Применение селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой

Изобретение относится к медицине и касается способа получения селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа (Dsg3) из крови больных пузырчаткой, при котором приготавливают раствор Dsg3 в фосфатном буфере. В пустую центрифужную микроколонку добавляют сухую NHS-активированную агарозу, вносят раствор Dsg3 в микроколонку с агарозой и, перемешивая, инкубируют; по окончании инкубации микроколонку центрифугируют с охлаждением, затем получившийся фильтрат отбирают, после чего для отмывки от несвязавшегося Dsg3 в колонку добавляют фосфатный буфер, центрифугируют; повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают; далее для блокирования остаточных активных NHS-групп сорбента добавляют раствор буфера - этаноламина и, перемешивая, инкубируют; по окончании инкубации центрифугируют, фильтрат удаляют; повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают; готовый сорбент используют для выделения аутоантител к Dsg3. Изобретение обеспечивает получение селективного иммуносорбента для избирательного удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к иммунохимии, а именно к способам получения материалов с нерастворимым носителем для иммобилизации иммунологических материалов, в том числе сорбирующих колонок.

Непосредственной целью изобретения является способ получения селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой. Селективный сорбент относится к материалам для биологического связывания антител в десмоглеину 3 типа с помощью сорбирующих колонок.

Полученный иммуносорбент может быть использован при проведении экстракорпоральной терапии при кожных заболеваниях, в частности для лечения аутоиммунных буллезных дерматозов, а именно пузырчатки.

Уровень техники

Пузырчатка (пемфигус) - тяжелое аутоиммунное буллезное заболевание, характеризующееся образованием пузырей и эрозий на коже и/или слизистых оболочках [Дерматовенерология, 2010. (Клинические рекомендации / Российское общество дерматовенерологов) / [под ред. А.А. Кубановой]. - М.: ДЭКС-Пресс, 2010. - 428 с.; Grando S.A. Pemphigus autoimmunity: hypotheses and realities// Autoimmunity. - 2012. - Vol. 45. - №1. - P. 7-35].

Патогенетическую роль в формировании пузырей при пузырчатке играют циркулирующие аутоантитела, обладающие высокой тканевой специфичностью, преимущественно относящиеся к классу иммуноглобулинов G (IgG), и вызывающие разрушение десмосом, что приводит к акантолизу [Матушевская Е.В., Кубанова А.А., Самсонов В.А. и др. Аутоантитела и аутоантигены при пузырчатке и пемфигоиде // Вестник дерматологии и венерологии. - 1995. - №5. - С.28-33; Joly P., Bernard P., Bedane C. et al. Pemphigus. Guidelines for the diagnosis and treatment. Centres de reference des maladies bulleuses auto-immunes. Societe Francaise de Dermatologie // Ann Dermatol Venereol. - 2011. - Vol. 138. - P. 252-258]. У больных пузырчаткой выявлены все 4 субкласса IgG с преобладанием в стадию обострения IgG4, а в стадию ремиссии - IgG1 [Bhol K., Mohimen A., Ahmed A.R. Correlation of subclasses of IgG with disease activity in pemphigus vulgaris // Dermatology. -1994. - Vol. 189 Suppl 1. - P. 85-89].

Основными структурами, к которым вырабатываются аутоантитела при вульгарной пузырчатке, являются белки десмосомального аппарата - десмоглеины 3 типа (Dsg 3) [Stanley J.R., Yaar М., Hawley-Nelson P. et al. Pemphigus antibodies identify a cell surface glycoprotein synthesized by human and mouse keratinocytes // J. Clin. Invest. - 1982. - Vol. 70. - P. 281-288; Stanley J.R., Koulu L. and Thivolet C. Distinction between epidermal antigensbinding pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies // J. Clin. Invest. - 1984. - Vol. 74 - P. 313-320; Ohyama M., Ota Т., Aoki M. et al. Suppression of the immune response against exogenous desmoglein 3 in desmoglein 3 knockout mice: an implication for gene therapy // J Invest Dermatol. - 2003 Apr. - Vol. 120(4). - P. 610-615]. Десмосомы состоят из белков клеточной адгезии, относящихся к семейству кадгеринов и соединительных (адапторных) белков, которые соединяют их с промежуточными филаментами. Белки клеточной адгезии, формирующие десмосомы, - десмоглеины и десмоколлины. Эти кальцийзависимые гликозилированные протеины состоят из экстрацеллюлярного амино-терминального участка, трансмембранного домена и внутриклеточного карбокситерминального участка. Известны три формы десмоколлина (1-3 типы) и четыре десмоглеина (1-4 типы) [Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Молекулярно-биологическая характеристика десмосом как системы межклеточного соединения // Вестник дерматологии и венерологии. - 2009. - №2. - С. 25-381; Garrod D.R., Merritt A.J., Nie Z. Desmosomal cadherins // Curr. Opin.Cell Biol. - 2002. - Vol. 14. - P. 537-545].

При вульгарной пузырчатке у 80-100% больных в сыворотке крови выявляются аутоантитела именно к Dsg3, т.е. этот белок является строго специфичным для данного заболевания [Свирщевская Е.В., Лысенко А.А., Матушевская Е.В. и др. Аутоиммунная пузырчатка: идентификация патогенных эпитопов десмоглеина 3 // Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и медицинской косметологию. - 2009. - №3. - С. 5-13]. Установлена связь между уровнем IgG к Dsg3 и тяжестью поражения при пузырчатке [Cozzani Е, Di Zenzo G., Riva S. et al. Are clinical phenotype and autoantibody profile always concordant in pemphigus? A study in a cohort of pemphigus patients // Eur J Dermatol. - 2013 Jan-Feb. - Vol. 23(1). - Р. 40-48].

Терапия больных пузырчаткой должна проводиться с момента появления пузырей и/или эрозий даже при ограниченном характере высыпаний [Соколовский Е.В. Пузырные дерматозы. Псориаз. Современные методы лечения. Серия «Библиотека врача-дерматовенеролога». Выпуск 3. - СПб: СОТИС, 1999. - 134 с.].

Известен способ лечения пузырчатки, включающий назначение системных глюкокортикостероидных (ГКС) препаратов [Каламкарян А.А., Трофимова Л.Я., Хапилова В.И. Иммунодепрессанты в комплексной терапии пузырчатки // Вестник дерматологии. - 1979. - №12. - С. 28-32; Самцов В.И., Клибсон С.К., Подвысоцкая И.И. и соавт. Дифференциальная диагностика и лечение больных буллезными дерматозами. Вестник дерматологии и венерологии // 1988. - №5. - С. 46-49]. Наиболее часто применяют преднизолон, другие ГКС (триамцинолон, метипред, гидрокортизон, дексаметазон) назначают в соответствии с преднизолоновым эквивалентом [Самцов А.В., Белоусова И.Э. Буллезные дерматозы: Монография. - СПб.: ООО «Издательско-полиграфическая компания «Коста», 2012. - 144 с.]. Введение в схему лечения пузырчатки системных ГКС препаратов увеличило продолжительность жизни больных пузырчаткой.

Однако длительное применение системных ГКС препаратов сопряжено с трудностями, обусловленными развитием тяжелых осложнений, что отягощает состояние больных и ухудшает прогноз пузырчатки [Ruocco Е., Wolf R., Ruocco V. et al. Pemphigus: Associations and management guidelines: Facts and controversies // Clin Dermatol. - 2013. - Vol. 31(4). - P. 382-390].

Побочные действия ГКС многообразны: синдром Иценко-Кушинга, стероидный диабет, нарушения водного и минерального обмена, остеопороз, осложнения со стороны желудочно-кишечного тракта (эзофагит, гастрит, язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки), тромбоэмболия, острая сердечная или сосудистая недостаточность, гипопротеинемия. Тяжелым осложнением ГКС терапии является иммуносупрессивное состояние, ДВС-синдром, сетицемия [Решетникова Т.Б. Лыкова С.Г., Спицына А.В., Макарова Я.Ю. Влияние гормональной терапии на состояние иммунной системы, частоту и характер осложнений у больных истинной акантолитической пузырчаткой в зависимости от исходного состояния Т-хелперов // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - №4. - С. 13-17; 22. Brenner S., Goldberg I. Drug-induced pemphigus // Clin. Dermatol. - 2011. - Vol. 29. - №4. - P. 455-457; D, Harman M, F, Akpolat V. The frequency of osteoporosis in patients with pemphigus vulgaris on treatment // Indian J Dermatol Venereol Leprol. - 2013. - Vol. 79, №2. - P. 211-215].

Серьезные осложнения ГКС терапии, а также необходимость длительного приема больших доз иммуносупрессивных препаратов требуют совершенствования методов терапии пузырчатки.

Для снижения дозы ГКС, а также при их недостаточной эффективности рекомендуется присоединение к ГКС цитостатиков: азатиоприна, микофенолата мофетила, метотрексата и циклофосфамида (заместительная терапия). Цитостатики обладают стероид-сберегающим действием, уменьшают частоту развития побочных эффектов ГКС и способны увеличить длительность ремиссии [Машкиллейсон А.Л., Антонова Т.Н., Глебова Л.И. и др. Комбинированная терапия пемфигуса кортикостероидами и метотрексатом // Вестник дерматологии. - 1977. - №3. - С. 60-63; Кубанова А.А., Самсонов В.А., Хапилова В.И., Матушевская Е.В. Сандиммун в терапии больных истинной пузырчаткой // Вестник дерматологии. - 1994. - №6. - С. 42-44; Bystryn J.C. Adjuvant therapy of pemphigus // 1984. Jul. - Vol. 120(7). - P. 941-951; Sharma V.K., Khandpur S. Evaluation of cyclophosphamide pulse therapy as an adjuvant to oral corticosteroid in the management of pemphigus vulgaris // Clin Exp Dermatol. - 2013 Aug. - Vol. 38(6). - P. 659-664].

Однако при комбинации ГКС и цитостатиков количество осложнений продолжает оставаться высоким [Schmidt Е., Zillikens D. The Diagnosis and Treatment of Autoimmune Blistering Skin Diseases // Dtsch Arztebl Int. - 2011. June. - Vol. 108(23). - P. 399-405.]. К тому же, данные группы препаратов усугубляют уже имеющееся иммунодефицитное состояние больных, что часто приводит к развитию инфекционных осложнений [Теплюк Н.П., Потекаев Н.Н., Кузьмина Т.С. и др. Летальный исход при кортикостероидной терапии акантолитической пузырчатки в результате инфекционных осложнений // Клин, дерматол. и венерол. - 2005. - №2. - С. 16-19].

В последние десятилетия для лечения пузырчатки используются эфферентные методы терапии: гемосорбция, плазмаферез, энтеросорбция, иммуносорбция. Для иммуносорбции используется 3 вида сорбентов: неселективные, с низкой селективностью и с высокой степенью селективности. Неселективные сорбенты (декстрансульфат, триптофан, фенилаланинсодержащие и другие) способны сорбировать такие компоненты плазмы крови, как фибриноген, альбумин, липиды, иммуноглобулины. Сорбенты с низкой селективностью (с иммобилизованным стафилококковым протеином А, антителами к Ig человека и другими) имеют сродство к определенной фракции протеинов плазмы. Сорбенты с высокой степенью селективности извлекают только определенные протеины без изменения концентрации других компонентов плазмы пациента.

Одним из наиболее эффективных и безопасных методов лечения аутоиммунных заболеваний является экстракорпоральный метод терапии с использованием специфических иммуносорбентов [Keller F., Wagner K., Faber U. et al. Elimination kinetics of plasma exchange // Klin. Wochen schr. - 1983. - Vol. 61, N22. - P. 1115-1122].

Известными на сегодняшний день способами-аналогами изобретения являются документы, представленные ниже.

Известен способ получения углеродного гемосорбента в сорбционных колонках для использования при лечении аутоиммунных заболеваний, в частности, пузырчатки [Грандо С.А., Глухенький Б.Т., Романенко А.Б. и соавт. Механизмы терапевтического действия экстракорпоральной детоксикации при аутоиммунных буллезных дерматозах // Вестник дерматологии и венерологии. - 1988. - №7. - С. 6-11; Eming R., Hertl М. Immunoadsorption in pemphigus // Autoimmunity. - 2006. - Vol. 39(7). - P. 609-616]. Гемоперфузия проводится по вено-венозному контуру через углеродный гемосорбент в сорбционных колонках, предназначенных для очистки и фильтрации крови вне организма со скоростью кровотока 80-120 мл/мин в объеме 1,5 объема циркулирующей плазмы. Положительный эффект иммуносорбции связывают с удалением из крови больных пузырчаткой циркулирующих аутоантител и иммунных комплексов.

Однако при использовании данных сорбентов, вследствие элиминации из сыворотки больных аутоантител и циркулирующих иммунных комплексов и других жизненно важных компонентов крови, без дифференциации к удалению определенных комплексов с IgG, обуславливающей более быстрое наступление клинического эффекта, наблюдался феномен рикошета (экзацербация патологического кожного процесса, сопровождающаяся резким повышением титра иммуноглобулинов в сыворотке крови больных), что является недостатком данного метода [Гребенников В.А., Белявский А.Д., Каминский М.Ю. Изучение иммунокорригирующего и детоксицирующего воздействия гемосорбции, плазмафереза и энтеросорбции при пузырчатке // Вестник дерматологии. - 1990. - №5. - С. 33-38].

Известен способ получения триптофансодержащих сорбентов для применения с целью удаления аутоантител при пузырчатке посредством иммуноадсорбции [ М., Stauber A., Mainka A., Klingel R., Schuler G., Hertl M. Successful removal of pathogenic autoantibodies in pemphigus by immunoadsorption with a tryptophan-linked polyvinylalcohol adsorber // Br J Dermatol. - 2003, Sep. - Vol. 149(3). - P. 598-605]. Триптофановые столбы состояли из поливиниловых шариков, сшитых алкоголь-гелем, которые иммобилизировали гидрофобной аминокислотой и триптофаном в качестве лиганда. В исследованиях in vitro было продемонстрировано, что триптофановые столбы более эффективно удаляют все классы аутоантител при пузырчатке, чем декстрановые, преимущество которых в избирательном удалении аффинных белков. К тому же, триптофановые столбы более дешевые. Недостаток данного метода: триптофановые столбы сорбируют необходимые для жизнедеятельности компоненты плазмы крови (фибриноген, альбумин, липиды, все классы иммуноглобулинов), к тому же, синтез триптофановых столбов является довольно сложным процессом.

Ближайшим аналогом-прототипом в лечении больных пузырчаткой является иммуноадсорбент с использованием стафилококкового протеина А (protein A affinity resin), представляющий собой рекомбинантный белок А Staphylococcus aureus, иммобилизованный на CNBr-активированной сефарозе FF (GEHealthcare). Преимущества данного иммуносорбента по сравнению с триптофановыми колоннами в том, что метод не требует замены компонентов плазмы [Samuelsson G. Extracorporeal immunoadsorption with protein A: technical aspects and clinical results // J Clin Apher. - 2001. - Vol. 16. - Р. 49-52].

Однако при проведении иммуносорбции с использованием данного иммуносорбента снижается количество иммуноглобулинов всех подклассов, уменьшается концентрация антител к ДНК, человеческому лейкоцитарному антигену [Samuelsson G. Extracorporeal immunoadsorption with protein A: technical aspects and clinical results // J Clin Apher. - 2001. - Vol. 16. - Р. 49-52].

Кроме того, после проведения иммуноадсорбции с использованием стафилококкового протеина А у больных пузырчаткой риск развития инфекционных заболеваний остается высоким, так как наряду с патогенетически значимыми аутоантителам IgG при пузырчатке во время процедуры выводятся иммуноглобулины всех подклассов (IgA, IgM, IgE), циркулирующие иммунные комплексы, иммунные комплексы другой специфичности. К тому же, стоимость данного сорбента значительно выше других [Schmidt Е., Klinker Е., Opitz A. et al. Protein A immunoadsorption: a novel and effective adjuvant treatment of severe pemphigus // Br J Dermatol. - 2003. - Vol. 148. - P. 1222-1229].

Заявляемый способ отличается от прототипа тем, что вместо иммунносорбентов, неспецифически связывающих белки и низкомолекулярные продукты, в качестве сорбента использована крупнозернистая агарозная матрица с ковалентно иммобилизованным рекомбинантным десмоглеином 3 типа человека, специфически связывающая антитела к десмоглеину 3 типа, в результате чего выводятся только пемфигусные, патогенетически значимые, аутоатитела к десмоглеинам 3 типа, а антитела другой специфичности, отвечающие за иммунный ответ на вирусные и бактериальные агенты, сохраняются, уменьшая частоту развития инфекционных осложнений. Сорбенты с высокой степенью селективности для удаления антител - IgG, строго специфичных именно к Dsg3, из доступных источников научной и научно-технической информации не известны.

Непосредственной целью изобретения является способ получения селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой. Селективный сорбент относится к материалам для биологического связывания антител в десмоглеину 3 типа с помощью сорбирующих колонок.

Применение данного иммуносорбента у больных пузырчаткой не имеет противопоказаний и должно позволить в короткие сроки получить выраженный и стойкий терапевтический эффект, в том числе при стероидорезистентной форме.

Таким образом, изобретение не известно из уровня техники, т.е. является новым.

Сущность изобретения

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в способе получения селективного иммуносорбента для избирательного удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой.

Применение данного иммуносорбента позволяет селективно связывать аутоантитела к компоненту десмосом - десмоглеину 3 типа, играющих ключевую роль в патогенезе пузырчатки, циркулирующих в сыворотке крови больных пузырчаткой и вырабатываемых строго иммунноспецифично к такому заболеванию.

В связи с этим, применение данного иммуносорбента является высокоэффективным, позволяет более быстро снижать дозы ГКС препаратов, достигать клинической ремиссии в 87% случаев. Полученный терапевтический эффект при применении такого избирательного иммуносорбента является стойким. При его использовании в схеме лечения больных пузырчаткой противопоказаний не выявлено.

Предложенный иммуносорбент позволяет проводить терапию стероидорезистентных форм пузырчатки, лечение во время беременности и грудного вскармливания, так как избирательная очистка крови от антител к десмоглеину 3 типа у больных пузырчаткой обеспечивает высокую эффективность и безопасность проводимой терапии.

Технический результат также достигается за счет того, что авторами впервые установлена избирательная (селективная) степень очистки крови именно от антител к десмоглеину 3 типа у больных пузырчаткой при применении разработанного иммуносорбента при сохранении иммуноглобулинов другой специфичности. Целевой иммуносорбент, получаемый в результате реализации способа, представляет собой агарозу с N-гидроксисукцинимидными группами (NHS-активированную сефарозу), на которой иммобилизирован рекомбинантный человеческий десмоглеин 3 типа (Dsg3).

Указанный технический результат обеспечивается определенной последовательностью действий и условий их выполнения.

Способ получения иммуносорбента реализуется следующим образом:

1.1 Материалы и реактивы:

- рекомбинантный человеческий десмоглеин 3 типа;

- центрифужная микроколонка с NHS-активированной агарозой;

- азид натрия;

- этанол амин;

- тест-системы EUROIMMUN Anti-Desmoglein 3 (IgG) (Canada).

1.2 Используемые растворы:

- буфер для связывания/промывки - 0,1М фосфатный буфер, рН 7,2;

- блокирующий раствор - 1М этаноламин рН 8;

- раствор для хранения - 0,1М фосфатный с 0,05% азида натрия.

1.3 Оборудование

- центрифуга с охлаждением;

- лабораторный шейкер.

1.4 Методика иммобилизации рекомбинантного десмоглеина 3 типа на NHS-активированной агарозе

Для получения селективного иммуносорбента рекомбинантый человеческий десмоглеин 3 типа (Dsg3) путем ковалентного связывания иммобилизируется на твердофазном аффинном носителе - NHS-активированной агарозе следующим образом.

1. Приготовление раствора белка Dsg3 в фосфатном буфере (рН 7,2), который обеспечивает оптимальное для эффективного ковалентного связывания с NHS-активированной агарозой расположение активных групп белка:

- в микропробирку с 33 мкг сухого рекомбинантного белка добавляют 400 мкл охлажденного до 4°С фосфатного буфера;

- микропробирку осторожно встряхивают, не допуская вспенивания, до полного растворения белка.

2. В пустую центрифужную микроколонку помещают 33 мг сухой NHS-активированной агарозы и вносят раствор Dsg3 в фосфатном буфере.

Микроколонку закрывают крышкой и инкубируют 16-18 ч, перемешивая на лабораторном шейкере при 4°С. На данном этапе обеспечивается необходимое для наиболее оптимального взаимодействия соотношение агарозной матрицы и белка-лиганда.

3. По окончании инкубации микроколонку центрифугируют (4°С, 1000 g, 1 мин), снимают верхнюю крышку, убирают надосадок и трижды промывают фосфатным буфером. Этап необходим для освобождения системы от несвязавшегося белка.

4. Для блокирования непрореагировавших групп активированной агарозы добавляют 100 мкл 1М этаноламина. Длительность блокирования - 1 ч при 4°С и перемешивании. Блокирование оставшихся свободными групп NHS-активированной агарозы исключит возможность неспецифического связывания с готовым сорбентом иммуноглобулинов класса G, отличных от антидесмоглеиновых антител.

5. Гель в колонке трижды отмывают буфером связывания/промывки, центрифугируя (1 мин 1000 g 4°С) и заменяя буфер на свежий. На данном этапе обеспечивается удаление этаноламина и заполнение системы рабочим буфером. Теперь колонка с иммуносорбентом готова к работе.

Готовый сорбент используют для выделения аутоантител к Dsg3 или, если эксперимент по выделению аутоантител будет проводиться позже, добавляют консервирующий раствор (0,1М фосфатный буфер содержащий 0,05% азида натрия, рН 7,2) и помещают на хранение при 4°С.

Осуществление изобретения

Практическая применимость способа подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

Пример 1. Сорбция антител к десмоглеину 3 типа из сывороток крови больных пузырчаткой in vitro с использованием селективного иммуносорбента.

Для проведения исследований по определению условий эффективного применения селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа из сывороток крови больных пузырчаткой были получены два препарата IgG: препарат из сыворотки крови больных пузырчаткой и препарат из сыворотки крови здоровых добровольцев. Количественная характеристика активности иммуноглобулинов класса G в отношении десмоглеина 3 типа (Ds3) определена в ест-системе EUROIMMUN Anti-Desmoglein 3 (IgG). В системе установлена единица измерения иммунологической активности антител класса IgG, обозначенная как relative units в миллилитре (RU/мл). Активность препарата IgG, полученного из сыворотки крови больных пузырчаткой, составила 15000 RU/мл. Препарат IgG из сыворотки здоровых добровольцев не обладал активностью в отношении Dsg3. Концентрацию растворов иммуноглобулинов определяли на спектрофотометре при длине волны 280 нм, умножая значение оптической плотности на коэффициент экстинкции 1,4, принятый для IgG. Концентрация IgG в обоих препаратах была 70 мг/мл.

0,5 мл препарата из сыворотки крови больных пузырчаткой, содержащий IgG с суммарной активностью 7500 RU был нанесен на колонку с 0,5 мл селективного иммуносорбента NHS-активированная агароза - Dsg3 для удаления антител к Dsg3. В сравнительной серии экспериментов такое же количество препарата IgG было пропущено через 0,5 мл NHS-активированной агарозы (неселективная матрица). После 30 мин инкубации при комнатной температуре и осаждения сорбента центрифугированием (1 мин, 4°С, 1000 об/мин) в супернатантах определяли концентрацию и активность IgG. Характеристики препарата IgG до и после сорбции на селективном и неселективном сорбентах представлены в таблице 1.

Таким образом, после взаимодействия с 0,5 мл селективного иммуносорбента NHS-активированная агароза - Dsg3 активность препарата IgG из сыворотки крови больных пузырчаткой снизилась на 2300 RU (30%), а после взаимодействия с неселективным сорбентом только на 300 RU (4%).

Представленные результаты доказывают селективность полученного сорбента по сравнению с неселективной матрицей. В условиях эксперимента in vitro количество иммунологически-активных антител в сыворотке уменьшилось на 30%. Применение данного иммуносорбента у больных пузырчаткой позволит снизить тяжесть заболевания и добиться ремиссии.

Пример 2. Эффективность селективного иммуносорбента для удаления антител-IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой in vivo на экспериментальной модели.

Проводились экспериментальные исследования по определению эффективности селективного иммуносорбента для удаления IgG - антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой in vivo с использованием 15 лабораторных животных (новорожденных мышей линии BALB/c).

Мыши были разделены на 3 группы по 5 животных в каждой. Первой группе животных (основная группа) вводили по 30 мг препарата IgG, выделенного из сыворотки крови больных пузырчаткой (не очищенного на иммуносорбенте); Второй (контрольной) группе - по 30 мг препарата IgG, выделенного из сыворотки крови здоровых лиц; Третьей группе вводили по 30 мг препарата IgG, полученного из сыворотки крови больных пузырчаткой и очищенных на селективном иммуносорбенте от антител к Dsg3. Все препараты вводили в объеме 150 мкл в стерильном фосфатно-солевом буфере (рН 7,2) инсулиновым шприцом на 1 мл с иглой 27G (один шприц на животное). Через 48 ч животные подвергались эвтаназии. Производили осмотр кожных покровов и забор биопсийного материала для гистологического изучения и исследования в реакции непрямой иммунофлюоресценции.

После введения IgG от больных пузырчаткой у мышей наблюдались эрозии в абдоминальной области, по 3-бальной шкале оцениваемые как 1+ (т.е. три или менее поражений кожи) (Фиг. 1. Экспериментальная модель; препараты IgG от больных пузырчаткой; эрозии на коже мыши, положительный симптом Никольского).

При патоморфологическом исследовании аутопсийного материала выявлены признаки акантолиза (Фиг. 2А. Гистологическая картина (субкорнеальная полость, содержащая акантолитические клетки), х50. Окр. гем. эоз.); при исследовании фиксированных IgG методом нРИФ определялась фиксация IgG в межклеточных промежутках эпидермиса (Фиг. 2Б. Реакция иммунофлюоресценции; конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, х20; фиксация IgG в межклеточных промежутках эпидермиса).

При введении препарата IgG от здоровых добровольцев не зафиксировано патологических изменений при клиническом осмотре (Фиг. 3. Экспериментальная модель; препарат IgG от здоровых добровольцев), патоморфологическом исследовании и проведении нРИФ препаратов кожи мышей (Фиг. 4А. Гистологическая картина, х50. Окр. гем. эоз., Фиг. 4Б. Реакция иммунофлюоресценции; конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, КЛСМ х20).

При введении препарата IgG, полученного от больных пузырчаткой и очищенных на предложенном иммуносорбенте от антител к десмоглеину 3 типа, не выявлены клинические, патоморфологические и иммунологические признаки пузырчатки у мышей.

Данный пример свидетельствует об эффективности удаления антител из сыворотки крови больных пузырчаткой твердофазным агарозным сорбентом, несущим на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированную агароз, ковалентно связанным с рекомбинантым человеческим десмоглеином 3 типа.

Пример 3. Оценка эффективности удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больного вульгарной пузырчаткой при прохождении через селективный иммуносорбент.

У больного В., 34 лет, с диагнозом «Вульгарная пузырчатка с поражением кожи и слизистых оболочек рта» (диагноз устанавливался на основании данных клинического осмотра, цитологического, гистологического и иммунофлюоресцентного исследований), находящегося на стационарном лечении, определяли содержание антител в крови методом иммуноферментного анализа. Анализ проводили с использованием тест-системы EUROIMMUN Anti-Desmoglein 3. При исследовании у больного пузырчаткой В., 34 г. уровень антител к десмоглеину 3 типа в сыворотке крови составлял 86,8 RU/мл, у здорового добровольца С., 28 лет - 3,9 RU/мл.

Сыворотку крови больного пузырчаткой пропустили через предложенный иммуносорбент, после чего повторно измерили уровень антител в сыворотке крови. Уровень антител к десмоглеину 3 типа после прохождения через иммуносорбент приблизился к диагностическому порогу и составил 22,2 RU/мл, что позволяет предположить положительный эффект данного экстракорпорального метода терапии.

Таким образом, приведенные выше примеры подтвердили практическую применимость селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой, позволяющего избирательно удалять специфические антитела, являющиеся ключевым звеном в иммунопатогенезе пузырчатки. Применение такого вида иммуносорбента у больных пузырчаткой позволит повысить качество проводимой терапии, уменьшить дозы и длительность системных глюкокортикостероидных препаратов, а также снизить частоту развития побочных эффектов вследствие иммуносупрессивной терапии.

Способ получения селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа (Dsg3) из крови больных пузырчаткой, при котором приготавливают раствор Dsg3 в фосфатном буфере, в пустую центрифужную микроколонку добавляют сухую NHS-активированную агарозу, вносят раствор Dsg3 в микроколонку с агарозой и, перемешивая, инкубируют; по окончании инкубации микроколонку центрифугируют с охлаждением, затем получившийся фильтрат отбирают, после чего для отмывки от несвязавшегося Dsg3 в колонку добавляют фосфатный буфер, центрифугируют при 4°С при 1000 g в течение 1 мин; повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают; далее для блокирования остаточных активных NHS-групп сорбента добавляют раствор буфера - этаноламина и, перемешивая, инкубируют; по окончании инкубации центрифугируют при 4°С при 1000 g в течение 1 мин, фильтрат удаляют; повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают; готовый сорбент используют для выделения аутоантител к Dsg3.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимии, а именно к способу получения материала для биологического связывания с помощью сорбирующих колонок. Сущность изобретения заключается в том, что разработан способ получения селективного иммуносорбента для удаления антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой с использованием твердофазного носителя, заключающийся в том, что для его получения рекомбинантый человеческий десмоглеин 3 типа (Dsg3) иммобилизируют путем ковалентного связывания с твердофазным носителем, в качестве которого применяют агарозный сорбент, несущий на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированную агарозу.

Группа изобретений относится к области диагностики, а именно к устройству для выявления аналитов, включающему пластиковую подложку, частично или полностью непосредственно покрытую связывающими полимерами, фиксированными на подложке нековалентно, при этом указанные связывающие полимеры содержат полисахаридный остов, снабженный: ароматическими группами формы -X-CONH-Z, группами карбоновой кислоты формы -Х-СООН и реакционно-способными группами F, имеющими форму -X-CONH-Z′, где X означает неразветвленную или разветвленную, замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, Z означает арильную функцию, Z′ означает группу, которая способна связываться с другой молекулой, а также к способам производства указанного устройства, кроме того, к связывающему полимеру и к способу его получения.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа анализа сахаридных вакцин без взаимовлияния. .
Изобретение относится к иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для (качественного и количественного) определения антигенов, антител и других иммунореактивных соединений, а также в технологии изготовления безинструментальных и надежных диагностикумов для генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного анализа.

Настоящее изобретение относится к акушерству и касается прогнозирования угрозы невынашивания инфекционного генеза на ранних сроках гестации. Сущность способа: в сыворотке крови беременных со сроком 6-11 недель гестации с помощью иммуноферментного анализа определяют уровень интерфероноподобного цитокина IL-28B.
Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах.
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и найдет широкое применение в лечении пациенток с аменореей, обусловленной нервной анорексией. Сущность способа: пациенток на этапе редукции нервной анорексии с продолжающейся аменореей в сыворотке крови методом ИФА определяют уровень дофамина и ЛГ, и если уровень дофамина составляет 67,25 пг/мл и более, но менее 280 пг/мл, а показатели ЛГ 0,95 мМЕ/л и более, прогнозируют нормализацию менструальной функции.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлено антитело, специфически связывающееся с PTK7 (протеинтирозинкиназа 7) человека, а также конъюгат указанного антитела с цитотоксическим агентом.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ).

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования риска развития быстрорастущей миомы матки, заключающийся в том, что исследуют ультразвуковые параметры матки с подсчетом количества миоматозных узлов, методом краевой дегидратации менструальных выделений (МВ) определяют наличие параллельных и волокнистых структур и рассчитывают коэффициент Р: где z рассчитывают по формуле:z=b1×x1+b2×x2+b3×х3+а,где b1 - коэффициент, равный 2,172; x1 - волокнистые структуры в MB: наличие «2»; отсутствие «1»; b2 - коэффициент, равный 2,238; x2 - параллельные структуры в MB: наличие «2»; отсутствие «1»; b3 - коэффициент, равный 1,568; x3 - количество узлов; а - константа, равная –10,915; и при значении Р>0,5 дополнительно методом иммуноферментного анализа исследуют уровни лигандов APRIL и TRAIL, и при значении APRIL более 11,1 нг/мл, TRAIL менее 22,5 пг/мл прогнозируют риск развития быстрорастущей миомы матки.

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к исследованиям таких канцерогенных веществ, как нитрозамины, модифицирующие апоптоз у детей, проживающих в неблагоприятных условиях среды обитания.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и патоморфологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики опухолей аногенитальных маммароподобных желез.

Настоящее изобретение касается способа предварительной оценки, будет ли терапевтическое средство, выбранное из группы полипептид, антитело или иммуноадгезин, иметь необходимую скорость выведения у яванского макака, человека.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено антитело к рецептору эпидермального фактора роста 2 (HER2) человека, а также включающие указанное антитело фармацевтические композиции, предназначенные для профилактики и лечения злокачественной опухоли и для индуцирования апоптоза. Кроме того, предложен набор для диагностики злокачественной опухоли, включающий указанное антитело. Изобретение позволяет уничтожать раковые клетки с существенно увеличенной цитотоксичностью при применении указанного антитела в комбинации с трастузумабом и может быть использовано в терапии рака. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 27 ил., 10 табл., 15 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен рекомбинантный ген, кодирующий белок L1 вируса папилломы человека 16 типа, с кодонами, оптимизированными для гетерологичной экспрессии в штаммах Е. coli. Представлен экспрессионный плазмидный вектор pQE-L1/16, несущий указанный рекомбинантный ген. Представлен способ получения рекомбинантного белка L1HPV16 с использованием указанного вектора, которым трансформируют штаммы Е. coli. Представлены иммуногенная композиция и вакцина для индукции специфического клеточного и гуморального иммунитета против HPV16, содержащие рекомбинантный белок L1HPV16. Группа изобретений позволяет получать устойчивый очищенный иммуногенный белок L1HPV16, а также позволяет снизить стоимость процесса его получения для применения в составе эффективных иммуногенных композиций и вакцин против вируса папилломы человека 16 типа. 6 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 5 пр.

Настоящая группа объектов изобретения относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный мультимерный скаффолд на основе 3 домена FnIII тенасцина (Tn3), который специфически связывается с рецептором 2 TRAIL (TRAIL R2). Кроме того, рассмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мультимерный скаффолд; вектор экспрессии; клетка-хозяин и способ получения рекомбинантного мультимерного скаффолда. Также описаны: фармацевтическая композиция; способ профилактики, лечения или снижения симптомов рака; способ индуцирования апоптоза в клетке и способ изменения активности TRAIL R2-экспрессирующей клетки. Мультимерный скаффолд по настоящему изобретению обладает повышенной аффинностью относительно TRAIL R2, повышенной стабильностью и пониженной иммуногенностью. В этой связи настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии и диагностике заболеваний, связанных с TRAIL R2. 9 н. и 23 з.п. ф-лы, 25 табл., 28 ил., 22 пр.

Группа изобретений относится к способу калибровки составного анализа, включающему: добавление калибровочного реагента, включающего по меньшей мере две различные связывающие молекулы, где каждая молекула обладает способностью специфичного связывания с агентом захвата и способностью связываться с детектирующей молекулой и где по меньшей мере две из связывающих молекул имеют различные специфичности и присутствуют в различных концентрациях, добавление детектирующей молекулы, детектирование связанной детектирующей молекулы, создание калибровочной кривой, включающей ряд калибровочных точек/интервалов. Также группа изобретений относится к набору реагентов и составной аналитической системе. Применение группы изобретений позволяет повысить точность результатов благодаря системной вариабельности систематических анализов в течение времени. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для диагностики периода инфекционного процесса, вызванного вирусом ветряной оспы. Сущность способа: исследуемую сыворотку одновременно вносят в лунки двух стрипов, иммобилизованных антигеном вируса varicella zoster, инкубируют в течение 50-55 минут, затем один стрип обрабатывают однократно водным раствором 6 М мочевины в течение 15 минут, после чего оба стрипа промывают и вносят в них конъюгат специфических моноклональньгх антител к IgG антителам человека, инкубируют в течение 30 минут, после промывания окрашивают водным раствором хромогена 10-15 минут при комнатной температуре, реакцию останавливают раствором 0,5 М серной кислоты, определяют оптическую плотность с помощью спектрофотометра, проводят расчет индекса авидности по формуле: и при уровне ИА менее 45% и до 50% диагностируют острый период, при более 50% ИА и менее 65% - раннюю паст-инфекцию, при ИА 65% и более 70% - поздний период заболевания. Способ является эффективным и информативным для диагностики периода инфекционного заболевания, вызванного вирусом varicella zoster у детей, с помощью которого возможно устанавливать острую инфекцию, активацию хронической персистирующей инфекции, а также высокий протективный иммунитет, что оказывается решающим фактором при установлении этиологии заболевания и выборе адекватной терапевтической тактики. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа диагностирования острого повреждения почек и применения in vitro набора, содержащего праймеры, необходимые для выполнения способа. Способ включает анализ образца, взятого у пациента, и определение уровня экспрессии по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-127, miR-126, miR-210 и miR-101, и сравнение упомянутого уровня экспрессии со значением контроля, где: (а) снижение уровня экспрессии сывороточной miR-127 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (б) повышение уровня экспрессии miR-127 в моче в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (в) снижение уровня экспрессии сывороточной miR-126 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (г) повышение уровня экспрессии сывороточной miR-210 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (д) снижение уровня экспрессии miR-210 в моче в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; или (е) повышение уровня экспрессии сывороточной miR-101 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 20 ил., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки влияния алюминия на иммунный статус. Для этого в пробе крови пациента определяют содержание алюминия, и в тех пробах крови пациентов, где содержание алюминия выше референтного значения, извлекают иммунокомпетентные клетки. Определяют мембранный маркер лимфоцитов CD11a/CD18 и количество внутриклеточного маркера апоптоза - белка bcl2. Затем рассчитывают интегральный коэффициент Ккр., равный отношению содержания CD11a/CD18 к содержанию белка bcl2: Ккр=(CD11a/CD18)/bcl2. При значении указанного интегрального коэффициента более 70 при одновременном содержании алюминия в крови пациента выше его референтного значения оценивают состояние иммунного статуса пациента от воздействия алюминия как соответствующее патологическому повышению иммунологической реактивности. Использование данного способа позволяет достоверно установить влияние алюминия на возникновение иммунодефицита за счет использования в качестве информативного критерия совокупности уровня контаминации алюминием и соотношения клеточного рецептора и белка, характеризующих инициируемый алюминием процесс клеточной гибели как маркер эффекта иммунотоксического действия. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа из крови больных пузырчаткой, при котором приготавливают раствор Dsg3 в фосфатном буфере. В пустую центрифужную микроколонку добавляют сухую NHS-активированную агарозу, вносят раствор Dsg3 в микроколонку с агарозой и, перемешивая, инкубируют; по окончании инкубации микроколонку центрифугируют с охлаждением, затем получившийся фильтрат отбирают, после чего для отмывки от несвязавшегося Dsg3 в колонку добавляют фосфатный буфер, центрифугируют; повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают; далее для блокирования остаточных активных NHS-групп сорбента добавляют раствор буфера - этаноламина и, перемешивая, инкубируют; по окончании инкубации центрифугируют, фильтрат удаляют; повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают; готовый сорбент используют для выделения аутоантител к Dsg3. Изобретение обеспечивает получение селективного иммуносорбента для избирательного удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Наверх