Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций (варианты), штаммы бактериофагов, используемые для получения такой композиции

Группа изобретений относится к вариантам антибактериальной композиции для профилактики или лечения госпитальных инфекций, штаммам бактериофага и молекулам нуклеиновой кислоты, соответствующим геному бактериофага. Предложенная композиция включает 7 штаммов бактериофага, каждый из которых представлен комбинацией фильтратов фаголизатов бактерий с литической активностью не ниже 10-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий, а также целевые добавки в количестве 0,01±99,99 мас.% от массы композиции. При этом используют фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH1, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-105, фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH111, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-95, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-90, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811, депонированного в ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-91, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5, депонированного в ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-88, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА10, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-89, фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-106. Вариант композиции содержит также фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АР22, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-42. Предложены также соответствующие штаммы бактериофагов. Предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующие геному указанных бактериофагов. Группа изобретений позволяет расширить ассортимент средств, содержащих в качестве основного действующего начала высокоселективные природные антибактериальные компоненты (бактериофаги), обеспечить биологическую стабильность и активность бактериофагов в составе композиции средства. Кроме того, композиция обладает низким риском токсических и побочных эффектов, позволяет расширить варианты и способы практического применения средств, содержащих бактериофаги, обеспечивает стабильность при хранении и эффективность применения в широком диапазоне температур. 16 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 24 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве продукции лечебно-профилактического назначения на основе бактериофагов.

Распространение антибиотикоустойчивых бактерий, а также открытие роли биопленок, устойчивых к антибиотикам, в развитии хронических инфекций, возродило интерес к использованию бактериофагов.

В настоящее время антибиотики широко используются как для лечения, так и для профилактики различных заболеваний. Однако частота и тяжесть течения гнойно-септических инфекций не имеют тенденции к снижению. Одной из причин этого является возрастание этиологической роли микроорганизмов, резистентных к большинству антибиотиков. Применение антибиотиков сопровождается нарушением состава нормальной микрофлоры, аллергизацией и быстрой адаптацией микроорганизмов к окружающей среде.

По данным Центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) 1 из каждых 20 госпитализированных больных встречается с госпитальной инфекцией. Это соответствует примерно 1,7 млн больничных инфекций в год и является причиной 99000 смертей в год. Оценки CDC показывают, что прямые затраты на внутрибольничные инфекции с поправкой на инфляцию превышают 30 миллиардов долларов ежегодно.

Около 16% госпитальных инфекций связаны с множественной лекарственной устойчивостью патогенов:

метициллин-резистентных Staphylococcus aureus(8%)

ванкомицин-резистентных Enterococcifaecium (4%)

карбапенем-резистентных P. aeruginosa (2%)

цефалоспорин-резистентных K. pneumonia (1%)

карбапенем-резистентных А. baumannii (0,5%)

Метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (MRSA) вызывает целый ряд заболеваний: от кожных и раневых инфекций до пневмонии и инфекций кровотока, что может привести к сепсису и смерти. Стафилококковые бактерии, в том числе MRSA, являются одной из наиболее распространенных причин инфекционных заболеваний человека. Устойчивость к метициллину и аналогичных антибиотиков (нафциллин, оксациллин) и устойчивость к цефалоспоринам по оценкам CDC в 2011 году привела к возникновению 80461 случая заболевания, вызванного MRSA и 11 285 смертным случаям.

K. pneumonia является важной причиной внутрибольничных инфекций. В 1998 году на K. pneumonia и K. oxytoca приходилось 8% внутрибольничных бактериальных инфекций в США и в Европе, в том числе инфекции мочевыводящих путей, пневмонии, септицемии и инфекции мягких тканей. K. pneumonia считается госпитальным оппортунистическим патогеном, который обычно поражает пациентов с имплантированными медицинскими устройствами. K. pneumonia продуцирует расширенный спектр β-лактамаз и вызванные им инфекции не поддаются лечению цефалоспоринами третьего поколения. Это резко ограничивает терапевтические возможности.

P. aeruginosa часто является причиной инфекции, особенно у больных с нарушенной иммунной защитой, включая пневмонию, инфекции кровотока, инфекции мочевыводящих путей и хирургических инфекций. Это наиболее распространенный возбудитель, выделенный от больных, находящихся на госпитализации более 1 недели. Некоторые штаммы P. aeruginosa устойчивы почти ко всем антибиотикам, включая аминогликозиды, цефалоспорины, фторхинолоны, карбапенемы.

В связи с вышесказанным перспективным направлением в усовершенствовании профилактики и лечения инфекций, в т.ч. гнойно-септических, является использование лечебных бактериофагов, которые могут воздействовать и на устойчивые к антибиотикам штаммы бактерий. Они сами или в комплексе с другими антибактериальными препаратами повышают эффективность этиотропной терапии. Кроме того, препараты бактериофагов не токсичны, не вызывают развития дисбактериозов и других побочных эффектов.

Преимущества бактериофагов перед антибиотиками достаточно очевидны и заключаются в следующем: бактериофаги способны уничтожать бактерии, устойчивые к антибиотикам, т.к. они действуют лишь на определенные бактерии; свободно проникают в ткани организма человека и животного, не нарушая баланса высшего организма; практически не вызывают побочных эффектов; не подавляют рост нормофлоры; не ослабляют иммунитет; не развивают устойчивость бактерий; сочетаются с любыми лекарственными препаратами; оказывают иммуностимулирующее действие.

Многие специалисты включают бактериофаги в комплекс лечебных мероприятий и убеждаются в их высокой эффективности как при местном, так и при пероральном применении. В ряде случаев бактериофаги применяли без антибиотиков. При этом отмечено, что клиническое улучшение происходило в среднем на 3-6 суток быстрее, чем в контрольной группе. Значительно сокращался срок пребывания больных на койке.

Установлено, что, несмотря на способ применения (местное или общее), фаги проникают в кровь и лимфу и попадают в очаг воспаления, оказывая положительное влияние на иммунный статус. Бактериофаги способны быстро проникать в кровь и лимфу и выводиться через почки с мочой. Активность лечебно-профилактических бактериофагов в отношении возбудителей гнойно-септических и энтеральных заболеваний достаточно высока - от 72 до 90%, в т.ч. и в отношении штаммов госпитального происхождения, характеризующихся множественной устойчивостью к антибиотикам. Соответствие препаратов бактериофагов современной этиологической структуре возбудителей достигается за счет их постоянной адаптации к циркулирующим штаммам путем обновления фаговых рас и производственных бактериальных штаммов. Эта особенность выгодно отличает фаги от других антимикробных препаратов - антибиотиков, эубиотиков или вакцин, где производственные штаммы (штаммы-продуценты) или синтезированное вещество не подлежат каким-либо модификациям. Под воздействием фага в первую очередь происходит активация фагоцитоза, повышается активность нейтрофилов и их метаболическая активность, что препятствует рецидивированию инфекции и хронизации воспалительного процесса. Отмечено снижение числа лейкоцитов и нейтрофилов, а уровень лимфоцитов повышается при лечении хронических воспалительных заболеваний на фоне иммунодепрессивных состояний, бактерионосительства.

Современные лечебно-профилактические препараты бактериофагов составлены из поликлональных вирулентных бактериофагов широкого диапазона действия, активных и в отношении бактерий, устойчивых к антибиотикам.

В настоящее время в России для фаготерапии и фагопрофилактики госпитальных инфекций производятся и используются:

- поливалентный сальмонеллезный бактериофаг;

- моновалентные бактериофаги - брюшнотифозный, дизентерийный, протейный, синегнойный, холерный, стафилококковый, стрептококковый, колифаг (кишечной палочки);

- комбинированные препараты поливалентных бактериофагов, среди которых наиболее известны:

- Пиобактериофаг комбинированный (Пиополифаг) способен лизировать стафило-, стрептококки (в т.ч. энтерококки), протея, синегнойную и кишечную палочки.

Предназначен для профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний уха, горла, носа, пазух носа, дыхательных путей, легких; хирургических инфекций (нагноений, абсцесса, флегмоны, остеомиелита, перитонита), урогенитальных инфекций (уретрита, цистита, пиелонефрита); гинекологических инфекций (кольпита, эндометрита, сальпингоофорита); энтеральных инфекций (гастроэнтероколита, холецистита, дисбактериоза); гнойно-септических заболеваний новорожденных.

- Пиобактериофаг поливалентный (Секстафаг) обладает способностью специфически лизировать стафило-, стрептококки (в т.ч. энтерококки), кишечную палочку, протея, синегнойную палочку и клебсиеллупневмония. Предназначен для профилактики и лечения различных форм гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний: гнойно-воспалительных заболеваний уха, горла, носа, дыхательных путей, легких и плевры; хирургических, урогенитальных и энтеральных инфекций; генерализированных септических заболеваний, в т.ч. гнойно-септических заболеваний новорожденных и детей грудного возраста.

- Пиобактериофаг комплексный жидкий представляет собой смесь фаголизатов стафило-, стрепто-, энтерококков, кишечной палочки, протея (мирабилис и вульгарис), синегнойной палочки и клебсиелл (пневмония и окситока). Применяют для лечения и профилактики гнойно-воспалительных и кишечных заболеваний: заболеваний уха, горла, носа, дыхательных путей и легких; хирургических, урогенитальных, энтеральных инфекций; генерализованных и септических заболеваний; гнойно-воспалительных заболеваний новорожденных, для обработки послеоперационных и свежеинфицированных ран.

Недостатком данных комплексных препаратов является тот факт, что бактериофаги, входящие в их состав в качестве активного начала, а также коллекционные штаммы чувствительных микроорганизмов, на которых они культивируются, не имеют полной биологической и молекулярно-генетической характеристики. Коллекция штаммов чувствительных микроорганизмов пополняется и постоянно обновляется циркулирующими возбудителями (Функнер Е.В. Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - Пермь, 2007. - 24 с.). В результате при регламентируемых пассажах и обновлениях штаммов бактериофагов в препаратах могут появиться умеренные бактериофаги, в коллекцию могут быть включены потенциально лизогенные бактерии, что в совокупности влияет на безопасность и эффективность данных препаратов.

Кроме того, ни один из вышеперечисленных препаратов не содержит штаммов бактериофага против внутрибольничных инфекций, вызванных A. baumannii, являющимся наиболее клинически значимым видом рода Acinetobacter, который вызывает 2-10% грамотрицательных инфекций в Европе и США, до 1% всех нозокомиальных инфекций. В патентной литературе описан штамм бактериофага A. baumannii, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером АР22, который используется для идентификации микроорганизмов этого вида и для разработки комплексных лечебных препаратов против внутрибольничных инфекций, но на практике данные препараты не используются (патент РФ №2439151).

В качестве общих факторов риска инфекций, вызванных A. baumannii, выделяют: мужской пол; пожилой возраст; наличие сопутствующих заболеваний (злокачественные заболевания крови, сердечно-сосудистая или дыхательная недостаточность, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови); длительность использования инвазивных методов лечения и мониторинга (ИВЛ более 3 дней; ингаляционное введение лекарственных препаратов; введение назогастрального зонда; трахеостомия; катетеризация мочевого пузыря, центральной вены, артерии, оперативное вмешательство); длительное нахождения в стационаре или отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ); предшествующая антибактериальная терапия с использованием цефалоспоринов, фторхинолонов или карбапенемов.

Предшествующее госпитализации в ОРИТ хирургическое вмешательство повышает риск инфицирования примерно в 5 раз.

A. baumannii в большинстве случаев вызывает заболевания у тяжелобольных иммуноскомпрометированных пациентов. Данный микроорганизм может являться причиной инфекций дыхательных путей (синусит, трахеобронхит, пневмония), кровотока (сепсис, эндокардит естественных и искусственных клапанов), мочевыводящих путей, раневой и хирургической инфекций, инфекций кожи и мягких тканей (включая некротизирующий фасциит), нервной системы (менингит, вентрикулит, абсцесс мозга), интраабдоминальных (абсцессы различной локализации, перитонит), опорно-двигательного аппарата (остеомиелит, артрит).

Главной задачей, решаемой изобретением, является расширение спектра специфической активности композиции лечебно-профилактического назначения на основе бактериофагов за счет включения в ее состав активных ингредиентов вирулентных бактериофагов с неперекрывающимся или частично перекрывающимся спектром литической активности и подбора целевых добавок, обеспечивающих стабилизацию активности бактериофагов, входящих в состав композиции и ее назначение в зависимости от применяемой лекарственной формы (далее по тексту описания, формулы и реферата изобретения - целевые добавки).

Поставленная задача реализуется за счет того, что композиция антибактериальная включает комбинацию фильтратов фаголизатов бактерий с литической активностью не ниже 10-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из клинического материала изолятов бактерий: фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH1, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-105, фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH111, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-95, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-90, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-91, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-88, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА10, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-89, фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-106, и/или фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АР22, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-42. Композиция может включать целевые добавки в количестве 0,01÷99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных в зависимости от применяемой лекарственной формы. Данная композиция в связи с достаточным спектром стабильной литической активности может быть использована для профилактики и лечения госпитальных инфекций и представлена в виде различных лекарственных форм: суспензии, мази, суппозитория, порошка, таблетки, капсулы, геля, спрея и т.д.

Заявлены 2 варианта антибактериальной композиции с использованием в качестве активного начала фильтратов фаголизатов 7 либо 8 бактериофагов.

Отбор 8 штаммов вирулентных бактериофагов осуществляли в процессе работы с 40 штаммами Staphylococcus aureus, 46 штаммами Pseudomonas aeruginosa), 40 штаммами Klebsiella pneumoniae и 80 штаммами Acinetobacter baumannii.

Среды и условия культивирования бактерий

Бактериальные культуры выращивали на плотных и жидких питательных средах: ГРМ-бульон - на основе препарата «питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон)» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск), ГРМ-агар на основе препарата «питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)» (ФГУН ГНЦ ПМБ, Оболенск).

Оценка литической активности бактериофагов.

Спектр литической активности бактериофагов оценивали несколькими способами:

а) Микрометод. Готовили последовательные десятикратные разведения фаголизатов в SM-буфере в 96-луночном планшете. Аликвоты из разведений переносили репликатором на газоны бактериальных штаммов, нанесенных на поверхность питательного агара в полужидкой (0,6%-ной) агарозе. Результаты учитывали после инкубации чашек при 37°С в течение ночи. Штаммы, на которых негативные зоны наблюдались в нескольких разведениях, считали чувствительными. Штаммы, на которых зоны лизиса наблюдались при нанесении нативного препарата фага (не разведенного), относили к условно чувствительным. Штаммы, на которых зоны лизиса отсутствовали, считали резистентными. Таким способом одновременно на одном газоне оценивали литическую активность нескольких бактериофагов.

б) По 10 мкл из последовательных десятикратных разведений фаголизата наносили на газон бактериального штамма в полужидкой (0,6%-ной) агарозе. Результаты учитывали после инкубации чашек при 37°С в течение ночи. Интерпретация результатов аналогична той, которая указана в первом способе. Данный способ позволяет оценить не только спектр литической активности фага, но и подсчитать количество бляшкообразующих единиц в единице объема фаголизата.

Штаммы вирулентных бактериофагов, используемые для получения фильтратов фаголизатов

1. Штамм бактериофага Staphylococcus aureus SCH1 выделен из клинических образцов и перевязочного материала больниц Москвы и Челябинска на культуре бактерий штамма Staphylococcus aureus 2004 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-105.

Штамм бактериофага Staphylococcus aureus SCH1 характеризуется следующими свойствами: на газоне чувствительного штамма фаги образуют мелкие негативные прозрачные колонии диаметром 1-2 мм с ровными краями без ореола.

Нуклеотидная последовательность генома штамма представлена в графической части.

2. Штамм бактериофага Staphylococcus aureus SCH111 выделен из клинических образцов и перевязочного материала больниц Москвы и Челябинска на культуре бактерий штамма Staphylococcus aureus 2004 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-95.

Штамм бактериофага Staphylococcus aureus SCH111 характеризуется следующими свойствами: на газоне чувствительного штамма фаги образуют мелкие негативные прозрачные колонии диаметром 1-2 мм с ровными краями без ореола.

Нуклеотидная последовательность генома штамма представлена в графической части.

Оценку спектра литических свойств фагов определяли на 40 индикаторных клинических штаммах S. aureus методом спот-теста. Наработанные фаголизаты стерилизовали хлороформом и наносили на свежезасеянные газоны S. aureus. О чувствительности штаммов S. aureus к фагам судили по появлению стерильного пятна на выросшем через 16-18 часов газоне индикаторного штамма. Результаты изучения спектра литического действия стафилококковых бактериофагов представлены в табл. 1.

Таблица 1. Спектр литического действия стафилококковых бактериофагов в отношении клинических штаммов S. aureusino (результатам спот-теста).

Как следует из полученных данных, наиболее широким спектром литического действия в отношении индикаторных культур обладает бактериофаг SCH1: он подавляет рост 92,5% стафиликокковых штаммов; в меньшей степени активен бактериофаг бактериофаги SCH111 (72%). Следует отметить, что на чувствительных культурах S. aureus в спот-тесте бактериофаги SCH1 и SCH111 образовывали стерильные пятна лизиса при разведении их в 10000 раз.

Два бактериофага S. aureus устойчивы к действию хлороформа: титр их в фаголизатах, стерилизованных фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, не превышал титр в аналогичных фаголизатах, обработанных хлороформом.

При изучении жизнеспособности стафилококковых фагов выявлена их чувствительность к сравнительно невысоким температурам: нагревание препаратов бактериофагов до температуры выше 56°С полностью инактивирует их за 15 минут. Оптимальная температура для поддержания исходного титра фагов в течение нескольких месяцев составляет от 4 до 10°С.

3. Штамм бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15 выделен из образцов сточных вод Москвы на культуре бактерий штамма Klebsiella pneumoniae В-716 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-90.

Штамм бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15 характеризуется следующими свойствами: образует мелкие непрозрачные негативные колонии диаметром 1-2 мм со слабым ореолом (1-2 мм) или без него.

Нуклеотидная последовательность генома штамма представлена в графической части.

4. Штамм бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811 выделен из образцов сточных вод Москвы на культуре бактерий штамма Klebsiella pneumoniae В-811 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-91.

Штамм бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811 характеризуется следующими свойствами: образует мелкие непрозрачные негативные колонии диаметром 1-2 мм со слабым ореолом (1-2 мм) или без него.

Нуклеотидная последовательность генома штамма представлена в графической части.

Оба фага устойчивы к хлороформу: титры их в фаголизатах, стерилизованных фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, не превышал титр в аналогичных фаголизатах, стерилизованных хлороформом. При нагревании препаратов бактериофагов KPV15 и KPV811 до температуры выше 60°С в течение 30 минут они полностью инактивировались. Оптимальная температура для поддержания исходного титра фагов в течение четырех месяцев (срок наблюдения) составляет от 4 до 10°С.

Литический спектр бактериофагов KPV15 и KPV811 в отношении штаммов K. pneumoniae, выделенных в клинических учреждениях в последние 5 лет, представлены в табл. 2.

Как следует из данных таблицы 2, бактериофаг KPV15 активно размножается и лизирует 14 из 40 клинических индикаторных штаммов K. pneumoniae: чувствительные к нему культуры K. pneumonia лизируются при разведении фаголизата до титра 1×10-7 - 1×10-8. На газоне чувствительных культур фаг KPV15 образует прозрачные бляшки. Кроме того, фаголизат бактериофага KPV15 в нулевом разведении лизирует еще 20 индикаторных штаммов K. pneumoniae, образуя на их газоне мутные пятна. Таким образом, из 40 индикаторных штаммов бактериофаг KPV15 с разной степенью активности лизирует 34 штамма (85%).

Бактериофаг KPV811 активно размножается (бляшкообразование наблюдается при разведении фаголизата до 10-7-10-8) и лизирует 7 из 40 индикаторных культур K. pneumoniae, причем бактериофаг реплицируется на тех штаммах, на которых не реплицируется бактериофаг KPV15, т.е. два бактериофага, KPV15 и KPV811 лизируют с разной степенью активности 92,5% клинических штаммов K. pneumoniae. Следует особо отметить, что в набор индикаторных штаммов входят культуры K. pneumoniae, выделенные в основном в 2012-2014 годах в крупных клинических центрах г. Москвы.

5. Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5 выделен из сточных вод Москвы и Серпухова на культуре бактерий штамма Pseudomonas aeruginosa В-1304 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-88.

Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5 характеризуется следующими свойствами: Бактериофаг РА5 на газоне штамма P. aeruginosa В1304 образует прозрачные негативные колонии диаметром 1-2 мм.

Нуклеотидная последовательность генома штамма представлена в графической части.

6. Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА10 выделен из сточных вод Москвы и Серпухова на культуре бактерий штамма Pseudomonas aeruginosa 176 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-89.

Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА10 характеризуется следующими свойствами: бактериофаг РА10 на хозяйском штамме P. aeruginosa 176 формирует колонии диаметром 4-5 мм с прозрачным центром и ореолом на периферии.

Нуклеотидная последовательность генома штамма представлена в графической части.

Оба бактериофага устойчивы к хлороформу и чувствительны к нагреванию: при температуре 55°С они инактивируются в течение 15 минут. Хорошо сохраняются в лиофильно высушенном состоянии при температуре 4-8°С. Максимальный титр бактериофагов РА5 и РА10 при размножении их на жидких и плотных питательных средах составляет около 1010 фаговых частиц в 1 мл фаголизата.

Спектр литической активности псевдомонадных бактериофагов в отношении клинических штаммов P. aeruginosa представлен в табл. 3.

Таблица 3. Спектр литической активности псевдомонадных фагов в отношении клинических штаммов P. aeruginosa, выделенных в г.г. Серпухове, Челябинске, Вологде и Москве.

Как следует из таблицы, выделенные бактериофаги имеют сравнительно узкий спектр литической активности: для фагов РА5, РА10 он составляет соответственно 27, 29%. Однако смесь этих фагов обусловливает лизис 52% индикаторных штаммов Р. aeruginosa.

7. Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АР22 выделен из образцов клинического материала больниц г. Москвы на культуре бактерий штамма Acinetobacter baumannii 1053 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-42. Штамм защищен патентом РФ №2439151.

Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АР22 характеризуется следующими свойствами: Бактериофаг АР22 на газоне чувствительного штамма Acinetobacter baumannii 1053 формирует круглые прозрачные негативные колонии диаметром около 2-3 мм с ровными краями, окруженные непрозрачным ореолом.

8. Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24 выделен из образцов клинического материала больниц г. Москвы на культуре бактерий штамма Acinetobacter baumannii В-05 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-106.

Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24 характеризуется следующими свойствами: Бактериофаг АМ24 на газоне чувствительного штамма В-05 формирует круглые прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром около 1 мм, окруженные непрозрачным ореолом. Диаметр ореола - от 2 до 6 мм.

Нуклеотидная последовательность генома штамма представлена в графической части.

Оба бактериофага устойчивы к хлороформу и чувствительны к нагреванию: при температуре 55°С они инактивируются в течение 15 минут. Хорошо сохраняются в лиофильно высушенном состоянии при температуре 4-8°С. Максимальный титр бактериофага АР22 при размножении его в жидких и на плотных питательных средах составляет 5×1010 БОЕ/мл, титр бактериофага АМ24 не превышает 7×109 БОЕ/мл. Спектр литической активности ацинетобактерных бактериофагов в отношении 80 клинических штаммов Acinetobacter baumannii представлен в табл. 4.

В основу заявляемого изобретения положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков: впервые предложено использование двух вариантов композиций из семи или восьми штаммов бактериофагов, дополняющих спектр литической активности в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий - возбудителей госпитальных инфекций при впервые подобранной смеси целевых добавок, обеспечивающих стабилизацию активности бактериофагов при использовании их в различных лекарственных формах.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах.

Пример 1. Получение отдельных фаголизатов и их комбинации

Бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 108-109 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования - стеклянный микробиологический матрац на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 105-106 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования, культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30-45 минут при 5000-6000 об/мин, стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. После центрифугирования смешивают надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги (7 или 8), затем стерилизуют смесь надосадочных жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Пример 2. Получена композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций (1 вариант) с литической активностью не ниже 10-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий, включающая фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH1, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-105, фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH111, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-95, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-90, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-91, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-88, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА10, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-89, и фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-106. Композиция включает целевые добавки в количестве 0,01÷99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов.

Проведены исследования стабильности поливалентной активности отдельных штаммов бактериофагов, входящих в состав заявляемой композиции в образцах композиции, хранящихся в течение года, и тестирование всех бактериофагов композиции на лизогению. Литическая активность всех штаммов бактериофагов композиции составляла не ниже 10-4 по Аппельману. Тесты на лизогению были отрицательные. Для испытания биодоступности полученной композиции ее образец массой 0,6 г вносился в среду 199. Отмечалось равномерное диспергирование препарата в водной среде и сохранение в растворе не менее 99% литической активности композиции.

Пример 3. Получена композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций (2 вариант) с литической активностью не ниже 10-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий, включающая фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH1, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-105, фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH111, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-95, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-90, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-91, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-88, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА10, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-89, фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АР22, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-42, и фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii AM24, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-106. Композиция включает целевые добавки в количестве 0,01÷99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов.

Проведены исследования стабильности поливалентной активности отдельных штаммов бактериофагов, входящих в состав заявляемой композиции в образцах композиции, хранящихся в течение года, и тестирование всех бактериофагов композиции на лизогению. Литическая активность всех штаммов бактериофагов композиции составляла не ниже 10-4 по Аппельману. Тесты на лизогению были отрицательные. Для испытания биодоступности полученной композиции ее образец массой 0,6 г вносился в среду 199. Отмечалось равномерное диспергирование препарата в водной среде и сохранение в растворе не менее 99% литической активности композиции.

Пример 4. Изучение токсичности, профилактической и лечебной эффективности заявляемой композиции в опытах на лабораторных животных

Изучение острой токсичности заявленной антибактериальной композиции (АК) выполняли на 10 опытных и 5 контрольных беспородных мышах, самках, живой массой 18-20 г. Мышам опытной группы однократно внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл АК с концентрацией фаговых частиц 1×108 БОЕ. Контрольным животным тем же путем вводили буфер, используемый для приготовления АК. За животными обеих групп вели наблюдение в течение 7 дней. У животных фиксировали внешние признаки интоксикации, активность, аппетит, состояние шерстного покрова, следят за изменением живого веса. Через 7 дней после введения АК у животных опытной и контрольной групп брали периферическую кровь, в которой исследовали общее содержание лейкоцитов.

Критерием безвредности препарата для мышей являются: отсутствие гибели, отсутствие признаков заболевания, отсутствие снижения веса у животных, хороший аппетит и хорошее состояние шерстного покрова. Состояние опытных (обработанных АК) животных не должно отличаться от такового контрольных животных. Количество лейкоцитов в крови опытных мышей не должно значительно отличаться от количества лейкоцитов в крови контрольных животных.

После отбора крови животных обеих групп эвтанизировали, вскрывали и описывали у них макроскопическую картину внутренних органов. У опытных (обработанных АК) животных эта картина не должна отличаться от таковой контрольных.

Изучение хронической токсичности АК проводилось на беспородных (аутбредных) белых мышах, самках (или самцах) живым весом 18-20 г.

В экспериментах использовали две группы мышей: опытную и контрольную, по 10 мышей каждая. Опытная группа животных ежедневно на протяжении 20 дней один раз в сутки получала AKperos в объеме 0,5 мл с концентрацией фагов 1×108 БОЕ, максимально эквивалентной разовой дозе для человека в пересчете на единицу массы тела. Группа контрольных животных вместо АК раз в сутки на протяжении 20 дней получала peros по 0,5 мл буферного раствора, который используют при приготовлении АК. За животными обеих групп наблюдали в течение всего периода получения ими АК (20 дней) и в последующие 7 суток после отмены препарата. Наблюдения проводили, аналогичные описанным выше для групп животных, на которых испытывали острую токсичность АК. На следующие и 7 сутки после окончания введения препарата у животных (самцов и самок) из экспериментальной и контрольной групп брали кровь для проведения гематологического анализа, обращая внимание на общее количество лейкоцитов. После взятия крови животных обеих групп эвтанизировали и брали материал для гистологических исследований (кусочки селезенки, печени, брыжеечных лимфоузлов, легких, сердца, корень языка, головной мозг, тонкий и толстый желудок), на основании которых судили о возможном повреждающем действии АК на организм мышей.

Хроническую токсичность АК оценивали по результатам наблюдений за поведением и здоровьем животных, по результатам гематологических и гистологических исследований (в сравнении с аналогичными исследованиями в контрольной группе животных).

Изучение профилактической эффективности АК при клебсиеллезной инфекции у мышей.

Эксперимент по оценке профилактической эффективности АК проводили на 4 опытных и 2 контрольных группах беспородных белых мышей (самках или самцах) живым весом 18-20 г (по 10 животных в каждой группе). Животным опытных групп вводили препарат АК (внутрибрюшинно, однократно в дозе 1×108 БОЕ в объеме 0,5 мл), соответственно, за 24. 12, 6 и 1 час до заражения клетками штамма K. pheumoniae 9. Животных опытных групп (обработанных ЛПП) и одной контрольной (группа №5, не обработанная бактериофагом) одновременно заражали штаммом K. pneumoniae 9 подкожно в дозе 1×104 БОЕ в объеме 0,5 мл, что соответствует, приблизительно, 600 ЛД50. Шестая контрольная группа (№6) не заражалась: ей однократно в максимальной дозе (1×108 БОЕ) вводили препарат АК (контроль токсичности препарата). За зараженными опытными животными проводили наблюдение в течение 14 дней, фиксируя у них поведение, состояние шерстного покрова, аппетит. Через 14 дней животных эвтаназировали и вскрывали. Из крови, селезенки, легких и печени делали высевы на предмет обсемененности их культурой заражающего штамма K. pneumoniae 9 с подсчетом КОЕ возбудителя в 1 г исследуемого образца. Эффективность профилактического лечения препаратом АК инфицированных животных оценивали по их состоянию в течение всего срока наблюдения, на основании процента выживших после заражения обработанных АК животных, а также по степени элиминации возбудителя из паренхиматозных органов обработанных АК животных

Изучение лечебной эффективности АК при клебсиеллезной инфекции у мышей.

Лечебная эффективность АК при острой клебсиеллезной инфекции у белых беспородных мышей оценивали на 8 группах животных по 10 особей в каждой: шести опытных и двух контрольных. Животные шести опытных групп и одной контрольной одновременно заражали штаммом K. pneumoniae 9 подкожно в дозе 1×104 КОЕ (600 ЛД50) в объеме 0,5 мл, восьмая группа животных не заражалась (контроль токсичности препарата бактериофага). Животных первых четырех опытных групп соответственно спустя 1, 6, 12 и 24 ч после заражения начинали лечить АК в дозе 1×108 БОЕ в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно один раз в сутки в течение 10 дней. Животных пятой и шестой групп лечили препаратом антибиотика ципрофлоксацина через 12 ч и 24 ч после заражения штаммом K. pneumoniae 9, соответственно, вводя препарат внутрижелудочно в дозе 2 мг/животное дважды в сутки (через 12 ч) в течение пяти дней. Седьмая группа - контроль эффективности заражения: животных инфицировали подкожно 1×104 КОЕ клеток K. pneumoniae 9 в объеме 0,5 мл, без лечения. Восьмая группа - контроль токсичности ЛПП: животным вводили внутрибрюшинно препарат в дозе 1×108 БОЕ один раз в течение десяти дней. Во время курса лечения и в течение 14 дней после окончания терапии проводили наблюдение за животными, фиксируя у них поведение, состояние шерстного покрова и аппетит. В опытных и контрольных группах животных регистрировали гибель животных. Павших животных вскрывали, паренхиматозные органы высевали на питательные среды для последующей оценки обсемененности их клетками заражающего штамма K. pneumoniae 9. Оставшихся в живых белых мышей эвтанизировали, а их органы исследовали на наличие возбудителя - бактерий штамма K. pneumoniae 9 с подсчетом КОЕ возбудителя в 1 г исследуемого образца. Эффективность лечения острой клебсиеллезной инфекции у мышей с помощью препарата бактериофага и антибиотика оценивали по продолжительности жизни леченых животных, по поведению опытных животных во время всего срока наблюдения по сравнению с контрольными группами, по проценту выживших после заражения обработанных бактериофагом животных, а также по степени элиминации возбудителя из паренхиматозных органов обработанных фагом животных.

Эффективность фаготерапии острой клебсиеллезной инфекции у беспородных белых мышей отражена на Рис. 1. При этом не наблюдалось значительных различий в эффективности двух испытываемых антибактериальных комбинаций.

Пример 5. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде суспензии, содержащая целевые добавки в количестве 0,01-95,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: сироп корня солодки, пектин яблочный, натрий-фосфатный буфер, HEPES-буфер, хинозол. Тест на лизогению был отрицательный. Для испытания биодоступности полученной суспензии ее образец массой 0,6 г вносили в среду 199. Отмечалось равномерное диспергирование суспензии в водной среде и сохранение в растворе не менее 99% литической активности композиции.

Пример 6. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде суппозитория, содержащая целевые добавки в количестве 50,0-95,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: глицин, цистеин, гистидин, альбумин, масло касторовое, ланолин, кондитерский жир, пищевой жир, спермацет, вазелин, глюкоза, твердые жиры (SolPro), эмульгатор Т-2, парафин, какао-масло, вода, витебсол, хинозол, желатин, глицерин, кальций глюконат, полиэтиленоксид 400, полиэтиленоксид 1500 и соли, способные образовывать фосфатный или ацетатный или трис-буферный раствор. Тест на лизогению был отрицательный. Для испытания биодоступности полученной суппозитории ее образец массой 0,6 г вносили в среду 199. Отмечалось равномерное диспергирование суспензии в водной среде и сохранение в растворе не менее 99% литической активности композиции.

Пример 7. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде мази содержащая целевые добавки в количестве 50,0-95,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: соли, образующие буферный раствор, глицин, цистеин, гистидин, хинозол, полиглюкин, воск, саломас, комбижир, ланолин, спермацет, вазелин, глицерин, церезин, вазелиновое масло, искусственный вазелин, пальмитин, гидрированный жир, кондитерский жир, пальмовый олеин, пальмовый стеарин, полиэтиленоксид 1500, полиэтиленоксид 400, масло какао, масло касторовое, персиковое масло, льняное масло, конопляное масло, пропиленгликоль, гексиленгликоль. Тест на лизогению был отрицательный.

Пример 8. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде косметического геля, содержащая целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: карбапол ЕТД, экстракт календулы, эфирное масло лаванды, нипазол (пропилпарабен), NaOH, марка РД, вода очищенная.

Препарат показан для профилактики или лечения гнойно-воспалительных поражений кожи и подкожной клетчатки, возникающих при различных повреждениях кожного покрова: ожогах, ранениях, ссадинах, и т.п. Гель рекомендован в качестве эффективного косметического средства по уходу за кожей лица после проведения лазерных косметических процедур, а также в качестве профилактического средства при различных нарушениях целостности кожного покрова. Препарат используется в сочетании с другими антибактериальными средствами, а также в качестве монотерапии - при непереносимости пациентом антибиотикотерапии и при антибиотикоустойчивости штаммов возбудителя заболевания. Препарат применяется 1-2 раза в день в виде аппликаций на бинт или на открытую поверхность. Для профилактики препарат наносится на чистую кожу, на 15-20 мин.

Пример 9. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде геля, содержащая целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: повидон, ПЭГ 40 гидрогенизированное касторовое масло, лаурет-9, гидроокись натрия, бензоат натрия, сорбат калия, метилпарабен, вода, лактат магния, D-пантенол, бензокаин, ментол, пропиленгликоль, АСД фракция 2.

Назначение: для использования в качестве вспомогательного, дополнительного средства в комплексной терапии ожогов любого происхождения (температурный, лучевой, химический). Комплекс бактериофагов обеспечивает защиту (в условиях амбулаторного и клинического применения) от заражения воспаленного участка основными возбудителями гнойных бактериальных инфекций, а также санацию инфицированной раны. Способствует снижению проявлений ацидоза, сенсибилизации и токсикации поврежденных тканей, стабилизирует микроциркуляцию крови. Оказывает противовоспалительный и легкий обезболивающий эффект.

Способ применения: на начальных стадиях (некроза, острого воспаления) наносить на раневые повязки до их увлажнения и пропитывания 3-4 раза в день, а также поле смены повязок. На последующих стадиях (рубцевание) наносить непосредственно на пораженный участок не менее 3 раз в день. Длительность курса по показаниям.

Пример 10. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде спрея для полости рта, содержащая целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: повидон, ПЭГ 40 гидрогенизированное касторовое масло, гидроокись натрия, бензоат натрия, сорбат калия, вода, фруктоолигосахарид, лактулоза, лактат калия, D-пантенол, ароматизатор. Назначение: для гигиенического, профилактического и оздоровительного ухода за полостью рта, предрасположенной к различным проявлениям дисбактериоза - неприятный запах и/или вкусовые ощущения, гингивиты, пародонтиты, стоматиты, кариес. Для снижения риска развития различных воспалений и инфекционных осложнений после лечебных и других интенсивных процедур в полости рта.

Способ применения: орошать полость рта, направляя спрей на проблемные участки. Не споласкивать водой и не запивать в течение 30 минут. Использовать 3-5 раз по мере необходимости, но не реже 3 раз в сутки. Длительность курса от 2 до 5 недель.

Пример 11. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде геля для аппликаций, содержащая целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: гипромеллоза, ПЭГ 40 гидрогенизированное касторовое масло, бензоат натрия, сорбат калия, фосфатный буфер, вода, отдушка, аргинин, ментол, пропиленгликоль. Наносится на повязку, состоящую из текстильной основы (полиамидной сетки) и используется для местного лечения ран, ожогов и заболеваний кожи.

Пример 12. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде спрея для дезинфекции воздуха помещений и поверхностей, содержащая целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: карбомер, триэтаноламин, бензиловый спирт, метилхлоризотиазолинон, метилизотиазолинон, ПЭГ 12 диметикон, хинозол, вода отдушка.

Назначение: для гигиенической, санитарной и дезинфекционной обработки воздуха и поверхностей в жилых, бытовых и производственных помещениях, в местах содержания животных, в учреждениях медицинского и ветеринарного профиля, в т.ч. для санирующей антибактериальной обработки воздуха, поверхностей помещений от возбудителей внутрибольничных инфекций и инструментария.

Способ применения: путем аэрозольного распыления разбрызгать средство в воздухе помещения из расчета 0,3-0,5 см3 средства на м3 воздушного пространства помещения. Нанести средство на поверхности с высокой вероятностью обсеменения бактериальной патогенной микрофлорой и на поверхности, требующие особенной чистоты и дополнительной защиты от контаминации (из расчета 0,2-0,3 см3 на м2 обрабатываемой поверхности).

Пример 13. Получение лиофильно высушенных фильтратов фаголизатов бактериофагов, используемых для приготовления композиции по Примеру 2 или 3 в виде лиофилизированного порошка, таблеток и капсул.

Были отработаны защитные среды и режим лиофильного высушивания фагов и бактерий на сублимационной сушке EPSILON 2-60 (CHRIST, Германия).

В защитной среде для бактериальных культур (сахароза 10%, желатин 1%) готовили суспензию бактерий с концентрацией 1×109 м.к./мл. Защитную среду для бактериофагов (сахароза 20%, желатин 2%) добавляли к фаголизату в равном объеме. Приготовленные суспензии фагов и бактериальных культур - хозяев разливали во флаконы по 0,5 мл и высушивали в течение 24 часов при температуре -85°С.

В результате проведенной работы были наработаны, лиофильно высушены и охарактеризованы (по концентрации) препараты восьми бактериофагов и десяти бактериальных штаммов.

Пример 14. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде лиофилизированного порошка, содержащая целевые добавки в количестве 30,0-94,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: аэросил, сахароза, лактоза, глюкоза, мальтоза, манит, фруктоза, кислота аскорбиновая, кислота лимонная, кислота янтарная, глицин, тиомочевина, полиглюкин, пектин, декстрин, альбумин, желатин, соли, образующие буферный раствор, кальция стеарат, титана двуокись, лактулоза, поливинилпирролидон, целлюлоза микрокристаллическая, крахмал, тальк, цистеин, гистидин, хинозол. Тест на лизогению был отрицательный.

Пример 15. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде таблетки с кишечнорастворимым покрытием, содержащая целевые добавки в количестве 50,0-94,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: аэросил, сахароза, лактоза, глюкоза, мальтоза, манит, фруктоза, кислота аскорбиновая, кислота лимонная, кислота янтарная, глицин, тиомочевина, полиглюкин, пектин, декстрин, альбумин, желатин, соли, образующие буферный раствор, кальция стеарат, титана двуокись, лактулоза, поливинилпирролидон, целлюлоза микрокристаллическая, крахмал, тальк, целлюлоза, метилцеллюлоза, ацетатфталатцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, натрий кроскармеллоза, натрия гликолят крахмал, воск, твин, гистидин, цистеин, хинозол. Тест на лизогению был отрицательный.

Пример 16. Получена композиция антибактериальная по Примеру 2 или Примеру 3 в виде капсулы, содержащая целевые добавки в количестве 30,0-94,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: аэросил, сахароза, лактоза, глюкоза, мальтоза, манит, фруктоза, кислота аскорбиновая, кислота лимонная, кислота янтарная, глицин, тиомочевина, полиглюкин, пектин, декстрин, альбумин, желатин, соли, образующие буферный раствор, кальция стеарат, титана двуокись, лактулоза, поливинилпирролидон, целлюлоза микрокристаллическая, крахмал, тальк, целлюлоза, метилцеллюлоза. ацетатфталатцеллюлоза, кросповидон, хинозол.

Пример 17. У пациента, госпитализированного в нейрохирургическую клинику с черепно-мозговой травмой, после успешно проведенной операции в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) на 3 сутки после подключения к ИВЛ при бактериологическом анализе эндотрахеального аспирата выделены Klebsiellapneumoniae и Pseudomonasaeruginosa, идентифицированные как штаммы с множественной резистентностью к антибиотикам. Аэрозольное использования спрея, содержащего антибактериальную композицию на основе коктейля бактериофагов дважды в сутки в течение 2 дней, позволило при повторном бактериологическом анализе подтвердить эрадикацию указанных микроорганизмов в эндотрахеальном аспирате.

Пример 18. У пациента, госпитализированного в нейрохирургическую клинику с геморрагическим инсультом, после успешно проведенной операции в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) на 5 сутки после подключения к ИВЛ при бактериологическом анализе эндотрахеального аспирата, а еще через двое суток и мочи выделены Klebsiella pneumoniae и Acinetobacter baumannii, идентифицированные как штаммы с множественной резистентностью к антибиотикам. Применение суспензии, содержащей антибактериальную композицию на основе коктейля бактериофагов дважды в сутки в течение 3 дней для полоскания полости рта и обработки интубационной трубки, позволило при повторном бактериологическом анализе эндотрахеального аспирата и мочи подтвердить эрадикацию указанных микроорганизмов.

Пример 19. В больнице хирургического профиля в ОРИТ возникла вспышка нозокомиальной инфекции, вызванной панрезистентным штаммом Klebsiella pneumoniae. Перед операцией пациентам, которые поступали в дальнейшем в блок №1 ОРИТ, профилактически в течение 2 суток два раза в день назначали энтеральные капсулы, содержащие лиофилизированную субстанцию на основе коктейля бактериофагов. Пациенты, поступавшие после операции в блок №2 ОРИТ, бактериофаговый препарат не получали. В результате проведенного сравнительного исследования в течение 30 дней лишь у 5% пациентов из блока №1 при бактериологическом анализе мочи и эндотрахеального аспирата был высеян панрезистентный штамм Klebsiella pneumoniae, в то время как в блоке №2 ОРИТ частота нозокомиальной инфекции превышала 50%.

Пример 20. У пациента, госпитализированного с ожогами 18% поверхности тела, на 10 сутки при бактериальном мониторинге раневых поверхностей из раневого отделяемого были высеяны MRSA штаммы. Использование мази на основе коктейля бактериофагов в течение 14 дней позволило провести эрадикацию указанных микроорганизмов из раневого отделяемого пациента.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет расширить ассортимент средств, содержащих в качестве основного действующего начала высокоселективные природные антибактериальные компоненты (бактериофаги), обеспечить биологическую стабильность и активность бактериофагов в составе композиции средства. Кроме того, композиция обладает низким риском токсических и побочных эффектов, позволяет расширить варианты и способы практического применения средств, содержащих бактериофаги, обеспечивает стабильность при хранении и эффективность применения в широком диапазоне температур. По семи штаммам бактериофагов представлен перечень нуклеотидных последовательностей согласно стандарту ВОИС.

При этом было обнаружено, что нуклеотидная последовательность каждого отдельного штамма, кодирующая геном бактериофага, на 90-100% идентична соответствующей последовательности, представленной в перечне нуклеотидных последовательностей, а именно идентична: SEQ ID NO: 1 на 93%, 96%, 99% или 100%; SEQ ID NO: 2 на 93%, 96%, 99% или 100%; SEQ ID NO: 3 на 90%, 93%, 96%, 99% или 100%; SEQ ID NO: 4 на 90%, 93%, 96%, 99% или 100%; SEQ ID NO: 5 на 99% или 100%; SEQ ID NO: 6 на 100%; SEQ ID NO: 7 на 90%, 93%, 96%, 99% или 100%. Вышеуказанные нуклеотидные последовательности могут быть трансформированы в чувствительную бактериальную клетку с последующим получением бактериофага. Термин «трансформация» означает процесс поглощения клеткой свободной молекулы ДНК из среды. Согласно настоящему уровню техники известен способ трансформации ДНК бактериофага в чувствительную бактериальную клетку с последующим развитием продуктивной фаговой инфекции (L. Planelles, С. Maranon, J.M Requena, М.С. Lopez, Phage recovery by electroporation of naked DNA into host cells avoids the use of packaging extracts. Analytical biochemistry, 1999, Vol. 267, No. 1, p. 234-235).

Пример 21. Молекулу ДНК, представляющую собой нуклеотидную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 1 на 93%, трансформировали в суспензию электрокомпетентных клеток штамма S. aureus методом электропорации. Культуру штамма S. aureus после трансформации инкубировали в мясопептонном бульоне при 37°C в течение 18 часов, затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Полученный фильтрат содержал стафилококковый бактериофаг в титре 5×105 БОЕ/мл.

Пример 22. Молекулу ДНК, представляющую собой нуклеотидную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 3 на 90%, трансформировали в суспензию химически компетентных клеток штамма K. pneumoniae химическим методом в присутствии хлорида кальция. Культуру штамма K. pneumoniae после трансформации инкубировали в мясопептонном бульоне при 37°C в течение 12 часов, затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный фильтрат содержал клебсиеллезный бактериофаг в титре 2×104 БОЕ/мл.

Пример 23. Молекулу ДНК, представляющую собой нуклеотидную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 5 на 99%, трансформировали в суспензию химически компетентных клеток штамма P. aeruginosa химическим методом в присутствии хлорида кальция. Культуру штамма P. aeruginosa после трансформации инкубировали в мясопептонном бульоне при 37°C в течение 10 часов, затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный фильтрат содержал псевдомонадный бактериофаг в титре 3×105 БОЕ/мл.

Пример 24. Молекулу ДНК, представляющую собой нуклеотидную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 7 на 100%, трансформировали в суспензию электрокомпетентных клеток штамма A. baumanii методом электропорации. Культуру штамма A. baumanii после трансформации инкубировали в мясопептонном бульоне при 37°C в течение 18 часов, затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный фильтрат содержал бактериофаг A. baumanii в титре 1×104 БОЕ/мл.

1. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций, включающая комбинацию фильтратов фаголизатов бактерий, отличающаяся тем, что она обладает литической активностью не ниже 10-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из клинического материала изолятов бактерий и включает фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH1, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-105, фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH111, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-95, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-90, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-91, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-88, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА10, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-89, фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-106, и целевые добавки в количестве 0,01±99,99 мас. % от массы композиции.

2. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций, включающая комбинацию фильтратов фаголизатов бактерий, отличающаяся тем, что она обладает литической активностью не ниже 10-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из клинического материала изолятов бактерий и включает фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH1, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-105, фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH111, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-95, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-90, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-91, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-88, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa PA10, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-89, фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-106, фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АР22, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-42, и целевые добавки в количестве 0,01±99,99 мас. % от массы композиции.

3. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 0,01-95,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: сироп корня солодки, пектин яблочный, натрий-фосфатный буфер, HEPES-буфер, хинозол, и представлена в виде суспензии.

4. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 50,0-95,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: глицин, цистеин, гистидин, альбумин, масло касторовое, ланолин, кондитерский жир, пищевой жир, спермацет, вазелин, глюкоза, твердые жиры (SolPro), эмульгатор Т-2, парафин, какао-масло, вода, витебсол, хинозол, желатин, глицерин, кальций глюконат, полиэтиленоксид 400, полиэтиленоксид 1500 и соли, способные образовывать фосфатный, или ацетатный, или трис-буферный раствор, и представлена в виде суппозитория.

5. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 50,0-95,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: соли, образующие буферный раствор, глицин, цистеин, гистидин, хинозол, полиглюкин, воск, саломас, комбижир, ланолин, спермацет, вазелин, глицерин, церезин, вазелиновое масло, искусственный вазелин, пальмитин, гидрированный жир, кондитерский жир, пальмовый олеин, пальмовый стеарин, полиэтиленоксид 1500, полиэтиленоксид 400, масло какао, масло касторовое, персиковое масло, льняное масло, конопляное масло, пропиленгликоль, гексиленгликоль, и представлена в виде мази.

6. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: карбапол ЕТД, экстракт календулы, эфирное масло лаванды, нипазол (пропилпарабен), NaOH, марка РД, вода очищенная, и представлена в виде косметического геля.

7. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: повидон, ПЭГ 40 гидрогенизированное касторовое масло, лаурет-9, гидроокись натрия, бензоат натрия, сорбат калия, метилпарабен, вода, лактат магния, D-пантенол, бензокаин, ментол, пропиленгликоль, АСД фракция 2, и представлена в виде геля при ожогах.

8. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: повидон, ПЭГ 40 гидрогенизированное касторовое масло, гидроокись натрия, бензат натрия, сорбат калия, вода, фруктоолигосахарид, лактулоза, лактат калия, D-пантенол, ароматизатор, и представлена в виде спрея для полости рта.

9. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: гипромеллоза, ПЭГ 40 гидрогенизированное касторовое масло, бензоат натрия, сорбат калия, фосфатный буфер, вода, отдушка, аргинин, ментол, пропиленгликоль, и представлена в виде геля для повязок.

10. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: карбомер, триэтаноламин, бензиловый спирт, метилхлоризотиазолинон, метилизотиазолинон, ПЭГ 12 диметикон, хинозол, вода, отдушка, и представлена в виде дезинфицирующего средства.

11. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она включает комбинацию фильтратов фаголизатов бактерий в виде сухой биомассы.

12. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 11, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 30,0-94,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: аэросил, сахароза, лактоза, глюкоза, мальтоза, манит, фруктоза, кислота аскорбиновая, кислота лимонная, кислота янтарная, глицин, тиомочевина, полиглюкин, пектин, декстрин, альбумин, желатин, соли, образующие буферный раствор, кальция стеарат, титана двуокись, лактулоза, поливинилпирролидон, целлюлоза микрокристаллическая, крахмал, тальк, цистеин, гистидин, хинозол и представлена в виде лиофилизированного порошка.

13. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 11, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 50,0-94,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: аэросил, сахароза, лактоза, глюкоза, мальтоза, манит, фруктоза, кислота аскорбиновая, кислота лимонная, кислота янтарная, глицин, тиомочевина, полиглюкин, пектин, декстрин, альбумин, желатин, соли, образующие буферный раствор, кальция стеарат, титана двуокись, лактулоза, поливинилпирролидон, целлюлоза микрокристаллическая, крахмал, тальк, целлюлоза, метилцеллюлоза, ацетатфталатцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, натрий кроскармеллоза, натрия гликолят крахмал, воск, твин, гистидин, цистеин, хинозол, и представлена в виде таблетки с кишечнорастворимым покрытием.

14. Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций по п. 11, отличающаяся тем, что она содержит целевые добавки в количестве 30,0-94,0 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: аэросил, сахароза, лактоза, глюкоза, мальтоза, манит, фруктоза, кислота аскорбиновая, кислота лимонная, кислота янтарная, глицин, тиомочевина, полиглюкин, пектин, декстрин, альбумин, желатин, соли, образующие буферный раствор, кальция стеарат, титана двуокись, лактулоза, поливинилпирролидон, целлюлоза микрокристаллическая, крахмал, тальк, целлюлоза, метилцеллюлоза, ацетатфталатцеллюлоза, кросповидон, хинозол, и представлена в виде капсулы.

15. Штамм бактериофага Staphylococcus aureus SCH1, используемый для получения композиции антибактериальной по п. 1 или 2, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-105.

16. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному бактериофага по п. 15, представленному SEQ ID NO: 1.

17. Штамм бактериофага Staphylococcus aureus SCH111, используемый для получения композиции антибактериальной по п. 1 или 2, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-95.

18. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному бактериофага по п. 17, представленному SEQ ID NO: 2.

19. Штамм бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15, используемый для получения композиции антибактериальной по п. 1 или 2, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-90.

20. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному бактериофага по п. 19, представленному SEQ ID NO: 3.

21. Штамм бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811, используемый для получения композиции антибактериальной по п. 1 или 2, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-91.

22. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному бактериофага по п. 21, представленному SEQ ID NO: 4.

23. Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5, используемый для получения композиции антибактериальной по п. 1 или 2, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-88.

24. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному бактериофага по п. 23, представленному SEQ ID NO: 5.

25. Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa PA10, используемый для получения композиции антибактериальной по п. 1 или 2, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-89.

26. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному бактериофага по п. 25, представленному SEQ ID NO: 6.

27. Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24, используемый для получения композиции антибактериальной по п. 1 или 2, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph-106.

28. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному бактериофага по п. 27, представленному SEQ ID NO: 7.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, обладающий высокоактивной продуктивностью капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-7884.
Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для получения сыворотки для профилактики и лечения некробактериоза животных. Способ включает гипериммуннизацию волов-продуцентов инактивированным формалином антигеном, выделенным из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным системам презентации множественных антигенов, и может быть использовано в медицине. Иммуногенная композиция против одного или более из антигенного полисахарида, пептидного антигена или полипептидного антигена содержит по меньшей мере один антигенный полисахарид, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген и по меньшей мере одну комплементарную пару аффинных молекул.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для экстренной профилактики экспериментальной мелиоидозной инфекции. Для этого применяют сочетанное введение иммуномодулятора имунофана и антибиотика доксициклина животным.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к стоматологии, и касается набора для лечения заболевания или состояния, связанного с присутствием Р. gingivalis в ткани ротовой полости у субъекта, включающий: (i) композицию, содержащую иммуноген, который вызывает иммунный ответ против P.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммуностимулирующий неметилированный CpG-олигодезоксинуклеотид, вектор экспрессии, его содержащий, вакцина для предотвращения или борьбы с инфекционным заболеванием у птиц, содержащая указанные олигодезоксинуклеотид и/или вектор экспрессии и иммунологическое количество антигенного компонента, выделенного из патогенного для птичьих вируса или микроорганизма, а также применение олигодезоксинуклеотида в качестве лекарственного средства и для предотвращения инфекции у птичьих.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены поливалентная иммуногенная композиция, содержащая комбинацию растворимой части цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae.

Изобретение касается вакцинной композиции. Охарактеризованная вакцинная композиция содержит эффективное иммунизирующее количество инактивированной Ehrlichia canis (Е.
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, аллергологии и пульмонологии, и может быть использовано для усиления активности факторов неспецифической защиты у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ отбора пробиотического молочнокислого бактериального штамма для применения в локальном продуцировании гистамина в млекопитающем. Предложены продукт и композиция для локального продуцирования гистамина в млекопитающем, содержащие молочнокислый бактериальный штамм, имеющий активный оперон гистидина и способный продуцировать гистамин, для применения в лечении и/или профилактике воспалительных состояний. Предложенная группа изобретений обеспечивает локальное продуцирование гистамина в млекопитающем посредством отбора определенных штаммов молочнокислых бактерий. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 5 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены рекомбинантные дрожжи штамма Kluyveromyces lactis DSM 25405, Kluyveromyces lactis DSM 25406 или Kluyveromyces lactis DSM 25407, несущие в качестве чужеродного гена ген для VP2-антигена вируса инфекционного бурсита (IBDV), интегрированный в геном дрожжей и обеспечивающий экспрессию VP2-антигена IBDV в качестве чужеродного белка. Представлен способ подкожной вакцинации с помощью целых дрожжевых клеток указанных рекомбинантных дрожжей. Группа изобретений позволяет сделать способ подкожной вакцинации более экономичным, а также обеспечивает эффективную защиту при вирусных инфекциях в результате подкожной вакцинации с использованием значительно меньших количеств дрожжей. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл., 9 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гибридных полипептидов для иммунизации, что может быть использовано в медицине. Получают гибридные полипептиды, которые способны индуцировать иммунный ответ против X1 у животного, кроме человека, согласно формуле I и II гдеX1 содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой целевой антиген или иммуногенную последовательность и необязательно включает линкерную или адапторную последовательность,обозначает пептидную связь,S1 и S2 представляют собой пару последовательностей SEQ ID NO: 3 и 2 соответственно. Изобретение позволяет эффективно добиваться иммунного ответа на целевой антиген и получать антитела к целевому антигену. 9 н. и 5 з.п. ф-лы, 40 ил., 2 табл., 17 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к разработке химерных молекул внешнего поверхностного белка А (OspA), и может быть использовано в медицине. Разработанный химерный полипептид с SEQ ID NO: 173, а также композиции и комбинированные вакцины, которые его содержат, способны вызывать специфический иммунный ответ против бактерий рода Borrelia. Изобретение позволяет эффективно лечить и предотвращать инфекции Borrelia или лаймской болезни. 13 н. и 23 з.п. ф-лы, 24 ил., 9 табл., 22 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению субъединичных вакцин против Mycoplasma spp., и может быть использовано в медицине для профилактики инфекции Mycoplasma spp. Предложены вакцинные композиции на основе белка Mhp145 с SEQ ID NO: 11 в сочетании с фармацевтически приемлемым адъювантом, белком XylF с SEQ ID NO: 09 и/или фармацевтически приемлемой добавкой. Изобретение обеспечивает достижение сильных иммунных эффектов против Mycoplasma spp. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 9 табл., 3 пр.

Группа изобретений относится к ветеринарии и касается вакцины для птиц и может быть использована для профилактики инфекций, вызываемых Salmonella. Композиция вакцины по изобретению включает в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от Salmonella, при условии, что указанная структура не содержит целую клетку, причем указанная структура, содержащая О-антиген, представляет собой липополисахарид, содержащий Липид А. Способ по изобретению касается получения композиции вакцины и включает стадии: культивирования грамотрицательных бактерий, высвобождения вышеупомянутой структуры из клеток, стадию сбора и стадию приготовления раствора структуры, содержащей O-антиген. Использование изобретений позволяет уменьшить инокуляционную реакцию и снизить количество инъекции по сравнению с обычной цельноклеточной вакциной. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 табл., 6 ил., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, микробиологии и ветеринарии и может быть использовано в биотехнологии при производстве инактивированной вакцины против кампилобактериоза КРС. Способ включает накопление колоний возбудителя кампилобактериоза КРС Campylobacter fetus subspecies fetus путем культивирования на питательной среде, смыв колоний возбудителя кампилобактериоза КРС Campylobacter fetus subspecies fetus 0,9%-ным раствором NaCl, инактивацию накопленной биомассы возбудителя кампилобактериоза КРС Campylobacter fetus subspecies fetus инактиватором и отличается тем, что в качестве инактиватора используют теотропин при следующем соотношении компонентов, масс. %: суспензия клеток кампилобактера серогруппы fetus subspecies fetus в культуральной среде с концентрацией 2×1010 КОЕ*/см3 (культура возбудителя кампилобактериоза КРС Campylobacter fetus subspecies fetus) 0,5%; 0,9%-ный раствор NaCl 99,2%; теотропин 0,3%. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано для профилактики и лечения кампилобактериоза собак. Бивалентная вакцина против кампилобактериоза собак содержит формализированный антиген из штамма Campylobacter fetus subspecies fetus и адьюванта 2% гидроокиси алюминия на фосфатно-буферном растворе, а также формалинизированный антиген из штамма Campylobacter jejuni sudspecies jejuni с концентрацией смеси антигенов 2 млрд микробных клеток в 1 мл вакцины при соотношении 1,5:0,5 (полторы части штамма Campylobacter fetus subspecies fetus и 0,5 части штамма Campylobacter jejuni subspecies jeuni). Использование изобретения позволяет расширить арсенал средств для лечения и профилактики кампилобактериоза. 3 табл.

Изобретения касаются иммуногенной композиции, способа иммунизации, набора для осуществления такой иммунизации и способа получения иммуногенной композиции. Композиция содержит эффективное количество растворимой части цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); где растворимая часть цельноклеточного препарата M.hyo содержит M.hyo-специфические растворимые протеиновые антигены и является отделенной от нерастворимого клеточного материала, в сущности, является свободной как от (i) lg G, так и от (ii) иммунокомплексов, состоящих из антигена, присоединенного к иммуноглобулину. Изобретения могут быть использованы для индуцирования иммунного ответа у субъекта против заболевания, вызванного M.hyo. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 10 ил., 14 табл., 13 пр.

Изобретения касаются иммуногенной композиции, способа иммунизации, набора для осуществления такой иммунизации и способа получения иммуногенной композиции. Композиция содержит эффективное количество растворимой части цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); где растворимая часть цельноклеточного препарата M.hyo содержит M.hyo-специфические растворимые протеиновые антигены и является отделенной от нерастворимого клеточного материала, в сущности, является свободной как от (i) lg G, так и от (ii) иммунокомплексов, состоящих из антигена, присоединенного к иммуноглобулину. Изобретения могут быть использованы для индуцирования иммунного ответа у субъекта против заболевания, вызванного M.hyo. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 10 ил., 14 табл., 13 пр.

Группа изобретений относится к вариантам антибактериальной композиции для профилактики или лечения госпитальных инфекций, штаммам бактериофага и молекулам нуклеиновой кислоты, соответствующим геному бактериофага. Предложенная композиция включает 7 штаммов бактериофага, каждый из которых представлен комбинацией фильтратов фаголизатов бактерий с литической активностью не ниже 10-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий, а также целевые добавки в количестве 0,01±99,99 мас. от массы композиции. При этом используют фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH1, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-105, фильтрат фаголизата Staphylococcus aureus, полученный с использованием штамма бактериофага Staphylococcus aureus SCH111, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-95, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV15, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-90, фильтрат фаголизата Klebsiella pneumoniae, полученный с использованием штамма бактериофага Klebsiella pneumoniae KPV811, депонированного в ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-91, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА5, депонированного в ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-88, фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, полученный с использованием штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa РА10, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-89, фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АМ24, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-106. Вариант композиции содержит также фильтрат фаголизата Acinetobacter baumannii, полученный с использованием штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АР22, депонированного в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора под номером Ph-42. Предложены также соответствующие штаммы бактериофагов. Предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующие геному указанных бактериофагов. Группа изобретений позволяет расширить ассортимент средств, содержащих в качестве основного действующего начала высокоселективные природные антибактериальные компоненты, обеспечить биологическую стабильность и активность бактериофагов в составе композиции средства. Кроме того, композиция обладает низким риском токсических и побочных эффектов, позволяет расширить варианты и способы практического применения средств, содержащих бактериофаги, обеспечивает стабильность при хранении и эффективность применения в широком диапазоне температур. 16 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 24 пр.

Наверх