Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления



Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления
Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления
Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления
Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления
Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления
Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления
Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления
Способ выделения рнк и днк из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления

Владельцы патента RU 2628695:

Общество с ограниченной ответственностью "Биологическая среда" (RU)

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ выявления РНК и ДНК из сухих биологических образцов и набор для выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов. Вышеуказанный способ включает в себя освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот. Осаждение ДНК и РНК осуществляется раствором, содержащим изопропанол и C6H10O5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в отношении 40:0,5 соответственно. Изобретение расширяет арсенал средств выделения нуклеиновых кислот. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл, 3 пр.

 

Группа изобретений относится к области медицины и биотехнологии, и может быть использовано для одновременного выделения РНК и ДНК из биологических образцов, хранившихся в высушенном формате на бумажном носителе при диагностике вирусных, бактериальных патогенов, дрожжей, микозов.

В настоящее время существует множество методов экстракции нуклеиновых кислот (НК) из разнообразного клинического материала, основанных на различных принципах. В частности для подготовки проб к ПНР анализу, чаще всего используются для выделения НК сорбционные методы, экспресс-методики на основе температурного лизиса и методы на основе спиртового осаждения. Однако каждый из этих подходов обладает как достоинствами, так и недостатками. Следовательно, необходимость в усовершенствовании методов по выделению нуклеиновых кислот с учетом имеющихся недостатков и в соответствии с типом анализируемого материала не потеряла своей актуальности.

Выделение ДНК и РНК из биологических образцов является важным этапом молекулярно-генетического исследования. От качества его исполнения зависит успех всех последующих этапов исследования и конечный результат. Поэтому особое значение приобретает правильный выбор метода выделения ДНК, так как его неправильное проведение могут привести либо к получению загрязненной ДНК, непригодной для исследования, либо вообще к потере ДНК. Особенно это относится к выделению нуклеиновых кислот из сухих биообразцов.

В настоящее время для выделения НК из сухих образцов применяются методы, которые уже на первом этапе используют либо лизирующие реагенты, либо буферные растворы. Однако, чувствительность при такой обработке биообразца не всегда бывает достаточной для исследования с целью диагностики вирусных, бактериальных патогенов, дрожжей и микозов.

Таким образом, известен способ выделения НК из различных сухих биологических образцов и набор для его осуществления «ДНК-сорб-В», содержащий лизирующий раствор, раствор для отмывки 1, раствор для отмывки 2, сорбент универсальный и ТЕ-буфер для элюции ДНК. Для выделения в промаркированные пробирки вносят подготовленные нарезки и 500 мкл лизирующего раствора. Встряхивают на вортексе и добавляют 12,5 мкл Протеиназы К и инкубируют в течение 3 часов при температуре 56°С (или в течение ночи при температуре 37°С) при периодическом перемешивании. После чего осторожно переносят раствор в чистую пробирку, оставляя предмет-носитель на дне, центрифугируют 2 минуты при максимальных оборотах (13-16000 об/мин) на микроцентрифуге. Использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новые пробирки. Далее из надосадочной жидкости проводят выделение ДНК. Вносят по 25 мкл ресуспендированного сорбента и центрифугируют для осаждения, с последующим отмываем раствором 1, затем осаждают сорбент центрифугированием и вновь проводят отмывку раствором 2, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента и после многократного центрифугирования подсушивают пробирки в термостат 65°С на 5-10 минут для подсушивания сорбента. И в пробирки добавляют по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК (Ветринская А.А., Кузовлева Е.Б. Использование комплекта реагентов «ДНК-СОРБ-В» для выделения ДНК из различных объектов биологического происхождения в криминалистических целях., 2010, Вестник КазНПУ, найдено 19.05.2016 в Интернет: http://articlekz.com/article/10446). Однако использование указанного набора и выполнения способа является сложным, затратным и длительным по времени.

Наиболее близким техническим решением к заявленному, является способ и набор для выделения нуклеиновых кислот, в частности ДНК из сухих пятен крови и набор реагентов для осуществления способа «РИБО-преп» путем экстракции ДНК из одного сухого пятна крови. В пробирку, содержащую бумагу с сухими пятнами крови, и с контрольными образцами, добавляют по 700 мкл раствора дляяяйзиса. Затем закрывают пробирки и аккуратно перемешивают содержимое пробирки на вортексе. Далее переставляют пробирки в термостат и прогревают при 65°С в течение 30 минут. Во время инкубации пробирки встряхивают на вортексе каждые 8-10 минут. После чего их вновь центрифугируют на микроцентрифуге в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин. Добавляют в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки, плотно закрывают крышки и осторожно промывают осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, а элюцию осуществляют с помощью 50 мкл РНК-буфера и центрифугирования (Инструкция по применению набора реагентов для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® ДНК-ВИЧ-FL», приказ Росздравнадзора от 12.10.2012, №1897-Пр112). Однако данный способ и набор также не обладают высокой степенью очистки ДНК, имеют ограниченную область использования и длительность процедуры выделения.

Технический результат заявленных способа и набора заключается в том, что при их использовании повышается выход нуклеиновых кислот - ДНК и РНК из сухих биологических образцов, полноценное их выделение, за счет высокой степени лизиса клеточных оболочек, освобождения от цельных эритроцитов при относительной простоте исполнения. Все это позволяет получить целостный исследуемый образец, подходящий для диагностических исследований.

Технический результат достигается тем, что создан способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, включающий освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот, при этом освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму осуществляют с помощью дистиллированной воды с рН 5,5-6,0, а лизис биообразца проводят раствором, содержащим в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к этой смеси 1 н HCl до рН 6,4 с последующей его инкубацией в течение 10 минут при температуре 65°С, а осаждение ДНК и РНК осуществляют раствором, содержащим изопропанол и С6Н10О5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в соотношении 40:0,5 соответственно.

Причем выделение РНК и ДНК проводят одновременно.

В предпочтительном варианте освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму осуществляют путем добавления в него дистиллированной воды с рН 5,5-6,0 и периодического перемешивая на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут.

В предпочтительном варианте для осаждения бумажного носителя биообразец центрифугируют в течение 30 секунд при 10 тыс. об/мин.

В предпочтительном варианте для отмывки осадка используют раствор, содержащий в конечной концентрации 10 мМ ацетата аммония в 75% этаноле.

В предпочтительном варианте элюцию нуклеиновых кислот, проводят с помощью буфера, содержащего в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0.

В предпочтительном варианте лизирующий раствор обеспечивает полноценный лизис оболочечных и безоболочечных вирусов, а так же всех видов бактерий, паразитов, микозов и повышает выход НК из бактерий, имеющих плотную клеточную оболочку.

В предпочтительном варианте лизирующий раствор позволяет проводить полноценное выделение НК из крови, освобождая образец от цельных эритроцитов.

Кроме того технический результат достигается тем, что создан набор для выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов путем освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, где набор содержит следующие компоненты: раствор для освобождения биологического образца от носителя, содержащий дистиллированную воду с рН 5,5-6,0; раствор для лизиса оболочек клеток, содержащий 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, 1 н HCl; раствор для осаждения нуклеиновых кислот, содержащий гликоген формулой С6Н10О5 и изопропиловый спирт; раствор для промывки биологического образца, содержащий ацетат аммония и 75% этанол; буфер для элюции нуклеиновых кислот, содержащий трис HCl с рН 8,0 и EDTA с рН 8,0.

Осуществление группы изобретений.

В описании подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящей группы изобретений, и оно не ограничивается приведенными ниже предпочтительными вариантами осуществления, и его можно без ограничений модифицировать в объеме настоящего изобретения.

Выделение РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, проводят одновременно с помощью набора реагентов, а именно раствора для освобождения биологического образца от носителя, содержащего дистиллированную воду с рН 5,5-6,0; раствора для лизиса оболочек клеток, содержащего 8 М гуанидинтиоционата, 6,5 М NaCl, 1 н HCl; раствора для осаждения нуклеиновых кислот, содержащего гликоген формулой С6Н10О5 и изопропиловый спирт; раствора для промывки биологического образца, содержащего ацетат аммония и 75% этанол и буфера для элюции нуклеиновых кислот, содержащего трис HCl с рН 8,0 и EDTA с рН 8,0. Для этого проводят освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму. В частности, например, в день исследования бумажные носители образцов распаковывают из защитной карты, разрезают вдоль по всей длине полоске, опускают в пробирку на 0,5 см и разрезают через каждые 0,5 см, так, чтобы все части полоски-носителя биологических образцов поместились в 1,5 мл пробирке. В пробирки добавляют 300 мкл дистиллированной воды рН 5,5-6,0, периодически перемешивают на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут. За это время сухой биологический образец растворяется и смывается с носителя. По истечению этого времени биологический образец центрифугируют в течение 30 секунд при 10 тыс. об/мин., с целью осаждения бумажного балласта. Образовавшуюся жидкость переносят в чистую пробирку, из которой проводят выделение РНК и ДНК набором реагентов. То есть проводят лизис клеточных оболочек раствором, содержащим в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к этой смеси 1 н HCl до рН 6,4 и последующей его инкубацией в течение 10 минут при температуре 65°С. Затем в эту пробирку с биологическим образцом добавляют осаждающий раствор, содержащий изопропанол и С6Н10О5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в соотношении 40:0,5 соответственно. После чего содержимое тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 7 минут при 14 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость сливают из пробирки, а осадок промывают отмывочным раствором, содержащим в конечной концентрации 10 мМ ацетата аммония в 75% этаноле, ручным перемешиванием содержимого пробирки в течении 30 секунд и центрифугированием в течение 30 секунд при 14 тыс.об/мин. Осадок растворяют в элюирующем буфере, содержащим в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0. Полученные ДНК и РНК используют в ПЦР. Используемые способ и набор обеспечивают полноценный лизис оболочечных и безоболочечных вирусов, а так же всех видов бактерий, паразитов, микозов, полноценное выделение НК из крови, освобождая образец от цельных эритроцитов, и повышают выход НК из бактерий, имеющих плотную клеточную оболочку. Все это позволяет упростить процедуру выделения ДНК и РНК, что дает возможность повысить достоверность и чувствительность дальнейшего исследования.

Примеры реализации способа выделения ДНК и РНК из сухих биологических образцов с помощью заявленного набора реагентов.

Пример 1

Биологический материал отбирался от пациентов в виде крови и урогенитальных мазков. Затем в объеме 130 мкл наносился на бумажный носитель в полоски, высушивали в течении 1,5 часов при комнатной температуре. После высыхания биологического материала бумажный носитель упаковывали в защитную карту и хранили в бытовом холодильнике до исследования. В день исследования бумажные носители образцов распаковывали из защитной карты, разрезали вдоль по всей длине полоске, опускали в пробирку на 0,5 см и разрезали через каждые 0,5 см, так, чтобы все части полоски-носителя образцов поместились в 1,5 мл пробирке. После чего в пробирки с биологическим образцом на носителе добавляли 300 мкл дистиллированной воды рН 5,5-6,0,. При этом периодически перемешивали на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут. За это время сухой образец растворяется и смывается с носителя. По истечении этого времени осуществляли центрифугирование биологического образца в течении 30 секунд при 10 тыс. об/мин, с целью осаждения бумажного балласта. Образовавшуюся жидкость переносили в чистую пробирку, из которой проводили выделение нуклеиновой кислоты набором реагентов:

- Лизирующим раствором, содержащим в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к смеси 1 н HCl до становления рН 6,4;

- Раствором осаждающим, содержащим изопропанол и С6Н10О5 в конечной концентрации 27 мг/мл, из расчета на 40 мл изопропанола - 200 мкл гликогена.

- Отмывочным раствором, содержащим в конечной концентрации 10 мМ Ацетат аммония в 75% этаноле.

- Элюирующим буфером, содержащим в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0.

То есть проводили лизис клеточных оболочек раствором, содержащим в конечной концентрацией М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к этой смеси 1 н HCl до рН 6,4 и последующей его инкубацией в течение 10 минут при температуре 65°С. Затем в эту пробирку с биологическим образцом добавляли осаждающий раствор, содержащий изопропанол и С6Н10О5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в соотношении 40:0,5 соответственно. После чего содержимое тщательно перемешивали и центрифугировали в течение 7 минут при 14 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали из пробирки, а осадок промывали отмывочным раствором, содержащим в конечной концентрации 10 мМ ацетата аммония в 75% этаноле, с ручным перемешиванием содержимого пробирки в течение 30 секунд и центрифугировали в течение 30 секунд при 14 тыс.об/мин. Осадок растворяли в элюирующем буфере, содержащем в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0. Полученные нуклеиновые кислоты использовали в ПЦР. В работу были приняты как отрицательные пробы, так и положительные, с целью проверки контаминации в процессе исследований. Пробы взяты из рутинного потока лабораторных исследований жидких образов, с коммерческим набором, производства ООО «НаноДиагностики». В итоге отрицательные пробы остались отрицательными, а положительные - положительными.

Результаты выделение ДНК бактерий из сухих образцов показаны в таблице 1.

Из таблицы видно, что такой способ получения нуклеиновых кислот из сухих образов позволяет их идентифицировать. Пример 2

Исследовали сухие биологические материалы крови и урогенитальных мазков человека, нанесенные на бумажные носители. Выделение нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) проводили с помощью набора реагентов:

- Раствора для освобождения биологического образца от носителя, содержащий дистиллированную воду с рН 5,5-6,0

- Лизирующего раствора, содержащего в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, а 1 н HCl добавляют до становления рН 6,4;

- Осаждающего раствора, содержащего изопропанол и С6Н10О5 в конечной концентрации 27 мг/мл, из расчета на 40 мл изопропанола - 200 мкл гликогена.

- Отмывочного раствора, содержащего в конечной концентрации 10 мМ Ацетат аммония в 75% этаноле.

- Элюирующего буфера, содержащего в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0

Бумажные носители образцов распаковывали из защитной карты, разрезали вдоль по всей длине полоске, опускали в пробирку на 0,5 см и разрезали через каждые 0,5 см, так, чтобы все части полоски-носителя образцов поместились в 1,5 мл пробирке. В пробирки добавляли 300 мкл дистиллированной воды рН 5,5-6,0, периодически перемешивали на вортексе в течение 10 минут по 30 секунд. За это время сухой образец растворяется и смывается с носителя. По истечению этого времени откручивали пробирки в течение 30 секунд при 10 тыс.об/мин. Далее образовавшуюся жидкость переносили в чистую пробирку. Добавляли 500 мкл лизирующего раствора, содержащего в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, а 1 н HCl добавляют до становления рН 6,4, перемешивали на вортексе и инкубировали при 65°С в течение 10 минут, при 60°С в течение 10 минут, при 60°С в течение 5 минут, при 65°С в течение 5 минут, далее в этот биологический образец добавляли осаждающий раствор из расчета на 40 мл изопропанола брали 200 мкл гликогена, тщательно перемешивали пробирки, и центрифугировали 7 минут при 14 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали из пробирки, а осадок промывали отмывочным раствором, содержащим в конечной концентрации 10 мМ Ацетата аммония в 75% этаноле с перемешиванием ручным способом пробирки с осадком в течение 30 секунд. После чего центрифугировали 30 секунд при 14 тыс. об/мин. Осадок растворяли в элюирующем буфере, содержащем в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8. Выделенную нуклеиновую кислоту использовали в ПЦР. Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, применение режима инкубации 65°С в течение 10 минут на стадии проведения лизиса биологического образца позволяет выявлять все положительные пробы без потерь.

Пример 3

При проведении исследований сухих биологических образцов крови от пациентов с применением описанного способа перевода сухих образцов в жидкую форму происходит осмотический лизис эритроцитов. Вода поступает внутрь эритроцитов, они набухают и лопаются. Цельные эритроциты выступают как ингибиторы процесса выделения нуклеиновых кислот. Следовательно, освобождение от цельных эритроцитов биологического образца позволяет улучшить качество процесса выделения нуклеиновых кислот. Заявленная нами методика и набор реактивов обеспечивают полноценный лизис бактериальных плотных клеточных стенок. В данном примере показано использование стандартных молярностей лизирующих растворов - 1) в конечной концентрации 5 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с 1 н HCl добавленным до рН 6,4; 2) в конечной концентрации 6,5 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с 1 н HCl добавленным до рН 6,4; 3) в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с 1 н HCl добавленным до рН 6,4.

Бумажные носители образцов распаковывали из защитной карты, разрезали вдоль по всей длине полоске, опускали в пробирку на 0,5 см и разрезали через каждые 0,5 см, так, чтобы все части полоски-носителя образцов поместились в 1,5 мл пробирке. В пробирки добавляли 300 мкл дистиллированной воды рН 5,5-6,0, периодически перемешивали на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут. За это время сухой образец растворяется и смывается с носителя. По истечению этого времени откручивали пробирки в течение 30 секунд при 10 тыс. об/мин. с целью осаждения бумажного балласта. Образовавшуюся жидкость переносили в чистую пробирку, из которой проводили выделение нуклеиновой кислоты с применением лизирующего буфера разной концентрации гуанидинтиоционата. Все остальные стадии проводили как в примере 1. Сухие образцы проверялись в потоке проводимых диагностических исследований. Результаты по сухим образцам сравнивали с результатами, полученными из жидких образов, и они разнились. Результаты по положительным и отрицательным пробам с применением 8 М гуанидинтиоционата в лидирующем буфере соотносились с результатами из сухих образцов. Отрицательные пробы были выявлены как отрицательные, что говорит о чистоте проводимых исследований, исключающих контаминацию. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.

Из таблицы 3 видно, что проведение процедуры выделения ДНК бактерий, имеющих различный слой клеточной стенки с конечной концентрацией 6,5 М гуанидинтиоционата (верхняя часть таблицы) и с 5 М гуанидинтиоционата (нижняя часть таблицы) в лизирующем буфере не позволяет получать идентичные результаты. Результаты показывают, что лизирование клеточной стенки бактерий проходит плохо, что влияет на выход из клеток искомой ДНК. Данные показывают, что выявления лактобактерий происходит без потерь, так как эти бактерии имеют тонскую клеточную стенку. При выявлении бактерий Уриеаплазм и Гарднерелл наблюдаются тенденция к потери образцов. Видно отсутствие Ст-флуоресцентного сигнала.

Из таблицы 4 видно, что выделение ДНК бактерий, имеющих различный слой клеточной стенки с конечной концентрацией 6,5 М гуанидинтиоционата (верхняя часть таблицы) в лизирующем буфере проходит плохо, получаются ложноотрицательные результаты. А использование 8 М гуанидинтиоционата (нижняя часть таблицы) в лизирующем буфере позволяет выявлять полноценно искомую ДНК, а это значит, что лизирование клеточной стенки различных бактерий проходит успешно. При выявлении ДНК бактерий с 6 М гуанидинтиоционата Уриеаплазм и Гарднерелл, имеющих в своем физиологическом составе плотную клеточную стенку, наблюдаются тенденция к потере проб, так как Ст-флуоресцентный сигнал отсутствует. А с использованием 8 М гуанидинтиоционата в лизирующем буфере происходит 100% выявления ДНК бактерий из всех сухих образов мазков, соотносимых с выявлением их из жидких проб.

Результаты выявления РНК вирусов представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5 РНК выделяется из сухих образов с применением методики лизиса с инкубацией при 65°С в течение 10 минут с 8 М гуанидинтиоционата в лизирующем буфере. РНК вируса гепатита С при диагностике определяли из крови. Нами были проверены образцы сухой крови от нескольких пациентов с ранее поставленным диагнозом при этом РНК данного вируса было обнаружено у всех пациентов с вирусом этого возбудителя. Ст, представленные цифрами, описанными в таблице, показывают, что РНК вирус обнаруживается на ранних циклах, что говорит о хорошем процессе выделения РНК из сухих образов. Так же нами проверены носоглоточные смывы на обнаружения РНК коронавируса. Показатели Ст говорят о том, что РНК коронавируса выходит в тех же пределах, что и выделяемая ДНК из урогенитальных смывов.

Таким образом, заявленные способ и набор обеспечивают в полной мере повышение выхода нуклеиновых кислот - ДНК и РНК из сухих биологических образцов. Они просты в использовании и сокращают длительность проведения процедуры полноценного выделения нуклеиновых кислот, за счет высокой степени лизиса клеточных оболочек, освобождения от цельных эритроцитов и в конечном итоге позволяют получить целостный исследуемый образец, подходящий для диагностических исследований с высокой чувствительностью.

1. Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, включающий освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму осуществляют с помощью дистиллированной воды с рН 5,5-6,0, а лизис биообразца проводят раствором, содержащим в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к этой смеси 1 н HCl до рН 6,4 с последующей его инкубацией в течение 10 минут при температуре 65°C, а осаждение ДНК и РНК осуществляют раствором, содержащим изопропанол и С6Н10О5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятые в соотношении 40:0,5 соответственно.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение РНК и ДНК проводят одновременно.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму осуществляют путем добавления в него дистиллированной воды с рН 5,5-6,0 и периодического перемешивая на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что для осаждения бумажного носителя биообразец центрифугируют в течение 30 секунд при 10 тыс. об/мин.

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что для отмывки осадка используют раствор, содержащий в конечной концентрации 10 мМ ацетата аммония в 75% этаноле.

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что элюцию нуклеиновых кислот проводят с помощью буфера, содержащего в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0.

7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что лизирующий раствор обеспечивает полноценный лизис оболочечных и безоболочечных вирусов, а также всех видов бактерий, паразитов, микозов и повышает выход НК из бактерий, имеющих плотную клеточную оболочку.

8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что лизирующий раствор позволяет проводить полноценное выделение НК из крови, освобождая образец от цельных эритроцитов.

9. Набор для выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов путем освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, где набор содержит следующие компоненты:

1) раствор для освобождения биологического образца от носителя, содержащий дистиллированную воду с рН 5,5-6,0;

2) раствор для лизиса оболочек клеток, содержащий 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, 1 н HCl;

3) раствор для осаждения нуклеиновых кислот, содержащий гликоген формулой С6Н10О5 и изопропиловый спирт;

4) раствор для промывки биологического образца, содержащий ацетат аммония и 75% этанол;

5) буфер для элюции нуклеиновых кислот, содержащий трис HCl с рН 8,0 и EDTA с рН 8,0.



 

Похожие патенты:

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, включающий выделение внеклеточной ДНК (вкДНК) из образца крови, полученной у беременной женщины, выбор регионов генома для проведения амплификации, приготовление геномных библиотек, картирование полученных последовательностей на референсный геном или части генома человека с определением их координат, определение значения покрытия для каждого региона генома, характеризующегося открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%, и получение регионов генома с указанной открытостью хроматина, после чего делается вывод о наличии анеуплоидий плода.

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для диагностики наличия мутации L576P гена c-KIT в тканях меланомы. Оценку наличия мутации проводят по соотношениям значений пороговых циклов Ct в трех реакциях ПЦР в реальном времени с аллель-специфичными праймерами.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена тест-система для мультиплексного количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 на основе обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени, включающая специфические праймеры и соответствующие им флуоресцентные гидролизуемые зонды, а также отрицательный и положительные контрольные образцы.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Изобретение обеспечивает способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения биологической активности дефибротида. Приводят в контакт дефибротид, эуглобулин млекопитающего и субстрат, специфичный для плазмина, который в результате реакции с плазмином дает измеряемый продукт.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями, включающий детекцию точковых мутаций в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа и наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, соответственно.

Изобретение относится к области медицины, в частности к эндокринологии, и предназначено для прогнозирования эффективности терапии сахарного диабета 2 типа. Осуществляют забор периферической венозной крови и выделение ДНК.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и предназначено для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способы обнаружения патологии системы органов или органа у субъекта, способ идентификации соединения, пригодного для замедления прогрессирования или лечения патологии системы органов, и способ определения токсичности соединения или фактора окружающей среды для системы органов у субъекта.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ профилактики африканской чумы свиней, включающий выявление животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных. Остальных животных в очаге инфекционного заболевания африканской чумой свиней обследуют в течение суток методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Животных-носителей вируса и здоровых животных переводят в отдельные помещения и в их присутствии осуществляют санацию помещений озоно-воздушной смесью: в помещении с животными-носителями вируса - в течение месяца не менее 3-4 раз в неделю с концентрацией озона 4-6 г/м3 в течение 20-30 минут, в помещении со здоровыми животными - в течение не более двух недель 2-3 раза в неделю с концентрацией озона 3-4 г/м3 в течение 15-20 минут. Изобретение обеспечивает расширение функциональных возможностей способа профилактики африканской чумы свиней. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа диагностирования острого повреждения почек и применения in vitro набора, содержащего праймеры, необходимые для выполнения способа. Способ включает анализ образца, взятого у пациента, и определение уровня экспрессии по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-127, miR-126, miR-210 и miR-101, и сравнение упомянутого уровня экспрессии со значением контроля, где: (а) снижение уровня экспрессии сывороточной miR-127 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (б) повышение уровня экспрессии miR-127 в моче в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (в) снижение уровня экспрессии сывороточной miR-126 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (г) повышение уровня экспрессии сывороточной miR-210 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (д) снижение уровня экспрессии miR-210 в моче в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; или (е) повышение уровня экспрессии сывороточной miR-101 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 20 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Изобретение обеспечивает набор праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами. 4 ил., 4 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН). Выявляют патологию шейки матки. Определяют уровень экспрессии маркеров-предикторов с помощью вестерн-блот анализа с детекцией хемилюминисценции и ПЦР в реальном времени. При значениях уровней экспрессии HIF1alpha 0,029, GLUT1 782,9±156,5, IGFBP-3 0,038±0,0076, HK2 36,4, VDAC1 70 диагностируют ЦИН1 (LSIL). При значениях уровней экспрессии HIF1alpha 0,03, GLUT1 1154,2±88,7, IGFBP-3 0,02±0,005, HK2 44,9, VDAC1 87 диагностируют ЦИН2-3 (HSIL). Изобретение обеспечивает эффективную диагностику ЦИН на более ранних этапах. 5 ил., 1 табл., 3 пр.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу диагностики заболеваний, сопровождающихся повышенной гибелью клеток, и набору для его осуществления. Для осуществления указанного способа получают образец плазмы крови у человека, затем проводят изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот плазмы крови. Далее осуществляют очистку нуклеиновых кислот из реакционной смеси и проводят количественный анализ нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Определяют коэффициент К в пробах. Далее сравнивают коэффициент К с референсным значением и диагностируют заболевание, сопровождающееся повышенной гибелью клеток, при значении коэффициента К менее референсного значения. Настоящее изобретение позволяет проводить малоинвазивную диагностику заболеваний, сопровождающихся повышенной гибелью клеток, с высокой чувствительностью, на любых стадиях заболевания, в том числе на ранних стадиях, при которых клинические симптомы отсутствуют. 2 н. и 50 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метелирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР и способ идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР. Указанный способ включает формирование панели генов-онкомаркеров колоректального рака: ADHFE1, ALX4, CNRIP1, EID3, ELMO1, ESR1, FBN1, HLTF, LAMA1, NEUROG1, NGFR, RARB, RXRG, RYR2, SDC2, SEPT9, SFRP2, SOCS3, SOX17, THBD, TMEFF2, UCHL1 и VIM. Изобретение расширяет арсенал олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных праймеров. 2 н.п. ф-лы., 3 ил., 4 табл., 3 пр., 1 прил.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности гена fad-3c в растении канолы. Также раскрыт набор для осуществления указанного способа. Изобретение позволяет эффективно определять зиготность гена fad-3c в растении канолы. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, композицию для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, набор для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, который включает в себя композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом и реакционную пробирку, набор для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ обратной транскрипции РНК-матрицы, способ амплификации нуклеиновой кислоты, композицию ПЦР с обратной транскрипцией для диагностики злокачественного новообразования. Композиция для реакции обратной транскрипции содержит в своем составе ион Mg2+, четыре типа dNTP, обратную транскриптазу, пирофосфат и пирофосфатазу. Композиция для ПЦР помимо вышесказанного включает в себя ДНК-полимеразу. Изобретение расширяет арсенал средств, позволяющих проводить реакцию обратной транскрипции. 9 н. и 28 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл., 13 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках rs9652490 LINGO1 (A>G), rs11856808 LINGO1 (C>Т), rs10968280 LINGO2 (А>Т), rs7033345 LINGO2 (C>Т), rs1412229 LINGO2 (А>Т), rs10812774 LINGO2 (C>Т) и rs3794087 SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором. Предложенная группа изобретений обеспечивает высокую специфичность и сокращение сроков идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов за счет возможности в мультиплексном формате в одной постановке оценивать семь однонуклеотидных полиморфных маркеров. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 21 ил., 19 табл., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для стандартизации эффективности амплификации набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации перестроенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, полученном из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем каждый рецептор адаптивной иммунной системы содержит вариабельный участок и соединительный участок, причем композиция содержит: множество синтетических матричных олигонуклеотидов, причем каждый синтетический матричный олигонуклеотид имеет известную концентрацию до амплификации и олигонуклеотидную последовательность общей формулы: , причем: (а) V представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 20 и не более 1000 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей вариабельный (V) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый V содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка; (b) J представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 15 и не более 600 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей соединительный (J) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый J содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка; (с) U1 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) первой специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (d) U2 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) второй специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (e) присутствует по меньшей мере один из B1, В2, В3 и В4 и каждый из B1, В2, В3 и В4 содержит олигонуклеотид В, содержащий последовательность штрихкода из 3-25 последовательных нуклеотидов, которая уникальным образом идентифицирует в качестве спаренной комбинации, (i) уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка из (а) и (ii) уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка из (b); (f) R либо отсутствует, либо содержит сайт распознавания рестрикционного фермента, который содержит олигонуклеотидную последовательность, отсутствующую в (а)-(е); и причем: (g) множество синтетических матричных олигонуклеотидов содержит количество по меньшей мере а или по меньшей мере b уникальных олигонуклеотидных последовательностей в зависимости от того, какое значение больше, причем а представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, а b представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, и композиция содержит по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности V-участка и по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности J-участка. Также заявлен способ количественного определения множества перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или множество рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце. 2 н. и 25 з.п. ф-лы, 14 ил., 17 табл., 12 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-06-14 2017-08-29T11:55:07
Наверх