Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк



Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк
Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк
Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк
Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк
Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк
Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк
Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк
Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк
Способ генетической паспортизации штаммов bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей днк

 


Владельцы патента RU 2627178:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии" (ФГБНУ ВНИИСХМ) (RU)

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Изобретение обеспечивает способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК. Выделяют бактериальную ДНК, проводят мультилокусную ПЦР для получения референт-комплексов ДНК с использованием праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 1-60 и их комбинаций, проводят пиросеквенирование полученных референт-комплексов ДНК для получения уникальных генетических паспортов штаммов Bacillus thuringiensis, достаточных для разделения штаммов в пределах одного биовара. Изобретение является высокопроизводительным экспресс-методом, позволяющим определять конкретные штаммы бактерии Bacillus thuringiensis в пределах одного биовара. Его применение приводит к удешевлению анализа и сокращению сроков его выполнения. 12 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и обеспечивает способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК, применяемый для генетической паспортизации коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Bacillus thuringiensis представляет собой грамположительную спорообразующую почвенную бактерию, которая во время споруляции синтезирует большие количества кристаллического белкового эндотоксина, который может оказывать инсектицидное действие на некоторые виды насекомых.

Указанный белок в течение длительного времени использовали в качестве микробного пестицида, в связи с чем бактерия Bacillus thuringiensis являлась объектом многих исследований. В результате таких исследований были выделены новые штаммы, обладающие не только инсектицидной, но и противовирусной активностью. Так, например, в патенте RU2405035 описан новый штамм Bacillus thuringiensis (Bt), обладающий противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) и антикандидозной активностью, в частности, относительно Candida albicans 620.

Согласно патенту RU2551236 Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии «Вектор» был обнаружен и депонирован новый штамм Bacillus thuringiensis (Bt), обладающий противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа человека A/H3N2 для получения препаратов, направленных на подавление указанного вируса.

В патенте RU2178798 описан выделенный и очищенный белок, происходящий из Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, имеющий молекулярную массу приблизительно 20 кДа, определенную с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, и чувствительность к протеазам и кислым условиям, проявляющий цитотоксическое действие против опухолевых клеток.

В заявке RU2003109416 предложен инсектицидный препарат на основе бактерий Bacillus thuringiensis, содержащий в качестве действующего начала растворенный дельта-эндотоксин, а в составе целевых добавок растворитель, прилипатель-стабилизатор, наполнитель.

Инсектицидные белки, локализованные в указанных бактериях, разделяют по размерам на три класса: 133-145 кДа, 65-67 кДа и 27 кДа.

Различные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis могут экспрессировать один или более классов размеров.

Белок 133-145 кДа является пиротоксином, который при расщеплении протеазами средней части желудочно-кишечного тракта дает аминоконцевой фрагмент приблизительно 67 кДа, который содержит токсиновую часть молекулы. Токсин 67 кДа имеет значительную структурную гомологию с токсинами из различных других подвидов Bacillus thuringiensis. Однако токсин 27 кДа не обнаруживает гомологии с любым токсином из других классов токсинов, но является высокогомологичным в пределах этого подвида. Так, например, при клонировании гена для токсина 27 кДа из подвидов israeliensis (Bacillus thuringiensis israeliensis), kyushunsis (Bacillus thuringiensis kursataki) и morrisoni (Bacillus thuringiensis morrisoni) было обнаружено, что токсин Bacillus thuringiensis israeliensis отличается одним основанием от токсина Bacillus thuringiensis morrisoni; тогда как он только на 39% идентичен токсину Bacillus thuringiensis kursataki (Waalaijk et al., 1985; Ward and Ellar, 1986; Ward et al., 1986; Galjart et al., 1987; Koni and Ellar, 1993). Было также показано, что токсины из различных подвидов являются цитолитическими в отношении клеток насекомых в культуре.

Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) поддерживает 37 штаммов Bacillus thuringiensis, обладающих выраженной энтомоцидной активностью и используемых для производства препаратов фитозащитного действия (битоксибациллин, бактокулицид, бацикол). Эффективность производимых биопрепаратов зависит от качества микробного материала.

Исследования показывают, что контроль за чистотой и аутентичностью коммерческих штаммов может осуществляться с помощью их молекулярно-генетической паспортизации.

Идентификация штаммов различных бактерий широко применяется в области техники. Так, например, в патенте RU2486251 представлен способ идентификации и дифференциации прокариотического микроорганизма, содержащего hin-регион, предусматривающий выделение и/или концентрирование ДНК, присутствующей в образце, амплификацию межгенного региона, визуализацию и секвенирование амплифицированных продуктов, а также сравнение полученных продуктов амплификации и их нуклеотидных последовательностей с известными, причем в качестве межгенного региона в указанном способе используют нуклеотидную последовательность, расположенную между копиями генов тРНК-Глю, представляющую собой hin-регион, которую амплифицируют с помощью родоспецифичных праймеров и секвенируют, идентификацию и дифференциацию прокариотических микроорганизмов проводят при этом на основании количества, длины и нуклеотидной последовательности продуктов такой реакции, характеризующих hin-регион.

Согласно патенту RU2561469 описан способ определения геновариантов штаммов возбудителя чумы методом мультилокусного секвенирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, амплификацию ДНК мишеней в полимеразной цепной реакции с использованием сконструированных праймеров, секвенирование амплифицированных фрагментов, выявление в них замен единичных нуклеотидов, маркерных для отдельных геновариантов, и определение геновариантов.

Однако указанный способ также не может быть использован для генетической паспортизации коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis.

Согласно патенту СА2086405 предложен способ применения праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения штаммов бактерии Bacillus thuringiensis, а также набор и способ, основанные на применении указных праймеров.

Недостатком указанного способа можно считать невозможность определения конкретного штамма Bacillus thuringiensis, т.е. невозможность использования метода для паспортизации штаммов.

В патенте DE19904795 предложен способ, позволяющий разделить виды Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis от других видов бацилл на основе полиморфизма определенных последовательностей ДНК. Однако указанный способ также не позволяет определить конкретный штамм Bacillus, т.е. его невозможно использовать для паспортизации штаммов.

Патент RU2415948 описывает способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов генов, анализ результатов, отличающийся тем, что при проведении ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры на гены rhaS, araC, metB, aspA и thiH, имеющие следующие последовательности:

в полученной нуклеотидной последовательности фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, в позиции 773 гена araC, в 988 и 989 гена metB, в 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH, определяют генотип штамма, по аллелям генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают сиквенс-тип (ST) штамма Y.pestis с последующей дифференциацией штаммов путем сравнения установленного сиквенс-типа с сиквенс-типами основного и неосновных подвидов.

Однако указанный способ не позволяет разделить штаммы в пределах одного биовара.

В настоящее время наиболее эффективной технологией доскональной генетической характеристики штаммов микроорганизмов считается полногеномное секвенирование. При этом, несмотря на несомненную востребованность полногеномного секвенирования для паспортизации коммерческих штаммов, ее широкое применение ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью. Поэтому для удешевления анализа и сокращения сроков его выполнения необходима разработка экспресс-методов высокопроизводительного секвенирования, позволяющих определять конкретные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В ходе экспериментов было неожиданно обнаружено, что одним из решений поставленной задачи может быть анализ не всего генома, а наиболее таксономически и функционально значимых генетических локусов (так называемого референт-комплекса). Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что указанный результат достигается с помощью стадии мультиплексного пиросеквенирования с использованием праймеров, содержащих определенные последовательности (SEQ ID NO: 1-60), представленные в настоящем изобретении.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК, включающий:

а) выделение бактериальной ДНК;

б) проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК с использованием праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 1-60 и их комбинаций;

в) пиросеквенирование полученных референт-комплексов ДНК для получения уникальных генетических паспортов штаммов Bacillus thuringiensis, достаточных для разделения штаммов в пределах одного биовара.

В частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 53.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Используемые в настоящей заявке термины и определения являются общеупотребительными и понятными для специалиста в данной области техники.

В настоящем изобретении предложен способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК с использованием праймеров, позволяющий каждому штамму Bacillus thuringiensis создать свой генетический паспорт с уникальным набором фрагментов ДНК.

Таким образом, заявляемый способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает:

а) выделение бактериальной ДНК,

б) проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК с использованием праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 1-60 и их комбинаций,

в) пиросеквенирование полученных референт-комплексов ДНК для получения уникальных генетических паспортов штаммов Bacillus thuringiensis, достаточных для разделения штаммов в пределах одного биовара.

При необходимости в дальнейшем проверить, например, для цели защиты прав, проверки качества продукта и т.д., не используется ли в каком-либо препарате исходный штамм Bacillus thuringiensis, из этого препарата выделяют содержащийся в нем штамм и при помощи заявленного способа получают генетический паспорт выделенного штамма, после чего проводят аутентификацию исходного штамма в этом препарате путем сравнения генетических паспортов выделенного штамма и исходного штамма Bacillus thuringiensis. При этом заявленный способ позволяет идентифицировать штамм Bacillus thuringiensis очень точно - в пределах одного биовара.

Описание предпочтительных вариантов реализации изобретения

В одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 53.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.

В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.

Следующие ниже примеры представлены исключительно для целей иллюстрации реализации данного изобретения и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

1. Выделение бактериальной ДНК

Общую ДНК бактерий выделяли по следующей методике: 1,5±0,1 мл ночной культуры клеток центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 буфера ТЕ (10 ммоль Трис-HCl, 5 ммоль ЭДТА, рН-8,0). К суспензии добавляли лизоцим (1 мг/мл) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли SDS до концентрации 0,5% и протеиназу К до концентрации 0,05 мг/мл и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Окончательное разрушение клеток проводили методом встряхивания со стеклянными шариками в гомогенизаторе FastPrep24 при максимальной мощности в течение 1 мин.

Далее проводили экстракцию смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (24:24:1). ДНК осаждали двумя объемами этанола 5±1 мин при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 2 мин при 14000 об/мин, удаляли супернатант, осадок промывали 70±2% этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл дистиллированной воды.

2. Проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК

Для проведения мультилокусной ПЦР использовали следующие праймеры:

Смеси праймеров готовили следующим образом.

Для приготовления смесей праймеров F отбирали по 3,5 мкл 10 0,5 рМ раствора каждого праймера F и перемешивали на вортексе. Аналогично готовили смеси праймеров R.

Комбинации праймеров, используемые для мультилокусного пиросеквенирования:

Для проведения мультилокусной ПЦР использовали следующие параметры.

Состав реакционной смеси:

Режим проведения ПЦР:

Амплифицированную ДНК визуализировали с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле с использованием маркера GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas) для оценки наличия амплификатов нужного размера.

3. Проведение пиросеквенирования образцов ДНК

Нуклеотидную последовательность референт-комплекса определяли на пиросеквенаторе Junior GS (Roche Applied Science, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Работу по сборке ридов и анализу референт-комплексов проводили с помощью программы CLC Genomics Workbench 7.5.1. (http://www.clcbio.com/products/latest-improvements/).

Таким образом, заявляемый способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК позволяет определять конкретные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis в пределах одного биовара. При этом в отличие от способов, использующих полногеномное секвенирование, он является высокопроизводительным и характеризуется значительно меньшей трудозатратностью и себестоимостью, его применение приводит к сокращению сроков анализа и удешевлению его выполнения. Сравнение современных методов паспортизации штаммов, полученное опытным путем, приведено ниже в таблице.

Любые патенты или публикации, упомянутые в этой заявке, являются показательными в отношении уровней квалификации специалистов в данной области, к которым имеет отношение данное изобретение. Эти патенты и публикации включены в настоящую заявку в качестве ссылки в полном объеме.

Специалисту в данной области будет понятно, что представленные примеры вместе со способами, описанными в настоящей заявке, являются в настоящее время типичными предпочтительными вариантами, являются примерами и не предназначены для ограничения объема изобретения. Любые модификации, очевидные для специалиста в данной области техники, являются частью изобретательского замысла согласно настоящей заявке и должны быть также включены в объем настоящего изобретения.

1. Способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК, включающий:

а) выделение бактериальной ДНК,

б) проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК с использованием праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 1-60 и их комбинаций,

в) пиросеквенирование полученных референт-комплексов ДНК для получения уникальных генетических паспортов штаммов Bacillus thuringiensis, достаточных для разделения штаммов в пределах одного биовара.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 53.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные праймеры представляют собой комбинацию праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения биологической активности дефибротида. Приводят в контакт дефибротид, эуглобулин млекопитающего и субстрат, специфичный для плазмина, который в результате реакции с плазмином дает измеряемый продукт.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями, включающий детекцию точковых мутаций в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа и наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, соответственно.

Изобретение относится к области медицины, в частности к эндокринологии, и предназначено для прогнозирования эффективности терапии сахарного диабета 2 типа. Осуществляют забор периферической венозной крови и выделение ДНК.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и предназначено для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способы обнаружения патологии системы органов или органа у субъекта, способ идентификации соединения, пригодного для замедления прогрессирования или лечения патологии системы органов, и способ определения токсичности соединения или фактора окружающей среды для системы органов у субъекта.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, микробиологии и медицины. Описан способ одновременной таргетной амплификации фрагментов геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека, включающих Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Atopobium vaginae, Enterococcus faecalis, Trichomonas vaginalis, Escherichia coli, Mobiluncus mulieris, Streptococcus anginosus, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis, Treponema pallidum, с целью одновременной идентификации возбудителей.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения кардио-генеративного потенциала клеток млекопитающих, включающий сбор измеренных уровней экспрессии в клетках млекопитающих генов Nkx2.5, Tbx5, MEF2C, GATA4, GATA6, Mesp1, FOG1 и определение коэффициента кардиального генеративного потенциала (CARPI) как среднего значения измеренных уровней экспрессии указанных генов указанных клеток.

Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфизмов генов.

Изобретения относятся к способам обнаружения рака поджелудочной железы с применением новых маркеров опухоли. Представленные способы обнаружения рака поджелудочной железы включают измерение наличия или количества полипептида, обладающего реактивностью в форме специфического связывания с антителом против белка CAPRIN-1 через взаимодействие антиген-антитело, или наличия или количества нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид, в образце, взятом от индивидуума, где полипептид, подлежащий измерению, представляет собой белок CAPRIN-1, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, и где наличие или количество нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определяют путем определения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащийся в образце.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантной молекуле ДНК, указывающей на присутствие трансгенного события, где репрезентативный образец семени, содержащий указанное трансгенное событие, депонирован как АТСС РТА-9670.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена тест-система для мультиплексного количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 на основе обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени, включающая специфические праймеры и соответствующие им флуоресцентные гидролизуемые зонды, а также отрицательный и положительные контрольные образцы. Изобретение позволяет проводить детекцию, идентификацию и количественные оценки уровней транскрипции РНК указанных генов с высокой чувствительностью, специфичностью и возможностью мультиплексного анализа, позволяет снизить стоимость анализа за счет уменьшения трудозатрат, расхода реактивов и пластика и ускорить процедуру, а также может успешно применяться при контроле лечения и прогнозирования течения инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека. 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для диагностики наличия мутации L576P гена c-KIT в тканях меланомы. Оценку наличия мутации проводят по соотношениям значений пороговых циклов Ct в трех реакциях ПЦР в реальном времени с аллель-специфичными праймерами. По результатам трех дублей реакции рассчитывают долю мутантной ДНК в образце. Изобретение обеспечивает оптимизацию аллель-специфичной ПЦР в реальном времени для диагностики мутации рецептора тирозинкиназы c-KIT L576P в тканях меланомы. 6 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы. Сущность способа заключается в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови обследуемого с последующим определением генотипа полиморфизма А1166С гена AGTR1 (rs 5186). Прогноз повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы осуществляется с помощью геномного типирования полиморфизма A1166С гена AGTRl (rs 5186). При наличии носительства аллеля С и генотипа АС полиморфизма А1166С гена AGTR1 (rs 5186) прогнозируют повышенный риск развития аСАК. Использование способа повышает точность прогнозирования риска развития аневризмы сосудов головного мозга и ее разрыва, приводящего к субарахноидальному кровоизлиянию у лиц азиатской расы. 7 табл., 3 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, включающий выделение внеклеточной ДНК (вкДНК) из образца крови, полученной у беременной женщины, выбор регионов генома для проведения амплификации, приготовление геномных библиотек, картирование полученных последовательностей на референсный геном или части генома человека с определением их координат, определение значения покрытия для каждого региона генома, характеризующегося открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%, и получение регионов генома с указанной открытостью хроматина, после чего делается вывод о наличии анеуплоидий плода. Предложен способ получения регионов генома для осуществления вышеуказанной неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода. Предложенная группа изобретений обеспечивает простой и экономичный способ пренатальной диагностики анеуплоидий плода на ранних этапах беременности. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 5 пр.
Наверх