфантильной формы МЛД. Кроме того, оценивают клиническую активность rhASA в отношении общей моторики, а также фармакокинетику однократных и многократных доз препарата в сыворотке и концентрации в спинномозговой жидкости (СМЖ).

Примеры ИТ доставки HNS

ПРИМЕР 21: ХРОНИЧЕСКОЕ ИНТРАТЕКАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ ГЕПАРАН-СУЛЬФАТАЗЫ

[0673] В данном примере продемонстрировано, что интратекальное введение можно применять для эффективной доставки лизосомального фермента, такого как рекомбинантная гепаран-N-сульфатаза человека (rhHNS), в ткани головного мозга для борьбы с неврологическими симптомами мукополисахаридоза IIIA (ПМС IIIA; синдром Санфилиппо типа А), которые являются определяющей особенностью данного расстройства. Эксперименты, описанные в данном примере, демонстрируют, что хроническое ИТ введение rhHNS хорошо переносилось и приводило к дозозависимой активности фермента в головном, спинном мозге и печени.

[0674] Вкратце, лекарственная форма рекомбинантной гепаран-N-сульфатазы человека (rhHNS) для интратекального (ИТ) введения была разработана для лечения неврологических симптомов мукополисахаридоза IIIA (ПМС IIIA; синдром Санфилиппо типа А), которые являются определяющей особенностью данного расстройства. Поскольку средний возраст пациентов с MPS IIIA составляет 4,5 года, базовые токсикологические исследования применения HNS проводили на молодых длиннохвостых макаках с целью оценки влияния на развивающийся головной мозг. Обезьянам вживляли интратекальное (ИТ) устройство ввода лекарственных препаратов в поясничный отдел и проводили через него краткосрочные инфузии раз в две недели (1,5, 4,5 или 8,3 мг/дозу HNS в течение 6 месяцев; 12 доз), а контроль введения устройства и контроль с введением основы получал фосфатно-солевой буфер или основу, соответственно. По восемь животных из каждой группы подвергали вскрытию через 3 и 6 месяцев (группу контроля введения устройства подвергали вскрытию через 3 месяца), а 8 животных из группы контроля и из трех групп разных доз HNS подвергали вскрытию через 1 месяц после введения последней ИТ дозы. Никаких связанных с HNS клинических признаков или ярко выраженных поражений центральной нервной системы не наблюдалось. По сравнению с контрольными группами в оболочках мозга/периневрии, окружающем головной/спинной мозг выявлялись клеточные инфильтраты малой или минимальной тяжести, которые коррелировали с временным увеличением числа лейкоцитов, преимущественно эозинофилов, в спинномозговой жидкости (СМЖ), которые в основном разрешались через 1 месяц после введения дозы. Указанные изменения не были ассоциированы с какими-либо нежелательными морфологическими изменениями в головном или спинном мозге. По-видимому, имела место тенденция к более высокому уровню HNS в СМЖ и более высокому уровню активности HNS в тканях головного, спинного мозга и печени. Уровнем отсутствия наблюдаемых нежелательных эффектов был уровень 8,3 мг/дозу, вводимый раз в две недели, т.е. максимальная вводимая доза, что указывает на то, что HNS можно безопасно вводить интратекально в разных концентрациях, включая концентрации выше 8,3 мг/дозу.

Синдром Санфилиппо типа А

[0675] Мукополисахаридоз типа IIIA (MPS IIIA; Синдром Санфилиппо типа А), редкая лизосомная болезнь накопления, поражающая людей во всем мире с частотой 1: 100 000, которая развивается вследствие отсутствия или недостаточной функции гепаран-N-сульфатазы (HNS) (Neufeld EF, et al. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001) pp.3421-3452) - экзосульфатазы, участвующей в лизосомальном катаболизме гликозаминогликан (ГАГ)-гепаран-сульфата. В отсутствие указанного фермента ГАГ-гепаран-сульфат накапливается в лизосомах нейронов и клеток глии, и за пределами головного мозга накопление происходит менее интенсивно. Определяющим клиническим признаком указанного расстройства является дегенерация центральной нервной системы (ЦНС), которая приводит к выпадению или невозможности достижения основных этапов умственного и физического развития. Прогрессивное снижение когнитивных способностей в итоге приводит к деменции и ранней смертности.

ИТ доставка rhHNS

[0676] Поскольку средний возраст пациентов с MPS IIIA составляет 4,5 года, базовые токсикологические исследования применения HNS проводили на молодых длиннохвостых макаках (выбор вида, основанный на генетическом и анатомическом сходстве с человеком) с целью оценки влияния на развивающийся головной мозг. Эквивалентность возрастов обезьян и человека согласно литературным данным варьирует в диапазоне от 7,6 до 12,1 месяцев у обезьян, приравниваемых к возрасту 30-40 месяцев у детей (Hood RD, Developmental and Reproductive Toxicology: A practical approach (2006) p.276). В качестве составной части решения указанной задачи проводили 6-месячное токсикологическое исследования на молодых длиннохвостых макаках, в котором оценивали ИТ введение в поясничный отдел позвоночника. При выборе уровня доз и дизайна 6-месячного исследования многократных доз на длиннохвостых макаках руководствовались данными, полученными в предыдущем 1-месячном исследовании токсичности на длиннохвостых макаках. Насколько нам известно, данное исследование является первым исследованием с хроническим ИТ введением средств ЗФТ приматам, отличным от человека, молодого возраста.

[0677] В данном исследовании применяли 56 самцов и 56 самок молодых длиннохвостых макак (Macaco, fascicularis) в возрасте приблизительно от 6 до 9 месяцев, с приблизительной массой от 0,82 до 1,81 кг. В качестве питания обезьяны ежедневно получали по 15 брикетов сертифицированного PMI корма для приматов 5048 (Ричмонд, Индиана). Воду подавали в любом количестве через автоматическую систему фильтрации воды, но подачу воды прекращали в периоды отбора проб мочи. Обезьян после прибытия размещали по группам (по две в клетке) на период 2-4 недели в клетках из нержавеющей стали, за исключением 3-месячных обезьян; указанных обезьян размещали по одной в клетках из нержавеющей стали. На протяжении всего исследования всех обезьян размещали по одной в клетках из нержавеющей стали, в комнатах с контролируемой температурой и влажностью, при световом периоде 12 часов света: 12 часов темноты.

[0678] Перед началом исследования всем обезьянам хирургическим путем имплантировали ПК порт и ИТ катетеры. Перед операцией вводили преднизолон натрия сукцинат (ВВ, 30 мг/кг) и флуниксин меглюмин (внутримышечно [ВМ], 2 мг/кг). Обезьян предварительно готовили, вводя ПК атропина сульфат 90,04 мг/кг), проводили седацию ВМ кетамином гидрохлоридом (8 мг/кг), интубировали и обеспечивали подачу кислорода приблизительно 1 л/мин и 2,0% изофлурана. Над задними отростками поясничных позвонков (L₄, L₅ или L₆) делали разрез и проводили гемиламинэктомию для введения сужающегося полиуретанового катетера (длина 25 см, наружный диаметр 0,9 мм × внутренний диаметр 0,5 мм, с шестью боковыми отверстиями диаметром 0,33 мм) на уровне L₃, L₄ или L₅. Через маленькое дуральное отверстие вводили катетер и продвигали его приблизительно на 10 см вперед до области соединения поясничного и грудного отдела. ПК порт из титана соединяли с ИТ катетером и вводили в ткани подкожно. Правильное расположение катетера подтверждали посредством миелограммы, полученной с использованием Isovue-300 (0,8 мл; «Bracco Diagnostics, Inc.», Принстон, Нью-Джерси). После восстановления после операции обезьяны получали буторфанол тартрат (ВМ, 0,05 мг/кг) и цефтиофур натрия (ВМ, 5,0 мг/кг два раза в день в течение 2 дней).

[0679] В данном примере HNS вводили в основе для ИТ введения, включающей 5 мМ фосфата натрия, 145 мМ хлорида натрия и 0,005% полисорбата 20 (рН 7,0). Дозы HNS вводили раз в две недели в форме краткосрочной инфузии, длящейся приблизительно одиннадцать минут: 0,6 мл (4 минуты), и последующая промывка 0,5 мл фосфатно-солевым буфером (ФБР) (7 минут). Обезьяны в группе контроля основы получали только основу для ИТ введения; обезьяны DC получали ИТ ФБР (рН 7,2).

Заболеваемость и смертность

[0680] Не было ни одного случая связанного с HNS летального исхода или раннего умерщвления. При введении препарата или во время ежедневных наблюдений не было выявлено никаких связанных с HNS клинических признаков. Ненормальное положение, зуд кожи, тремор и атаксия, наблюдаемые во время и после введения, разрешались в течение нескольких минут - 4 часов после введения, и рассматривались как реакция на объем, а не как реакция на HNS или основу. Клинические признаки, наблюдаемые во время введения препарата и непосредственно после него, имели сопоставимую частоту в контрольных группах (DC и/или группа, получавшая основу); указаний на зависимость «доза-ответ» не было. В целом, частота клинических признаков при введении препарата снижалась при введении каждой последующей дозы. Связанных с HNS изменений массы тела, потребления пищи, а также физикальных и неврологических признаков, или изменения ЭКГ или данных офтальмологического исследования не возникало.

Клиническая патология

[0681] Ни в один из интервалов не возникало изменений гематологии, биохимии крови, свертывания крови или показателей анализа мочи, оцениваемых как связанные с HNS.

Количество клеток и биохимия СМЖ

[0682] Через 24 часа после введения препарата во всех группах, включая DC (контроль дозы) и 0 мг/кг, происходило дозозависимое увеличение среднего количества лейкоцитов в СМЖ. Происходило общее увеличение количества лейкоцитов при каждой вводимой дозе. Отбор СМЖ приблизительно у половины обезьян перед введением препарата показал, что указанные эффекты уменьшались за две недели с момента введения предыдущей дозы. После введения дозы 5 помимо увеличения количества лейкоцитов наблюдался более высокий среднегрупповой уровень белка и альбумина в СМЖ у самцов, получавших 4,5 и 8,3 мг/дозу (до 4-5 - кратного увеличение), по сравнению со средним значением до введения препарата (Р≤0,05 по сравнению с DC и 0 мг/кг); у самок в группах, получавших HNS выявлялась менее выраженная тенденция.

Анализ концентраций HNS и антител к нему

[0683] Обычно средний уровень HNS в сыворотке во всех группах исследования во все моменты времени был ниже предела определения (ПО). Концентрация HNS в СМЖ обезьян в DC и группе контроля основы обычно была ниже предела количественного определения (ПКО). Хотя статистического анализа не проводили, по-видимому, имела место тенденция к зависимости от дозы в сторону более высоких средних уровней HNS в СМЖ групп, получавших 1,5, 4,5 и 8,3 мг/дозу. Средний уровень HNS в СМЖ перед введением препарата был значительно ниже, чем уровень HNS в СМЖ после его введения. Средние концентрации HNS в 6-месячной когорте (оба пола) в конце исследования (основное вскрытие и вскрытие после периода восстановления) приведены в Таблице 46. При данном уровне доз концентрации HNS в СМЖ, по-видимому, сохраняются в одном и том же диапазоне (Фигура 146А), несмотря на уровень анти-HNS антител в сыворотке и СМЖ, который продолжает расти на протяжении всего исследования.

Таблица 46
Концентрации HNS в СМЖ в конце исследования (основное вскрытие и вскрытие после периода восстановления)
	Основное вскрытие		Вскрытие после периода восстановления
Группа	n	Среднее ± COa (нг/мл)		n	Среднее ± СО (нг/мл)
Основа	8	-		8	НП
1,5 мг ИТ	8	516 366±1024 084		8	НП
4,5 мг ИТ	7	377460±304996		7	НП
8,3 мг ИТ	8	419 492±345 975		8	НП
СМЖ, спинномозговая жидкость; HNS, гепаран-N-сульфатаза человека; n = количество проб с уровнем выше ПКО; ИТ, интратекально; СО, стандартное отклонение.
апробы, отобранные, приблизительно через 24 часа после введения препарата.
НП = нет проб, применимых для анализа, или пробы с уровнем ниже ПКО.

[0684] В 6-месячной когорте/когорте, прошедшей период восстановления ни в один из моментов времени ни у одной обезьяны из группы контроля устройства (только ФБР) или из группы, получавшей только основу, не образовалось анти-HNS антител в сыворотке или СМЖ. Пробы сыворотки и СМЖ, отобранные у всех обезьян из групп, получавших 1,5, 4,5 и 8,3 мг/дозу перед исследованием (для СМЖ) и перед введением дозы 2, были негативны (<ПКО) в отношении анти-HNS антител. К концу исследования пробы сыворотки всех обезьян были положительны в отношении анти-HNS антител.

[0685] Пробы СМЖ всех обезьян из групп, получавших 1,5 и 8,3 мг/дозу, и шести обезьян из группы, получавшей 4,5 мг/дозу, были положительны в отношении анти-HNS антител в один или более моментов времени. Поскольку у двух обезьян из группы, получавшей 4,5 мг/дозу, пробу не отбирали ни в один момент времени, включая вскрытие, указанные результаты, по-видимому, указывают на то, что все у всех обезьян, получавших HNS, формировался гуморальный иммунный ответ.

[0686] При всех трех уровнях доз концентрацию анти-HNS антител в сыворотке определяли после дозы 2, и после введения дозы 4 уровень значительно повышался. Хотя статистического анализа не проводили, по-видимому, имела место тенденция к зависимости от дозы в сторону более высокой концентрации анти-HNS антител; к концу исследования уровень антител был сопоставимым во всех 3 группах, получавших HNS (Фигура 146В). Уровень анти-HNS антител в сыворотке всегда был выше, чем в СМЖ на протяжении всего исследования (от 9 до 236-кратного превышения концентрации антител в сыворотке над концентрацией в СМЖ); максимальное отношение концентраций в сыворотке/СМЖ (98 и 236 раз) наблюдалось при уровне дозы 8,3 мг на ранней стадии введения препарата (6 и 10 недель).

[0687] Концентрация анти-HNS антител в сыворотке увеличивалась в 9, 16 и 16 раз при дозах 1,5 мг, 4,5 мг и 8,3 мг, соответственно, в начальный период введения препарата (от 6 до 14 недели). В течение того же периода концентрация антител в СМЖ увеличивалась в 30, 41 и 52 раза при дозах 1,5 мг, 4,5 мг и 8,3 мг, соответственно (Фигура 146 В); после месячного периода восстановления существенный уровень оставался (Таблица 47).

Таблица 47
Концентрация анти-HNS антител в СМЖ при окончании исследования (основное вскрытие и вскрытие после периода восстановления).
Группа	Основное вскрытие3		Вскрытие после периода восстановления
n	Среднее ± СО (нг/мл)		n	Среднее ± СО (нг/мл)
Основа	8	-		8	-
1,5 мг ИТ	8	351 456±244 171		8	299 512±226 654
4,5 мг ИТ	7	147 187±213 095		7	193 045±157 896
8,3 мг ИТ	8	185 227±315 858		8	238 727±185785
СМЖ, спинномозговая жидкость; HNS, гепаран-N-сульфатаза человека; ИТ, интратекально; n; количество проб с уровнем выше ПКО; СО; стандартное отклонение.
aПробы, отобранные, приблизительно за 1 неделю до введения препарата.

[0688] В СМЖ анти-HNS антитела появлялись позже, чем в сыворотке (Фигура 146С). Никаких явных дозозависимых различий в концентрации антител в сыворотке или СМЖ не наблюдалось (статистический анализ не проводился из-за маленького размера выборки); заметных различий в гуморальном ответе между самцами и самками не было.

[0689] В присутствии анти-HNS-антитела в СМЖ средние концентрации HNS- в СМЖ, по-видимому, сохранялись, что указывает на то, что присутствие анти-HNS антител в сыворотке и СМЖ не изменяет уровень концентраций вводимого ИТ HNS. Анализ 6-месячной когорты/когорты, прошедшей период восстановления с 6-месячным периодом введения препарата показывает, что концентрация анти-HNS антител в промежуточный период через 3 месяца и в когорте, умерщвленной через 6 месяцев, была сопоставимой (Фигура 146С).

Макроскопические и гистопатологические признаки

[0690] При всех уровнях доз (но не для всех интервалов умерщвления, вне зависимости от пола, не дозозависимо) в паренхиме головного мозга (преимущественно в сером веществе), спинного мозга (в сером и белом веществе), задних корешках/ганглиях спинномозговых нервов (только у самцов, получавших среднюю дозу) присутствовали эозинофильные инфильтраты (Фигура 147А), (Фигура 147B-D). Указанные инфильтраты интерпретировали как вторичные по отношению к инфильтратам в оболочках мозга/периневрии и/или по отношению к присутствию (проникновению) HNS в паренхиму указанной ткани. Хотя имели место многочисленные изменения воспалительного типа, по-видимому, обезьяны переносили введение HNS, и предполагается, что указанные инфильтраты не были связаны и не вызывали нежелательных морфологических изменений в паренхиме нервной системы. Более конкретно, не было никаких признаков некроза/дегенерации нейронов и реакции на введение HNS со стороны глии.

[0691] Микроглиоз в сером веществе головного и спинного мозга в сочетании с клеточными инфильтратами, преимущественно эозинофильными, были относительно частым явлением в ранее проводимом 1-месячном исследовании токсичности у молодых длиннохвостых макак; указанные изменения были относительно редки во время промежуточного умерщвления через 3 месяца в 6-месячном исследовании, но остаточные признаки такой реакции могли еще наблюдаться в когорте, умерщвленной через 6 месяцев (Фигура 147F). Реакции со стороны микроглии обычно возникали относительно рано в ответ на центральное введение (или введение с центральной реакцией) некоторых тестируемых веществ (обычно на основе белков). Эозинофильные инфильтраты действительно коррелировали с повышенным количеством эозинофилов в СМЖ получавших HNS обезьян, хотя указанные клетки не присутствовали в том количестве, которое могло бы вызвать нежелательную реакцию.

[0692] При всех уровнях доз в большинстве групп, получавших HNS, независимо от пола, в задних корешках/ганглиях спинномозговых нервов присутствовали эозинофильные инфильтраты. Указанные инфильтраты в разных тканях нервной системы интерпретировали как вторичные по отношению к инфильтратам в оболочках мозга/периневрии и/или по отношению к присутствию (проникновению) HNS в паренхиму указанной ткани. У обезьян, умерщвленных после периода восстановления, связанные с HNS эффекты обычно либо отсутствовали, либо снижались до контрольного уровня. Некоторые изменения, такие как микроглиоз в спинном мозге, после периода восстановления полностью разрешались. По-видимому, ни одно из связанных с HNS изменений не было ассоциировано с какими-либо нежелательными структурными микроскопическими изменениями в головном или спинном мозге. Ни в спинном, ни в головном мозге, ни в ганглиях некроза нейронов не отмечалось.

Активность фермента HNS

[0693] В 6-месячной когорте/когорте, прошедшей период восстановления активность фермента HNS в спинном и головном мозге группы, получавшей только основу (0,0-0,154 нмоль/ч/мг белка), была сходна с уровнем активности, показанным в тканях когорты, умерщвленной через 3 месяца (промежуточный анализ) (0,0-0,154 нмоль/ч/мг белка). Уровень активности фермента был выше в спинном мозге (в поясничном отделе приблизительно на порядок выше), чем уровень, определяемый в головном мозге или печени, в группах, получавших 4,5 мг и 8,3 мг/дозу, которые демонстрировали сходные между собой уровни. Активность фермента HNS в срезах спинного мозга варьировали в диапазоне 3,9-18,6, 13,1-67,1 и 3,6-69,2 нмоль/ч/мг белка у самцов (Фигура 148А) и 1,8-16,2, 4,5-61,2 и 21,1-66,0 нмоль/ч/мг белка у самок (Фигура 148 В) для групп, получавших 1,5 мг, 4,5 мг и 8,3 мг/дозу, соответственно. В тканях спинного мозга после месячного периода восстановления уровень активности фермента возвращался к уровню, согласующемуся со значениями, полученными для контроля, получавшего только основу.

[0694] Активность фермента HNS в срезах головного мозга варьировали в диапазоне 0,03-16,0, 0,30-55,7 и 0,15-21,2 нмоль/ч/мг белка у самцов (Фигура 148С), и 0,04-5,1, 0,0-14,4 и 0,9-33,2 нмоль/ч/мг белка у самок (Фигура 148D) для групп, получавших 1,5 мг, 4,5 мг и 8,3 мг/дозу, соответственно. В тканях головного мозга после периода восстановления уровень активности фермента возвращалась к уровню, согласующемуся с контрольными значениями.

[0695] Кратность изменений активности для разных областей головного мозга по сравнению с эндогенным уровнем (группа DC) показана на Фигуре 149А. Хотя в поверхностных пробах была отмечена тенденция к повышенному распределению, можно показать, что вводимый ИТ в поясничный отдел HNS проникал в перивентрикулярные области головного мозга.

[0696] В 6-месячной когорте/когорте, прошедшей период восстановления, средний уровень активности фермента в печени составил 0,50, 2,41 и 6,65 нмоль/ч/мг белка у самцов и 1,04, 4,15 и 7,62 нмоль/ч/мг белка у самок из групп, получавших 1,5 мг, 4,5 мг и 8,3 мг/дозу, соответственно (Фигура 149В). Уровень у обезьян из контрольной группы, получавшей только основу, составил 0,089 нмоль/ч/мг белка у самцов и 0,083 нмоль/ч/мг белка у самок. После периода восстановления уровень активности HNS в печени был сопоставим с исходным контрольным уровнем в группах, получавших все дозы.

Иммуногистохимия

[0697] В когортах, умерщвленных через 3 месяца (промежуточный анализ) и через 6 месяцев/когорте, прошедшей период восстановления, доставка HNS в ЦНС посредством болюсной ИТ инъекции приводила к доставке тестируемого вещества к тканям мягкой и арахноидальной оболочек спинного и головного мозга. У обезьян, которые получали HNS ИТ, иммунореактивный материал присутствовал в макрофагах оболочек мозга и периваскулярных макрофагах (головной/спинной мозг) и периодически присутствовал в популяции нейронов и клеток глии. Отсутствие окрашивания у контрольных обезьян, получавших только основу (Фигура 150А), продемонстрировало специфичность антитела в отношении HNS человека. Как правило, указанная иммунореактивность была дозозависимой (т.е. в соответствии с полуколичественной шкалой оценок отмечалось увеличение иммуногистохимического окрашивания, которое было обычно дозозависимым). Доставка HNS к ЦНС посредством болюсной ИТ инъекции приводила к положительному иммунному окрашиванию в коре больших полушарий и мозжечке (Фигура 150B-D); однако не выявлялось явной постоянной иммунореактивности в области хвостатого ядра/скорлупы, среднего мозга или более глубоких отделах моста или продолговатого мозга. Иммунореактивность была явной в печени (в клетках выстилки синусоидных капилляров, включая купферовские клетки, но не в гепатоцитах) всех обезьян, которым вводили HNS. Иммунореактивность не выявлялась у одной самки, умерщвленной рано (группа 4,5 мг/дозу) из-за утечек в катетере, которые нельзя было ликвидировать.

[0698] В группе, получавшей 1,5 мг/дозу, наблюдалось по существу полное восстановление за исключением печени и оболочек головного и спинного мозга, в которых выявлялась некоторая остаточная иммунореактивность. При более высоких дозах (4,5 и 8,3 мг/дозу) интенсивность и частота иммунореактивности была ниже, чем при окончании введения препарата. При всех уровнях доз уровень HNS в спинном, головном мозге и печени приближался к уровню, наблюдаемому в контроле, получавшем только основу, после месячного периода восстановления.

[0699] В данном исследовании ИТ введение HNS раз в 2 недели в течение 6 месяцев хорошо переносилось. Никаких заметных изменений массы тела, клинического состояния, результатов офтальмологического/неврологического/физикального обследования, ЭКГ массы органов или макроскопического вида органов не возникало. Выявляемые результаты ограничивались временными изменениями показателей лабораторной диагностики СМЖ, сопровождающимися легкими или умеренными инфильтратами в оболочках мозга и эпидуральным воспалением, с полным обращением после периода восстановления во всех группах, кроме группы, получавшей максимальную дозу. Наблюдалось обширное распределение HNS по всему головному и спинному мозгу.

[0700] ИТ введение HNS один раз в 2 недели вызывало воспалительную реакцию, которая характеризовалась остаточной лейкоцитарной инфильтрацией и выходом альбумина, отмечаемыми при вскрытии через 24 часа после введения препарата. Не будем вдаваться в теорию, но это, предположительно, отражает временное, локализованное и неполное открытие гематоэнцефалического барьера, связанное с изменением свойств плотных контактов вблизи кончика катетера, что приводит к входу лейкоцитов и белков плазмы в СМЖ (Simard JM, et al. Lancet Neurol. (2007) 6, 258-268; Stamatovic SM, et al. Curr. Neuropharmacol. (2008) 6, 179-192). Это может быть следствием двух компонентов: один связан с процедурами введения препарата или объема, а другой связан с ИТ введением белков.

[0701] Временные изменения проницаемости гематоэнцефалического барьера (нет значимых различий между группами, получавшими разные дозы, и контрольными группами при основном вскрытии через 24 часа после введения дозы), не сопровождались никакими клиническими признаками.

[0702] По-видимому, есть дозозависимая тенденция к более высокому уровню HNS в СМЖ, при данном уровне дозы средние концентрации HNS в СМЖ, по-видимому, сохраняются в одном и том же диапазоне, несмотря на повышение уровня анти-HNS антител в сыворотке и СМЖ.

[0703] В головном и спинном мозге молодых обезьян, получавших HNS, наблюдались клеточные инфильтраты в оболочках мозга от низкой до минимальной средней степени тяжести. Указанное микроскопическое изменение также отмечалось у контрольных животных, получавших только основу, что указывает на то, что некоторые из реакций были связаны с установкой ИТ катетера, а также неспецифической воспалительной реакцией на чужеродный белок. Введение биологического препарата/белка в ИТ пространство, особенно того, который проникает в ЦНС, почти всегда вызывает воспалительную реакцию определенной степени (Hovland DN, et al. Toxicol. Pathol. (2007) 35, 1013-1029; Butt MT, Toxicol. Pathol. (2011) 39, 213-219), и если ее степень такова, что повреждаются соседние ткани, то она может представлять собой нежелательный эффект. Однако в настоящем исследовании указанные клетки (преимущественно эозинофилы), по-видимому, были маркером реакции/проникновения в ткань и не обнаруживались в той количестве, которое можно было оценить как нежелательный эффект. Ни одно из связанных с HNS изменений, по-видимому, не было ассоциировано с нежелательными структурными микроскопическими изменениями в головном или спинном мозге. Ни в спинном, ни в головном мозге, ни в ганглиях некроза нейронов не отмечалось.

[0704] Оценка уровня антител к тестируемому веществу является важным аспектом исследований токсичности из-за потенциального влияния нейтрализующих или связывающих антител на выведение или биораспределение тестируемого вещества (Ponce RP, et al. Regul. Toxicol. Pharmacol. (2009) 54, 164-182). В данном исследовании, поскольку в головном и спинном мозге животных, умерщвленных через 3 месяца (промежуточный анализ) и через 6 месяцев обнаруживались дозозависимые и количественно близкие уровни активности фермента HNS, и средняя концентрация HNS в СМЖ, по-видимому, сохранялась в одном и том же диапазоне, несмотря на повышение уровня анти-HNS антител в сыворотке и СМЖ, нейтрализующая активность не предполагается. По-видимому, есть дозозависимая тенденция к более высокому уровню активности фермента HNS в спинном, головном мозге и печени, который был максимальным вблизи участка инъекции в поясничном отделе спинного мозга и равномерным в головном мозге, и не было значимых различий в рострокаудальном направлении, а также между правым и левым полушариями.

[0705] В тканях головного и спинного мозга 6-месячной когорты по сравнению с 3-месячной промежуточной когортой никаких признаков аккумуляции HNS не отмечалось. Хотя в поверхностных пробах наблюдалась тенденция к повышенному распределению, вводимая ИТ в поясничный отдел HNS проникала в более глубокие, перивентрикулярные области головного мозга. Активность фермента HNS в печени указывает на то, что HNS подвергается повторному системному распределению после ИТ доставки; после оценки клинических и патологических параметров в базовых исследованиях токсичности в печени никаких связанных с HNS нежелательных эффектов выявлено не было.

[0706] В целом, результаты иммуногистохимического исследования подтвердили данные об активности фермента в том, что дозозависимая иммунореактивность наблюдалась в спинном и головном мозге в мягкой и арахноидальной оболочках и в нервной системе (нейроны, клетки глии) в непосредственной близости от оболочек мозга. После болюсной ИТ инъекции или краткосрочной ИТ инфузии отмечалось хорошее проникновение в серое вещество. Хотя явной иммунореактивности в более глубоких структурах, таких как базальные ганглии или центральные области таламуса/гипоталамуса, среднего мозга или моста/продолговатого мозга, не было, результаты определения активности фермента показывают, что введенная ИТ в поясничный отдел HNS проникает в глубокие, перивентрикулярные области головного мозга. Таким образом, иммуногистохимическое исследование может быть менее чувствительным способом определения биораспределения тестируемого вещества. Имела место явная иммунореактивность в купферовских клетках и клетках эндотелия (клетки, способные к фагоцитозу) печени, но не в клетках паренхимы (гепатоциты).

[0707] Анализ токсичности 6-месячного многократного ИТ введения молодым длиннохвостым макакам в 6-месячной когорте/когорте, прошедшей период восстановления, выявил, что связанные с HNS изменения при 3 месячном промежуточном анализе и при вскрытии через 6 месяцев были сопоставимыми, включая прижизненные показатели, показатели лабораторной диагностики и патологической анатомии, концентрацию HNS и анти-HNS антител в СМЖ и сыворотке, и распределение/субклеточную локализацию HNS в спинном, головном мозге и печени. У обезьян, подвергнутых вскрытию после периода восстановления, эффекты HNS либо отсутствовали, либо существенно сокращались. Таким образом, уровнем отсутствия наблюдаемых нежелательных эффектов был признан уровень 8,3 мг/дозу - максимальная из вводимых доз.

[0708] Мониторинг изменений насыщенности клетками и концентраций белка в СМЖ, по-видимому, достоверно коррелирует с морфологическими изменениями, отмеченными при гистопатологической оценке, и может быть полезным инструментом при ИТ введении HNS пациентам; указанные изменения были сочтены предсказуемой реакцией на ИТ-вводимый белок, и они в основном разрешались после периода восстановления. Указанные данные, полученные в модели на животных, вселяют уверенность в применимости ИТ терапии в качестве стратегии лечения неврологических проявлений лизосомных болезней накопления. Данное токсикологическое исследование на молодых низших приматах продемонстрировало допустимость и переносимость введения HNS через устройство ИТ доставки лекарственных препаратов в поясничном отделе у педиатрических пациентов. Отсутствие неблагоприятных патологических изменений в ЦНС и нежелательных клинических признаков подтвердило одобрение досье исследуемого лекарственного препарата и показало, что ИТ-вводимый HNS может быть безопасен и эффективен при лечении симптомов со стороны ЦНС синдрома Санфилиппо типа А.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

[0709] Примеры материалов и методов, применяемых в ходе разных экспериментов, описанных в указанных примерах, перечислены ниже.

Схема эксперимента и введение HNS

[0710] Обезьян случайным образом распределяли в пять групп: группу 1 не подвергали лечению (контроль вживления устройства [DC], порта и катетера) и не вводили ей ни основы, ни тестируемого вещества. Группы 2-5 получали 0,6 мл 0, 2,5, 7,5 или 13,8 мг/мл HNS ИТ, (т.е. общая доза 0, 1,5, 4,5 или 8,3 мг) раз в две недели. Четыре обезьяны/пол/группу подвергали вскрытию через 3 месяца (промежуточное вскрытие; через 24 часа после 6-й дозы), четыре обезьяны/пол/группу подвергали вскрытию (за исключением группы DC, в которой вскрытие проводили через 3 месяца) через 6 месяцев введения препарата (основное вскрытие; через 24 часа после 12-й дозы), и оставшиеся четыре обезьяны/пол/группу подвергали вскрытию в конце месячного периода восстановления. При вскрытии отбирали выбранные ткани, обрабатывали их и подвергали микроскопическому исследованию.

[0711] HNS вводили в основе для ИТ лекарственных форм, состоящей из 5 мМ фосфата натрия, 145 мМ хлорида натрия и 0,005% полисорбата 20 (рН 7,0). Раз в две недели дозы HNS вводили в форме краткосрочной инфузии в течение приблизительно одиннадцати минут: 0,6 мл (4 минуты), и последующая промывка 0,5 мл фосфатно-солевым буфером (ФБР) (7 минут). Обезьяны в группе контроля основы получали только основу для ИТ введения; обезьяны DC получали ИТ ФБР (рН 7,2).

Наблюдение за клиническими признаками

[0712] Наблюдение за клиническими признаками, а также оценку заболеваемости и смертности проводили по меньшей мере два раза в день, начиная с введения первой дозы. Массу тела измеряли перед операцией, раз в неделю во время исследования и при вскрытии. Потребление пищи отслеживали ежедневно, начиная с момента времени до операции. Данные объективной оценки (частота сердечных сокращений, дыхание, температура тела, аускультация, походка, положение, пальпация живота, лимфатические узлы и внешний вид) и неврологического обследования (уровень сознания, прокладывание пути) регистрировали до начала исследования, раз в месяц во время исследования и перед вскрытием. Также оценивали двигательные функции, рефлексы уровня головного мозга (зрачковый рефлекс, моргание и роговичный рефлекс) и рефлексы уровня спинного мозга (чувствительность ступней, коленный рефлекс, кожный, проприоцептивный и хвостовой рефлекс). Электрокардиографию (ЭКГ, отведения I, II и III) и офтальмологическое обследование проводили перед введением первой дозы HNS и за неделю до промежуточного (3 месяца) и основного (6 месяцев) вскрытия. Офтальмологическое обследование проводили с использованием непрямого офтальмоскопа, обезьян подвергали седации с использованием кетамина гидрохлорида (ВМ, 8 мг/кг), и глаза расширяли 1% тропикамидом.

Клиническая патология

[0713] Пробы крови для гематологического исследования и биохимии крови отбирали у обезьян натощак перед началом исследования, после ИТ введения доз 1, 3, 5, 7, 9 и 11, в середине периода восстановления и при вскрытии. Пробы мочи отбирали путем улавливания струи перед введением препарата, раз в месяц в период введения и период восстановления, и перед вскрытием. Пробы СМЖ для оценки общего количества клеток и биохимического анализа отбирали через катетер в поясничном отделе во время операции, а также через 24 часа после ИТ введения доз 1, 3, 5, 7, 9, 11, в середине периода восстановления и при вскрытии; иногда пробы не отбирали из-за частичной непроходимости катетера. Поскольку отмечалось более высокое, чем ожидалось, количество лейкоцитов, пробы СМЖ у когорты промежуточного 3-месячного вскрытия после дозы 5 отбирали у половины обезьян в каждой группе до введения препарата, а у оставшейся половины - через 24 часа после введения препарата. Отбор проб до введения препарата проводили по меньшей мере за 1 день до введения дозы, так что это не оказывало значительного влияния на объем СМЖ непосредственно перед введением препарата. У обезьян, умерщвленных через 6 месяцев, и у обезьян, умерщвленных после периода восстановления, пробы СМЖ для оценки общего количества клеток и биохимического анализа отбирали у половины обезьян в каждой группе до введения препарата, а у оставшейся половины - через 24 часа после введения препарата. Если у обезьяны из катетера пробы было не отобрать из-за его непроходимости, при вскрытии проводили спинномозговую пункцию (мостомозжечковая цистерна).

Анализ HNS

[0714] Пробы крови для анализа HNS отбирали из периферической вены перед введением и через 24 часа после ИТ введения доз 2, 4, 6, 8, 10, 12; в середине периода восстановления и при вскрытии. Пробы СМЖ отбирали через катетер в поясничном отделе перед введением и через 24 часа после ИТ введения доз 2, 4, 6, 8, 10, 12; в середине периода восстановления и при вскрытии. Концентрацию HNS определяли посредством твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве иммобилизованного антитела применяли поликлональное анти-HNS антитело кролика IgG, а в качестве детекторного антитела применяли конъюгат того же анти-HNS IgG кролика с пероксидазой хрена. ПО составил 0,22 нг/мл; таким образом, расчетный ПКО составил 0,66 нг/мл. Пробы сыворотки и СМЖ подвергали скринингу в двойном экземпляре в разведениях 1:100 и 1:5; пробы, в которых концентрация выходила за пределы калибровочной кривой, разводили дополнительно и тестировали повторно.

Анализ на анти-HNS антитела

[0715] Пробы крови для анализа на анти-HNS антитела отбирали из периферической вены приблизительно за 1 неделю до ИТ введения доз 2, 4, 6, 8, 10, 12; в середине периода восстановления и при вскрытии. Пробы СМЖ для анализа на антитела отбирали через катетер в поясничном отделе приблизительно за 1 неделю до ИТ введения доз 2, 4, 6, 8, 10, 12; в середине периода восстановления и при вскрытии. Для определения анти-HNS антител применяли технологию Meso Scale Discovery (MSD®), основанную на электрохемилюминесцентном мостовом измерении. Указанный способ анализа является универсальным, но чувствительным способом скрининга для определения анти-HNS антител, образующихся у любых видов, и подходит для всех изотипов иммуноглобулинов. ПО составил 5 нг/мл, и указанные пробы подвергали скринингу в двойном экземпляре в разведении 1:20, что приводило к эффективной чувствительности анализа 100 нг/мл. Пробы, в которых показатели выходили за пределы калибровочной кривой, разводили дополнительно и тестировали повторно.

Вскрытие и подготовка тканей

[0716] Обезьян подвергали полному вскрытию либо через 24 часа после ИТ введения последней дозы (основное вскрытие), либо по окончании месячного периода восстановления (вскрытие после восстановления). Всем обезьянам проводили седацию гидрохлоридом кетамина (ВМ, 8 мг/кг), поддерживали подачу смеси изфлуорана/кислорода, и вводили им ВВ болюсно гепарин натрия (200 МЕ/кг). Через левый желудочек сердца обезьян проводили перфузию 0,001% нитрита натрия в физиологическом растворе комнатной температуры со скоростью 200 мл/мин в течение 12 мин (~2400 мл). После отбора проб тканей, их фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине для гистопатологического исследования/иммуногистохимического анализа или замораживали на сухом льде и хранили при температуре -60°C или ниже для анализа активности HNS.

[0717] Срезы головного мозга делали из матрикса головного мозга (МВМ-2000С, «ASI Instruments, Inc.», Уоррен, Мичиган), срезая фронтальный срез толщиной приблизительно 3 мм. Указанные срезы нумеровали, и самому ростральному срезу присваивали номер 1. Срезы 1, 4, 7, 10, 13 и 16 подготавливали для гистопатологического исследования, а срезы 2, 5, 8, 11, 14 и 17 (если таковые были) подготавливали для иммуногистохимического исследования. Срезы 3, 6, 9, 12 и 15 замораживали для оценки активности HNS. Из спинного мозга (шейный, грудной и поясничный отделы) изготавливали срезы толщиной один сантиметр. Первый срез и каждый последующий третий срез подготавливали для гистопатологической оценки, а второй срез и каждый последующий третий срез подготавливали для иммуногистохимического анализа. Третий срез и каждый последующий третий срез замораживали для оценки активности HNS. Распределение срезов корректировали так, чтобы срез с кончиком интратекального катетера (срез 0) можно было фиксировать в формалине и подвергнуть гистопатологическому анализу. Пробы печени в двойном экземпляре массой ~5 г отбирали из двух разных долей и замораживали для оценки активности HNS, и дополнительные пробы массой ~5 г фиксировали для иммуногистохимического анализа.

Гистопатология

[0718] При вскрытии у всех обезьян брали головной, спинной мозг, задние корешки спинномозговых нервов/ганглии, седалищный, большеберцовый и икроножный нервы, полный перечень тканей (типичный для доклинических исследований безопасности такой продолжительности и у такого вида) и очаги макроскопических поражений. Срезы тканей заключали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином (наряду с любым специальными процедурами окрашивания/заключения, указанными ниже) для всесторонней микроскопической оценки.

[0719] Срезы мозга из подготовленных парафиновых блоков от животных из групп контроля устройства и контроля основы, а также от обезьян, получавших высокую дозу, окрашивали Fluoro-Jade В (краситель, повышающий чувствительность оценки на дегенерацию нейронов в головном мозге) и серебряным красителем Бильшовского (способ, который позволяет прямо визуализировать аксоны, дендриты и филаменты нейронов). Окрашенные Fluoro-Jade В срезы исследовали при флуоресцентном освещении с применением фильтр-куба из флуоресцинизотиоцианата.

[0720] Срезы спинного мозга получали последовательным срезанием; поперечные и косые срезы брали из шейного, грудного и поясничного отделов (на каждом уровне исследовали один срез), включая срезы у кончика катетера; дополнительный поперечный срез получали из области конского хвоста. Задние корешки спинномозговых нервов и ганглии (из середины шейного, середины грудного и середины поясничного отдела) обрабатывали и исследовали. Периферические нервы (седалищный, большеберцовый и икроножный) разрезали, получая продольный срез, и окрашивали гематоксилином и эозином (Г и Э). Поперечные срезы впоследствии фиксировали в осмии, заключали в смолу Спурра, получали срезы (2 мкм) и окрашивали толлуидиновым синим. Последовательные срезы спинного мозга, а также задних корешков спинномозговых нервов/ганглиев, из групп контроля устройства и контроля основы, а также из группы, получавшей высокую дозу, окрашивали серебряным красителем Бильшовского. Срезы спинного мозга животных из указанных групп также окрашивали антиглиальным фибриллярным кислым белком, т.е. иммуногистохимическим красителем, который позволяет прямо визуализировать звездчатые клетки и их отростки.

Подготовка экстрактов тканей к количественному анализу

[0721] Замороженные срезы головного мозга с номерами 3, 6, 9, 12 и 15 рассекали, отделяя левое полушарие от правого. Поверхностную ткань отбирали, откладывая 4 мм от поверхности, а оставшуюся ткань в каждом полушарии считали глубокими тканями. Из фронтальных срезов вырезали дополнительные пробы перивентрикулярной ткани, если таковые присутствовали (например, срезы 6 и 9). Поскольку обработке подвергали только половину головного мозга (правую половину, а левую половину хранили замороженной), при изготовлении срезов получали от двух до трех проб на срез: поверхность правой половины, глубокий слой правой половины и паравентрикулярная область правой половины, если присутствовала (т.е. глубокий слой желудочка, Vdeep). Ткани мозжечка и ствола головного мозга, если они присутствовали, изолировали до разделения полушарий и обрабатывали их отдельно. Срезы спинного мозга готовили аналогичным образом, взвешивали и гомогенизировали.

[0722] Пробы тканей гомогенизировали в лизирующем буфере (1 мл/0,25 мг ткани), смешанном с 10 мМ трис, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой, 0,1% игепала с добавлением минитаблеток полного ингибитора протеаз альфа (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана) с применением пробирок TeenA Lysing Matrix А или конических полипропиленовых пробирок. Пробы обрабатывали в течение 40 секунд в автоматическом гомогенизаторе Fastprep-24 («MP Biomedicals», Солон, Оклохома) или в механическом гомогенизаторе PowerGen, модель 125 («Omni International», Кеннесо, Джорджия). Сразу после гомогенизации пробы подвергали пяти циклам замораживания-размораживания с использованием бани из этанола/сухого льда и водяной бани с температурой 37°C, затем центрифугировали, чтобы осадить обломки тканей; надосадочную жидкость хранили при -80°C до проведения анализа. Активность HNS определяли с использованием специфичного субстрата (4-метилумбеллиферил-α-D-N-сульфоглюкозаминид) с 2-стадийным флуориметрическим анализом.

Обработка тканей и окрашивание для иммуногистохимического анализа

[0723] Шесть фиксированных в формалине фронтальных срезов головного мозга (срезы под номерами 2, 5, 8, 11, 14 и 17) толщиной З мм от каждой обезьяны нумеровали от 1 до 6 в направлении от головы к хвосту. Как правило, срезы 1-4 содержали ткани базальных ядер/таламуса/гипоталамуса/среднего мозга и больших полушарий, а два хвостовых среза содержали ткани мозжечка и ствола головного мозга (продолговатого мозга). Срезы головного, спинного мозга и печени (из тех же парафиновых блоков, которые применяли для окрашивания Г и Э и разными специальными красителями) окрашивали для иммуногистохимического анализа HNS. Для определения внутриклеточного захвата вводимой ИТ HNS применяли специфическое моноклональное антитело мыши (клон 2С7; «Maine Biotech», Портленд, Мэн); указанный реагент не демонстрировал перекрестной реактивности с эндогенной HNS длиннохвостых макак. Отрицательные контроли проводили с применением несоответствующего IgG мыши. Депарафинизированные срезы инкубировали с первичным анти-HNS антителом мыши в течение ночи при 2-8°C.Добавляли вторичный антимышиный биотинилированный иммуноглобулин G овцы и инкубировали в течение 30 минут при 37°C. Добавляли комплекс авидин/биотинилированная пероксидаза хрена и инкубировали в течение 30 минут. Срезы инкубировали с раствором субстрата пероксидазы хрена диаминобензидина до тех пор, пока не развивалась желаемая интенсивность окрашивания. Ядра подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином.

Статистический анализ

[0724] Массу тела, изменение массы тела, потребление пищи, частоту дыхания, температуру тела, частоту сердечных сокращений, количество клеток в СМЖ, биохимию СМЖ, данные лабораторной диагностики, показатели анализа мочи, а также абсолютную и относительную массу органов анализировали посредством одностороннего дисперсионного анализа и сравнения с группами контроля устройства и контроля основы с каждой из групп, получавших HNS с применением критерия Даннета. Кроме того, проводили статистический анализ для сравнения двух контрольных групп друг с другом. Анализ был двусторонним при уровне значимости 5% и 11%. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

ПРИМЕР 22: ИССЛЕДОВАНИЯ БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ФАРМАКОКИНЕТИКИГЕПАРАН-N-СУЛЬФАТАЗЫ

[0725] Эксперименты, описанные в данном примере, были направлены на определение распределения HNS в тканях крыс после однократного внутривенного или интратекального введения (1 или 10 мг/кг) HNS. Например, среди прочего, цель настоящих экспериментов состояла в том, чтобы охарактеризовать свойства биораспределения (БР) HNS у крыс с применением позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ); сравнить характер распределения HNS при разных путях введения (ВВ или ИТ) и при разных дозах (1 или 10 мг/кг); и определить фармакокинетические свойства HNS в каждом из рассматриваемых органов при указанных режимах введения.

[0726] Профили фармакокинетики (ФК) и биораспределения (БР) ¹²⁴I-сульфамидазы (HNS) изучали посредством ПЭТ тканей у крыс после однократного внутривенного (ВВ) или интратекального (ИТ) введения 1 или 10 мг/кг ¹²⁴I-HNS. Данные зависимости радиоактивности от времени в рассматриваемом отделе получали из динамических изображений в первые 20 минут и из статических изображений через 0,05 (только для ИТ введения) 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 и 192 часа после ВВ и ИТ введения препарата.

[0727] В данном исследовании участвовали по четыре крысы в каждой группе (1 мг/кг ВВ, 1 мг/кг ИТ, 10 мг/кг ВВ и 10 мг/кг ИТ). Зависимость радиоактивности от времени регистрировали в голове, головном мозге (включая спинномозговую жидкость, СМЖ), в области позвоночника и области печени после ИТ введения; и в крови, головном мозге (включая СМЖ), печени, почках сердце (включая легкие) и коже после ВВ введения. Указанные данные корректировали на период полураспада 124-йода (100,2 часа), выражали в процентах от вводимой дозы (% ВД) для рассматриваемого отдела или %ВД на грамм (%ВД/г) визуализируемых тканей, а затем нормировали на массу тела, равную 200 грамм. Общее количество (мкг) или концентрацию (мкг/г) дозы белка в рассматриваемом отделе рассчитывали на основании соответствующих данных %ВД или %ВД/г.

[0728] В первые 20 минут после ИТ введения общее количество HNS в головном отделе снижалось с постоянной скоростью 0,002/мин - 0,011/мин (λz) при дозе 1 и 10 мг/кг. Скорость клиренса и объем распределения для сравнения фармакокинетики между двумя дозами и двумя путями введения в данном отчете не применяли (см. раздел «Результаты» для более подробной информации). Постоянные скорости выведения из головного мозга по существу были одинаковые при двух тестируемых дозах (λz: 0,016/ч и 0,014/ч для дозы 1 и 10 мг/кг, соответственно) при близком времени полувыведения около двух дней, определенном по статическим изображениям до 192 часов после ИТ введения. Значения Cmax и AUC (0-last или 0-∞ inite) были пропорциональны вводимым дозам. В диапазоне доз 1-10 мг/кг при данных режимам с однократным ИТ введением было показано линейное фармакокинетическое поведение. При обоих уровнях доз наблюдались градиенты концентраций от проксимальных к дистальным срезам позвоночника.

[0729] После ИТ введения уровень белка HNS количественно определялся в течение 96 часов при 1 мг/кг и до 192 часов при 10 мг/кг HNS. Концентрации в печени достигали максимума через 2 часа при 1 мг/кг, и через 7 часов при 10 мг/кг. Скорость выведения составила 0,030±0,011/ч (среднее λz) при 1 мг/кг, что незначительно отличалось от скорости выведения при 10 мг/кг (λz 0,017±0/ч) (р=0,10), с соответствующим t1/2 (28 и 42 часа при дозах 1 и 10 мг/кг, соответственно).

[0730] После ВВ введения период полувыведения в печени, почках, сердце и коже составил 47±10 и 38±13 часов для печени, 54±25 и 29±16 часов для почек, 36±15 и 42±19 часов для сердца, и 40±21 и 31±13 часов для кожи при 1 и 10 мг/кг, соответственно; хотя период полувыведения в головном мозге составил 71±23 и 60±53 часа. Средние значения Cmax для печени, кожи, почек, сердца и головного мозга составили 9,6, 0,30, 0,25, 0,22, и 0,08 мкг/г при дозе 1 мг/кг и 132, 7,9, 3,9, 3,7 и 1,8 мкг/г при дозе 10 мг/кг. После того, как значения Cmax для отдельных животных нормировали на дозу, значения Cmax /дозу при 10 мг/кг были значительно выше, чем при 1 мг/кг во всех органах (максимальные значения р<0,05, p=0,06 для печени). Значения AUClast для печени, кожи, почек, сердца и головного мозга составили 525, 16, 14, 9 и 7 ч.мкг/г при 1 мг/кг; и 6747, 276, 183, 201 и 86 ч.мкг/г при 10 мг/кг. После нормировки значения AUClast / дозу при 10 мг/кг были значительно выше, чем при 1 мг/кг в коже (р<0,01), минимально отличались в сердце (р=0,06), и незначимо отличались в печени, головном мозге и почках (все значения р>0,34).

[0731] При введении одной и той же дозы интратекальное введение приводило к более высокому на 3 порядка воздействию в головном мозге, чем внутривенное введение. Время полувыведения в головном мозге составило 2 дня при ИТ и 3 дня при ВВ введении. Однако воздействие в печение после ИТ введения было близким к воздействию при ВВ введении при той же дозе HNS. Отношение воздействия (Cmax и AUClast) на печень при ИТ/ВВ введении при дозе 1 мг/кг и 10 мг/кг было в диапазоне 0,4-1,2.

Схема эксперимента

[0732] При большинстве лизосомных болезней накопления повреждению подвержена центральная нервная система (ЦНС), и при некоторых типах указанных заболевания повреждения в ЦНС серьезны, например, при синдроме Санфилиппо типа А или В (мукополисахаридоз III), метахроматическая лейкодистрофия (МЛД) и синдром Хантера. Как описано в настоящей заявке, предполагается, что из-за плохого проникновения через гематоэнцефалический барьер при периферическом введении, прямое введение белков-ферментов в ЦНС может повысить их концентрации в тканях центральной нервной системы и впоследствии усилить их терапевтическое действие. В данном исследовании интратекальное введение (ИТ, или в мостомозжечковую цистерну) исследовали и сравнивали с ВВ введением при разном уровне доз.

[0733] ПЭТ является неинвазивным, воспроизводимым и количественным способом отслеживания динамических изменений концентрации лекарственного препарата во времени в рассматриваемых органах. Данные динамической зависимости концентрации от времени в органах-мишенях (активных участках, а не в кровеносном русле) поддаются оценке и прямо связаны с биологической активностью вводимого лекарственного препарата. Кроме того, информацию о воздействии в тканях, полученную в ПЭТ исследовании на животных, можно применять для подбора первой дозы у человека.

Материалы и методы Тестируемые вещества

[0734] Гепаран-N-сульфатазу (HNS) готовили в концентрации 20 мг/мл HNS в 5 мМ фосфатно-натриевого буфера с 145 мМ хлорида натрия при pH 7,0. Указанный материал очищали с использованием ОФ-ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой), и он содержал 98,7% renapaH-N-сульфатазы, где процент димеров составлял 99,9%. HNS метили с использованием ¹²⁴йода.

Источник проб

[0735] Изображения радиоактивности получали на крысах после ВВ и ИТ введения ¹²⁴I-H-N-сульфатазы в дозах 1 и 10 мг/кг.

Животные

[0736] Шестнадцать самцов крыс Спраг-Доули были получены из Charles River Laboratories (190±60 г, n=16), и их разделили на 4 группы (n=4). Каждой группе указанных крыс (всего 4 группы) делали ВВ или ИТ инъекции с двумя разными дозами (1 мг/кг и 10 мг/кг). Дозу и вводимый объем подбирали индивидуально на основании массы тела каждого животного. В двух группах, получавших препарат ВВ, седацию индуцировали путем ВВ введения фенобарбитала натрия в дозе 35 мг/кг. Внутривенные дозы вводили в форме болюсов через хвостовую вену. В двух группах, получавших препарат ИТ, животных подвергали анестезии путем внутрибрюшинного введения фенобарбитала натрия в дозе 50 мг/кг. Интратекальные дозы вводили в течение 1 мин на уровне мостомозжечковой цистерны через атлантозатылочную мембрану. Реально введенную радиоактивность измеряли посредством ПЭТ, и данное значение применяли как значение введенной дозы.

Экспериментальные методы и/или методы анализа

[0737] После ВВ инъекции в первые 20 минут получали динамические изображения (каждые 2 минуты) в областях сердца (включая легкие), печени и почек; при ИТ введение обоих доз - также области головы. Статистические изображения получали в областях, включая головной мозг (включая спинномозговую жидкость, СМЖ), печень, почки, сердце (включая легкие), мышцы, кожу и кость в группе, получавшей препарат ВВ; и в области головы, головного мозга (включая СМЖ) и печени - у животных, получавших препарат ИТ, через 0,05 (только для групп ИТ введения) 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 и 192 часа после введения препарата. Указанные изображения реконструировали, и три измерения объединяли в одно изображение.

Анализ данных

[0738] Данные ПЭТ выражали в нанокюри (нКи) на мл (для жидкости) или на грамм (для ткани). В статических изображениях относительную активность получили для отделов головного мозга, печени, почек, скелетных мышц, желудка, сердца (с легкими) и кожи. Для животных, получавших ИТ инъекции, была получена абсолютная активность для целой области головы или головного мозга. У животных, получавших ИТ инъекции, определяли радиоактивность на миллиметр позвоночного столба, в трех избранных отделах позвоночника: проксимальный (шея), средний (напротив верхнего края печени) и дистальный (на 1 см от дистального конца белоксодержащего компартмента).

[0739] Все данные корректировали на период полураспада ¹²⁴I (100,2 часа) и нормировали на регистрируемую эффективность на основании калибровки с источником ¹²⁴I при активности, измеряемой вовне. Затем указанные данные выражали в процентах от вводимой дозы (% ВД) для рассматриваемого отдела (голова или головной мозг) или % ВД на грамм (% ВД/г) ткани, а затем нормировали на массу тела, равную 200 грамм [нормировка данных: (% ID или % ID/г) / масса тела животного × 200]. Указанную нормировку вводили, чтобы уменьшить вариабельность данных, поскольку в каждой группе было всего по четыре животных.

[0740] В данном примере концентрацию или количество белка HNS рассчитывали на основании вводимой каждому животному дозы белка: концентрация белка (мкг/г) = (% ID/г) × (мг/кг введенной дозы × 1000×0,2); общее количество вводимого белка (мкг) в рассматриваемой области = % ID × (мг/кг введенной дозы × 1000×0,2), где вводимая доза составляла 1 мг/кг или 10 мг/кг, а 0,2 - коэффициент нормировки на массу тела. Среднегрупповое значение и стандартное отклонение для каждого ФК параметра рассчитывали на основании индивидуальных данных анализа без деления на компартменты в каждой из четырех групп. Для сравнения значений of λz, t1/2, Cmax и AUC между двумя тестируемыми дозами и двумя путями введения применяли t-критерий Стьюдента. Статистическую значимость определяли как значение p ниже 0,05 (p<0,05).

Результаты

[0741] Количество (мкг) и концентрацию (мкг/г) HNS, приводимые в следующих таблицах, на фигурах и при анализе ФК, рассчитывали путем умножения вводимой дозы белка (1 мг/кг или 10 мг/кг) на соответствующие значения % ВД или % ВД/г.

Интратекальное введение 124I-HNS в дозах 1 и 10 мг/кг

[0742] Количество введенного белка (мкг) в области головы, оцененное на основании динамических изображений, откладывали на графике как функцию от времени (Фигура 151). Концентрацию (мкг/г) в области головного мозга, оцененную на основании статических изображений, откладывали на графике как функцию от времени (Фигура 152). Общее количество введенного белка (мкг) в области головного мозга и головы, оцененное на основании статических изображений, откладывали на графике как функцию от времени (Фигура 153 и 154, соответственно). Кривые зависимости концентрации от времени (мкг/мм) в проксимальном, среднем и дистальном отделе позвоночника показаны на Фигурах 155-157. На Фигуре 158 показаны изменения концентрации HNS (мкг/г) во времени в печени после ИТ введения ¹²⁴I-HNS в дозах 1 мг/кг или 10 мг/кг.

[0743] Зависимости общего количества от времени (мкг) или концентрации от времени (мкг/г) анализировали в модели без учета компартментов (WinNonlin 5.2, Pharsight, Маунтин-Вью, Калифорния). ФК параметры, такие как постоянная скорости выведения (λz), максимальная концентрация (Cmax), терминальное время полувыведения (t1/2), площадь под кривой (AUClast и AUC0-∞) оценивали на основании данных по каждому конкретному животному.

[0744] Оценивали также скорость клиренса и объем распределения, однако их не применяли для сравнения ФК между двумя дозами и двумя путями введения в данном отчете по двум причинам: (1) данное исследование было направлено главным образом на оценку биораспределения HNS в твердых тканях, а не оценку ФК в крови; и (2) радиоактивность в области головного мозга являлась суммой радиоактивности в тканях головного мозга (твердых) и СМЖ (жидкость), которые нельзя было разделить в рамках данного исследования. Оценивали значение λz и применяли его для сравнения, поскольку оно отражает процент введенной дозы, выводимой за единицу времени.

[0745] Среднегрупповые значения и стандартное отклонение (СО) рассчитывали и сравнивали между двумя тестируемыми дозами. ФК параметры приведены в Таблице 48 ниже.

Таблица 48
1 мг/кг ИТ	Головной мозг (мкг/г)*	Печень	Головной мозг (мкг)#	Голова (мкг)#	Проксимальный	Средний	Дистальный
Parameter	Среднее	СО	Среднее	СО	Среднее	СО	Среднее	СО	Среднее	СО	Среднее	СО	Среднее	СО
λz	0,016	0,003	0,030	0,011	0,017	0,002	0,016	0,002	0,025	0,012	0,020	0,008	0,028	0,016
t1/2	45	7	28	16	42	5	45	7	32	13	39	16	30	12
Tmax	0,1	0,0	2,3	1,3	2,0	4,0	0,1	0,0	0,3	0,5	1,8	1,5	1,0	0,0
Cmax	257,0	89,9	4,9	1,3	68,6	8,0	200,1	0,0	0,5	0,1	0,2	0,0	0,1	0,0
AUClast	8393	2457	204	50	3809	622	8216	782	9	3	7	3	2	1
AUG∞,	8942	2416	216	57	4030	643	8904	1069	11	3	8	3	3	2
MRTlast	46	6	32	13	44	5	46	5	31	17	34	20	16	5
10 мг/кг ИТ
λz	0,014	0,001	0,017	0,000	0,014	0,001	0,010	0,001	0,018	0,008	0,014	-	0,006	-
t1/2	49	4	42	1	51	5	70	9	45	18	50	-	123	-
Tmax	0,1	0,0	7,0	2,0	0,1	0,0	0,1	0,0	0,3	0,5	8,7	13,3	8,0	-
Cmax	2628	265	105	41	836	117	1844	314	6	4	1	0	1	-
AUClast	83962	10083	7987	3276	59115	8624	128751	15723	83	67	35	20	38	-
AUG∞,	89460	12098	8345	3424	63836	9466	151405	15123	98	66	60	-	73	-
MRTlast	56	1	51	1	58	2	65	3	31	2	32	7	61	-
1 мг/кг ВВ	Головной мозг (мкг/г)*	Печень	Почки	Сердце	Кожа
λz	0,011	0,005	0,015	0,003	0,016	0,009	0,021	0,006	0,021	0,010
t1/2	71	23	47	10	54	25	36	15	40	21
Tmax	7	12	5	4	10	12	2	1	5	4
Cmax	0,1	0,0	9,6	1,5	0,2	0,1	0,2	0,0	0,3	0,1
AUClast	7	2	525	104	14	5	9	3	16	4
AUG∞,	9	3	576	138	16	6	10	3	18	5
MRTlast	61	16	47	5	47	18	36	13	41	16
10 мг/кг ВВ
λz	0,102	0,180	0,021	0,012	0,035	0,024	0,020	0,010	0,026	0,012
t1/2	60,5	53,1	37,8	13,4	28,4	16,4	41,6	18,6	31,0	12,7
Tmax	13	12	2	1	12	11	16	9	3	1
Cmax	1,8	0,2	131,6	26,8	3,9	0,7	3,7	0,7	7,9	2,3
AUClast	86	66	6747	2837	183	123	201	89	276	40
AUG∞,	118	98	7171	3029	198	131	230	110	292	43
MRTlast	43	32	40	14	33	21	41	18	33	13

[0746] В первые 20 минут после введения общее количество (мкг) HNS в головном отделе снижалось с постоянной скоростью 0,002/мин - 0,011/мин (λz: 0,005±0,004/мин)) при дозе 1 мг/кг и скоростью 0,003-0,010 в минуту (0,007±0,003/min) при дозе 10 мг/кг. Указанные постоянные скорости выведения не различались значимо при данных двух уровнях доз (р=0.57, Фигура 151).

[0747] Кривая зависимости концентрации от времени (мкг/г от 0,05 до 192 часов) для головного мозга продемонстрировала двухфазный профиль (Фигура 152). Ранняя фаза длится приблизительно два часа. Терминальная фаза соответствует кинетике первого порядка. Постоянные скорости выведения из головного мозга были очень близки при двух тестируемых дозах (0,0016±0,003 и 0,014±0,001 в час) с близкими временами полувыведения около двух дней (45±7 и 49±4 часов при 1 и 10 мг/кг, соответственно). Значения максимальной концентрации (257±90 и 2628±265 мкг/г) и AUC_last (8393±2457 и 83962±10083 ч. мкг/г при 1 и 10 мг/кг, соответственно) увеличивались приблизительно в десять раз, когда дозу увеличивали с 1 до 10 мг/кг. Данные результаты указывают на линейное поведение ФК в диапазоне доз от 1 до 10 мг/кг, вводимых в рамках указанного однократного ИТ режима введения. После ИТ введения максимальная концентрация создается в головном мозге через 3 минуты (Tmax).

[0748] Кривая зависимости общего количества от времени (мкг от 0,05 до 192 часов) в области головы и головного мозга продемонстрировала двухфазный характер, как и кривые зависимости концентрации от времени (мкг/г) в головном мозге (Фигура 153 и Фигура 154). Значения Cmax в области головного мозга были значительно ниже, чем в области головы (69±8 и 200±0 при 1 мг/кг, р<0,01; и 836±117 и 1844±314 мкг, р<0,01 при 10 мг/кг, соответственно). Постоянные скорости выведения составили 0,017±0,002/ч и 0,014±0,001/ч для головного мозга, и 0,016±0,002 и 0,010±0,001/ч для области головы при 1 и 10 мг/кг, соответственно. Значения среднего остаточного времени жизни составили 42±5 и 51±5 часов для головного мозга (р=0,048), и 45±7 и 70±9 часа для головы (р<0,01) при 1 и 10 мг/кг, соответственно. Данные результаты указывают на то, что введенный белок выводился из обеих областей быстрее при более низкой дозе, чем при высокой дозе. Среднее время полувыведения в указанных областях после ИТ введения 1 мг/кг и 10 мг/кг HNS было в диапазоне от 42 до 70 часов.

[0749] При обоих уровнях доз наблюдался градиент концентрации от проксимального к среднему и к дистальному отделам позвоночника (данные не показаны). После ИТ введения максимальная концентрация (мкг/мм позвоночного столба) отмечалась приблизительно через 30 минут (от 0 до 1 часа) в проксимальном, от 1 до 4 часов в среднем (за исключением одной крысы, у которой она достигалась через 24 часа) и от 1 до 8 часов в дистальном отделе. Время полувыведения в указанных отделах было вариабельным (среднее t1/2: 32±13 и 45±18 часов для проксимального, 39±16 и приблизительно 50 часов для среднего, и 30±12 и приблизительно 123 часа для дистального отдела позвоночника при 1 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно). Средние значения максимальной концентрации были приблизительно пропорциональны дозам в каждом из указанных отделов при дозах 1 и 10 мг/кг ¹²⁴I-HNS (0,5 и 6,0, 0,2 и 0,9 и 0,1 и 0,5 мкг/мм в проксимальном, среднем и дистальном отделах позвоночника, соответственно). Средние значения AUC_last также демонстрировали ту пропорциональность, которая наблюдалась в случае максимальных концентраций (9,5 и 83, 6,8 и 35, и 2 и 38 ч.мкг/мм в проксимальном, среднем и дистальном отделах позвоночника, соответственно).

[0750] Даже несмотря на то, что HNS не определялась в большинстве периферических органов, она была определима печени, начиная с 1 часа (первый момент времени для визуализации после введения препарата) и до 96 часов (у трех из четырех животных) при 1 мг/кг и до 192 часов (у всех четырех крыс) при 10 мг/кг после ИТ введения (Фигура 158). Концентрации в печени достигали максимума через 2 часа после ИТ введения дозы 1 мг/кг, и через 7 часов после ИТ введения дозы 10 мг/кг, после чего наступала фаза выведения с кинетикой первого порядка. Постоянные скорости выведения были больше при 1 мг/кг (λz 0,030±0,011/ч), чем при дозе 10 мг/кг (λz 0,017±0/ч) (р=0,10), с соответствующим более низким t1/2 (28±16 и 42±1 часа при дозах 1 и 10 мг/кг, соответственно, р=0,76). Значение AUC_last при 1 мг/кг было ниже приблизительно в 40 раз, чем при 10 мг/кг (204±50 и 7987±3276 мкг/г, соответственно).

Внутривенное введение ¹²⁴I-HNS в дозах 1 и 10 мг/кг

[0751] Концентрацию в головном мозге, печени, почках, сердце (включая легкие) и коже откладывали на графике как функцию от времени после ВВ введения HNS в дозе 1 и 10 мг/кг, что показано на Фигурах 159-163, соответственно. Поскольку первым моментом времени получения статического изображения указанных органов был один час, начальную фазу зависимости концентрации от времени в данном исследовании наблюдать не удалось. Кривые зависимости концентрации от времени для печени, почек, сердца и кожи демонстрировали плоский участок от 1 до 8 часов после ВВ введения. Данный плоский участок длился 24 часа в головном мозге после введения препарата, что указывает на то, что головной мозг захватывает введенный ВВ белок медленнее, чем периферические органы. Остальные данные показывают, что терминальная фаза выведения приблизительно соответствует кинетике первого порядка.

[0752] Период полувыведения в печени, почках, сердце и коже составил 47±10 и 38+13 часов для печени, 54±25 и 29±16 часов для почек, 36±15 и 42±19 часов для сердца, и 40±21 и 31±13 часов для кожи при 1 и 10 мг/кг, соответственно; хотя период полувыведения в головном мозге составил 71±23 и 60±53 часа (крысу 3 из группы 10 мг/кг исключили из-за недостаточности данных для определения t1/2) при 1 и 10 мг/кг, соответственно. Указанные постоянные скорости выведения различались значимо при дозах 1 и 10 мг/кг в указанных органах, и исключение составили почки, значение р<0,03.

[0753] Средние значения Cmax для печени, кожи, почек, сердца и головного мозга составили 9,6, 0,3, 0,25, 0,22, и 0,08 мкг/г при дозе 1 мг/кг и 132, 7,9, 3,9, 3,7 и 1,8 мкг/г при дозе 10 мг/кг. Отношения Cmax при 10 мг/кг к соответствующим значениям при 1 мг/кг составили 14, 26, 16, 17 и 23 для указанных органов. После того, как значения Cmax для отдельных животных нормировали на дозу, значения Cmax /дозу при 10 мг/кг были значительно выше, чем при 1 мг/кг во всех органах (максимальные значения р<0,05, р=0,06 для печени). Значения AUClast для печени, кожи, почек, сердца и головного мозга составили 525, 16, 14, 9 и 7 ч.мкг/г при 1 мг/кг; и 6747, 276, 183, 201 и 86 ч.мкг/г при 10 мг/кг. Отношения AUClast при 10 мг/кг к соответствующим значениям AUClast при 1 мг/кг составили 13, 17, 13, 22 и 12 для указанных органов, соответственно. После нормировки значения AUClast /дозу при 10 мг/кг были значительно выше, чем при 1 мг/кг в коже (р<0,01), минимально отличались в сердце (р=0,06), и незначимо отличались в печени, головном мозге и почках (все значения р>0,34).

[0754] Данные результаты показывают, что (1) время полувыведения в большинстве органов составляло приблизительно 2 дня, за исключением головного мозга (приблизительно 3 дня); (2) воздействие на грамм печени было выше, чем на грамм кожи, сердца и почек, которые были выше, чем в головном мозге; (3) при десятикратном превышении дозы (10/1 мг/кг) значения Cmax во всех тестируемых органах увеличивались более чем в 10 раз по сравнению с дозой 1 мг/кг.

[0755] Максимальная концентрация в головном мозге достигалась через 1-24 часа (Tmax) после ВВ введения.

Сравнение ВВ и ИТ введения

[0756] Кривые зависимости концентрации от времени в головном мозге и печени после ВВ и ИТ введения доз 1 и 10 мг/кг сравниваются на Фигуре 164 и 165, соответственно. Отношения Cmax в головном мозге при ИТУВВ введении доз 1 и 10 мг/кг составили 3212 и 1501, соответственно. Указанные отношения для AUC0-1924 составили 1136 и 978. Данные результаты показывают, что когда вводили одну и ту же дозу HNS, интратекальное введение приводило к более высокому воздействию в головном мозге приблизительно на 3 порядка, чем внутривенное введение. Время полувыведения в головном мозге составило 2 дня (45 и 49 часов при 1 и 10 мг/кг) при ИТ, и 3 дня (71 и 60 часов при 1 и 10 мг/кг) при ВВ введении при обоих уровнях доз. Однако воздействие в печени после ИТ введения было близко к воздействию после ВВ введения той же дозы HNS. Отношения Cmax в печени при ИТ/ВВ введении 1 мг/кг и 10 мг/кг составили 0,5 и 0,8, а отношения AUClast составили 0,4 и 1,2, соответственно.

Заключение

[0757] Профили фармакокинетики и биораспределения ¹²⁴I-сульфамидазы (HNS) изучали посредством ПЭТ тканей у крыс после однократного внутривенного или интратекального введения 1 или 10 мг/кг ¹²⁴I-сульфамидазы. Данные зависимости радиоактивности от времени получали динамическим путем (в первые 20 минут) и статическим путем, получая изображения рассматриваемых отделов через 0,05 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 и 192 часа после введения препарата. Согласно динамическим изображениям в первые 20 минут после ИТ введения общее количество HNS в области головы снижалось с близкой постоянной скоростью 0,005/мин - 0,007/мин (среднее λz). Согласно статическим изображениям скорости выведения из головного мозга были по существу одинаковыми при двух тестируемых дозах (λz: 0,016/ч и 0,014/ч для 1 и 10 мг/кг, соответственно) с близкими временами полувыведения приблизительно два дня.

[0758] Значения Cmax и AUClast были пропорциональны вводимой дозе, и в диапазоне доз 1-10 мг/кг, вводимых в однократном ИТ режиме введения было показано линейное ФК поведение.

[0759] При обоих уровнях доз наблюдался градиент концентрации от проксимального к дистальному отделу позвоночника.

[0760] После ИТ введения максимальная концентрация отмечалась приблизительно через 20 минут в проксимальном, через 1-4 часа в среднем и через 1-8 часов в дистальном отделе. В разных отделах позвоночника также было показано линейное ФК поведение.

[0761] После ИТ введения уровень белка HNS количественно определялся, начиная с самых ранних моментов времени до 96 часов при 1 мг/кг и до 192 часов при 10 мг/кг. Скорость выведения составила при 1 мг/кг (λz 0,030 /ч), была выше, чем скорость при 10 мг/кг (λz 0,017/ч), с соответствующим более коротким t1/2 (28±16 и 42±1 часа при дозах 1 и 10 мг/кг, соответственно).

[0762] После ВВ введения период полувыведения в печени, почках, сердце и коже составил 47±10 и 38±13 часов для печени, 54±25 и 29±16 часов для почек, 36±15 и 42±19 часов для сердца, и 40±21 и 31±13 часов для кожи при 1 и 10 мг/кг, соответственно; хотя период полувыведения в головном мозге составил 71±23 и 60±53 часа. Средние значения Cmax для печени, кожи, почек, сердца и головного мозга составили 9,6, 0,30, 0,25, 0,22, и 0,08 мкг/г при дозе 1 мг/кг и 132, 7,9, 3,9, 3,7 и 1,8 мкг/г при дозе 10 мг/кг. После того, как значения Cmax для отдельных животных нормировали на дозу, значения Cmax/дозу при 10 мг/кг были значительно выше, чем при 1 мг/кг во всех перечисленных органах (максимальные значения р<0,05, p=0,06 для печени). Значения AUClast для печени, кожи, почек, сердца и головного мозга составили 525, 16, 14, 9 и 7 ч.мкг/г при 1 мг/кг; и 6747, 276, 183, 201 и 86 ч.мкг/г при 10 мг/кг. После нормировки значения AUClast /дозу при 10 мг/кг были значительно выше, чем при 1 мг/кг в коже (р<0,01), минимально отличались в сердце (р=0,06), и незначимо отличались в печени, головном мозге и почках (все значения р>0,34).

ПРИМЕР 23: Лечение пациентов с синдромом Санфилиппо типа А (Санфилиппо А) с использованием HNS

[0763] Прямое введение в ЦНС, например, посредством ИТ доставки, можно применять для эффективного лечения пациентов с синдромом Санфилиппо типа А. Данный пример иллюстрирует многоцентровое исследование с увеличением дозы, направленное на оценку безопасности 3 уровней доз rhHNS, вводимых раз в две недели (р/2 нед) в течение 40 недель через устройство интратекальной доставки лекарственных препаратов (IDDD) пациентам с синдромом Санфилиппо типа А. Разные варианты устройств интратекальной доставки лекарственных препаратов, применимых для лечения людей, показаны на Фигурах 94-97.

[0764] Всего в исследование было включено до 20 пациентов:

Когорта 1: 5 пациентов (Минимальная доза)

Когорта 2: 5 пациентов (Средняя доза)

Когорта 3: 5 пациентов (Максимальная доза)

5 пациентов были рандомизированы в группу, не получающую препарат.

[0765] Для участия в исследовании пациентов отбирали на основании следующих критериев включения:

[0766] Определяют безопасность увеличивающихся доз HNS, вводимых путем ИТ инъекций, в течение 40 недель пациентам с синдромом Санфилиппо типа А Кроме того, оценивают клиническую активность HNS в отношении когнитивных функций, а также фармакокинетику однократных и многократных доз препарата в сыворотке и концентрации в спинномозговой жидкости (СМЖ).

ПРИМЕРЫ ИТ ДОСТАВКИ Е NAGLU-IGFII

ПРИМЕР 24: Исследование rhNaglu и Naglu-IGFII in vitro

[0767] Механизм клеточного захвата каждого из вариантов Naglu изучали с применением двух линий фибробластов от пациентов с синдромом Санфилиппо В GM02391 (P359L) и GM 01426 (Е153К), и линии фибробластов от здорового человека. Исследователи традиционно используют фибробласты для исследования клеточного захвата лизосомальных ферментов, поскольку указанная линия клеток экспрессирует рецепторы М6Р.

[0768] Исследования клеточного захвата проводили путем инкубации фибробластов с rhNaglu или Naglu-IGFII в течение четырех часов при 37°C. После инкубации клетки промывали и лизировали, затем в лизатах клеток определяли активность фермента Naglu. Инкубация фибробластов с rhNaglu приводила к появлению едва определяемого количества фермента внутри клеток. Напротив, инкубация фибробластов с Naglu-IGFII приводила к значительному уровню фермента внутри клеток (Фигура 166). Количество интернализованного Naglu-IGFII достигало насыщения, когда количество фермента, применяемое для инкубации, увеличивали. Дозозависимый насыщающийся захват является типичным признаком рецептор-опосредуемого клеточного захвата. Кроме того, интернализацию Naglu-IGFII не ингибировало введение экзогенного М6Р, но полностью ингибировало введение экзогенного IGFII (Фигура 166). Указанный результат указывает на то, что интернализация Naglu-IGFII в фибробластах зависит от рецептора M6P/IGFII и не зависит от гликозилирования.

[0769] Также проводили эксперимент с целью изучения направленной миграции rhNaglu и Naglu-IGFII в лизосомы. В данном исследовании применяли фибробласты от пациентов с синдромом Санфилиппо В (GM01426). Определение hNaglu и Naglu-IGFII проводили посредством окрашивания клеток поликлональным антителом к Naglu человека после первоначальной инкубации указанных белков с указанными клетками. Для определения лизосом применяли иммунофлуоресцентное окрашивание на LAMP-1 (ассоциированный с лизосомами мембранный белок 1). Совместную локализацию rhNaglu и Naglu-IGFII с лизосами визуализировали на конфокальном микроскопе (Фигура 167).

[0770] Масштабная интернализация Naglu-IGFII наблюдалась после 4-часовой инкубации указанного белка с указанными клетками, была продемонстрирована совместная локализация Naglu-IGFII с лизосомами. Напротив, rhNaglu не демонстрировала локализацию в тех же временных рамках, и не наблюдалось совместной локализации с лизосомами. Указанный результат дает дополнительное подтверждение того, что Naglu-IGFII интернализуется в клетки и транспортируется в нужный компартмент клетки - в лизосомы. Определенное время полужизни интернализованного Naglu-IGFII в фибробластах пациентов с синдромом Санфилиппо В составило 1,5 дня (данные не показаны).

ПРИМЕР 25: Исследования in vivo в моделях на мышах

Канюлированные крысы дикого типа (wt)

[0771] Помимо модели синдрома Санфилиппо В на мышах, для молекулярного скрининга in vivo также применяли крыс дикого типа с канюлей, модель животных без недостаточности. Канюлированным крысам wt хирургическим путем вживляли канюлю в поясничный и нижний грудной отдел спинного мозга, и через канюлю проводили однократную инъекцию 35 мкл в СМЖ. Критерии, оцениваемые при молекулярном скрининге с применением указанной модели на животных, включали активность Naglu и иммуногистохимическое исследование головного и спинного мозга.

Модель синдрома Санфилиппо типа В на мышах

[0772] Модель синдрома Санфилиппо типа В на мышах (мыши Naglu-/-, мыши Санфилиппо В) была создана Е. Neufeld с соавт.(Li HH, et al., PNAS 96(25): 14505-14510; 1999). 6-й экзон гена Naglu мыши разрушали путем вставки селектируемого маркера - гена устойчивости к неомицину. Получаемая в результате гомозиготная мышь Naglu-/- была полностью дефицитной по Naglu (Фигура 168), и у нее в печени и почках происходит полная аккумуляция ГАГ. Несмотря на полный дефицит Naglu, указанные мыши в целом здоровы, и продолжительность жизни составляет 8-12 месяцев. Изменения экспрессии других лизосомальных ферментов возникает приблизительно в возрасте 5 месяцев, указанные изменения включают компенсаторное увеличение уровня β-галактозидазы, α-глюкозидазы, β-глюкуронидазы и β-гексозамидазы в печени и головном мозге, повышение уровня α-L-идуронидазы в печени, но не в головном мозге, и снижение уровня нейраминидазы в печени и головном мозге. Летальный исход обычно наступает вследствие задержки мочи и инфекций мочевыводящих путей. В литературе описаны многочисленные исследования на модели синдрома Санфилиппо типа В на мышах, направленные на описание патологических изменений при синдроме Санфилиппо типа В. Есть сообщения о том, что фенотип, связанный с патологией ЦНС у мышей Naglu-/-, обладает сниженной активностью в возрасте 4,5 месяцев, но гиперактивность наблюдали также и у мышей другого возраста.

[0773] Описанные нейропатологические изменения у мышей Naglu-/- включают вакуоли и тельца включения в нейронах, макрофагах и клетках эпителия, что видно при ЭМ (электронной микроскопии). Указанные патологические изменения обычно начинают возникать к 33 дню после рождения и прогрессивно ухудшаются по мере того, как животное становится старше. При гистопатологическом анализе также можно продемонстрировать активированные звездчатые клетки и клетки микроглии. Биохимический анализ двух ганглиозидов, GM2 и GM3, продемонстрировал 5-кратное и 9-кратное увеличение их уровня в головном мозге (Поскольку GM2 и GM3 не являются прямыми субстратами Naglu, и может быть трудно продемонстрировать значимое снижение после ЗФТ в течение короткого периода времени, их не применяют в качестве конечных биомаркеров для экспериментальной проверки концепции).

[0774] Биохимический анализ проводили посредством измерения активности фермента Naglu и уровней ГАГ, гистопатологический анализ проводили с использованием иммуногистохимического окрашивания с антителом к Naglu человека, анти-LAMP-1 антителом анти-Iba-1 антителом и анти-GFAP антителом. Антителом к Naglu человека, применяемым в настоящем исследовании, было моноклональное антитело мыши, которое не связывается с эндогенной Naglu мыши или мутированной Naglu у мышей с синдромом Санфилиппо типа В. При иммунном окрашивании на LAMP-1 применяли антитело, связывающееся с белком мембраны лизосом, ассоциированным с лизосомами мембранным белком-1. При окрашивании на Iba-1 применяли антитело, связывающееся с ионизированным кальцийсвязывающим адапторным белком, который специфичен для клеток микроглии и макрофагов. При окрашивании на GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) применяли антитело, связывающееся с глиальным фибриллярным кислым белком, который специфичен для астроцитов.

Скрининг биологической активности in vivo при внутричерепном (ВЧ) введении мышам с синдромом Санфилиппо В

[0775] Цель настоящего исследования состояла оценке биологической активности ферментов Naglu in vivo. В данном исследовании белки вводили посредством внутричерепной инъекции в головной мозг мышам с синдромом Санфилиппо В. Возраст мышей с синдромом Санфилиппо В для данного исследования подбирали близким к 8 неделям. ВЧ путь введения является наилучшим сценарием для оценки эффективности указанных молекул. Оценивали способность белков Naglu к захвату нейронами и к сокращению лизосомального накопления. Для оценки биораспределения и применяли иммуногистохимический способ, а лизосомальное накопление описывали по количеству и объему положительного окрашивания с применением иммунного окрашивания на LAMP-1.

[0776] ВЧ инъекцию осуществляли в виде прямой инъекции через череп мышам с синдромом Санфилиппо В в кору правого полушария. Каждому животному вводили два микролитра или 35 мкг белка Naglu. Умерщвление животных проводили через 7 дней после инъекции. Время умерщвления заранее определили на основании пробного исследования, в котором умерщвление животных проводили через 3, 7 и 14 дней после инъекции. На основании данных пробного исследования было определено, что 7 дней после инъекции - оптимальное время для иммуногистохимического исследования. Срезы головного мозга получали в поперечном направлении (Фигура 169), и проводили иммунное окрашивание на Naglu и Lamp-1. Клеточный захват и нейронами, и клетками глии у мышей с синдромом Санфилиппо В, получавших rhNaglu и Naglu-IGFII, был продемонстрирован с использованием иммуногистохимического способа с применением антител к Naglu человека (Фигура 170 и Фигура 171). Что касается клеточного захвата, значимых различий между мышами с синдромом Санфилиппо В, получавшими rhNaglu и Naglu-IGPII, не наблюдалось. Кроме того, иммунное окрашивание на LAMP-1 ткани головного мозга у мышей, получавших rhNaglu и Naglu-IGFII, указывает на значимый уровень снижения лизосомального накопления. Уровень снижения лизосомального накопления у групп, получавших как rhNaglu, так и Naglu-IGFII, был почти одинаковым с уровнем, обнаруживаемым у здоровых мышей wt.

[0777] Также снижение лизосомального накопления наблюдалось у мышей с синдромом Санфилиппо В, получавших Naglu-TAT, Naglu-Kif и PerT-Naglu, вводимых путем ВЧ инъекции (данные не показаны). Данное исследование продемонстрировало биологическую активность in vivo всех вариантов Naglu.

[0778] В отдельном исследовании мыши с дефицитом Naglu ИТ получали основу или, в качестве альтернативы, дозы рекомбинантного гибридного белка Naglu-IgF-II (Naglu) в ФБР раз в неделю, раз в две или раз в три недели. В качестве контроля дикого типа без введения препарата служила группа мышей дикого типа, которым вводили основу без Naglu. Мышей умерщвляли через 24 часа после последней инъекции, после чего ткани подготавливали к иммуногистохимическому (ИГХ) и гистопатологическому анализу.

[0779] Распределение Naglu в ткани головного мозга мышей с дефицитом Naglu было явным после ИТ введения рекомбинантной Naglu. Как проиллюстрировано на Фигуре 172А, ИТ введение рекомбинантной Naglu мышам с дефицитом Naglu приводило к масштабному снижению вакуолизации клеток в тканях белого вещества по сравнению с мышами с дефицитом Naglu, которые получали ИТ основу. Аналогично, и как проиллюстрировано на Фигуре 172В, морфометрический анализ выявил выраженное снижение иммунного окрашивания на LAMP1 в тканях белого вещества мышей, получавших препарат, по сравнению с мышами с дефицитом Naglu, не получавшими препарат, что отражает улучшение патологических признаков заболевания.

[0780] Как показано на Фигурах 173А-В, в каждой оцениваемой зоне головного мозга (кора, хвостатое ядро и скорлупа (СР), таламусе (ТН), мозжечке (CBL) и белом веществе (WM)) LAMP-положительная зона сокращалась у мышей, получавших Naglu, по сравнению с контрольными мышами с дефицитом Naglu, и приближалась к размеру LAMP-положительной зоны мышей дикого типа. Особенно примечательно то, что LAMP-положительные площади в каждой анализируемой зоне ткани головного мозга еще больше сокращалась после ИТ введения двух или трех доз (Фигура 173В) по сравнению с одной дозой (Фигура 173А) Naglu.

[0781] Указанные результаты подтверждают, что вводимая ИТ Naglu способна модифицировать прогрессирование лизосомных болезней накопления, таких как синдром Санфилиппо типа В, в модели мышей с дефицитом Naglu, что дает дополнительное подтверждение способности вводимых ИТ ферментов, таких как Naglu, бороться с проявлениями со стороны ЦНС, ассоциированными с лизосомальными болезнями накопления, такими как синдром Санфилиппо типа В.

Молекулярный скрининг посредством интратекального (ИТ) введения канюлированным крысам wt

[0782] В данном исследовании прямо имитирован способ введения лекарственных препаратов через порт. Белок Naglu вводили посредством ИТ инъекций канюлированным крысам wt, чтобы определить биораспределение в паренхиме головного мозга.

[0783] Канюлю указанным животным устанавливали в верхнем поясничном и нижнем грудном отделе спинного мозга (Фигура 174). Животным вводили 35 мкл или 385 мкг rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII и PerT-Naglu, через указанную канюлю (из-за ограниченной растворимости Naglu Kif вводили только в количестве 38,5 мкг, что в 10 раз меньше, чем доза остальных вариантов Naglu). Умерщвление проводили через 14 ч и 24 ч после инъекций.

[0784] Отбирали ткани головного и спинного мозга и проводили измерение активности Naglu. В головном мозге животных, получавших Naglu-TAT и Naglu-IGFII, активность фермента была выше, чем у животных, получавших rhNaglu и все другие варианты Naglu (Фигура 175). В виде общей тенденции активность Naglu была значительно выше в спинном мозге, чем в головном мозге у всех получавших препараты животных (данные не показаны). Указанное явление может указывать на то, что белки захватывались в большей степени в участке, расположенном ближе к месту ИТ инъекции.

[0785] Иммуногистохимический анализ показал, что биораспределение у группы, получавшей Naglu-IGFII, в головном мозге через 24 часа после ИТ инъекций было более масштабным, чем в группах, получавших другие варианты Naglu (Фигура 176 и Фигура 177). У животных, получавших rhNaglu, указанный белок обнаруживался в оболочках мозга только в головном мозге. В отделе спинного мозга ИГХ исследование показало некоторую степень клеточного захвата rhNaglu в нейронах серого вещества, но эта степень была гораздо ниже, чем степень захвата Naglu-IGFII нейронами спинного мозга (данные не показаны).

[0786] У группы, получавшей ИТ Naglu-TAT, даже хотя при биохимической анализе активность Naglu в тканях головного мозга была наивысшей, ИГХ не показала никакого проникновения Naglu-TAT в паренхиму головного мозга, помимо сохранения в оболочках мозга. Помимо Naglu-IGFII все остальные варианты Naglu не продемонстрировали биораспределения за пределами оболочек мозга, что является весомым доказательством зависимости клеточного захвата в головном мозге от рецепторов M6P/IGFII после ИТ введения. Указанное исследование показало, что ведущей молекулой для разработки препаратов от синдрома Санфилиппо В является Naglu-IGFII.

ПРИМЕР 26: ИССЛЕДОВАНИЕ С ЦЕЛЬЮ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ КОНЦЕПЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ NAGLU-IGFII

Схема эксперимента

[0787] Исследование с целью подтверждения концепции было разработано таким образом, чтобы показать биораспределение и обращение лизосомального накопления после ИТ инъекции Naglu-IGFII у мышей с синдромом Санфилиппо В. В рамках данного исследования три группы мышей с синдромом Санфилиппо В в возрасте 8 недель получали ИТ инъекции Naglu-IGFII. При каждой ИТ инъекции вводили объем 10 мкл или 260 мкг Naglu-IGFII. Всего было три лечебных группы - группа, получавшая 1 инъекцию, 2 инъекции и 3 инъекции. В группе 1 инъекции животные однократно получали дозу белка в день 0. Животных умерщвляли через 24 часа после инъекции. В группе 2 инъекций ИТ инъекции вводили в день 0 и день 7, и животных умерщвляли через 24 часа после последней инъекции. В группе 3 инъекций ИТ инъекции вводили в день 0, день 7 и день 14, и животных умерщвляли через 24 часа после последней инъекции. Также были включены три группы, получавших только основу. В контрольных группах, получавших только основу, мыши с синдромом Санфилиппо В получали инъекции основы с теми же интервалами времени, что и группы, получавшие препарат, и их умерщвляли по такому же графику, как и в лечебных группах.

[0788] Для оценки результата исследования проводили как биохимический, так и гистологический анализ. Биологический анализ включал оценку активности Naglu с целью определения количества фермента в тканях, а также оценку общего содержания ГАГ, чтобы определить сокращение лизосомального накопления. Для биохимического анализа двумя целевыми тканями были печень и головной мозг (Фигура 178 и Фигура 179). Гистологический анализ включал окрашивание тканей Г и Э для морфологической оценки (данные не показаны), и иммуногистохимическое окрашивание с применением антител к Naglu человека, LAMP, Iba и GFAP (данные для окрашивания на Iba и GFAP не показаны).

[0789] Антителом к Naglu человека, применяемым в настоящем исследовании, было моноклональное антитело мыши, которое не связывается с эндогенной Naglu мыши или мутированной Naglu у мышей с синдромом Санфилиппо типа В. При иммунном окрашивании на LAMP-1 применяли антитело, связывающееся с белком мембраны лизосом, ассоциированным с лизосомами мембранным белком. При окрашивании на Iba-1 применяли антитело, связывающееся с ионизированным кальций-связывающим адапторным белком, который специфичен для клеток микроглии и макрофагов. При окрашивании на GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) применяли антитело, связывающееся с глиальным фибриллярным кислым белком, который специфичен для астроцитов.

[0790] Показательные микроскопические изображения иммунофлуоресценции Naglu показаны на Фигуре 181. На Фигуре 181 показан показательный схематический срез головного мозга. Даже несмотря на то, что Naglu-IGFII определялась в коре больших полушарий, которая ближе к оболочкам мозга, она не обнаруживалась в таких подкорковых отделах, как хвостатое ядро, таламус и белое вещества (данные не показаны). Поскольку иммунное окрашивание на LAMP-1, Iba-1 и GFAP тех же подкорковых областей все же продемонстрировало обращение лизосомального накопления, было сделано предположение, что отрицательное иммунное окрашивание на Naglu глубоких отделов мозга, вероятно, было связано с чувствительностью иммунофлуоресценции Naglu.

[0791] Показательные микроскопические изображения иммунного окрашивания на Lamp-1 показаны на Фигурах 182-186. Чтобы продемонстрировать степень распределения белка и эффективность для иммуногистологического анализа были избраны кора больших полушарий и такие подкорковые отделы, как хвостатое ядро, таламус и белое вещество, а также кора мозжечка. Результаты иммунного окрашивания на Iba-1 и GFAP (данные не показаны) показали что результат, наблюдаемый при иммунном окрашивании на LAMP-1, отражал сочетанный эффект изменений в клетках микроглии и астроцитах - двух типах клеток, которые по сообщениям поражаются в модели синдрома Санфилиппо В на мышах, (Li 2002, Ohmi 2002) наряду с нейронами. Из-за технических ограничений, иммунное окрашивание на LAMP-1 не позволяло выявить лизосомальное накопление в нейронах. Обычно для наиболее успешной визуализации накопления в нейронах, таких как вакуоли и включения, применяют электронную микроскопию (ЭМ в настоящее исследование не включало).

[0792] Следует понимать, что идентификация типов клеток ограничивалась нейронами и клетками глии. Обычно нейроны идентифицировали по относительно крупному и бледному ядру, которое содержало одно или более интенсивно окрашенных ядрышек, и часто - окрашенную цитоплазму. Клетки глии обычно идентифицировали по маленьким интенсивно окрашенным ядрам и бледной цитоплазме. Различение разных типов клеток глии, таких как звездчатые клетки, клетки микроглии, эпиндимальные клетки и олигодендроциты, обычно лучше проводить путем окрашивания специфическими маркерами на разные типы клеток.

[0793] Помимо сокращения лизосомального накопления, выявляемого при иммунном окрашивании на LAMP-1, иммунное окрашивание на Iba-1 показало уменьшение размера и числа отростков клеток микроглии, а иммунное окрашивание на GFAP показало уменьшение размера и длины/числа отростков астроцитов в коре больших полушарий, хвостатом ядре, таламусе и белом веществе, а также в коре мозжечка после ИТ инъекций Naglu-IGFII (данные не показаны). Кроме того, гистопатологический анализ, проводимый путем окрашивания Г и Э (гематоксилином и эозином) тканей головного мозга из тех же областей, которые исследовали иммуногистохимически, продемонстрировал сокращение вакуолей в клетках глии после 3 ИТ инъекций Naglu-IGFII. Все результаты, упоминаемые выше, также указывают на дозозависимый эффект ИТ инъекций Naglu-IGFII.

[0794] Биохимический анализ мышей с синдромом Санфилиппо В после ИТ инъекций Naglu-IGFII выявил активность Naglu в головном мозге и печени. Эффективность Naglu-IGFII была продемонстрирована по уменьшению общего количества ГАГ в головном мозге и печени. Иммуногистохимический анализ продемонстрировал биораспределение Naglu-IGFII в паренхиму головного мозга. Иммунное окрашивание на LAMP-1, Iba-1, GFAP и гистопатологический анализ с применением окрашивания Г и Э выявил сокращение лизосомального накопления, уменьшение размера и отростков у клеток микроглии и астроцитов не только в области коры больших полушарий, но также в подкорковых отделах, белом веществе и коре мозжечка головного мозга.

Заключение

[0795] Помимо прочего было продемонстрировано, что гибридный белок Naglu-IGFII проявляет ферментативную активность m vitro по отношению к субстрату, который обладает структурой, близкой к структуре нативного субстрата Naglu. Исследование клеточного захвата m vitro продемонстрировало, что молекула захватывается клетками при участии рецептора M6P/IGFII и независимо от гликозилирования М6Р. Было показано, что интернализованный белок Naglu-IGFII локализован совместно с лизосомами. Было показано, что Naglu-IGFII сокращает лизосомальное накопление in vivo после ВЧ инъекции мышам с синдромом Санфилиппо В. По сравнению с hNaglu и другими гибридными белками и модификациями Naglu, Naglu-IGFII превосходит их всех по проникновению в паренхиму головного мозга крыс дикого типа с канюлей после ИТ инъекции. Кроме того, ИТ введение Naglu-IGFII мышам с синдромом Санфилиппо В продемонстрировало обширное распределение за пределы оболочек мозга, и в коре больших полушарий и в подкорковых отделах наблюдалось обращение лизосомального накопления. В совокупности перечисленные данные указывают на то, что Naglu-IGFII является кандидатом в препараты для лечения синдрома Санфилиппо В.

ПРИМЕР 27: ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧНОСТИ, ФАРМАКОКИНЕТИКИ (ФК) И БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ В ТКАНЯХ NAGLU-IGFII, ВВОДИМОЙ ИТ

Исследования с целью подтверждения правильности концепции на мышах

[0796] Трем группам мышей Naglu(-/-) (n=3) вводили 10 мкл, содержащие 260 мкг Naglu-IGFII, в форме болюсной ИТ инъекции в поясничный отдел. Доза 260 мкг соответствует 520 мг/кг массы головного мозга (мозг мыши = 0,0005 кг). Одной группе инъекцию осуществляли в день 0 и умерщвляли через 24 часа после инъекции. Второй группе инъекцию осуществляли в день 0 и 7 и умерщвляли через 24 часа после последней инъекции. Третьей группе инъекцию осуществляли в день 0, 7 и 14 и умерщвляли через 24 часа после последней инъекции. Каждая группа, получавшая Naglu-IGFII, была дополнена соответствующей контрольной группой, получавшей основу, чтобы контролировать влияние возраста/тяжести заболевания.

[0797] Активность фермента Naglu в головном мозге и печени была близкой во всех трех группах, получавших Naglu-IGFII. При сравнении активности фермента Naglu в головном мозге и печени, в печени была выявлена активность выше более чем в 10 раз. Поскольку уровень активности фермента Naglu в головном мозге и печени был сопоставимым через 1, 3 и 6 месяцев введения препарата в пробных исследованиях токсичности у крыс и молодых обезьян, предполагалось, что некоторая часть дозы rhNaglu, вводимой мышам Naglu(-/-), может доставляться не ИТ, а скорее системно. Тем не менее, общий уровень ГАГ в головном мозге продемонстрировал статистически значимое снижение после 3 ИТ инъекций (р<0,05). В печени наблюдалась тенденция к зависимости от дозы в отношении общего уровня ГАГ, которая была статистически значимой (р<0,05) в группах, получавших 2 или 3 дозы.

[0798] После ИТ инъекции распределение Naglu-IGFII наблюдалось далеко за пределами оболочек мозга, в паренхиме головного мозга, но глубокие подкорковые отделы были негативны при иммунном окрашивании анти-Naglu антителом. Снижение лизосомальной активности, определяемой по иммунному окрашиванию на ассоциированный с лизосомами мембранный белок (LAMP), наблюдалось только в группах, получавших 2 и 3 дозы. Области снижения лизосомальной активности включали кору больших полушарий и глубокие подкорковые отделы - хвостатое ядро, таламус и белое вещество. Таким образом, снижение разных показателей иммунного окрашивания у получавших Naglu-IGFII животных, указывает на то, что могут присутствовать терапевтические уровни NAGLU, несмотря на отсутствие иммунного окрашивания анти-NAGLU. Уменьшение воспалительной реакции выявлялось по уменьшению иммунного окрашивания астроцитов на антиглиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и по уменьшению окрашивания клеток микроглии/макрофагов на кальцийсвязывающий адапторный белок (Iba) только в группах, получавших 2 и 3 дозы. Области анализа включали кору больших полушарий и глубокие подкорковые отделы - хвостатое ядро, таламус и белое вещество.

Исследования на крысах

[0799] В качестве вида грызунов для токсикологической оценки ИТ введения Naglu-IGFII были выбраны крысы С-Д. В результате, шестнадцати крысам (по восемь на пол) вводили рекомбинантный Naglu-IGFII в максимальной допустимой дозе (МДД), и приблизительно ¼ и ½ от МДД (низкие и средние дозы, соответственно) раз в 4 дня, всего 8 доз.

[0800] Исследование ФК/биораспределения однократных доз проводили на крысах, чтобы определить концентрацию в СМЖ и сыворотке, или распределение в тканях, соответственно, после ИТ-П введения самцам и самкам животных.

[0801] Токсикологические исследования направлены на оценку ИТ-П введения Naglu-IGFII с точки зрения токсикологии и фармакологической безопасности (безопасность для нервной, дыхательной и сердечно-сосудистой системы) как у самцов, так и самок. Токсикологическая оценка в указанных исследованиях включает наблюдение за клиническими признаками, массу тела, потребление пищи, лабораторную диагностику, соответствующую оценку фармакологической безопасности (по физикальному обследованию и электрокардиографии), макроскопическую и микроскопическую оценку тканей. Отбирают ограниченное количество проб СМЖ и сыворотки и анализируют их на наличие Naglu-IGFII, а также на антитела к тестируемому веществу. Распределение Naglu-IGFII в ткани и субклеточную локализацию Naglu-IGFII количественно оценивают по активности фермента и иммуногистохимически, соответственно. Кроме того, выбранные исследования включают период восстановления для оценки обратимости или потенциальных отдаленных проявлений любых выявленных значимых токсикологических изменений.

Исследования на обезьянах

[0802] В качестве вида не грызунов для токсикологической оценки ИТ введения Naglu-IGFII были выбраны яванские макаки, поскольку они генетически и анатомически близки людям, и следовательно, предполагается, что это наиболее подходящий вид. С учетом того, что планируемая популяция пациентов для участия клинических исследования лечения синдрома Санфилиппо типа В - это дети, хроническое 6-месячное токсикологическое исследование проводили на молодых длиннохвостых макаках с устройством интратекальной доставки лекарственных препаратов (IDDD) для введения Naglu-IGFII. В начале исследования молодые яванские макаки обычно были моложе 1 года (приблизительно 7-9 месяцев) и весили от 900 г до 1500 г.Данные, полученные в исследовании токсичности 1-месячного многократного введения молодым длиннохвостым макакам, помогли в выборе уровня доз и схемы эксперимента для 6-месячного исследования на молодых длиннохвостых макаках. Токсикологические исследования многократного введения направлены на имитирование ожидаемого клинического пути введения (ИТ-П болюсное) и частоты введения (раз в две недели; р/2 нед) в течение 1-6 месяцев.

[0803] Как описывалось выше, токсикологические исследования направлены на оценку ИТ-П введения Naglu-IGFII с точки зрения токсикологии и фармакологической безопасности (безопасность для нервной, дыхательной и сердечно-сосудистой системы) как у самцов, так и самок. Токсикологическая оценка в указанных исследованиях включает наблюдение за клиническими признаками, массу тела, потребление пищи, лабораторную диагностику, соответствующую оценку фармакологической безопасности (по физикальному обследованию и электрокардиографии), макроскопическую и микроскопическую оценку тканей. Отбирают ограниченное количество проб СМЖ и сыворотки и анализируют их на наличие Naglu-IGFII, а также на антитела к тестируемому веществу. Распределение Naglu-IGFII в ткани и субклеточную локализацию Naglu-IGFII количественно оценивают по активности фермента и иммуногистохимическим способом, соответственно. Кроме того, выбранные исследования включают период восстановления для оценки обратимости или потенциальных отдаленных проявлений любых выявленных значимых токсикологических изменений.

ПРИМЕР 28: ИНТРАТЕКАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ NAGLU-IGFII РАЗ В ДВЕ НЕДЕЛИ

[0804] В данном примере предполагается определить допустимость ИТ введения 6 инъекций (3-месячное исследование) раз в две недели в поясничный отдел мышам в модели Naglu-/-. Указанный режим введения может обладать более высокой клинической значимостью, чем введение раз в неделю.

[0805] В исследовании применяли самцов и самок мышей Naglu-/- в возрасте восемь недель в соответствии со схемой эксперимента, представленной в Таблице 49:

Таблица 49
Схема эксперимента ИТ доставки Naglu-IGFII р/2 нед
Группа	N	Препарат	Доза	Частота	Умерщвление
А	3	Основа	НП	ИТ инъекция р/2 нед в течение 3 месяцев (всего 6 инъекций)	Через 24 ч после последней инъекции
В	6	Naglu-IGFII	60 мг/кг массы головного мозга (30 мкг)	ИТ инъекция р/2 нед в течение 3 месяцев (всего 6 инъекций)	Через 24 ч после последней инъекции

[0806] Проводили физиологические исследования, включая оценку активности Naglu в печени, головном мозге и сыворотке, определение анти-Naglu антител в сыворотке, и ВСА оценку в печени и головном мозге. Проводили гистологические исследования, включая ИГХ Naglu в головном, спинном мозге и печени, и окрашивание на LAMP в головном и спинном мозге.

[0807] Головной, спинной мозг и печень отбирали и фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине. Для гистологического окрашивания готовили парафиновые срезы с шагом 5 мкм. Для определения клеточного захвата вводимого белка применяли иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание на Naglu. Для отслеживания морфологических изменений применяли окрашивание Г и Э. Для оценки гистопатологического улучшения LAMP - индикатор лизосомальной активности и статуса заболевания, GFAP и Iba-1 - два маркера патологии ЦНС в отношении активированных астроцитов и клеток микроглии.

[0808] Иммунное окрашивание головного, спинного мозга и печени на Naglu у мышей, получавших только основу, и мышей, получавших Naglu-IGFII, продемонстрировало, что в головном и спинном мозге вводимая Naglu определялась в оболочках мозга (М) только при ИГХ, но ни в одном другом отделе положительного окрашивания на Naglu не определялось (Фигура 187). В печени положительно окрашенными на Naglu были синусоидальные клетки (S), а в гепатоцитах (И) захвата Naglu не обнаруживалось.

[0809] Иммунное окрашивание на LAMP, а также окрашивание Г и Э печени и спинного мозга мышей, получавших только основу, и мышей, получавших Naglu-IGFII, продемонстрировало, по сравнению с мышами, получавшими только основу, окрашивание LAMP снижалось по всей печени и спинному мозгу мышей, получавших Naglu. Окрашивание Г и Э продемонстрировало, что вакуолизация в гепатоцитах явно снижалась у групп, получавших препарат, по сравнению с животными, получавшими только основу (Фигура 188 и Фигура 189).

[0810] Окрашивание Г и Э головного мозга мышей, получавших только основу, и мышей, получавших Naglu-IGFII, продемонстрировало морфологическое улучшение в головном мозге после 6 ИТ инъекций Naglu-IGFII, проводимых раз в две недели в течение 3 месяцев. В головном мозге животных, получавших препарат, вакуолизация клеток (показано стрелками) снижалась во всех исследуемых областях по сравнению с группой, получавшей только основу (Фигура 190).

[0811] ИГХ на LAMP в разных отделах головного мозга после 6 ИТ инъекций Naglu-IGFII, проводимых раз в две недели в течение 3 месяцев, продемонстрировало, что по сравнению с группой, получавшей только основу, ИТ введение Naglu мышам с SFB приводило к снижению лизосомальной активности во всех исследуемых областях, что определяли по иммунному окрашиванию на LAMP (Фигура 190). Указанное снижение характеризовалось уменьшением количества LAMP-положительных клеток, уменьшением размера клеток и более светлым окрашиванием. Значимое по сравнению с другими отделами головного мозга снижение было выявлено в мозжечке и стволе головного мозга, который расположен в нижней части головного мозга, приближенной к спинному мозгу. Также явное снижение было выявлено в глубоких отделах головного мозга, включая белое вещество, гиппокамп и таламус.

[0812] ИГХ на Iba в разных отделах головного мозга после 6 ИТ инъекций Naglu, проводимых в течение 3 месяцев, выявило активацию клеток микроглии (Фигура 191). По сравнению с группой, получавшей только основу, снижения количества положительно окрашенных клеток и интенсивности окрашивания в группе, получавшей Naglu, не наблюдалось. Однако изменялась клеточная морфология положительно окрашенных клеток микроглии, и уменьшался размер клеток во всех исследуемых областях головного мозга по сравнению с крупными и вакуолизированными клетками в группе, получавшей только основу (врезка).

[0813] ИГХ на GFAP в разных отделах головного мозга после 6 ИТ инъекций Naglu, проводимых в течение 3 месяцев, выявило активацию астроцитов (Фигура 192). По сравнению с группой, получавшей только основу, положительное окрашивание на GFAP снижалось в мозжечке и стволе головного мозга, и слегка снижалось в других исследуемых отделах.

[0814] Что касается клеточного захвата, указанные данные демонстрируют, что в головном и спинном мозге Naglu определялась в клетках оболочек мозга только после 6 ИТ инъекций Naglu IGFII, проводимых раз в две недели в течение 3 месяцев. Naglu не определялась ИГХ способом ни в одном из других областей головного и спинного мозга. В печени положительное окрашивание на Naglu обнаруживалось в синусоидальных клетках. В головном и спинном мозге после 6 ИТ инъекций Naglu IGFII, проводимых раз в две недели в течение 3 месяцев, по всему головному и спинному мозгу наблюдалось гистопатологическое улучшение, даже несмотря на то, что введенная Naglu не определялась ИГХ способом. Окрашивание Г и Э продемонстрировало снижение вакуолизации клеток во всех исследуемых отделах головного мозга. Окрашивание на LAMP снижалось в спинном мозге всех получавших препарат животных, и во всех исследуемых отделах головного мозга, включая белое вещество, гиппокамп и таламус, которые являются глубокими зонами головного мозга, с выраженным снижением в мозжечке и стволе головного мозга групп, получавших Naglu-IGFII. Менее интенсивный характер окрашивания на GFAP в астроцитах согласовывался с окрашиванием на LAMP, хотя снижение окрашивания на GFAP было не столь существенным, как на LAMP. Окрашивание на Iba-1 продемонстрировало уменьшение размера клеток микроглии во всех исследуемых отделах головного мозга. В печени окрашивание Г и Э продемонстрировало снижение вакуолизации с выраженным снижением окрашивания на LAMP у групп, получавших Naglu.

ПРИМЕР 29: ЛЕЧЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ С СИНДРОМОМ САНФИЛИППО ТИПА В

[0815] Прямое введение в ЦНС, например, посредством ИТ доставки, можно применять для эффективного лечения пациентов с синдромом Санфилиппо типа В. Данный пример иллюстрирует многоцентровое исследование с увеличением дозы, направленное на оценку безопасности 3 уровней доз Naglu-IGFII и/или rhNaglu, вводимых раз в две недели (р/2 нед) в течение 40 недель через устройство интратекальной доставки лекарственных препаратов (IDDD) пациентам с синдромом Санфилиппо типа В. Разные варианты устройств интратекальной доставки лекарственных препаратов, применимых для лечения людей, показаны на Фигурах 94-97.

[0816] Всего в исследование было включено до 20 пациентов:

Когорта 1: 5 пациентов (Минимальная доза)

Когорта 2: 5 пациентов (Средняя доза)

Когорта 3: 5 пациентов (Максимальная доза)

5 пациентов были рандомизированы в группу, не получающую препарат.

[0817] Для участия в исследовании пациентов отбирали на основании следующих критериев включения:

[0818] Определяют безопасность увеличивающихся доз Naglu-IGFII, вводимых путем ИТ инъекций, в течение 40 недель пациентам с синдромом Санфилиппо типа В. Кроме того, оценивают клиническую активность Naglu-IGFII и/или rhNaglu в отношении когнитивных функций, а также фармакокинетику однократных и многократных доз препарата в сыворотке и концентрации в спинномозговой жидкости (СМЖ).

[0819] Обычно терапевтически эффективное количество Naglu-IGFII и/или rhNaglu вводят интратекально с регулярными интервалами, в зависимости от природы и степени эффектов заболевания, на постоянной основе. Термин «введение с определенными интервалами» в настоящей заявке означает, что терапевтически эффективное количество вводят периодически (в отличие от введения однократной дозы). Указанный интервал модно определить с использованием стандартных клинических способов. Согласно некоторым вариантам реализации rhNaglu вводят интратекально раз в два месяца, раз в месяц, два раза в месяц, раз в три недели, раз в две недели, раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю или раз в день. Интервал введения для конкретного индивидуума не обязательно должен быть фиксированным интервалом, а может варьировать во времени, в зависимости от потребностей индивидуума. Например, в момент соматического заболевания или стресса, если появляются анти-Naglu антитела или возрастает их уровень, или если симптомы заболевания ухудшаются, интервал между дозами можно уменьшать.

[0820] Хотя определенные соединения, композиции и способы, описываемые в настоящей заявке, были описаны специфически в рамках определенных вариантов реализации, следующие примеры служат только для иллюстрирования соединений согласно настоящему изобретению, но не должны ограничиваться только такими же соединениями.

[0821] Применяемые в настоящем документе в описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа, если явно не указано другое, включают множественное число. Формула изобретения или описание, в которых встречается «или» между одним или более членами группы, считаются удовлетворенными, если один, более одного или вся группа челнов присутствуют, используются или другим образом относятся к данному продукту или способу, если не указано противоположенное, или другое не следует явно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты реализации, в которых один член указанной группы точно присутствует, используется или другим образом относится к данному продукту или способу. Настоящее изобретение также включает варианты реализации, в которых более одного, или целая группа членов присутствует, используется или другим образом относится к данному продукту или способу. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и преобразования, в которых одно или более ограничений, элементов, условий, описательных выражений, и др., из одного или более перечисленных пунктов формулы изобретения введено в другой пункт изобретения, зависимый от того же основного пункта формулы изобретения (или, если значимо, любого другого пункта формулы изобретения), если не указано другое, или если специалисту в данной области техники не очевидно, что может возникнуть противоречие или несоответствие. Когда элементы присутствуют в перечнях (например, группа Маркуша или аналогичная форма), следует понимать, что также раскрывается каждая подгруппа элементов, и любые элементы из данной группы можно удалить. Следует понимать, что обычно там, где настоящее изобретение или аспекты изобретения описываются как содержащие конкретные элементы, признаки, и др., определенные варианты реализации настоящего изобретения или аспектов изобретения включают, или по существу включают такие элементы, признаки, и др. В целях упрощения в настоящей заявке указанные варианты реализации не были в каждом случае описаны так буквально. Следует понимать, что любой вариант реализации или аспект настоящего изобретения можно в явной форме исключить из формулы изобретения, независимо от того, ограничено ли такое конкретное исключение в описании. Публикации, нтернет-сайты и прочие справочные материалы, на которые ссылается настоящий документ в целях описания уровня техники в области изобретения и для предоставления дополнительных подробностей касательно его внедрения в практику, включены в настоящий документ посредством ссылки.

1. Способ прямой доставки в ЦНС для лечения лизосомных болезней накопления, включающий стадию интратекального введения субъекту, страдающему от или предрасположенного к лизосомной болезни накопления, ассоциированной со снижением уровня или активности лизосомального фермента, композиции, содержащей замещающий фермент для замещения лизосомального фермента в концентрации выше примерно 5 мг/мл и до 50 мМ фосфата.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация замещающего фермента выше примерно 10 мг/мл.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что композиция дополнительно содержит один или более из (I) поверхностно-активного вещества или (II) регулятора тоничности.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что рН композиции составляет примерно 3,0-8,0.

5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что композицию вводят в объеме одной дозы менее 5 мл.

6. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что композицию вводят в объеме одной дозы менее 3 мл.

7. Способ прямой доставки в ЦНС для лечения лизосомных болезней накопления, включающий стадию интратекального введения субъекту, страдающему от или предрасположенного к лизосомной болезни накопления, ассоциированной со снижением уровня или активности лизосомального фермента, композиции, содержащей замещающий фермент для замещения лизосомального фермента, в составе, который не является синтетической СМЖ, причем концентрация замещающего фермента выше примерно 5 мг/мл, и при этом состав содержит до 50 мМ фосфата.

8. Способ прямой доставки в ЦНС для лечения лизосомных болезней накопления, включающий стадию введения субъекту, страдающему от или предрасположенного к лизосомной болезни накопления, ассоциированной со снижением уровня или активности лизосомального фермента, композиции, содержащей замещающий фермент для замещения лизосомального фермента, причем концентрация замещающего фермента выше примерно 5 мг/мл, и при этом состав содержит до 50 мМ фосфата, причем указанное введение включает интратекальное введение композиции в отсутствие сопутствующей терапии иммунодепрессантами.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанный способ не включает предварительного лечения или предварительной подготовки субъекта с применением агентов для иммуносупрессии Т-клеток.

10. Способ прямой доставки в ЦНС для лечения лизосомных болезней накопления, включающий стадию интратекального введения субъекту, страдающему от или предрасположенного к лизосомной болезни накопления, ассоциированной со снижением уровня или активности лизосомального фермента, композиции, содержащей замещающий фермент для замещения лизосомального фермента в такой терапевтически эффективной дозе и с таким интервалом введения, которые обеспечивают достижение не менее 10% нормального уровня или активности лизосомального фермента в одной или более тканях головного мозга, спинного мозга и периферических органов, причем концентрация замещающего фермента выше примерно 5 мг/мл, и при этом состав содержит до 50 мМ фосфата.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что одна или более тканей головного мозга включает ткань оболочки.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что ткань оболочки выбрана из группы, включающей мягкую мозговую оболочку, твердую мозговую оболочку и паутинную оболочку.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что одна или более тканей головного мозга включает ткань головного мозга.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что ткань головного мозга представляет собой поверхностную или неглубокую ткань головного мозга.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что поверхностная или неглубокая ткань головного мозга выбрана из группы, включающей ткани мягкой мозговой оболочки, ткани коры головного мозга, ткани в пределах 4 мм от поверхности головного мозга, а также их комбинации.

16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что ткань головного мозга представляет собой глубокую ткань головного мозга.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что глубокая ткань головного мозга выбрана из группы, включающей ткани, лежащие под корой головного мозга, ткани, расположенные на глубине более 4 мм от поверхности коры головного мозга, ткани, расположенные на глубине более 6 мм от поверхности коры головного мозга, ткани, расположенные на глубине более 10 мм от поверхности коры головного мозга, а также их комбинации.

18. Способ по п. 10, отличающийся тем, что одна или более тканей головного мозга включает ткань мозжечка.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что ткань мозжечка выбрана из группы, включающей ткани молекулярного слоя, ткани слоя клеток Пуркинье, ткани зернистого слоя и их комбинации.

20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что ткань мозжечка представляет собой глубокую ткань мозжечка.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что глубокая ткань мозжечка выбрана из группы, включающей ткани слоя клеток Пуркинье, ткани зернистого слоя, глубокие ткани белого вещества мозжечка и ткани глубоких ядер мозжечка.

22. Способ по п. 10, отличающийся тем, что одна или более тканей головного мозга включает ткань ствола головного мозга.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что ткань ствола головного мозга выбрана из группы, включающей ткань белого вещества ствола головного мозга и/или ткань ядер ствола головного мозга.

24. Способ по п. 10, отличающийся тем, что одна или более тканей спинного мозга представляет собой поверхностную или неглубокую ткань спинного мозга.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что поверхностная или неглубокая ткань спинного мозга выбрана из группы, включающей мягкую оболочку, пути белого вещества и ткани в пределах 4 мм от поверхности спинного мозга.

26. Способ по п. 10, отличающийся тем, что одна или более тканей спинного мозга представляет собой глубокую ткань спинного мозга.

27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что глубокая ткань спинного мозга выбрана из группы, включающей серое вещество спинного мозга и эпендимоциты и ткани, расположенные на глубине более 4 мм от поверхности спинного мозга.

28. Способ по п. 10, отличающийся тем, что одна или более тканей головного мозга включает поверхностную или неглубокую ткань.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что поверхностная или неглубокая ткань выбрана из группы, включающей ткани мягкой оболочки, твердой оболочки и паутинной оболочки головного мозга, ткани мягкой мозговой оболочки, ткани коры головного мозга, ткани в пределах 4 мм от поверхности головного мозга, а также их комбинации.

30. Способ по п. 10, отличающийся тем, что ткани включают глубокие ткани.

31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что глубокие ткани мозга выбраны из глубокого белого вещества головного мозга, глубокого серого вещества спинного мозга, мозолистого тела, перивентрикулярной ткани, таламуса, фимбрий, тканей, лежащих глубже коры головного мозга, тканей, лежащих глубже 4 мм от поверхности головного мозга, тканей глубже 6 мм от поверхности головного мозга, тканей глубже 10 мм от поверхности головного мозга, слоя клеток Пуркинье, тканей зернистого слоя, глубокой ткани белого вещества мозжечка, ткани глубоких ядер мозжечка и их комбинации.

32. Способ по любому из пп. 10-31, отличающийся тем, что терапевтически эффективная доза находится в диапазоне от 0,005 мг/кг веса мозга до 100 мг/кг веса мозга.

33. Способ по любому из пп. 10-31, отличающийся тем, что терапевтически эффективная доза составляет более 1 мг/кг веса мозга.

34. Способ по любому из пп. 10-31, отличающийся тем, что терапевтически эффективная доза составляет более 10 мг/кг веса мозга.

35. Способ по любому из пп. 10-31, отличающийся тем, что терапевтически эффективная доза составляет более 30 мг/кг веса мозга.

36. Способ по любому из пп. 10-31, отличающийся тем, что периодичность введения составляет один раз в две недели.

37. Способ по любому из пп. 10-31, отличающийся тем, что периодичность введения составляет один раз в месяц.

38. Способ по любому из пп. 10-31, отличающийся тем, что периодичность введения составляет один раз в два месяца.

39. Способ прямой доставки в ЦНС для лечения лизосомных болезней накопления, включающий стадию введения субъекту, страдающему от или предрасположенного к лизосомной болезни накопления, ассоциированной со снижением уровня или активности лизосомальных ферментов, композиции, содержащей замещающий фермент для замещения лизосомального фермента, причем введение включает интратекальное введение композиции с доставкой замещающего фермента в глубокие ткани мозга по меньшей мере на 5 мм глубже наружной поверхности, причем концентрация замещающего фермента составляет выше примерно 5 мг/мл, и при этом состав содержит до 50 мМ фосфата.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что замещающий фермент доставляют в глубокие ткани мозга по меньшей мере на 10 мм глубже наружной поверхности.

41. Способ по п. 39, отличающийся тем, что замещающий фермент специфично доставляется в лизосомы глубоких тканей мозга.

42. Способ по любому из пп. 39, 40 и 41, отличающийся тем, что глубокие ткани мозга выбраны из глубокого белого вещества головного мозга, глубокого серого вещества спинного мозга, мозолистого тела, перивентрикулярной ткани, таламуса, фимбрий, тканей глубже коры головного мозга, тканей глубже 4 мм от поверхности головного мозга, тканей глубже 6 мм от поверхности головного мозга, тканей глубже 10 мм от поверхности головного мозга, слоя клеток Пуркинье, тканей зернистого слоя, глубокой ткани белого вещества мозжечка, ткани глубоких ядер мозжечка и их комбинации.

43. Способ прямой доставки в ЦНС для лечения лизосомных болезней накопления, включающий стадию:

интратекального введения субъекту, страдающему от или предрасположенного к лизосомной болезни накопления, ассоциированной со снижением уровня или активности лизосомального фермента, композиции, содержащей замещающий фермент для замещения лизосомального фермента, который вырабатывается клетками человека, причем концентрация замещающего фермента составляет более примерно 5 мг/мл, и при этом состав содержит до 50 мМ фосфата.

44. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что лизосомная болезнь накопления выбрана из группы, включающей аспартилглюкозаминурию, болезнь накопления эфиров холестерина, болезнь Вольмана, цистиноз, болезнь Данона, болезнь Фабри, липогрануломатоз, болезнь Фарбера, фукозидоз, галактосиалидоз I/II типа, болезнь Гоше I/II /III типов, лейкодистрофию глобоидных клеток, болезнь Краббе, болезнь накопления гликогена II типа, болезнь Помпе, GM1-ганглиозидоз I/II/III типов, GМ2-ганглиозидоз I типа, болезнь Тея-Сакса, GМ2-ганглиозидоз II типа, болезнь Сандхофа, GМ2-ганглиозидоз, α-маннозидоз I/II типов, β-маннозидоз, метахроматическую лейкодистрофию, муколипидоз I типа, сиалидоз I/II типов, муколипидоз II/III типов, I-клеточную анемию, муколипидоз IIIС типа, полидистрофию псевдо-Хурлера, мукополисахаридоз I типа, мукополисахаридоз II типа, синдром Хантера, мукополисахаридоз IIIA типа, синдром Санфилиппо А типа, В типа или С типа (мукополисахаридоз IIIВ типа, мукополисахаридоз IIIС типа, мукополисахаридоз IIID типа), мукополисахаридоз IVA типа, синдром Моркио, мукополисахаридоз IVB типа, мукополисахаридоз VI типа, мукополисахаридоз VII типа, синдром Слая, мукополисахаридоз IX типа, множественный дефицит сульфатазы, нейронный цероидный липофусциноз, CLN1 болезнь Баттена, CLN2 болезнь Баттена, болезнь Ниман-Пика А/В типов, болезнь Ниман-Пика С1 типа, болезнь Ниман-Пика С2 типа, пикнодизостоз, болезнь Шиндлера I/II типов, болезнь Гоше и болезнь накопления сиаловых кислот.

45. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что лизосомная болезнь накопления выбрана из группы, включающей синдром Хантера, метахроматическую лейкодистрофию (МЛ), синдром Санфилиппо типа А, синдром Санфилиппо типа В и лейкодистрофию глобоидных клеток (ЛГК).

46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что замещающий фермент выбран из группы, включающей рекомбинантные идунорат-2-сульфатазу (I2S), арилсульфатазу A (ASA), гепаран N-сульфатазу (HNS), альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu) и β-галактозидазу (GLC).

47. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что замещающий фермент содержит остатки манноза-6-фосфата (М6Р).

48. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что замещающий фермент представляет собой гибридный белок, содержащий группу, обеспечивающую направленную доставку в лизосомы.

49. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что замещающий фермент доставляют в нейроны, глиальные клетки, периваскулярные клетки и/или менингеальные клетки.

50. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что замещающий фермент далее доставляют в нейроны спинного мозга.

51. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что интратекальное введение дополнительно обеспечивает системную доставку замещающего фермента в периферические ткани-мишени.

52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что периферические ткани-мишени выбраны из печени, почек, селезенки и/или сердца.

53. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что нейроны включают клетки Пуркинье.

54. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что интратекальное введение приводит к увеличению ферментативной активности замещающего фермента в тканях-мишенях мозга, нейронов спинного мозга и/или периферических тканях-мишенях.

55. Способ по п. 54, отличающийся тем, ферментативная активность увеличивается по меньшей мере в 1 раз, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз или в 10 раз по сравнению с контролем.

56. Способ по п. 54, отличающийся тем, что повышенная ферментативная активность составляет по меньшей мере около 10 нмоль/ч/мг, 20 нмоль/ч/мг, 40 нмоль/ч/мг, 50 нмоль/ч/мг, 60 нмоль/ч/мг, 70 нмоль/ч/мг, 80 нмоль/ч/мг, 90 нмоль/ч/мг, 100 нмоль/ч/мг, 150 нмоль/ч/мг, 200 нмоль/ч/мг, 250 нмоль/ч/мг, 300 нмоль/ч/мг, 350 нмоль/ч/мг, 400 нмоль/ч/мг, 450 нмоль/ч/мг, 500 нмоль/ч/мг, 550 нмоль/ч/мг или 600 нмоль/ч/мг.

57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что ферментативная активность увеличивается в люмбальной области.

58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что повышенная ферментативная активность в люмбальной области составляет по меньшей мере около 500 нмоль/ч/мг, 600 нмоль/ч/мг, 700 нмоль/ч/мг, 800 нмоль/ч/мг, 900 нмоль/ч/мг, 1000 нмоль/ч/мг, 1500 нмоль/ч/мг, 2000 нмоль/ч/мг, 3000 нмоль/ч/мг, 4000 нмоль/ч/мг, 5000 нмоль/ч/мг, 6000 нмоль/ч/мг, 7000 нмоль/ч/мг, 8000 нмоль/ч/мг, 9000 нмоль/ч/мг, или 10000 нмоль/ч/мг.

59. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что лизосомные болезни накопления ассоциированы с периферическими симптомами, и способ дополнительно включает внутривенное введение субъекту замещающего фермента.

60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что внутривенное введение осуществляют не чаще чем один раз в месяц.

61. Способ по любому из пп. 1, 7, 8, 10, 39, 43, отличающийся тем, что лизосомные болезни накопления связаны с периферическими симптомами, и способ не включает введение субъекту внутривенно замещающего фермента.

62. Способ лечения синдрома Хантера, включающий стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантного фермента идуронат-2-сульфатазы (I2S), в концентрации выше примерно 5 мг/мл в составе, содержащем до 50 мМ фосфата, в терапевтически эффективной дозе и с таким интервалом введения, которые обеспечивают снижение интенсивности, тяжести или частоты или замедление проявления по меньшей мере одного симптома или признака синдрома Хантера.

63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что по меньшей мере один симптом или признак синдрома Хантера представляет собой когнитивное нарушение, повреждения белого вещества; расширение периваскулярного пространства в паренхиме головного мозга, ганглиях, мозолистом теле и/или стволе мозга, атрофию и/или вентрикуломегалию.

64. Способ лечения метахроматической лейкодистрофии (МЛ), включающий стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантного фермента арилсульфатазы A (ASA) в концентрации выше примерно 5 мг/мл в составе, содержащем до 50 мМ фосфата, в терапевтически эффективной дозе и с таким интервалом введения, которые обеспечивают снижение интенсивности, тяжести или частоты или замедление проявления по меньшей мере одного симптома или признака МЛ.

65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что по меньшей мере один симптом или признак заболевания МЛ представляет собой повышенное внутричерепное давление, заместительную гидроцефалию, накопление сульфатированных гликолипидов в миелиновых оболочках в центральной и периферической нервной системе и во внутренних органах, прогрессирующую демиелинизацию и потерю аксонов в ЦНС и ПНС и/или двигательную и когнитивную дисфункцию.

66. Способ лечения синдрома Санфилиппо типа А (Санфилиппо А), включающий стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантного фермента гепаран N-сульфатазы (HNS) в концентрации выше примерно 5 мг/мл в составе, содержащем до 50 мМ фосфата, в терапевтически эффективной дозе и с таким интервалом введения, которые обеспечивают снижение интенсивности, тяжести или частоты или замедление проявления по меньшей мере одного симптома или признака Санфилиппо А.

67. Способ лечения синдрома Санфилиппо типа В (Санфилиппо В), включающий стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантного фермента альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (Naglu) в концентрации выше примерно 5 мг/мл в составе, содержащем до 50 мМ фосфата, в терапевтически эффективной дозе и с таким интервалом введения, которые обеспечивают снижение интенсивности, тяжести или частоты или замедление проявления по меньшей мере одного симптома или признака Санфилиппо В.

68. Способ по пп. 66 или 67, отличающийся тем, что по меньшей мере один симптом или признак синдрома Санфилиппо А или Санфилиппо В представляет собой потерю слуха, задержку развития речи, дефицит моторных навыков, гиперактивность, умственную отсталость, агрессивность и/или нарушение сна.

69. Способ по п. 68, отличающийся тем, что рекомбинантный фермент представляет собой гибридный белок Naglu, содержащий Naglu и фрагмент, обеспечивающий направленную доставку в лизосомы.

70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что фрагмент, обеспечивающий направленную доставку в лизосомы, представляет собой IGF-II.

71. Способ лечения лейкодистрофии глобоидных клеток (ЛГК), включающий стадию интратекального введения субъекту, нуждающемуся в лечении, рекомбинантного фермента β-галактозидазы (GLC) в концентрации выше примерно 5 мг/мл в составе, содержащем до 50 мМ фосфата, в терапевтически эффективной дозе и с таким интервалом введения, которые обеспечивают снижение интенсивности, тяжести или частоты или замедление проявления по меньшей мере одного симптома или признака ЛГК.

72. Способ по п. 71, отличающийся тем, что по меньшей мере один симптом или признак заболевания ЛГК представляет собой раздражительность, судороги, умственную деградацию, глухоту, слепоту, миоклонические судороги, повышенный мышечный тонус, отставание в развитии, регрессию навыков, связанных с развитием, повышенную чувствительность, тремор, атаксию, спастичность, эпизодическую сильную рвоту, лейкодистрофию, церебральную атрофию, образование глобоидных клеток и/или демиелинизацию.

73. Способ по любому из пп. 1-3, 7-31, 39-41, 43, 46, 52, 55, 57, 58, 60, 62-67, 69-72, отличающийся тем, что композиция дополнительно содержит полисорбат 20, присутствующий в концентрации от примерно 0,001% до примерно 0,5%.