Способ определения условий кристаллизации белков

Изобретение относится к химической промышленности. Способ кристаллизации белков предусматривает подготовку исходных растворов белка в буфере, фильтрование полученного раствора, центрифугирование и заполнение раствором капилляров. Первую часть полученных после центрифугирования белковых растворов смешивают с буферным раствором в равных объемах, а оставшуюся вторую часть впоследствии используют для смешения с осадителем. Проводят исследование первой части белковых растворов методом малоуглового рентгеновского рассеяния для получения серии кривых рассеяния, анализируют названные кривые и вычисляют размер отдельной белковой субъединицы в каждом из растворов различной концентрации. Готовят маточные растворы осадителя, в качестве которого используют вещества, способные оказать влияние на конформацию молекул, фильтруют маточный раствор осадителя, смешивают вторую часть белковых растворов в равных объемах с маточными растворами осадителя, получая коллекцию кристаллизационных растворов. Проводят исследование каждого из растворов названной коллекции методом малоуглового рентгеновского рассеяния в диапазоне температур от температуры, при которой не происходит денатурации молекулы данного белка, до 0°С с выбранным шагом изменения температуры, получая в результате графики кривых малоуглового рассеяния, математически обрабатывают эти кривые рассеяния, получая распределение количества белковых субъединиц и их олигомеров в растворе в зависимости от их радиуса, отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых было выявлено образование в растворе наибольшего количества олигомеров, что означает нахождение условий кристаллизации. Если в кристаллизационных растворах не выявлены частицы, большие по размерам, чем мономеры, то ступенчато производят понижение температуры исследуемых растворов до 0°С, на каждой из ступеней понижения температуры раствора производят исследование каждого из растворов методом малоуглового рассеяния, математически обрабатывают эти кривые рассеяния, получая распределение количества частиц в растворе в зависимости от их радиуса, отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых было выявлено образование в растворе наибольшего количества олигомеров, операцию ступенчатого понижения температуры завершают при выявлении наибольшего количества олигомеров, что означает нахождение условий кристаллизации. Изобретение позволяет сократить время для образования кристаллов, а также создать прямой способ определения образования единиц роста, обеспечивающего получение надежной и оперативной информации о начальной стадии кристаллизации белка. 8 з.п. ф-лы, 6 ил.

 

Изобретение относится к способам кристаллизации белковых макромолекул и может быть использовано для получения белковых кристаллов с целью определения структуры белковых молекул, имеющих промышленное и медицинское значение.

Кристаллизация белков в настоящее время производится в широких масштабах в связи необходимостью определения структуры белков для дальнейшего их использования в биологии и медицине.

Общим принципом кристаллизации макромолекул из растворов является снижение их растворимости до достижения пересыщения за счет варьирования таких параметров как pH, температура, концентрация осадителей и пр. Процесс кристаллизации представляет собой сложную самостоятельную задачу и до сих пор в большей степени является эмпирической и наименее прогнозируемой стадией структурного исследования. Подбор условий кристаллизации происходит методом проб и ошибок за счет перебора всевозможных условий (различные концентрации белка, осадителя, различные типы буферов и осадителей, температура и др.). При этом для получения самого кристалла (т.е. определения условий кристаллизации) требуется длительное время: от нескольких недель до нескольких лет.

Существенный выигрыш может дать нахождение способа характеризации растворов на стадии, предшествующей образованию зародышей кристаллов, с определением структуры раствора наиболее благоприятной для начала роста кристаллов, например, обнаружение объединения белковых субъединиц (минимальное образование, которое существует в растворе белка, например, молекула белка или комплекс белка с ингибитором) в более сложные формирования (например, олигомеры).

Известен способ измерения растворимости белков, который можно использовать для определения условий образования кристаллитов и контроля динамики роста белковых кристаллов в капиллярах, содержащий операции растворения белка в воде, фильтрования раствора и центрифугирования с последующим определением оптимальных условий для кристаллизации белков путем исследования изменения растворимости белка при изменении температуры. Растворимость белка определялась путем регистрации сцинтиллирования, исходящего от кристаллитов микронного размера (F. Rosenberger, S.B. Howard, J.W. Sowers and T.A. Nyce, Temperature dependence of protein solubility - determination and application to crystallization in X-ray capillaries, Journal of Crystal Growth, 1993, 129, 1-12).

Данный способ основан на том, что предлагается определять оптимальные условия для кристаллизации белков путем исследования изменения растворимости белка при изменении температура. Растворимость белка определяется путем регистрации сцинтиллирования, исходящего от кристаллитов микронного размера при облучении раствора лазером. При образовании кристаллитов в растворе происходит увеличение сигнала на фотодиоде регистрирующего устройства.

Однако для образования кристаллитов требуются часы. При этом данный способ является косвенным и не позволяет определить форму и размер отдельных кристаллитов, кроме того, он чувствителен только к достаточно большим частицам размером в несколько микрон, которые являются зародышами для будущего кристалла.

Данный способ имеет следующие недостатки:

- способ чувствителен к частицам размером в несколько микрон, которые являются зародышами для будущего кристалла;

- длительность процесса - для образования кристаллитов требуются часы (например, для образования кристаллитов лизоцима при 10°C потребовалось 6 ч);

- способ не позволяет охарактеризовать раствор до выпадения кристаллов и таким образом установить являются эти условия неподходящими для кристаллизации или требуется дополнительное время для образования кристаллов.

Задачей изобретения является создание способа, в котором устранены указанные недостатки.

В рамках изобретения предлагается применить прямой способ определения образования субъединиц роста белковых кристаллов. Предлагается использовать метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) для определения образования олигомеров белковых субъединиц на ранних стадиях кристаллизации - первые минуты после добавления осадителя. Такие олигомеры являются строительными элементами кристалла, присутствуют в растворе в процессе роста кристалла. Путем объединения таких олигомеров строится весь кристалл. Применение метода МУРР позволяет определить форму и распределение различных олигомеров в растворе белка, а также сопоставить структуру полученных олигомеров со структурой кристалла. В настоящее время метод МУРР является одним из наиболее эффективных дифракционных методов экспериментального исследования органических наноструктур в растворах. Важнейшей особенностью метода малоуглового рассеяния является возможность анализа внутренней структуры разупорядоченных систем. Зачастую его применение - единственный способ получения структурной информации о системах с хаотическим распределением неоднородностей плотности.

Наличие в полидисперсной системе равномерно распределенных неоднородностей, размеры которых лежат в диапазоне от 1 до 100 нм, приводит к рассеянию рентгеновских лучей под малыми углами (меньше 30°). При исследовании зависимости интенсивности рассеянного излучения от угла рассеяния можно определить такие характеристики наноразмерных элементов, как их форма и размер, фазовый состав, внутренняя структура, ориентация и распределение.

Источниками рентгеновского излучения являются рентгеновские трубки (длина волны излучения λ=0,1-0,2 нм) и синхротронное излучение (λ=0,03-0,35 нм). Монохроматичность узкого пучка первичного излучения достигается с помощью специальных коллимационных систем. Проходя сквозь образец, пучок рассеивается и регистрируется при помощи детекторов. Размер и форму частиц находят на основе зависимости интенсивности рассеянного излучения от угла рассеяния.

С помощью МУРР можно получать информацию не только о размерах и форме частиц, но также и о структуре неупорядоченных или частично упорядоченных систем: белковых молекул, поверхностно-активных веществ, различных дисперсных систем (например, пигментов в краске, клеток крови), эмульсий, волокон, катализаторов, полимеров и нанокомпозитов, жидких кристаллов.

Учитывая изложенное, можно считать, что техническим результатом изобретения является создание прямого способа определения образования единиц роста, обеспечивающего получение надежной и оперативной информации о начальной стадии кристаллизации белка.

Поставленные техническая задача и результат достигаются тем, что в способе определения условий кристаллизации белков, содержащем операции подготовки исходных растворов белка в буфере, фильтрования полученного раствора, центрифугирования и заполнения раствором капилляров, первую часть, полученных после центрифугирования белковых растворов, смешивают с буферным раствором в равных объемах, а оставшуюся вторую часть впоследствии используют для смешения с осадителем. Проводят исследование первой части белковых растворов методом малоуглового рентгеновского рассеяния для получения серии кривых рассеяния, анализируют названные кривые и вычисляют размер отдельной белковой субъединицы в каждом из растворов различной концентрации, готовят маточные растворы осадителя, в качестве которого используют вещества, способные оказать влияние на конформацию молекул, фильтруют маточный раствор осадителя, смешивают вторую часть белковых растворов в равных объемах с маточными растворами осадителя, получая коллекцию кристаллизационных растворов. Проводят исследование каждого из растворов названной коллекции методом малоуглового рентгеновского рассеяния в диапазоне температур от температуры, при которой не происходит денатурации молекулы данного белка, до 0°C с выбранным шагом изменения температуры, получая в результате графики кривых малоуглового рассеяния, математически обрабатывают эти кривые рассеяния, получая распределение количества белковых субъединиц и их олигомеров в растворе в зависимости от их радиуса, отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых было выявлено образование в растворе наибольшего количества олигомеров, что означает нахождение условий кристаллизации. Если в кристаллизационных растворах не выявлены частицы, большие по размерам, чем мономеры, то ступенчато производят понижение температуры исследуемых растворов до 0°C, на каждой из ступеней понижения температуры раствора производят исследование каждого из растворов методом малоуглового рассеяния, математически обрабатывают эти кривые рассеяния, получая распределение количества частиц в растворе в зависимости от их радиуса, отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых было выявлено образование в растворе наибольшего количества олигомеров, операцию ступенчатого понижения температуры завершают при выявлении наибольшего количества олигомеров, что означает нахождение условий кристаллизации. При применении метода малоуглового рентгеновского рассеяния в качестве источника излучения применяют рентгеновскую трубку или используют синхротронное излучение. В качестве маточных растворов осадителя применяют растворимые соли, полиэтиленгликоль, глицерин, которые могут быть осадителями для данного белка, исходя из анализа последовательности аминокислот, а также вещества, которые могут оказать влияние на конформацию молекул, например, спирты с различной концентрацией (0.01-1 М) и показателем pH, соответствующем показателю исходного белкового раствора. Для вычисления размера отдельной белковой субъединицы в растворе используют стандартные программы, например, OLIGOMER, POLYMIX. При исследовании коллекции кристаллизационных растворов методом малоуглового рассеяния обработку информации на основании полученных кривых рассеяния производят с помощью стандартных программ, например, программы OLIGOMER, POLYMIX. Для фильтрования маточных растворов белка и маточных растворов осадителя применяют фильтры с диаметром отверстий 0.15-0.5 мкм. Центрифугирование маточных растворов белка производят с числом оборотов центрифуги 5000-15000 об/мин. При исследовании коллекции кристаллизационных растворов методом малоуглового рассеяния в диапазоне температур от температуры, при которой не происходит денатурации молекулы данного белка, до 0°C шаг изменения температуры выбирается в диапазоне 1-5°C.

На фигурах, поясняющих существо способа, представлены:

Фиг. 1 - блок схема реализации способа;

Фиг. 2 - Экспериментальные кривые интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния, полученные для раствора лизоцима (40 мг/мл) при различных температурах. Кривые 1.2 и 3 смещены по вертикали для лучшей визуализации (1-10°C, 2- 25°C и 3-35°C)

Фиг. 3 - Распределение объемных долей белковых субъединиц и их олигомаров в предположении сферической формы при температуре 20°C для раствора лизоцима (40 мг/мл). Максимум соответствует мономеру белка лизоцима;

Фиг. 4 - Кривые 1, 2 и 3 интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния, полученные для раствора лизоцима (40 мг/мл) с осадителем (25 мг/мл) при различных температурах. Кривые смещены по вертикали для лучшей визуализации (1-10°C, 2-25°C и 2-35°C);

Фиг. 5 - Сравнение формы кривых МУРР от растворов лизоцима (40 мг/мл) без осадителя (пунктирная линия) и с осадителем (25 мг/мл) (сплошная линия) при температуре 10°C;

Фиг. 6 - Распределение объемных долей белковых субъединиц и их олигомеров в предположении сферической формы для растворов лизоцима (40 мг/мл) с осадителем (25 мг/мл) при температуре 10°C. Максимум 1 соответствует мономеру, максимум 2 - октамеру.

Реализация способа осуществляется в следующей последовательности (фиг. 1).

1. Готовят маточные растворы белка в буфере с различной концентрацией (от Cmax - концентрации, соответствующей концентрации насыщенного раствора при комнатной температуре, до Cmax/64) и показателем pH (в диапазоне, в котором не происходит денатурации белка).

2. Растворы белка фильтруют, а затем проводят центрифугирование раствора. Часть полученных белковых растворов смешивают с буферным раствором в равных объемах. Оставшуюся часть впоследствии используют для смешения с осадителем.

3. Проводят исследование таких растворов методом МУРР (на лабораторном рентгеновском источнике или источнике синхротронного излучения).

4. Анализируя кривые МУРР, например в области Гринье, вычисляют размер отдельной белковой субъединицы в растворе для растворов различной концентрации, используя стандартные алгоритмы программ, например, OLIGOMER [Konarev P.V., Petoukhov M.V., Volkov V.V. et al. // J. Appl. Cryst. 2006. V. 39. №2. P. 277; http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/oligomer.html].

5. После определения размеров белковых субъединиц начинают собственно поиск условий кристаллизации. Для этого готовят маточные растворы осадителя из стандартного набора (например, из набора для кристаллизации фирмы Hampton Research https://www.hamptonresearch.com/menus.aspx?id=2&cid=1) и любых других наборов для кристаллизации, растворимые соли, полиэтиленгликоль, глицерин, которые могут быть осадителями для данного белка (исходя из анализа последовательности аминокислот), а также вещества, которые могут оказать влияние на конформацию молекул - например спирты) с различной концентрацией (0.01-1 М) и показателем pH, соответствующем показателю исходного белкового раствора.

6. Растворы осадителя фильтруют через фильтры (диаметр 0,15-0,5 мкм).

7. Белковые растворы, полученные в соответствии с пунктом 2 смешивают с растворами осадителей (из п. 5) в равных объемах. Таким образом, получают коллекцию кристаллизационных растворов.

8. Далее проводят исследование таких растворов методом МУРР (на лабораторном рентгеновском источнике или источнике синхротронного излучения), при этом каждый раствор исследуют в диапазоне температур от температуры, при которой не происходит денатурации молекулы данного белка до 0°C (температура кристаллизации растворителя).

9. На основании анализа графиков кривых рассеяния с помощью стандартных программ рассчитывают распределение белковых субъединиц и их олигомеров в зависимости от их радиуса. В качестве программы возможно использование, например, программы POLYMIX или OLIGOMER. Из полученных кривых МУРР рассчитывают распределение частиц по радиусам с помощью названных стандартных программ [Konarev P.V., Petoukhov M.V., Volkov V.V. et al. // J. Appl. Cryst. 2006. V. 39. №2. P. 277].

10. По результатам анализа по п. 9 отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых выявляется образование в растворе наибольшего количества олигомеров (то есть из монодисперсной системы раствор становится полидисперсным, содержащим частицы, соответствующие нескольким молекулам белка). Таким образом, если в растворах обнаружены частицы большие по размерам, чем мономеры, то можно считать, что условия кристаллизации найдены.

В дальнейшем, кристаллизацию проводят в условиях, при которых в кристаллизационном растворе образовалось максимальное количество олигомеров.

11. Если в кристаллизационных растворах не выявлены частицы большие по размерам, чем мономеры, то ступенчато производят понижение температуры исследуемых растворов (до 0°C.)

12. На каждой из ступеней понижения температуры раствора производят исследование каждого из растворов методом МУРР, повторяя операции 9 и 10, до тех пор, пока не будут найдены условия кристаллизации.

Пример реализации способа.

Для приготовления растворов белка использовался лизоцим из яйца курицы (HEWL) (CAS# 12650-88-3) фирмы Sigma-Aldrich; натрий-ацетатный буферный раствор (CAS# 6131-90-4) фирмы Helicon.

Для приготовления растворов использовали воду, очищенную с помощью системы очистки воды (Milli-Q, Millipore, 18 МОм*см). Белок растворяли в 0.1 М натрий-ацетатном буфере с показателем pH=4.55. Концентрация белка в буфере составляла 80 мг/мл. Удаление агрегатов белков, а также крупных частиц проводили с помощью фильтров Millex 0.22 мкм и центрифугирования 10000 об/мин в течение 10 мин. После этого концентрацию белка (80 мг/мл) контролировали с помощью измерения спектра поглощения на длине волны 280 нм в ячейках 1 см на спектрофотометре Cary 5000 (Varian, Australia).

Часть белкового раствора смешали с буферным раствором в равных объемах так, что конечная концентрация белка в растворе составила 40 мг/мл. Полученный белковый раствор, а также буферный раствор исследовали методом МУРР на синхротронной станции ДИКСИ (НИЦ «Курчатовский институт», г. Москва) [Korneev, V.N.; Shlektarev, V.A.; Zabelin, A.V.; Aul'chenko, V.M.; Tolochko, В.P.; Ariskin, N.I.; Lanina, L.F.; Vazina, A.A. X-ray stations based on cylindrical zoom lenses for nanostructural investigations using synchrotron radiation. J. Surf. Invest.: X-Ray, Synchrotron Neutron Tech. 2012, 6, 849-864] при фиксированной длине волны .

Картины рассеяния регистрировали высокоскоростным двумерным детектором Pilatus3 1 М при расстоянии образец-детектор 300 мм и времени экспозиции 5 мин. Сечение пучка, сформированного по трехщелевой схеме коллимации, было равно 0.4×0.6 мм. Калибровку угловой шкалы измерений проводили путем обработки дифракционной картины от поликристаллического порошка бегената серебра [Huang, Т.С.; Toraya, Н.; Blanton, T.N.; Wu, Y. X-ray powder diffraction analysis of silver behenate, a possible low-angle diffraction standard. J. Appl. Crystallogr. 1993, 26, 180-184]. Для интегрирования двумерных картин рассеяния и первичной обработки использовали программы Fit2D [Hammersley, А.Р. FIT2D: An Introduction and Overview, 1997] и Primus (из пакета ATS AS) [Konarev, P.V.; Volkov, V.V.; Sokolova, A.V.; Koch, M.H.J.; Svergun, D.I. a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 2003, 36, 1277-1282]. Образцы помещали в тонкостенные стеклянные капилляры диаметром 1.5-2 мм и толщиной стенки 0.01 мм.

Для обеспечения стабильности температуры капилляры помещали в латунный держатель с проточным теплоносителем, подключенный к водяному термостату. Температуру контролировали цифровым термодатчиком, расположенным в непосредственной близости от образца.

Перед началом измерений образец выдерживали при заданной температуре в течение 5 минут. Путем сопоставления кривых МУРР от белковых растворов, снятых через 5, 10, 20 минут от достижения заданной температуры было выявлено отсутствие каких-либо эффектов, связанных с радиационными повреждениями образца, поскольку поперечное сечение первичного пучка было достаточно большим, а его интенсивность не превышала 109 фотонов/с. Первичную обработку полученных экспериментальных данных малоуглового рассеяния и расчеты интенсивности МУРР от смесей макромолекул и смоделированных олигомеров проводили с помощью программ AGBEH, SASPLOT, CRYSOL, MIXTURE, OLIGOMER [Konarev Р.К, Petoukhov M.V., Volkov V.V. et al. // J. Appl. Cryst. 2006. V. 39. №2. P. 277] и ряда других с использованием методики, описанной в [ГОСТ P 8.698 - 2010. Государственная система обеспечения единства измерений. Размерные параметры наночастиц и тонких пленок. Методика выполнения измерений с помощью малоуглового рентгеновского дифрактометра. М.: Стандартинформ. 2010. 41 с.]

Метод расчета интенсивности малоуглового рассеяния от многокомпонентной полидисперсной системы. Малоугловое рассеяние от смеси, содержащей различные типы невзаимодействующих компонентов, представляют в виде суммы парциальных интенсивностей рассеяния Ik(s) этими компонентами, взвешенных согласно их объемным долям Vk:

где K - число компонент,

s=4πsin(θ)/λ - модуль вектора рассеяния,

2θ - угол рассеяния,

λ - длина волны.

Под компонентом в данном подходе подразумевалась система частиц одинаковой формы, распределенных по размерам согласно заданному аналитическому выражению, параметры которого необходимо найти. При априори заданной форме частиц и, соответственно, известной нормированной интенсивности рассеяния частицей i(sR) (при s=0, i(0)=1) интенсивность рассеяния от k-го компонента определяется соотношением

где

Nk(R) - функция распределения по размерам,

Δρk(R), νk(R) и ik(s,R) обозначают рассеивающий контраст (разность между средней электронной плотностью частицы и средней плотностью окружения), объем и нормализованную интенсивность рассеяния (квадрат формфактора) частицы радиусом R,

Tk(s) - структурный фактор, учитывающий межчастичную интерференцию в приближении Перкуса-Йовика. Распределения по размерам оказываются более наглядными, если использовать объемные доли частиц, т.е. функции Dk(R)=Nk(R)νk(R).\

В качестве аналитического выражения для Dk(R) в данной работе использовали распределение Шульца-Цимма, определяемое средним размером (радиусом) частиц R0k и полушириной ΔRk:

В качестве формфактора использовали выражения для амплитуд рассеяния от сферических частиц радиуса R. Практика решения модельных задач показала, что применение сферических формфакторов применимо для описания рассеяния и от несферических частиц, в этом случае R имеет смысл радиуса эквивалентной (по объему) сферы, а формы распределений на практике достаточно близки к распределениям несферических неоднородностей в достаточно широком диапазоне отклонений от сферичности. Формулы для формфакторов частиц различной геометрической формы приведены в [Свергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука, 1986. 280 с].

Решение задачи по параметрам Vk, R0k, ΔRk и Tk(s) было получено путем минимизации нелинейного квадратичного функционала с помощью разработанной программы POLYMIX, которая представляет собой модифицированную версию программы расчета распределений наночастиц по размерам MIXTURE, свободно доступную на сайте EMBL с/о Hamburg, DESY [Konarev P.V., Petoukhov M.К, Volkov V.V. et al. // J. Appl. Cryst. 2006. V. 39. №2. P. 277]. Минимизируемый функционал имеет вид:

где

N - число экспериментальных точек,

W(s) - весовая функция, рассчитываемая из сглаженных экспериментальных данных и предназначенная для сужения динамического диапазона интенсивности до пределов, обеспечивающих получение адекватного описания формы кривой рассеяния во всем взятом диапазоне s. В работе использовали p=1/2, определенное путем решения модельных задач как оптимальное для данного случая.

ξ - множитель, совмещающий кривые;

Iexp(s) (экспериментальные данные рассеяния) и Imod(s) (интенсивность рассеяния от модельной смеси) методом наименьших квадратов, рассчитываемый в программе поиска перед вычислением критерия минимизации (формула 4).

Параметрами поиска являются доли аналитических распределений в сумме (формула 2) и их коэффициенты, указанные выше.

На основании проведенных экспериментов получены результаты, подтверждающие эффективность и промышленную применимость настоящего способа. Так кривые, представленные на фиг. 2, иллюстрируют зависимость интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния (I) от модуля вектора рассеяния (s), измеренные от капилляра с раствором лизоцима (40 мг/мл) в буфере без осадителя.

По полученным кривым интенсивности малоуглового рассеяния с помощью программы POLYMIX были рассчитаны распределения объемных долей сферических частиц с подобранной с учетом их размеров моделью рассеяния. На рис. 3 представлено распределение по размерам частиц для чистого раствора белка, максимум распределения соответствует мономеру белка лизоцима. Полуширина определяется отклонением формы молекулы от сферической.

На втором этапе эксперимента работа производилась с растворами белка и осадителя с целью получения коллекции кристаллизационных растворов, оптимальные условия кристаллизации которых необходимо было определить. Для приготовления растворов осадителя использовали раствор хлорида натрия (CAS# 7647-14-5) фирмы Helicon. Хлорид натрия растворяли в 0.1 M натрий-ацетатном буфере с показателем pH=4.55, конечная концентрация составляла 50 мг/мл. Для приготовления растворов использовали воду, очищенную с помощью системы очистки воды (Milli-Q, Millipore, 18 МОм*см).

Удаление крупных частиц проводили с помощью фильтров Millex 0.22 мкм. Часть белкового раствора смешали с раствором осадителя в равных объемах так, что конечная концентрация белка в растворе составила 40 мг/мл, а осадителя 25 мг/мл.

Методом МУРР были исследованы пересыщенный раствор белка (40 мг/мл) в смеси с осадителем (25 мг/мл) и раствор осадителя (25 мг/мл). Рассеяние от последнего вычитали из данных после приведения измерений к нулевому поглощению. Исследования состояния молекул лизоцима в смеси с осадителем проводили при разных температурах в диапазоне 10-30°C.

На фиг. 4 представлены кривые зависимости интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния (I) от модуля вектора рассеяния (s), измеренные от капилляра с раствором лизоцима (40 мг/мл), смешанным с осадителем (25 мг/мл) через 10 мин после смешивания растворов.

Сравнение формы кривых МУРР от растворов лизоцима без осадителя (пунктирная линия) и с осадителем (25 мг/мл) (сплошная линия) при температуре 10°C. показано на фиг. 5. Добавление осадителя привело к уменьшению межчастичной интерференции из-за изменения состояния молекул белка в пересыщенном растворе. Данный эффект объясняется формированием олигомеров.

Затем по полученным кривым интенсивности малоуглового рассеяния с помощью программы POLYMIX были рассчитаны распределения объемных долей сферических частиц с подобранной с учетом их размеров моделью рассеяния. На фиг. 6 представлено распределение по размерам частиц для раствора белка с осадителем через 10 мин после смешивания при температуре 10°C. Из рассмотрения графика видно, что наиболее интенсивный максимум распределения (1) при всех температурах соответствует мономеру. Второй, менее интенсивный пик (2) соответствует частицам, появившимся в растворе в присутствии осадителя при температуре 10°C, со средним диаметром 6.07 нм и объемом 117 нм3, равному объему октамера.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что преимуществом предлагаемого способа определения условий кристаллизации является то, что он позволяет с первых секунд характеризовать условия роста, определять процентное соотношение олигомеров, образующихся в растворе, проводить осознанное изменение условий роста, определять влияние каждого параметра роста на количество образующихся строительных элементов кристалла.

1. Способ определения условий кристаллизации белков, содержащий операции подготовки исходных растворов белка в буфере, фильтрования полученного раствора, центрифугирования и заполнения раствором капилляров, отличающийся тем, что первую часть полученных после центрифугирования белковых растворов смешивают с буферным раствором в равных объемах, а оставшуюся вторую часть впоследствии используют для смешения с осадителем, проводят исследование первой части белковых растворов методом малоуглового рентгеновского рассеяния для получения серии кривых рассеяния, анализируют названные кривые и вычисляют размер отдельной белковой субъединицы в каждом из растворов различной концентрации, готовят маточные растворы осадителя, в качестве которого используют вещества, способные оказать влияние на конформацию молекул, фильтруют маточный раствор осадителя, смешивают вторую часть белковых растворов в равных объемах с маточными растворами осадителя, получая коллекцию кристаллизационных растворов, проводят исследование каждого из растворов названной коллекции методом малоуглового рентгеновского рассеяния в диапазоне температур от температуры, при которой не происходит денатурации молекулы данного белка, до 0°C с выбранным шагом изменения температуры, получая в результате графики кривых малоуглового рассеяния, математически обрабатывают эти кривые рассеяния, получая распределение количества белковых субъединиц и их олигомеров в растворе в зависимости от их радиуса, отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых было выявлено образование в растворе наибольшего количества олигомеров, что означает нахождение условий кристаллизации, если в кристаллизационных растворах не выявлены частицы, большие по размерам, чем мономеры, то ступенчато производят понижение температуры исследуемых растворов до 0°C, на каждой из ступеней понижения температуры раствора производят исследование каждого из растворов методом малоуглового рассеяния, математически обрабатывают эти кривые рассеяния, получая распределение количества частиц в растворе в зависимости от их радиуса, отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых было выявлено образование в растворе наибольшего количества олигомеров, операцию ступенчатого понижения температуры завершают при выявлении наибольшего количества олигомеров, что означает нахождение условий кристаллизации.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при применении метода малоуглового рентгеновского рассеяния в качестве источника излучения применяют рентгеновскую трубку.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при применении метода малоуглового рентгеновского рассеяния используют синхротронное излучение.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве маточных растворов осадителя применяют растворимые соли, полиэтиленгликоль, глицерин, которые могут быть осадителями для данного белка, исходя из анализа последовательности аминокислот, а также вещества, которые могут оказать влияние на конформацию молекул, например спирты с различной концентрацией (0.01-1 М) и показателем рН, соответствующим показателю исходного белкового раствора.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для вычисления размера отдельной белковой субъединицы в растворе используют стандартные программы, например OLIGOMER, POLYMIX.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при исследовании коллекции кристаллизационных растворов методом малоуглового рассеяния обработку информации на основании полученных кривых рассеяния производят с помощью стандартных программ, например программы OLIGOMER, POLYMIX.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для фильтрования маточных растворов белка и маточных растворов осадителя применяют фильтры с диаметром отверстий 0.15-0.5 мкм.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что центрифугирование маточных растворов белка производят с числом оборотов центрифуги 5000-15000 об/мин.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при исследовании коллекции кристаллизационных растворов методом малоуглового рассеяния в диапазоне температур от температуры, при которой не происходит денатурации молекулы данного белка, до 0°C шаг изменения температуры выбирается в диапазоне 1-5°C.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к кристаллическим коллоидным массивам, используемым в качестве материалов, рассеивающих излучение. Описана композитная, отражающая и поглощающая излучение композиция, включающая множество коллоидных кристаллов или агрегатов коллоидных кристаллов, где каждый упомянутый кристалл содержит отражающие излучение частицы в виде коллоидного массива и поглощающие излучение частицы, диспергированные в кристаллах.

Изобретение относится к технологии выращивания водорастворимых оптических монокристаллов группы дигидрофосфата калия (KDP), которые могут быть использованы, например, при изготовлении активных элементов параметрических преобразователей лазерного излучения для квантовой оптики.

Изобретение относится к новой кристаллической модификации (R)-ДОФХ, которая может использоваться в фармацевтической промышленности. Предложена новая кристаллическая форма ДОФХ и способ ее получения, а также ее применение в качестве компонента при получении лекарственных средств.

Изобретение относится к устройствам для кристаллизации белковых макромолекул в наземных условиях и условиях микрогравитации (в космосе). Микрофлюидное устройство содержит емкости с растворами различных белков 7, 9, 11 и осадителей 8, 10, 12, попарно подключенные через отдельные каналы 2, 3, 4, в которых установлены микрозатворы 13, к кристаллизационным камерам, при этом каналы 2, 3, 4 подключены к одному трубчатому элементу 1, внутри которого формируют отдельные кристаллизационные камеры 20-28 для каждого из белков, один конец трубчатого элемента 1 соединен через микрозатвор 16 с микронасосом 15, подающим из резервуара 14 в полость трубчатого элемента 1 рабочую среду 19, служащую для разделения полостей кристаллизационных камер 20-28, а другой конец трубчатого элемента 1 соединен со сборником 17 рабочей среды 19, причем для подачи растворов белков и осадителей через отдельные каналы 2, 3, 4 в кристаллизационные камеры 20-28 применяют отдельные микронасосы 5, 6, функционирующие по индивидуальным программам.

Изобретение относится к технологии взрывчатых веществ (ВВ) и может быть использовано в детонаторах и других взрывных устройствах, использующих процесс перехода горения ВВ во взрыв.

Изобретение относится к технике, связанной с выращиванием кристаллов из пересыщенных водных растворов, и может быть использовано при скоростном выращивании профилированных кристаллов (например, типа KH2PO4, KD2PO4 , Ва(NO3)2 и др.).

Изобретение относится к получению полупроводниковых квантовых точек типов ядро и ядро-оболочка методом коллоидного синтеза, которые могут быть использованы в производстве различных люминесцентных материалов, а также в качестве основы для производства сверхминиатюрных светодиодов, источников белого света, одноэлектронных транзисторов, нелинейно-оптических устройств, фоточувствительных и фотогальванических устройств.

Изобретение относится к технике выращивания кристаллов из растворов солей, в частности для выращивания кристаллов группы KDP (КН2РO4), которые широко применяются для изготовления элементов нелинейной оптики.
Изобретение относится к области химии и может быть использовано для синтеза кристаллического нитрида углерода C 3N4. .

Группа изобретений относится к неочищенному ферментному препарату, способу его получения и применению указанного препарата. Предложен неочищенный ферментный препарат для гидролиза зернового продукта, полученный в процессе ферментации коджи в твердом состоянии.
Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при приготовлении диетических белковых продуктов типа десертов, кремов, суфле или порционных продуктов с белковой сердцевиной.

Изобретение относится к способу и системе для формирования смеси напитка, содержащей белок. Способ включает нагревание напитка в теплообменнике, передачу напитка в контур удерживания, расположенный за пределами теплообменника, денатурирование белка в контуре удерживания в течение периода удерживания после того, как напиток нагрет в теплообменнике, так чтобы происходило денатурирование за пределами теплообменника для предотвращения загрязнения теплообменника, и стерилизацию напитка в дополнительном контуре удерживания.

Изобретение относится к пищевой и косметической промышленности. Одновременно загружают в реактор, оборудованный органом перемешивания, обезвоженный исходный белок, гидроксид щелочного или щелочноземельного металла, катализатор реакции алкоголят того же щелочного или щелочноземельного металла.

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к способу получения стабилизированных гелем частиц пены, используемых для аэрирования пищевых продуктов, и к продуктам, содержащим указанную пену, и к способу получения таких продуктов.

Изобретение относится к приготовлению капсулированных белоксодержащих продуктов. Способ получения белоксодержащих продуктов заключается в приготовлении внутреннего содержимого с белковой составляющей с последующим капсулированием внутреннего содержимого с получением белоксодержащего продукта с оболочкой.

Изобретение относится к волокнистым материалам, и, в особенности, к волокнистым пищевым материалам, способам их получения и применения указанных волокнистых материалов.

Изобретение относится к пищевым продуктам, содержащим специфичную к пролину протеазу, способам их производства и применению специфичной к пролину протеазы при производстве пищевых продуктов.

Группа изобретений относится к способу получения натурального говяжьего корригента и пищевой композиции, содержащей натуральный говяжий корригент. Способ включает: (a) ферментирование источника растительного белка грибами Aspergillus sp. с получением зернового ферментированного бульона; (b) ферментирование части зернового ферментированного бульона со стадии (а) бактериями Corynebacterium sp. или Brevibacterium sp. с получением ферментированного бульона с инозин-5'-монофосфатом (IMP); и (c) смешивание части зернового ферментированного бульона со стадии (а) и ферментированного бульона с IMP со стадии (b) и взаимодействие при 80°С-120°С и 0,8-1,5 бар (0,8-1,5×105 Па) в течение 0,5-24 часов. Натуральные говяжьи корригенты получены с использованием натурального сырья, безвредны и безопасны для применения в организме человека и могут быть добавлены в пищу для получения вкусов говядины и улучшения вкуса и/или запаха пищи. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 4 ил., 15 табл., 3 пр.

Изобретение относится к химической промышленности. Способ кристаллизации белков предусматривает подготовку исходных растворов белка в буфере, фильтрование полученного раствора, центрифугирование и заполнение раствором капилляров. Первую часть полученных после центрифугирования белковых растворов смешивают с буферным раствором в равных объемах, а оставшуюся вторую часть впоследствии используют для смешения с осадителем. Проводят исследование первой части белковых растворов методом малоуглового рентгеновского рассеяния для получения серии кривых рассеяния, анализируют названные кривые и вычисляют размер отдельной белковой субъединицы в каждом из растворов различной концентрации. Готовят маточные растворы осадителя, в качестве которого используют вещества, способные оказать влияние на конформацию молекул, фильтруют маточный раствор осадителя, смешивают вторую часть белковых растворов в равных объемах с маточными растворами осадителя, получая коллекцию кристаллизационных растворов. Проводят исследование каждого из растворов названной коллекции методом малоуглового рентгеновского рассеяния в диапазоне температур от температуры, при которой не происходит денатурации молекулы данного белка, до 0°С с выбранным шагом изменения температуры, получая в результате графики кривых малоуглового рассеяния, математически обрабатывают эти кривые рассеяния, получая распределение количества белковых субъединиц и их олигомеров в растворе в зависимости от их радиуса, отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых было выявлено образование в растворе наибольшего количества олигомеров, что означает нахождение условий кристаллизации. Если в кристаллизационных растворах не выявлены частицы, большие по размерам, чем мономеры, то ступенчато производят понижение температуры исследуемых растворов до 0°С, на каждой из ступеней понижения температуры раствора производят исследование каждого из растворов методом малоуглового рассеяния, математически обрабатывают эти кривые рассеяния, получая распределение количества частиц в растворе в зависимости от их радиуса, отбирают те кристаллизационные растворы, при обработке кривых малоуглового рассеяния от которых было выявлено образование в растворе наибольшего количества олигомеров, операцию ступенчатого понижения температуры завершают при выявлении наибольшего количества олигомеров, что означает нахождение условий кристаллизации. Изобретение позволяет сократить время для образования кристаллов, а также создать прямой способ определения образования единиц роста, обеспечивающего получение надежной и оперативной информации о начальной стадии кристаллизации белка. 8 з.п. ф-лы, 6 ил.

Наверх