Способ изготовления комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллёзом животных

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. Для этого проводят экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении. Обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом с последующим диализом и выделяют О-полисахарид центрифугированием. Использование данного способа позволяет получить комплексный антиген, содержащий О-полисахаридный М- и А-антигены, при этом включение в комплекс М-компонента значительно повышает чувствительность реакции иммунодиффузии при диагностике бруцеллеза, вызываемого B. Melitensis. 1 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и иммунологии, в частности к способу выделения О-цепи полисахаридов бруцелл из штаммов Br.abortus 19 и Br.melitensis 16М, используется в иммунологии, диагностике в т.ч. дифференциальной диагностике вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Известен способ получения частично очищенных О-ПС (K. Nielsen, J. Cherwonogrodzky et al., 1989), включающий автоклавирование бактериальных клеток в 2%-ной уксусной кислоте с 10%-ным раствором хлористого натрия в течение 1 часа при 120°С. Осадок растворяли в 1%-ном растворе уксуснокислого натрия и подвергали ферментативному перевариванию дезоксирибонуклеазой, рибонуклеазой и протеиназой.

После ферментативного переваривания проводили ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 18 часов. Затем супернатантный раствор подвергали фенольно-водной экстракции при 22°С, и фенольный слой отбирали и диализировали против 1%-ного раствора ацетата натрия. Окончательную очистку осуществляли на колонке с гелем Сефадекса.

К недостаткам способа можно отнести его трудоемкость, сложность и длительность.

Известен способ получения противобруцеллезного антигенного иммуноферментного конъюгата (ИФК) для дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных, характеризующийся тем, что вирулентный штамм бруцелл вида В. abortus 54 инактивируют гамма-лучами 60Со в дозе 3,0-3,5×104 Гр, лизируют в растворе, приготовленном на 0,062-0,125 М трис HCL-буфере, рН 6,8, содержащем 2-5% додецилсульфата натрия и 5% меркаптоэтанола, наносят пробы в лунки концентрирующего геля в количестве 50-100 мкг по белку, проводят электрофорез при силе тока 40 мА на две пластины геля до вхождения красителя в гель и затем при силе тока 80 мА на две пластины 3-3,5 ч, фиксируют пластины в растворе, содержащем 40% изопропилового спирта и 10% уксусной кислоты в течение 1 ч, окрашивают в 0,1%-ном растворе "кумасси" бриллиантовым голубым R-250, затем фракции полипептидов окрашивают серебром с использованием раствора формальдегида, денситометрируют пластины геля на сканере SHARP-330Y х в проходящем свете, определяют молекулярную массу и иммунологическую компетентность фракций методом иммуноблотинга, полипептидную антигенную фракцию вирулентного штамма бруцелл В. abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа конъюгируют с ферментной меткой - пероксидазой хрена из расчета 1 мг белка на 20 мг пероксидазы при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 20 мин (RU 2300107, кл. G01N 33/535, A61K 39/10 от 11.01.2005).

К недостаткам способа можно отнести его трудоемкость, сложность и длительность.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является известный способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающий экстракцию липополисахарида из бруцелл вида abortus обработкой 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10%-ного раствора NaCl при автоклавировании, отделение экстракта центрифугированием, фракционирование супернатанта спиртом, выделение О-полисахарида из полученного осадка с последующей его очисткой, при этом выделение О-полисахарида осуществляют трихлоруксусной кислотой на холоду в течение 15 мин, а очистку проводят гель-фильтрацией в агарозе (RU 2035188, кл. А61K 39/10, от 21.02.1992).

Недостатком данного способа является его трудоемкость, сложность и длительность. Необходимость использования трудоемкого процесса гельфильтрации в 1,6%-ной агарозе и дополнительное осаждение белков трихлоруксусной кислотой значительно понижали выход конечного продукта (О-ПС антигена). Кроме того, очистка антигена с помощью гельфильтрации требует громоздкого и дорогостоящего оборудования и реактивов, что существенно повышает стоимость конечного продукта.

Техническая задача - получить высокоочищенный антиген на основе О-цепи полисахарида бруцелл, пригодный для дифференциации вакцинированных и больных животных с такой очисткой от примесей, которая обеспечивает получение высокоочищенного антигена на простом и более дешевом оборудовании и с помощью недорогих реактивов.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающем экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении и обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом и выделяют О-полисахарида центрифугированием.

Антиген, полученный предлагаемым способом, имеет высокий выход (500 мг из 100 г сырой клеточной массы бруцелл) при малом количестве примесей (порядка 2%).

Пример: 100 г сырой клеточной смешанной массы бруцелл из штамма 19 (Brucella abortus, 19) и из штамма 16М (Brucella melitensis, 16М), смешанных в соотношении 1:1 ресуспендировали в 250 мл 2%-ной уксусной кислоты, содержащей 10% NaCl и автоклавировали 30 минут при 120°С. Суспензию охлаждали и центрифугировали 30 минут при 3000 об/мин при 4°С. Осадок отбрасывали, супернатант нейтрализовали 0,5М NaOH, охлаждали до 0°С и добавляли 1,3 л охлажденного этанола, оставляли на ночь для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут при 4°С и растворяли в 15 мл 5%-ного раствора NaCl. Растворенный осадок диализировали в 100-кратном объеме 5%-ного раствора NaCl с двукратной сменой раствора в течение 2 суток. Получили около 500 мг свободной О-цепи полисахаридов бруцелл. Препарат содержал 98% О-цепи полисахарида и около 2% примеси, представленных остатками нуклеиновых кислот. Количество белков и нуклеиновых кислот определяли по Лоури и спектрофотометрически.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенный антиген для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных простым и экономичным способом, за более короткий срок и без применения дорогостоящих реактивов и оборудования.

Способ получения комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающий экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении и обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом с последующим диализом и выделяют О-полисахарид центрифугированием.



 

Похожие патенты:

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих.
Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано при получении эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и санитарной эпидемиологии. Предложен способ получения имитаторов патогенных биологических агентов путем обработки суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания СВЧ-облучением с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см3 двукратно по 5 минут.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии изготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения эритроцитарного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов. При осуществлении предлагаемого способа получения сыворотки для диагностики алеутской болезни норок (АБН) получают высокоочищенный вирусный антиген путем гомогенизации органов инфицированных АБН норок с последующим трехкратным замораживанием/размораживанием гомогената, дезинтеграции клеточного гомогената трехкратной ультразвуковой обработкой, осаждением неразрушенных клеток двукратным низкоскоростным центрифугированием, последующим осаждением иммунных комплексов, уплотнением осадка низкоскоростным центрифугированием, экстрагированием иммунных комплексов (ИК) минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратной экстракции на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, осаждением ИК высокоскоростным центрифугированием из объединенных экстрактов при 30000 об/мин в течение 2,5 часов, извлечением ИК из осадка минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратного экстрагирования на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, диссоциацией иммунных комплексов в кислой среде в течение 1 часа на холоду, отделением вируса АБН-Ф от антител высокоскоростным ультрацентрифугированием, растворением осадка в минимальном количестве карбонатного буфера, отделением ферритина от вирусных частиц на колонке с сефарозой 6B в системе карбонатного буфера.
Изобретение относится к медицине, а именно к малоинвазивным методам в хирургической эндокринологии, и касается дифференциальной диагностики образований шеи. Способ включает ультразвук-контролируемую тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию, которую выполняют однократно одной иглой через один прокол.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе.
Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. Для этого проводят экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении. Обрабатывают 2-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10 NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом с последующим диализом и выделяют О-полисахарид центрифугированием. Использование данного способа позволяет получить комплексный антиген, содержащий О-полисахаридный М- и А-антигены, при этом включение в комплекс М-компонента значительно повышает чувствительность реакции иммунодиффузии при диагностике бруцеллеза, вызываемого B. Melitensis. 1 пр.

Наверх