Trail r2-специфические мультимерные скаффолды

Настоящая группа объектов изобретения относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный мультимерный скаффолд на основе 3 домена FnIII тенасцина (Tn3), который специфически связывается с рецептором 2 TRAIL (TRAIL R2). Кроме того, рассмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мультимерный скаффолд; вектор экспрессии; клетка-хозяин и способ получения рекомбинантного мультимерного скаффолда. Также описаны: фармацевтическая композиция; способ профилактики, лечения или снижения симптомов рака; способ индуцирования апоптоза в клетке и способ изменения активности TRAIL R2-экспрессирующей клетки. Мультимерный скаффолд по настоящему изобретению обладает повышенной аффинностью относительно TRAIL R2, повышенной стабильностью и пониженной иммуногенностью. В этой связи настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии и диагностике заболеваний, связанных с TRAIL R2. 9 н. и 23 з.п. ф-лы, 25 табл., 28 ил., 22 пр.

 

Ссылка на список последовательностей

[0001] Данная заявка включает посредством ссылки список последовательностей, предоставляемый вместе с данной заявкой с помощью EFS-Web в виде текстового файла под названием «2943.011PC02_sequence_listing.txt», созданного 12 апреля 2011 г. и имеющего размер 211 кБайт.

Область техники

[0002] Данное изобретение в целом относится к области миметиков антитела, в частности, мультимерные скаффолд-белки, основанные на домене фибронектина типа III (Fn3) и используемые, например, для получения продуктов с новейшими характеристиками связывания. В частности, изобретение описывает TRAIL R2-специфические мультимерные скаффолды, полученные из третьего домена FnIII Тенасцина С человека, а также их использование для определения рецептора TRAIL R2 и модуляции TRAIL R2-опосредованной функции, такой как лечение рака и других нарушений.

Известный уровень техники

[0003] Биомолекулы, способные специфически связываться с требуемой мишенью - антигенной детерминантой, играют важную роль в качестве лекарственных препаратов, инструментов для исследования и медицинской диагностики. Хорошо известным примером данного класса биомолекул является антитело. Могут быть выбраны антитела, которые связываются специфическим образом с аффинностью по существу к любой структурной антигенной детерминанте. Однако классические антитела представлены структурными сложными гетеротетрамерными молекулами, которые сложно экспрессировать в простых эукариотических системах. В результате этого большинство антител получают с использованием сложной и дорогостоящей системы экспрессии клеток млекопитающих.

[0004] Белки, имеющие относительно определенные трехмерные структуры, обычно называют скаффолд-белками, которые могут использоваться в качестве реагентов для конструирования продуктов рекомбинации. Одной из специфических областей применения, в которой используют такие белки-скаффолды, является разработка миметиков антитела. Миметики антитела, т.е. небольшие, не являющиеся антителом белковые лекарственные вещества, используют преимущества антител и фрагментов антитела, такие как высокая аффинность связывания с мишенями и низкая иммуногенность и токсичность, что позволяет избежать некоторых недостатков, таких как тенденция фрагментов антитела образовывать агрегаты и быть менее стабильными в сравнении с IgG полной длины.

[0005] Такие недостатки могут быть объяснены использованием фрагментов антител, созданных путем удаления частей антител нативной конформации. Однако воздействие растворителем на аминокислотные остатки, которые в обычном случае погружены в гидрофобную среду, такую как поверхность взаимодействия между вариабельным и константным доменом, часто приводит к агрегации. Одним из примеров миметика антитела на основе скаффолда является миметик антитела, основанный на структуре модуля фибронектина типа III (FnIII), домена, который широко представлен среди белков таких типов и классов, как белки крови млекопитающих и структурные белки.

[0006] TRAIL (ФНО-зависимый апоптоз-индуцирующий лиганд, также указываемый в литературе как Apo2L и TNFSF10) принадлежит к суперсемейству факторов некроза опухолей (ФНО) и был идентифицирован как активатор программируемой смерти клеток, или апоптоза, в опухолевых клетках. Как связанная с мембраной, так и растворимая форма TRAIL способна запускать апоптоз посредством взаимодействия с рецепторами TRAIL, расположенными на клетках-мишенях. У людей было идентифицировано пять рецепторов, обладающих способность связываться с TRAIL. После связывания TRAIL с TRAIL R1 или TRAIL R2, запускается каспаза-обусловленная гибель клеток. Относительно такой апоптозной активности клеток, изучаются способы лечения, основанные на TRAIL. Было разработано несколько терапевтических подходов, основанных на TRAIL или TRAIL R1 или R2 агонистических антителах человека, однако TRAIL имеет очень короткое время жизни, и связывается с рецептором-приманкой, а большой размер антител может ограничить их проникновение в опухоль. В соответствии с этим существует необходимость в создании новых молекул, которые могут связываться с рецепторами TRAIL, фармацевтических композиций, включающих такие молекулы, способов скрининга таких молекул и способов использования таких молекул в терапевтическом лечении целого ряда видов рака.

[0007] Цитирование или обсуждение представленной ссылки не должно толковаться как разрешение к раскрытию информации в данной заявке.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Изобретение описывает TRAIL R2-специфический рекомбинантный мультимерный скаффолд-белок, включающий два мономера-скаффолда Tn3, при этом (а) каждый мономер-скаффолд Tn3 включает семь бета-цепей, обозначаемых А, В, С, D, Е, F и G, и шесть участков-петель, обозначаемых АВ, ВС, CD, DE, EF и FG, (б) мономеры-скаффолды Tn3 соединены тандемно, и (в) рекомбинантный мультимерный скаффолд специфически связывается с TRAIL R2. В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфический рекомбинантный мультимерный скаффолд-белок включает 3, 4, 5, 6, 7 или 8 мономеров-скаффолдов. В некоторых других вариантах воплощения изобретения все мономеры-скаффолды Tn3 в TRAIL R2-специфическом мультимерном скаффолд-белке по изобретению представлены в тандеме.

[0009] В некоторых вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, один мономер-скаффолд Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка присоединен непосредственным образом, посредством линкера или гетерологичной молекулы к 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 другим мономерам-скаффолдам Tn3. В определенных вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, два мономера-скаффолда Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка присоединены непосредственным образом без линкера, расположенного между мономерами-скаффолдами Tn3. В некоторых вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, два мономера-скаффолда Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка присоединены посредством линкера. В некоторых вариантах воплощения изобретения линкер включает пептидный линкер. В некоторых вариантах воплощения изобретения пептидный линкер представлен гибким пептидным линкером. В некоторых вариантах воплощения изобретения пептидный линкер включает последовательность (G_xS)_y, при этом x и y являются целыми числами, x=1, 2, 3 или 4, и y=1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

[0010] В некоторых вариантах воплощения изобретения связывание TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка по изобретению с TRAIL R2 улучшено в сравнении с TRAIL R2-специфическим мономером-скаффолдом Tn3. В некоторых вариантах воплощения изобретения связывание TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка с TRAIL R2 улучшает действие мишени в сравнении с TRAIL R2-специфическим мономером-скаффолдом Tn3.

[0011] В некоторых вариантах воплощения изобретения улучшенное связывание TRAIL R2-специфического скаффолд-белка по изобретению с TRAIL R2 в сравнении с TRAIL R2-специфическим мономером-скаффолдом Tn3 представлено улучшением аффинности связывания и/или улучшением в авидности связывания. В других вариантах воплощения изобретения аффинность связывания TRAIL R2 и стабильность белка улучшены в сравнении с TRAIL R2-специфическим мономером-скаффолдом Tn3. В некоторых вариантах воплощения изобретения авидность связывания TRAIL R2 и стабильность белка улучшены в сравнении с TRAIL R2-специфическим мономером-скаффолдом Tn3.

[0012] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный белок-скаффолд включает линкер, состоящий из функциональной молекулы. В некоторых вариантах воплощения изобретения функциональная молекула представлена иммуноглобулином или его фрагментом. В определенных вариантах воплощения изобретения иммуноглобулин или его фрагмент выбирают из группы, состоящей из: фрагмента Fab, фрагмента Fab’, фрагмента Fd, фрагмента Fd’, фрагмента Fv, фрагмента dAb, фрагмента F(ab’)2, scFv, диатела, линейного антитела, антитела полной длины, участка Fc и комбинации из двух или более указанных молекул. В определенных вариантах воплощения изобретения иммуноглобулин или его фрагмент включает домен Fc и шарнирный участок IgG. В других вариантах воплощения изобретения иммуноглобулин или его фрагмент включает домен СН1. В некоторых вариантах воплощения изобретения иммуноглобулин или его фрагмент включает домен Ckappa или домен Clambda IgG.

[0013] В некоторых вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, один мономер-скаффолд Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка соединен с гетерологичной молекулой. В некоторых вариантах воплощения изобретения, гетерологичная молекула включает композицию, выбираемую и группы, состоящей из: белка, пептида, белкового домена, линкера, лекарства, токсина, цитотоксического агента, агента для визуализации, радионуклида, радиоактивного соединения, органического полимера, неорганического полимера, полиэтиленгликоля (ПЭГ), биотина, человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), связующего участка FcRn ЧСА, антитела, домена антитела, фрагмента антитела, одноцепочечного антитела, домена антитела, альбумин-связующего домена, фермента, лиганда, рецептора, связующего пептида, скаффолда, не принадлежащего FnIII, тэга антигенной детерминанты, рекомбинантного полипетпидного полимера, цитокина и комбинации из двух или более указанных молекул.

[0014] В некоторых специфических вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд-белок конъюгирован с ПЭГ. В других вариантах воплощения изобретения более двух мономеров-скаффолдов Tn3 присоединены линкерами, при этом, по меньшей мере, один линкер структурно и/или функционально отличается от других линкеров.

[0015] В некоторых вариантах воплощения изобретения мономеры-скаффолды Tn3 в TRAIL R2-специфическом мультимерном скаффолде присоединены в разветвленном виде. В других вариантах воплощения изобретения некоторые мономеры-скаффолды Tn3 в TRAIL R2-специфическом мультимерном скаффолде по изобретению присоединены линейным тандемным образом и некоторые мономерные скаффолды Tn3 присоединены в разветвленном виде. В некоторых вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, два мономера-скаффолда Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка идентичны. В других вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, два мономера-скаффолда Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка разные.

[0016] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению связывается, по меньшей мере, с дополнительной мишенью, которая может быть представлена Т-клеточным антигеном. В некоторых вариантах воплощения изобретения такой Т-клеточный антиген представлен CD40L.

[0017] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению представлен агонистом рецептора. В некоторых вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, два мономера-скаффолда Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка по изобретению связываются с одной и той же самой антигенной детерминантой на TRAIL R2. В других вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, два мономера-скаффолда Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка по изобретению связываются с разными антигенными детерминантами на TRAIL R2. В некоторых вариантах воплощения изобретения разные антигенные детерминанты TRAIL R2 представлены неперекрывающимися антигенными детерминантами. В других вариантах воплощения изобретения разные антигенные детерминанты TRAIL R2 представлены перекрывающимися антигенными детерминантами.

[0018] В некоторых вариантах воплощения изобретения бета-цепи, по меньшей мере, двух мономеров-скаффолдов Tn3 в TRAIL R2-специфическом мультимерном скаффолде по изобретению имеют последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности бета-цепей SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, два мономера-скаффолда Tn3 TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолд-белка по изобретению включают следующую аминокислотную последовательность:

IEV(X_AB)nALITW(X_BC)_nCELX₁YGI(X_CD)_nTTIX₂L(X_DE)_nYSI(X_EF)_nYEVSLIC(X_FG)_nKX₃TFTT

при этом X_AB, X_BC, X_CD, X_DE, X_EF и X_FG представляют аминокислотные остатки, присутствующие в петлях АВ, ВС, CD, DE, EF и FG, соответственно, при этом X₁ представляет аминокислотный остаток А или Т, при этом X₂ представляет аминокислотный остаток D или G, при этом Х₃ представляет аминокислоту Е или G, и при этом длина петли n представлена целым числом между 2 и 26. В некоторых вариантах воплощения изобретения петля АВ включает последовательность SEQ ID NO: 35, петля CD включает последовательность SEQ ID NO: 37, и петля EF включает последовательность SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах воплощения изобретения петля ВС включает последовательность, выбираемую из группы, включающей SEQ ID NO: 97, 98 или 168. В некоторых вариантах воплощения изобретения петля DE включает последовательность, выбираемую из группы, включающей SEQ ID NO; 102, 103 и 179. В некоторых вариантах воплощения изобретения петля FG включает последовательность, выбираемую из группы, включающей SEQ ID NO: 106, 108, 109, 169 и 170. В некоторых вариантах воплощения изобретения петля ВС включает последовательность SEQ ID NO: 97, петля DE включает последовательность SEQ ID NO: 179, и петля FG включает последовательность SEQ ID NO: 170. В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению включает последовательность SEQ ID NO: 209 или 204.

[0019] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению связывается с рецептором TRAIL R2 с аффинностью (K_d) 1 мкМ или менее. В другом варианте воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению связывается с рецептором TRAIL R2 с аффинностью (K_d) 500 нМ или менее. В еще одном варианте воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению связывается с рецептором TRAIL R2 с аффинностью (K_d) 100 нМ или менее.

[0020] Изобретение также описывает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей любые описанные выше мультимерные скаффолды. В некоторых вариантах воплощения изобретения вектор экспрессии включает нуклеиновую кислоту. В других вариантах воплощения изобретения клетка-хозяин может включать вектор.

[0021] Изобретение также описывает способ получения TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолда по изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина в условиях, при которых экспрессируется мультимерный скаффолд, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты. Изобретение также описывает композицию, включающую рекомбинантный TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе. Изобретение также описывает способ предотвращения, лечения, уменьшения степени тяжести или ведения рака у нуждающегося в этом пациента путем введения эффективного количества композиции, включающей TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению. В некоторых вариантах воплощения изобретения рак выбирают из рака легкого, неходжкинской лимфомы, рака яичника, рака толстого кишечника, колоректального рака, рака поджелудочной железы и множественной миеломы.

[0022] Изобретение также описывает способ диагностики или визуализации заболевания у пациента с использованием композиции, включающей TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению. Также описан способ индуцирования апоптоза в клетке, экспрессирующей TRAIL R2, и такой способ включает контакт клетки с TRAIL R2-специфическим мультимерным скаффолдом по изобретению. В некоторых вариантах воплощения изобретения способ предотвращения, лечения, уменьшения степени тяжести или ведения рака у нуждающегося в этом пациента дополнительно включает вспомогательную терапию, при этом указанная терапия представлена иммунотерапией, терапией биопрепаратами, химиотерапией, лучевой терапией или терапией низкомолекулярными препаратами.

[0023] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специцический мультимерный скаффолд специфически связывается с TRAIL R2 человека. В некоторых специфических вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд по изобретению связывается с TRAIL R2 и (а) оказывает агонистическое действие на рецептор TRAIL R2, (б) имитирует связывание TRAIL с рецептором TRAIL R2, (в) облегчает димеризацию или олигомеризацию рецептора TRAIL R2, (г) индуцирует апоптоз, (д) снижает или ингибирует жизнеспособность клеток, или (е) имеет комбинацию действия (а), (б), (в), (г) и (д).

[0024] В других вариантах воплощения изобретения описан способ изменения активности клетки, экспрессирующей TRAIL R2, включающий контакт клетки с TRAIL R2-специфическим мультимерным скаффолдом по любому из пп.1-47 формулы изобретения, при этом мультимерный скаффолд связывается с TRAIL R2 и (а) оказывает агонистическое действие на рецептор TRAIL R2, (б) имитирует связывание TRAIL с рецептором TRAIL R2, (в) облегчает димеризацию или олигомеризацию рецептора TRAIL R2, (г) индуцирует апоптоз, (д) снижает или ингибирует жизнеспособность клеток, или (е) имеет комбинацию действия (а), (б), (в), (г) и (д).

[0025] В некоторых специфических вариантах воплощения изобретения ПЭГ конъюгирован с TRAIL R2-специфическим мультимерным скаффолдом по изобретению на N-конце или С-конце.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0026] В целях иллюстрации изобретения, определенные варианты воплощения изобретения представлены в виде графических материалов. Однако изобретение не ограничено конкретными механизмами и способами для вариантов воплощения изобретения, указанными в графических материалах.

[0027] ФИГ.1 отображает линейный, антителоподобный формат и формат в виде слияния мультивалентных скаффолдов Tn3. Мультивалентные скаффолды Tn3 содержат два или более модулей Tn3, присоединенных спейсером (указано черным восьмиугольником), при этом спейсер может быть представлен, например, линкером.

[0028] ФИГ.2 отображает TRAIL R2-специфические мультивалентные скаффолды Tn3, обозначаемые от А2 до А9, при этом такие скаффолды были получены в соответствии с тремя различными молекулярными форматами, указанными на ФИГ.1 с валентностью (номер модулей Tn3), варьирующими от 2 до 8.

[0029] ФИГ.3 отображает анализ электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в невосстанавливающихся условиях (SDS-PAGE) сырой бактериальной среды (гель с правой стороны) и очищенных образцов с надлежащей аффинностью (гель слева) в соответствии с линейными тандемными векторами, обозначаемыми А1-А5, при этом их валентность варьирует от 1 до 8 и они экспрессируются E.coli.

[0030] ФИГ.4 отображает конкурентный ИФА, измеряющий связывание одновалентных (А1) и поливалентных (А2, A3) скаффолдов Tn3 с TRAIL R2.

[0031] ФИГ.5 отображает гистограмму анализа проточной цитометрии TRAIL R2-специфического поливалентного скаффолда А9, связывающегося с клетками Н2122, в сравнении с когнатным контрольным скаффолдом (В9), который не связывается с TRAIL R2.

[0032] ФИГ.6А отображает влияние валентности на специфическую гибель клеток линии Н2122, экспрессирующих TRAIL R2, под действием поливалентных скаффолдов.

[0033] ФИГ.6В отображает специфичность гибели опухолевых клеток Н2122 под действием TRAIL R2-специфических поливалентных скаффолдов.

[0034] ФИГ.7А отображает влияние молекулярной формы на гибель клеток Н2122 под действием TRAIL R2-специфических поливалентных скаффолдов, включающих 4 модуля Tn3.

[0035] ФИГ.7В отображает влияние молекулярной формы на гибель клеток Н2122 под действием TRAIL R2-специфических поливалентных скаффолдов, включающих 8 модулей Tn3.

[0036] ФИГ.8А отображает специфическую гибель клеток линии колоректальной аденокарциномы Colo205, экспрессирующих TRAIL R2, под действием линейно слитых тетра-(АЗ) и восьмивалентных (А5) TRAIL R2-специфических скаффолдов Tn3.

[0037] ФИГ.8В отображает специфическую гибель лейкемических клеток линии Jurkat, экспрессирующих TRAIL R2, под действием линейно слитых тетра-(АЗ) и восьмивалентных (А5) TRAIL R2-специфических скаффолдов Tn3.

[0038] ФИГ.9А отображает схему мышиных CD40L-специфических тандемных двухвалентных скаффолдов Tn3 (векторы М13).

[0039] ФИГ.9В представляет анализ SDS-PAGE очищенного одновалентного вектора М13 (CD40L-специфический вектор Tn3) или тандемных двухвалентных скаффолдов с линкерами, содержащими 1, 3, 5 или 7 единиц Гли₄Сер (обозначается как GS), соединяющих два модуля М13. Одновалентный вектор М13 был проанализирован и указан в полосе 2, вектор С1 в полосах 3 и 7, вектор С2 в полосах 4 и 8, вектор С3 в полосах 5 и 9, и вектор С4 в полосах 6 и 10. Образцы были проанализированы в невосстанавливающихся (полосы 2-6) или восстанавливающихся условиях (полосы 7-10).

[0040] ФИГ.9С отображает конкурентное ингибирование связывания MuCD40L с рецептором CD40 мыши, иммобилизированном на биосенсорном чипе с использованием MuCD40L-специфических одновалентных (М13) или двухвалентных тандемных скаффолдов. Указана половина максимальной ингибирующей концентрации (ИК₅₀) для разных векторов.

[0041] ФИГ.9D отображает ингибирующее воздействие MuCD40L-специфического одновалентного (М13) Tn3, двухвалентных тандемных скаффолдов или антитела MR1 (антитело к MuCD40L) на В-клетки, экспрессирующие MuCD40L, под воздействием CD86.

[0042] ФИГ.10 отображает уровни экспрессии растворимых одновалентных и TRAIL R2/CD40L-биспецифических тандемных двухвалентных векторов скаффолдов Tn3, которые были рекомбинантным образом экспрессированы в Е.coli; анализ проведен с использованием SDS-PAGE в бактериальной питательной среде. Одновалентные скаффолды А1 и 79 представлены на полосах 2 и 3, соответственно. Векторы тандемных скаффолдов, включающие А1 и 79, соединены в тандеме аминокислотным линкером Гли₄Сер с увеличенной длиной (когнатный относительно векторов С5, С6, С7 и С8) и представлены в полосах 4-7. Экспрессируемые векторы указаны на окрашенном геле звездочкой.

[0043] ФИГ.11А отображает связывание биспецифических скаффолдов Tn3 с TRAIL R2, как это оценено с использованием ИФА с захватом.

[0044] ФИГ.11В отображает связывание биспецифических скаффолдов Tn3 с CD40L человека, как это оценено с использованием ИФА с захватом.

[0045] ФИГ.12 отображает одновременное связывание биспецифических тандемных скаффолдов Tn3 С5, С6, С7 и С8 с TRAIL R2 и CD40L, как это оценено с использованием анализа AlphaScreen™.

[0046] ФИГ.13 отображает стабильность скаффолдов Tn3 в присутствии гуанидин-HCl. Указано C_m (значение медиана) для каждого исследуемого скаффолда.

[0047] ФИГ.14 отображает термостабильность трех разных скаффолдов Tn3 с разными последовательностями петель, но петлей FG одинаковой длины (девять аминокислот) в сравнении с исходным скаффолдом Tn3 с более длинной петлей FG, как это проанализировано с использованием дифференциально сканирующей калориметрии (ДСК).

[0048] ФИГ.15 отображает повышение стабильности в присутствии гуанидин-HCl скаффолдов Tn3 с петлей FG с девятью аминокислотами (Р1С01, А6 и 71) в сравнении с исходным скаффолдом Tn3 (WT).

[0049] ФИГ.16А отображает схему и экспрессию триспецифического/трехвалентного скаффолда Tn3. Скаффолд D1-1E11-79 включает домен связывания Synagis* (D1), за которым следует TRAIL R2-Fc связующий домен (1Е11) и С-терминальный домен Tn3, специфический относительно CD40L (79) человека. Гибкий линкер (Гли₄Сер)₃ разделяет каждый домен.

[0050] ФИГ.16В отображает гель SDS-PAGE (4-12% Бис-Трис) экспрессированного и очищенного скаффолда D1-1E11-79. Ожидаемый молекулярный вес такого вектора составляет примерно 34081 Дальтон.

[0051] ФИГ.17А отображает одновременное связывание триспецифического/трехвалентного скаффолда Tn3 D1-1E11-79 с huCD40L и TRAIL R2-Fc с использованием анализа связывания AlphaScreen. Сигнал AlphaScreen (ASS) указан как функция концентрации TrailR2-Fc.

[0052] ФИГ.17В отображает одновременное связывание триспецифического/трехвалентного скаффолда Tn3 D1-1E11-79 с huCD40L и Synagis' с использованием анализа связывания AlphaScreen. Сигнал AlphaScreen (ASS) указан как функция концентрации Synagis.

[0053] ФИГ.18 отображает одновременное связывание триспецифического/трехвалентного скаффолда Tn3 D1-1E11-79 с TRAIL R2-Fc и Synagis® с использованием ИФА.

[0054] ФИГ.19 отображает выравнивание последовательностей исходного связующего клона TRAIL R2 1С12 и аффинность его зрелых производных. Положение рекомбинантной дисульфидной связи выделено, стрелкой указано расположение одной мутации в шарнирном участке, а изменения в петлях, которые возникают во время созревания аффинности, представлены в выделенных блоках А, В, С и D.

[0055] ФИГ.20 отображает анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo клона 1С12 и его производных с созревшей аффинностью.

[0056] ФИГ.21 отображает концентрации тандемов G6 как функцию времени в мышиной сыворотке.

[0057] ФИГ.22А отображает выравнивание последовательностей в соответствии с рекомбинантным повышением цино-перекрестной реакционной способности для клона F4. Общей чертой для всех этих клонов является мутация двух аминокислот от D к G перед петлей DE.

[0058] ФИГ.22В отображает измерения ИФА ингибирования связывания планшетов с TRAIL R2-Fc человека или яванского макака с F4mod1 под действием мономера F4 или F4mod1.

[0059] ФИГ.23А отображает выравнивание последовательностей в соответствии с гуманизированием клона F4mod1, в частности сравнение F4, F4mod1 и F4mod12 с гуманизированным TN3.

[0060] ФИГ.23В отображает измерения ИФА ингибирования связывания планшетов с TRAIL R2-Fc человека или яванского макака с F4mod1 под действием мономера F4, F4mod1 или F4mod12.

[0061] ФИГ.23С отображает анализ гибели клеток Colo205, сравнивающий тандем G6 6 с тандемом 6 F4mod12.

[0062] ФИГ.23D отображает анализ гибели клеток Colo205, сравнивающий тандем G6 8 с тандемом 8 F4mod12.

[0063] ФИГ.24 отображает анализ гибели клеток НТ29, сравнивающий активность тандема 8 G6 с тандемом 8 F4mod12 в TRAIL-резистентной линии клеток НТ29.

[0064] ФИГ.25 отображает выравнивание последовательностей в соответствии с клонами, исследуемыми в ходе анализов иммуногенности Antitope EpiScreen. Подчеркнуты различия относительно клона F4mod12.

[0065] ФИГ.26А отображает следы SEC очищенного и не являющегося SEC тандема 8 G6.

[0066] ФИГ.26В отображает следы SEC очищенного SEC тандема 8 G6.

[0067] ФИГ.27 отображает изменения в объеме опухоли в моделях ксенотрансплантата колоректального рака Colo205 в ответ на разные дозы агонистов Tn3 TRAIL R2 тандема 6 G6 и тандема 8 G6.

[0068] ФИГ.28 отображает изменения в массе тела в моделях ксенотрансплантата колоректального рака Colo205 в ответ на разные дозы агонистов Tn3 TRAIL R2 тандема 6 G6 и тандема 8 G6.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0069] Перед подробным описанием данного изобретения, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается специфическими композициями или этапами процесса, которые могут варьировать. Следует отметить, что, как это используется в данной заявке и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают и формы множественного числа, если контекст четко не указывает иное. Термины единственного числа, а также термины «один или несколько» и «по меньшей мере, один» могут использоваться взаимозаменяемым образом.

[0070] Кроме того, слова «и/или» при использовании в тексте данной заявки должны рассматриваться в качестве специфического описания каждой из двух указанных особенностей или компонентов с или без другой особенности или композиции. Следовательно, термин «и/или» при использовании в такой фразе, как «А и/или В» обозначает включение «А и В», «А или В» «А» (только) и «В» (только). Подобным образом, термин «и/или» при использовании в такой фразе, как «А, В и/или С» обозначает включение каждого из следующих вариантов воплощения изобретения: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (только); В (только); и С (только).

[0071] Если иное не определено, все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же самое значение, что и используемое обычно значение специалистом в области науки, к которой принадлежит изобретение. Например, The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; и The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press содержат словарь с множеством терминов, используемых в данном изобретении в помощь специалисту.

[0072] Единицы, префиксы и символы указаны в формате, принятом в международной системе единиц (СИ). Числовые диапазоны включают числа, определяющие интервал. Если иное не указано, аминокислотные последовательности пишутся слева направо в направлении от амино- до карбоксильного конца. Представленные здесь названия не являются ограничивающими различные аспекты или варианты воплощения изобретения, однако они могут использоваться как справочные для данной заявки в целом. В соответствии с этим, представленные ниже термины более полно определены в соответствии со своей спецификацией в полном объеме.

[0073] Следует понимать, что при описании в тексте данной заявки вариантов воплощения изобретения с термином «включать», также подразумеваются и другие аналогичные варианты воплощения изобретения в понятиях «состоять из» и/или «состоять по существу из».

[0074] Аминокислоты указаны в тексте данной заявки в виде широко используемого трехбуквенного обозначения или в виде одной буквы, как это рекомендовано Комитетом по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Подобным образом, нуклеотиды указаны в виде однобуквенных общепринятых кодов.

[0075] В контексте данного изобретения термин «антигенная детерминанта» обозначает белковую детерминанту, способную связываться со скаффолдом по изобретению. Антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или Сахаров, и обычно обладают тремя специфическими пространственными структурными характеристиками, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные или неконформационные антигенные детерминанты отличаются тем, что в отличие от некоформационных, связывание конформационные детерминант отсутствует при наличии денатурирующих растворителей.

[0076] Термины «домен фибронектина III типа (FnIII)» и «домен FnIII» обозначают полипептиды, гомологичные домену фибронектина человека III типа, имеющему, по меньшей мере, 7 бета-цепей, которые распределены между бета-складчатыми слоями, при этом такие слои группируются вокруг друг друга с образованием кора белка, и дополнительно содержат подвергаемые действию растворителя петли, соединяющие бета-цепи друг с другом. Существует, по меньшей мере, три такие петли на каждом конце сендвича бета-складчатого слоя, при этом конец является границей белка перпендикулярно направлению бета-цепей. В определенных вариантах воплощения изобретения домен FnIII включает 7 бета-цепей, обозначаемых А, В, С, D, Е, F и G, присоединенных к шести петлевым участкам, обозначенным АВ, ВС, CD, DE, EF и FG, при этом петлевой участок присоединяется к каждой бета-цепи.

[0077] Термин «ДНК» обозначает последовательность двух или более ковалентно присоединенных, встречающихся в природе или модифицированных дезоксирибонуклеотидов.

[0078] Термин «белок слияния» обозначает белок, который включает (i) один или более скаффолдов по изобретению, присоединенных к (ii) второму, другому белку (т.е. «гетерологичному» белку).

[0079] Термин «гетерологичная молекула» в контексте данного изобретения обозначает добавление композиции к скаффолду по изобретению, при этом композиция не является естественном образом частью домена FnIII. Типичные гетерологичные молекулы включают белки, пептиды, домены белков, линкеры, препараты, токсины, агенты визуализации, радиоактивные соединения, органические и неорганические полимеры, а также любые другие композиции, которые могут обеспечить активность, не свойственную домену FnIII, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), цитотоксический агент, радионуклид, агент визуализации, биотин, домен димеризации (например, домен лейциновой молнии), человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) или связующий участок FcRn, домен или фрагмент антитела (например, вариабельный домен антитела, домен СН1, домен Ckappa, домен Clambda, домен СН2 или домен СН3), одноцепочечное антитело, доменное антитело, белоксвязующий домен, молекулу IgG, фермент, лиганд, рецептор, связующий пептид, FnIII, не являющийся скаффолдом, тег антигенной детерминанты, рекомбинантный полипептидный полимер, цитокин и т.п.

[0080] В контексте данного изобретения термин «линкер» обозначает любую молекулярную структуру, которая соединяет или объединяет два или более скаффолдов. Линкер может быть представлен молекулой, чья функция состоит в действии в качестве «спейсера» между модулями в скаффолде, или он также может быть представлен молекулой с дополнительной функцией (т.е. «функциональной молекулой»). Молекула, включенная в определение «гетерологичной молекулы», также может функционировать как линкер.

[0100] Термины «присоединенный» и «слитый» используют взаимозаменяемым образом. Эти термины относятся к соединению вместе двух или более скаффолдов, гетерологичных молекул или линкеров любыми способами, включая химическую конъюгацию или рекомбинацию.

[0101] Термины «мультимер», «мультимерный скаффолд» и «поливалентный скаффолд» обозначают молекулу, которая включает, по меньшей мере, два объединенных скаффолда FnIII. Скаффолды, образующие мультимерный скаффолд, могут быть присоединены посредством линкера, что обеспечивает независимое функционирование каждого скаффолда. Термины «мультимерный» и «поливалентный» в тексте данной заявки могут использоваться взаимозаменяемым образом. Поливалентный скаффолд может быть моноспецифическим или биспецифическим.

[0102] Термины «домен» или «белковый домен» обозначают участок белка, который может скручиваться в стабильную трехмерную структуру, часто независимо от остальной части белка, и который выполняет определенную функцию. Такая структура несет специфическую функцию, связанную с функцией домена в оригинальном белке, например, ферментативную активность, создание мотива распознавания для другой молекулы или обеспечение необходимыми структурными компонентами для белка для его существования в отдельной среде белков. В рамках семейства белков и суперсемейств родственных белков домены белков могут быть представлены эволюционно консервативными участками. При описании компонента мультимерного скаффолда термины «домен», «мономерный скаффолд» и «модуль» могут использоваться взаимозаменяемым образом. Термин «нативный домен FnIII» обозначает любой не рекомбинантный домен FnIII, который кодируется живым организмом.

[0103] Термины «белковая последовательность» или «аминокислотная последовательность» обозначают линейное представление аминокислотных составляющих в полипептиде в направлении от амино- к карбоксильному концу таким образом, что остатки, расположенные по соседству, являются смежными в первичной структуре полипептида.

[0104] Термин «нуклеиновая кислота» обозначает любые два или более ковалентно присоединенных нуклеотида или аналога нуклеотидов, или производных. В контексте данного изобретения этот термин включает, без ограничения, ДНК, РНК и ПНК. Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются в тексте данной заявки взаимозаменяемым образом.

[0105] Термин «полинуклеотид» охватывает отдельную нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот, и обозначает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, например, матричную РНК (мРНК) или плазмидную ДНК (пДНК). Термин «выделенная» нуклеиновая кислота или полинуклеотид обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была выделена из своей естественной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий, например, скаффолд по изобретению, содержащийся в векторе, считается выделенным в целях данного изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или по существу) полинуклеотиды в растворе. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro транскрипты РНК полинуклеотидов по данному изобретению. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты по данному изобретению дополнительно включают молекулы, полученные в ходе синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может быть представлена или может включать контролирующий элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции.

[0106] Термин «фармацевтически приемлемый» относится к соединению или белку, который может вводиться животному (например, млекопитающему) без существенных нежелательных медицинских последствий.

[0107] Термин «физиологически приемлемый носитель» обозначает носитель, который не оказывает значимого губительного воздействия на подвергнутого лечению хозяина и который сохраняет терапевтические свойства соединения, с которым его вводят. Одним типичным физиологически приемлемым носителем является физиологический раствор. Другие физиологически приемлемые носители и их композиции известны специалисту в данной области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, (18^th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (включено в данный документ посредством ссылки).

[0108] Термин «полипептид» обозначает любую последовательность из двух и более аминокислот, которые линейно присоединены амидными связями (пептидными связями) независимо от длины, посттрансляционной модификации или функции. Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в тексте данной заявки взаимозаменяемым образом. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды или олигопептиды включены в определение «полипептид», и термин «полипептид» может использоваться вместо или взаимозаменяемым образом с любым из таких терминов. Термин «полипептид» также обозначает продукты модификаций после экспрессии полипептида, включая, без ограничения, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию с использованием известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление или модификацию не встречающихся в природе аминокислот. Полипептид может быть получен из естественного биологического источника или с использованием рекомбинации, при этом необязательно он должен быть получен в результате трансляции из отдельной последовательности аминокислот. Полипептид может быть получен любым способом, включая химический синтез.

[0109] Также в данном изобретении в качестве полипептидов рассматриваются фрагменты, производные, аналоги или варианты указанных выше полипептидов и любая их комбинация. Варианты могут быть встречающимися в природе и не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены с использованием известных в науке способов мутагенеза. Варианты полипептидов могут включать замены, делеции или вставки консервативных или неконсервативных аминокислот. В качестве «производных» также включены такие пептиды, которые содержат одну или более производных встречающейся в природе аминокислоты из двадцати стандартных аминокислот.

[ОНО] Термин «рандомизированный» или «мутированный» обозначает включение одного или более изменения в аминокислотах, включая делецию, замену или вставку, относительно эталонной последовательности. Под «рандомизацией» или «мутацией» понимают процесс введения в последовательность подобного изменения в аминокислотах. Рандомизация или мутация может сопровождаться преднамеренным, слепым или спонтанным изменением в последовательности, как правило, в кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, и может возникнуть с использованием любого способа, например, ПЦР, ПЦР пониженной точности или химического синтеза ДНК. Термины «рандомизация», «рандомизированный», «мутация», «мутированный» и т.п. в тексте данной заявки используют взаимозаменяемым образом.

[0111] Термин «когнатный» или «когнатный, не мутированный белок» обозначает белок с последовательностью, идентичной последовательности вариантного белка, за исключением мутаций в аминокислотах, введенных в вариантный белок, при этом такой вариантный белок рандомизирован или мутирован.

[0112] Термин «РНК» обозначает последовательность из двух или более ковалентно присоединенных, встречающихся в природе или модифицированных рибонуклеотидов. Одним из примеров модифицированной РНК, включенной в данный термин, является фосфоротиоатная РНК.

[0113] Термины «скаффолд по изобретению» или «скаффолды по изобретению» в контексте данного изобретения обозначают мультимерные скаффолды, а также мономерные скаффолды FnIII. Термин «мишень» обозначает соединение, распознаваемое специфическим скаффолдом по изобретению. Типичные мишени включают белки, полисахариды, полинуклеотиды и небольшие молекулы. Термины «мишень» и «антиген» в тексте данной заявки используют взаимозаменяемым образом. Термин «специфичность» в контексте данного изобретения, например, в понятии «специфическое связывание» или «специфически связывать» относится к относительной аффинности, с которой скаффолд по изобретению связывается с одним или более связующимися доменами антигена, и такое связывание влечет за собой определенную комплементарность между одним или более антигенсвязующими доменами и одним или более антигенами. Согласно данному определению, говорится, что скаффолд по изобретению «специфически связывается» с антигенной детерминантой, если он связывается с данной антигенной детерминантой с большей легкостью, как если он связывался со случайной, неродственной антигенной детерминантой.

[0114] Термин «аффинность» в контексте данного изобретения обозначает меру силы связывания определенного скаффолда по изобретению с отдельной антигенной детерминантой.

[0115] Термин «авидность» в контексте данного изобретения обозначает общую стабильность комплекса между популяцией скаффолдов по изобретению и определенной антигенной детерминантой, т.е. это функционально скомбинированная сила связывания множества скаффолдов с антигеном. Авидность относится как к аффинности отдельных антигенсвязующих доменов со специфическими антигенными детерминантами, так и к валентности скаффолда по изобретению.

[0116] Термин «действие на мишень» обозначает связывание мультимерного скаффолда по изобретению с одной или более мишенями и биологические эффекты в результате такого связывания. В этом отношении множественные антигенсвязующие единицы в мультимерном скаффолде могут взаимодействовать с различными мишенями и/или антигенными детерминантами и, например, приближать физически две мишени, запускать каскады метаболизма посредством взаимодействия с отдельными мишенями и т.д. Относительно TRAIL R2, термин «действие на мишень» обозначает эффект, достигнутый, например, путем усиления, стимуляции или активации одного или более биологических действий TRAIL R2.

[0117] Термин «валентность» в контексте данного изобретения обозначает ряд потенциальных антигенсвязующих модулей, например, ряд модулей FnIII в скаффолде по изобретению. Если скаффолд по изобретению включает более одного антигенсвязующего модуля, каждый связующий модуль может специфически связываться, например, с одной и той же антигенной детерминантой или разными антигенными детерминантами, в одной и той же мишени или в нескольких мишенях.

[0118] Термин «дисульфидная связь» в контексте данного изобретения включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Цистеин аминокислоты включает тиоловую группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиоловой группой.

[0119] Термины «модуль Tn3» и «скаффолд Tn3» в контексте данного изобретения обозначает скаффолд FnIII, при этом А бета-цепь включает SEQ ID NO: 42, В бета-цепь включает SEQ ID NO: 43, С бета-цепь включает SEQ ID NO: 45 или 131, D бета-цепь включает SEQ ID NO: 46, E бета-цепь включает SEQ ID NO: 47, F бета-цепь включает SEQ ID NO: 49, и бета-цепь G включает SEQ ID NO: 52, при этом, по меньшей мере, одна петля представлена не встречающимся в природе вариантом в петлях «скаффолда Tn3 дикого типа». В определенных вариантах воплощения изобретения одна или более бета-цепей модуля Tn3 включает, по меньшей мере, замену одной аминокислоты, за исключением того, что остатки цистеина в С бета-цепи (например, цистеин в SEQ ID NO: 45 или 131) или F бета-цепи (SEQ ID NO: 49) не замещены.

[0120] Термин «скаффолд Tn3 дикого типа» в контексте данного изобретения обозначает скаффолд FnIII, включающий SEQ ID NO: 1, т.е. рекомбинантный скаффолд FnIII, полученный из 3^го FnIII тенасцина С человека.

[0121] Термин «иммуноглоублин» и «антитело» включает различные широкие классы полипептидов, которые могут быть различены биохимически. Специалист в данной области должен знать, что тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон. Природа такой цепи определяет «класс» антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgG или IgE, соответственно. Модифицированные версии каждого из таких классов должны быть известны специалисту в данной области. В контексте данного изобретения термин «антитело» включает, но не ограничивается этим, интактное антитело, модифицированное антитело, антитело VL или домен VL, домен СН1, домен Ckappa, домен Clambda, домен Fc (см. выше), домен СН2 или СН3.

[0122] В контексте данного изобретения термин «модифицированное антитело» включает синтетические формы антител, которые в измененном виде не встречаются в природе, например, антитела, включающие, по меньшей мере, два участка тяжелых цепей, а не две полных тяжелых цепи (например, антитела с удаленными доменами или минитела); мультиспецифические формы антител (например, биспецифические, триспецифические и т.д.) изменены таким образом, чтобы связываться с двумя или более антигенами или с различными антигенными детерминантами одного антигена). Кроме того, термин «модифицированное антитело» включает поливалентные формы антител (например, трехвалентные, тетравалентные и т.д. антитела, связывающиеся с тремя или более копиями одного и того же антигена). (См., например, Antibody Engineering, Kontermann & Dubel, eds., 2010, Springer Protocols, Springer)

[0123] Термин «период полужизни in vivo» используют в его общепринятом значении, т.е. это время, в течение которого 50% биологической активности полипептида все еще присутствует в организме/органе-мишени, или время, в течение которого активность полипептида составляет 50% от ее исходной величины. В качестве альтернативы для определения функционального периода полужизни in vivo, может использоваться термин «период полужизни в сыворотке», т.е. это время, на момент которого 50% полипептидных молекул циркулирует в плазме или кровотоке перед выведением. Определение периода полужизни в сыворотке часто проще, чем определение функционального периода полужизни in vivo и диапазон значений периода полужизни в сыворотке является обычно хорошим индикатором диапазона значений функционального периода полужизни in vivo. Альтернативные термины периода полужизни в сыворотке включают период полужизни в плазме, период полужизни в кровотоке, период полужизни циркулирующего вещества, сывороточный клиренс, плазменный клиренс и период полувыведения. Функциональность, которую следует сохранить, обычно выбирают на основе прокоагулянтной, протеолитической активности, связывания ко-фактора, связывания рецептора или другого типа биологической активности, связанной с отдельным белком.

[0124] Термин «повышенный» относительно функционального периода полужизни in vivo или периода полужизни в плазме используют для указания того, что релевантный период полужизни полипептида статистически значимым образом повышен в сравнении с таковым значением эталонной молекулы (например, немодифицированного полипептида), как это определено в условиях сравнения.

[0125] Термин «экспрессия» в контексте данного изобретения обозначает процесс, с помощью которого ген вырабатывает биохимическое соединение, например, скаффолд по изобретению или его фрагмент. Процесс включает любое проявление функционального присутствия гена в клетке, включая, без ограничения, нокдаун генов, а также временную экспрессию и стабильную экспрессию. Это включает, без ограничения, транскрипцию гена в одну или более мРНК, а также трансляцию таких мРНК в один или более полипептидов. Если необходимый конечный продукт должен быть получен биохимическим способом, экспрессия включает создание такого биохимически полученного продукта и любых предшественников.

[0126] «Продукт экспрессии» может быть представлен нуклеиновой кислотой, например, матричной РНК, полученной в ходе транскрипции гена, или полипептидом. Описанные здесь продукты экспрессии дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например, полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами, протеолитическим расщеплением и т.п.

[0127] Термин «вектор» или «вектор экспрессии» в контексте данного изобретения обозначает векторы, используемые в соответствии с данным изобретением в качестве носителя для введения и экспрессии необходимого продукта экспрессии в клетке-хозяине. Как это известно специалисту в данной области, такие векторы могут быть легко выбраны из группы, включающей плазмиды, фаги, вирусы и ретровирусы. В целом, векторы, совместимые с данным изобретением, будут включать маркер селекции, подходящие сайты транскрипции для облегчения клонирования требуемой нуклеиновой кислоты и способности введения и/или репликации в эукариотических или прокариотических клетках.

[0128] Термин «клетки-хозяева» обозначает клетки, несущие векторы, построенные с использованием способов рекомбинации ДНК и кодирующие, по меньшей мере, один продукт экспрессии. В описаниях процессов для выделения продуктов экспрессии из рекомбинантных хозяев термин «клетка» и «культура клеток» используют взаимозаменяемым образом для обозначения источника продукта экспрессии, если четким образом не указано иное, т.е. восстановление продукта экспрессии из "клеток" обозначает восстановление при гибели всех клеток или восстановление из культуры клеток, содержащей промежуточные и суспендированные клетки.

[0129] Термины «лечить» или «лечение» в контексте данного изобретения обозначает терапевтическое лечение и профилактические или превентивные меры, при этом объект подвергается профилактике или у него замедляют (снижают) нежелательное физиологическое изменение или нарушение, такое как прогрессирование воспалительного заболевания или состояния. Преимущественные или необходимые клинические результаты включают, но не ограничиваются этим, ослабление симптомов, снижение степени распространения заболевания, стабилизация (т.е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, замедление или задержка прогрессирования заболевания, снижение степени тяжести или временное ослабление состояния заболевания, а также ремиссия (частичная или общая), определяемая или неопределяемая.

[0130] Термин «лечение» также обозначает продолжительную выживаемость в сравнении с ожидаемым показателем выживаемости при отсутствии лечения. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают субъекты с уже имеющимся состоянием или расстройством, а также субъекты, склонные к наличию такого состояния или расстройства, или субъекты, у которых такое состояние или расстройство должно быть предотвращено.

[0131] Термины «субъект», «индивидуум», «животное», «пациент» или «млекопитающее» обозначают любого индивидуума, пациента или животного, в частности, субъекта-млекопитающего, для которого желательно проведение диагностики, прогноза или лечения. Субъекты-млекопитающие включают человека, домашних животных, животных, используемых в фермерстве, а также зоопарке, спорте, или таких домашних животных, как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, мелкий рогатый скот, коровы и т.д.

[0132] Термин «рецептор TRAIL» в контексте данного изобретения обозначает белок, который связывается с TRAIL и, после связывания TRAIL, активирует программируемую гибель клеток (апоптоз) в опухолевых клетках. Неограничивающий пример рецептора TRAIL включает рецептор TRAIL-R2.

[0133] Термины «TRAIL R2» или «рецептор TRAIL R2» в тексте данной заявки используются взаимозаменяемым образом и обозначают последовательность рецептора TRAIL полной длины и растворимые, внеклеточные доменные формы рецептора, описанные в Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), патенты США No.6072047 и 6342369: публикации РСТ No.WO 98/51793, WO 98/41629, WO 98/35986, WO 99/02653, WO 99/09165, WO 98/46643 и WO 99/11791; Screaton et al., Curr. Biol, 7: 693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16: 5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17: 141-143 (1997). Репрезентативные последовательности рецептора TRAIL полной длины могут быть получены в GenBank, номера доступа ААС51778.1 и 014763.2.

[0134] Термин «агонист рецептора TRAIL» или «агонист» используют в самом широком своем смысле и включает любую молекулу, которая частично или полностью повышает, стимулирует или активирует одно или более биологических действий TRAIL R2, а также биологически активные варианты in vitro, in situ или in vivo. Примеры таких биологических действий включают апоптоз, а также другие примеры, указанные в литературе. Агонист может функционировать прямым или непрямым образом. Например, агонист рецептора TRAIL может функционировать для частичного или полного повышения, стимуляции или активации одного или более биологических действий одного или более рецепторов TRAIL R2, или одного или более рецепторов TRAIL R2 и других мишеней in vivo, in vitro или in situ, как результат связывания с TRAIL R2, что вызывает активацию рецептора или передачу сигнала.

[0135] Термин «TRAIL» или «полипептид TRAIL» обозначает лиганд, который связывается с одним или более рецепторами TRAIL, включая TRAIL R2, а также его биологически активными фрагментами. Репрезентативные последовательности TRAIL могут быть получены в GenBank, номера доступа ААН32722.1 и Р50591.1. Фрагменты включают, но не ограничиваясь этим, последовательности, состоящие от примерно 5 до примерно 50 аминокислотных остатков, или от примерно 5 до примерно 25, или от примерно 10 до 20 остатков, или от примерно 12 до примерно 20 аминокислотных остатков полипептидной последовательности TRAIL. В некоторых случаях пептид TRAIL состоит из не более чем 25 аминокислотных остатков (например, 25, 23, 21, 19, 17, 15 или менее аминокислотных остатков).

[0136] Термины «апоптоз» или «апоптозная активность» используются в широком своем смысле и обозначают конечную или контролируемую форму гибели клеток у мелкопитающих, которая обычно сопровождается одним или характерными изменениями в клетках, включая конденсацию цитоплазмы, потерю микроворсинок плазматической мембраной, сегментацию ядра, деградацию распада ДНК или потерю митохондриями своей функции. Такая активность может быть определена и измерена с использованием хорошо известных в науке способов, например, с использованием анализов жизнеспособности клеток, анализа FACS или электрофореза ДНК, анализа связывания аннексина V, фрагментации ДНК, сжатия клетки, расширения эндоплазматического ретикулума, фрагментации клетки и/или образования мембранных везикул (апоптозных тел).

Введение

[0137] Белок TRAIL-R2 кодируется членом суперсемейства генов рецептора ФНО и содержит внутриклеточный домен смерти. В некоторых случаях он также может быть известен под названием TNFRSF10B; CD262, DR5, KILLER, KILLER/ORS, TRAILR2, TRICK2, TRICK2A, TRICK2B, TRICKB или ZTNFR9. Этот рецептор может быть активирован лигандом, индуцирующим апоптоз, обусловленный фактором некроза опухолей (TNFSF 10/TRAIL/APO-2L), и передать апоптозный сигнал. Кроме того, апоптоз, индуцированный TRAIL-R2, вовлекает каспазы и внутриклеточную адаптер-молекулу FADD/MORT1 (Walczak et al. EMBOJ, (1997), 16, 5386- 97).

[0138] Несмотря на то, что TRAIL R2 экспрессируют несколько типов здоровых клеток, передача сигнала апоптоза посредством такого рецептора ограничена преимущественно опухолевыми клетками, которые становятся более восприимчивыми к апоптозу, опосредованному рецептором смерти в контексте своей трансформации под действием онкогенов, таким как Myc или Ras (Wang et al., Cancer Cell 5:501-12 (2004); Nesterov et al., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). TRAIL-R2 часто экспрессируется линиями раковых клеток человека, а также клетками первичных опухолей.

[0139] Данное изобретение описывает семейство рекомбинантных, не встречающихся в природе скаффолд-белков, способных связываться с TRAIL R2. В частности, описанные здесь белки могут использоваться для отображения необходимых петель, которые аналогичны гипервариабельным участкам («CDR») вариабельного участка антитела. Эти петли могут подвергаться рандомизации или ограниченной эволюции для получения разнообразных вариантов, способных связываться с множеством соединений-мишеней. Белки могут быть собраны в мультиспецифические скаффолды, способные связываться с TRAIL R2 и различными мишенями.

[0140] В специфических вариантах воплощения изобретение описывает TRAIL-R2-специфические связующие агенты, которые используют для профилактики, снижения степени тяжести, определения, диагностики или мониторинга заболеваний, таких как (но не ограничиваясь этим) рак. В других специфических вариантах воплощения изобретения TRAIL-R2-специфические связующие скаффолды по изобретению используют для лечения видов рака, при которых раковые клетки экспрессируют TRAIL-R2. В некоторых вариантах воплощения изобретения рак может включать, но не ограничиваясь этим, рак легкого, неходжкинскую лимфому, рак яичника, рак толстого кишечника, колоректальный рак, рак поджелудочной железы и множественную миелому. Изобретение также описывает способы использования скаффолдов для снижения популяции клеток. В одном варианте воплощения изобретения способы по изобретению используют для снижения количества клеток следующих типов: эозинофилы, базофилы, нейтрофилы, Т-клетки, В-клетки, тучные клетки, моноциты и опухолевые клетки.

[0141] Скаффолды по изобретению представлены мультимерными скаффолдами, включающими мономерные скаффолды, полученные из третьего домена FnIII тенасцина С человека, в котором, по меньшей мере, одна не встречающаяся в природе внутримолекулярная дисульфидная связь была введена путем рекомбинации. Скаффолды Tn3, которые составляют мультимерные скаффолды по изобретению, скручиваются правильным образом независимо друг от друга, сохраняют свою специфичность связывания и аффинность, и каждый из мономерных скаффолдов сохраняет свои функциональные свойства. Если скаффолды Tn3, которые составляют мультимерные скаффолды по изобретению, собраны в высоковалентные мультимерные скаффолды, например, гексавалентные или октавалентные скаффолды, мономерные скаффолды правильным образом скручиваются независимо друг от друга, сохраняя свою специфичность связывания и аффинность, и каждый мономерный скаффолд сохраняет свои функциональные свойства.

[0142] Мультимерные скаффолды Tn3, включая высоковалентные скаффолды (например, гексавалентные или октавалентные), скручиваются правильным образом, даже если топология вектора не линейная, например, если мономерные Tn3 или мультимерные Tn3 скаффолды собраны в комплексную разветвленную структуру (например, векторы слияния Fc или антителоподобные векторы).

[0143] Нативные домены FnIII, такие как 10^й домен FnIII фибронектина человека, и большой ряд встречающихся в природе доменов FnIII не содержат дисульфидных связей или несвязанных цистеинов. Если мультидоменные белки получают путем введения множественных остатков цистеина, часто отмечается недостаточная экспрессия белка, осаждение полученных белков или выработка нефункциональных белков. Такие губительные эффекты вызваны неправильным образованием внутримолекулярного интрадомена и/или междоменных дисульфидных связей, и/или неправильным образованием межмолекулярных дисульфидных связей, что приводит к неправильному скручиванию белка. Такие эффекты обычно интенсифицируются, если количество цистеинов и/или белковых доменов повышено.

[0144] Например, линейный мультимерный скаффолд, включающий 8 скаффолдов Tn3 дикого типа (SEQ ID NO: 1), будет содержать 16 цистеинов в аминокислотной последовательности отдельного полипептида. В другом типичном варианте воплощения изобретения антителоподобный вектор, включающий 4 модуля Tn3, при этом два модуля Tn3 присоединены к тяжелым цепям IgG и два Tn3 присоединены к легким цепям IgG, будет включать 8 цистеинов, распределенных по 4 разным полипептидным цепям. Мультимерные скаффолды по данному изобретению, такие как скаффолды, содержащие 4, 6 или 8 линейных модулей Tn3, включающие такое количество цистеинов, с подобной структурной сложностью будут скручены надлежащим образом и будут характеризоваться повышенной стабильностью и свойством связывания с мишенью при сравнении с соответствующими мономерами.

[0145] Если скаффолды Tn3, включающие один или более рекомбинантных дисульфидных мостиков, собраны в высоковалентные мультимерные форматы, каждый индивидуальный мономерный скаффолд скручивается надлежащим образом, сохраняя свою специфичность связывания и аффинность, а также функциональные свойства. Кроме того, мономерные скаффолды способны образовывать стабильные, функциональные и скрученные надлежащим образом мультимерные скаффолды.

[0146] Преимущество мультимерных скаффолдов по изобретению заключается в их способности связываться с множественными антигенными детерминантами, например, (i) связываться с множественными антигенными детерминантами на одной мишени, (ii) связываться с одной антигенной детерминантной на множественных мишенях, (iii) связываться с множественными антигенными детерминантами, расположенными на разных субъединицах мишени, или (iv) связываться с множественными антигенными детерминантами на нескольких мишенях, увеличивая, тем самым, авидность.

[0147] Кроме того, благодаря гибкости мультимерных скаффолдов и возможности варьирования расстояния между множественными мономерами Tn3 посредством линкеров, мультимерные скаффолды Tn3 способны связываться с множественными молекулами-мишенями на поверхности (этой же клетки/поверхности или различных клеток/поверхностей).

[0148] В результате своей способности связываться одновременно с более чем одной мишенью, мультимерные скаффолды по изобретению могут использоваться для модуляции множественных путей, образовывать перекрестные связи с рецепторами на поверхности клеток, связывать рецепторы клеточной поверхности на отдельных клетках и/или связывать молекулы-мишени или клетки в субстрате.

[0149] Основываясь на проведенном ранее анализе последовательности доменов FnIII, отмечались большие вариации в петлях ВС и FG, что позволяет предположить, что такие петли не являются критически важными в стабильности (см., например, публикацию РСТ No: WO 2009/058379). Данное изобретение описывает скаффолды Tn3 с улучшенной стабильностью, с варьирующей аминокислотной последовательностью, при этом петля FG имеет более короткую длину в сравнении с соответствующей длиной петли FG в третьем FnIII тенасцина С человека. Отмечалось, что укорочение петель FG приводит к образованию мутированного скаффолда Tn3, обладающего повышенной стабильностью. Вследствие этого, другой аспект данного изобретения описывает варианты скаффолда Tn3 дикого типа (SEQ ID NO: 1) с повышенной белковой стабильностью.

[0150] В определенных вариантах воплощения изобретения мономерный скаффолд Tn3 по изобретению включает петлю FG с 9 аминокислотами и обладает повышенной стабильностью в сравнении со скаффолдом, включающим нативный третий домен FnIII тенасцина С человека, в котором петля FG имеет в длину 10 аминокислот. Кроме того, данное изобретение описывает библиотеки различных скаффолдов Tn3 с указанными длинами петель FG, которые используют для выделения скаффолдов Tn3 с повышенной стабильностью.

[0151] Кроме того, данное изобретение описывает мультиспецифические скаффолды, которые могут связываться с TRAIL R2 и одной или более дополнительными мишенями, скаффолды с созревшей аффинностью, при этом аффинность скаффолда для отдельной мишени модулируется посредством мутации, и иммуногенность и/или перекрестная реакционная способность скаффолдов у видов животных модулируется посредством мутации. Кроме того, изобретение описывает способы получения скаффолдов по изобретению, а также способы рекомбинации скаффолдов с требуемыми физико-химическими, фармакологическими или иммунологическими свойствами. Более того, данное изобретение описывает использование таких скаффолдов и способов для терапевтического, профилактического и диагностического использования.

Структурный мотив FnIII

[0152] Скаффолды Tn3 по данному изобретению основаны на структуре модуля фибронектина типа III (FnIII), домена, который представлен широким образом во всех трех доменах живых организмов и вирусов, в также в множестве классов белков.

[0153]

[0154] В специфических вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению получают из третьего домена FnIII тенасцина С человека (SEQ ID NO: 4). В одном специфическом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают модуль Tn3. Общее трехмерное скручивание такого домена тесно связано с наименьшим функциональным фрагментом антитела, вариабельным участком тяжелой цепи (VH), который в однодоменных антителах верблюдов и верблюдовых (например, лам) включает полную единицу распознавания антигена.

[0155] Мономерные скаффолды Tn3 по изобретению и нативный домен FnIII из тенасцина С характеризуются одинаковой трехмерной структурой, а именно структурой бета-сендвича с тремя бета-цепями (А, В и Е) на одной стороне и четырьмя бета-цепями (С, D, F и G) на другой стороне, соединенными шестью петлевыми участками. Такие петлевые участки обозначают в соответствии с бета-цепями, соединенными с N- и С- концами каждой петли. В соответствии с этим, петля АВ располагается между бета-цепями А и В, петля ВС располагается между цепями В и С, петля CD расположена между бета-цепями С и D, петля DE расположена между бета-цепями D и Е, петля EF расположена между бета-цепями Е и F, и петля FG расположена между бета-цепями F и G. Домены FnIII обладают растворимой краевой петлей s, толерантной к рандомизации, что облегчает получение различных пулов белковых скаффолдов, способных связываться со специфическими мишенями с высокой аффинностью.

[0156] В одном аспекте изобретения домены Tn3 используют в качестве скаффолдов, которые подвергаются направленной эволюции, разработанной для рандомизации одной или более петель, аналогичных гипервариабельным участкам (CDR) вариабельного домена антитела. Такой способ направленной эволюции приводит к получению антителоподобных молекул с высокой аффинностью к интересующим мишеням, например, TRAIL R2. Кроме того, в некоторых вариантах воплощения изобретения, описанные здесь скаффолды могут использоваться для отображения определенных краевых петель (например, петель, которые были ранее рандомизированы и выбраны на основе связывания мишени) для направления эволюции молекул, связывающимися с такими введенными петлями. Такой вид селекции может проводиться для идентификации распознаваемых молекул для любой отдельной и подобной CDR петли, или, с другой стороны, для распознавания двух или всех трех CDR-подобных петель, скомбинированных в нелинейную связующую антигенную детерминанту.

[0157] Скаффолды по изобретению и молекулы на основе третьего домена FnIII тенасцина С человека с его структурным мотивом описаны в публикации РСТ No: WO 2009/058379. Набор из трех петель (обозначенные как ВС, DE и FG), которые могут обладать специфическим связыванием с мишенью, располагаются между цепями В и С; цепями D и Е и цепями F и G, соответственно. Петли ВС, DE и FG и третий домен FnIII тенасцина С человека имеют в длину 9, 6 и 10 аминокислотных остатков, соответственно. Длина таких петель варьирует в узком диапазоне когнатных антигенраспознающих петель, находящихся в тяжелых цепях антитела, составляя 7-10, 4-8 и 4-28 аминокислот в длину, соответственно. Подобным образом, второй набор петель АВ, CD и EF (7, 7 и 8 аминокислот в длину, соответственно) располагается между цепями А и В; цепями С и D; и цепями Е и F, соответственно.

[0158] После рандомизации и селекции на предмет высокоаффинного связывания с мишенью, петли в домене Tn3 могут контактировать с мишенями, эквивалентно контакту когнатных петель CDR в антителах. В соответствии с этим, в некоторых вариантах воплощения изобретения петли АВ, CD и EF рандомизированы и выбраны на предмет высокоаффинного связывания с одной или более мишенями, например, TRAIL R2. В некоторых вариантах воплощения изобретения такая рандомизация и процесс селекции может проводиться параллельно рандомизации петель ВС, DE и FG, в то время как в других вариантах воплощения изобретения такая рандомизация и процесс селекции выполняется серийно.

Мономерные скаффолды по изобретению

[0159] Изобретение описывает рекомбинантные, не встречающиеся в природе скаффолды FnIII, включающие множество доменов бета-цепей, присоединенных к множеству петлевых участков, при этом один или более указанных петлевых участков варьирует по делеции, замене или вставке, по меньшей мере, одной аминокислоты из когнатных петель в Tn3 дикого типа (SEQ ID NO: 1).

[0160] Для получения улучшенных модулей Tn3 с новейшими характеристиками связывания, Tn3 подвергают проведению замен, добавлений или делеции аминокислот. Следует понимать, что при сравнении последовательности улучшенного скаффолда с последовательностью Tn3, используют одно и то же определение бета-цепей и петель. Улучшенные скаффолды Tn3 могут быть получены с использованием третьего домена FnIII тенасцина С человека, скаффолда Tn3 дикого типа или ранее улучшенного скаффолда Tn3. В некоторых вариантах воплощения изобретения мономерные скаффолды по изобретению включают аминокислотную последовательность:

IEV(X_AB)_nALITW(X_BC)_nCELX₁YGI(X_CD)_nTTIDL(X_DE)_nYSI(X_EF)_nYEVSLIC(X_FG)_nKETFTT, при этом X_AB, X_BC, X_CD, X_DE, X_EF и X_FG представляют аминокислотные остатки в петлях АВ, ВС, CD, DE, EF и FG, соответственно, и X₁ представляет аминокислотный остаток А или Т, и n=2-26.

[0161] В одном варианте воплощения изобретения X_AB состоит из SEQ ID NO: 35. В одном варианте воплощения изобретения X_BC состоит из SEQ ID NO: 36. В одном варианте воплощения изобретения X_CD состоит из SEQ ID NO: 37. В одном варианте воплощения изобретения X_DE состоит из SEQ ID NO: 38. В одном варианте воплощения изобретения X_EF состоит из SEQ ID NO: 39. В одном варианте воплощения изобретения X_FG состоит из SEQ ID NO: 40.

[0162] В одном варианте воплощения изобретения X_AB включает SEQ ID NO: 35. В одном варианте воплощения изобретения X_BC включает SEQ ID NO: 36. В одном варианте воплощения изобретения X_CD включает SEQ ID NO: 37. В одном варианте воплощения изобретения X_DE включает SEQ ID NO: 38. В одном варианте воплощения изобретения X_EF включает SEQ ID NO: 39. В одном варианте воплощения изобретения X_FG включает SEQ ID NO: 40.

[0163] В определенных вариантах воплощения изобретения X_AB состоит из SEQ ID NO: 35, X_CD состоит из SEQ ID NO: 37, и X_EF состоит из SEQ ID NO: 39. В одном варианте воплощения изобретения X_BC состоит из SEQ ID NO: 36, X_DE состоит из SEQ ID NO: 38, и X_FG состоит из SEQ ID NO: 40.

[0164] В определенных вариантах воплощения изобретения X_AB включает SEQ ID NO: 35, X_CD включает SEQ ID NO: 37, и X_EF включает SEQ ID NO: 39. В одном варианте воплощения изобретения X_BC включает SEQ ID NO: 36, X_DE включает SEQ ID NO: 38, и X_FG включает SEQ ID NO: 40.

[0165] В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают модуль Tn3. В еще других вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают модуль Tn3 (SEQ ID NO: 1), при этом бета-цепь С третьего домена FnIII тенасцина С человека (SEQ ID NO: 4) замещена вариантом бета-цепи С (SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 131), включающем N-терминальный цистеин, и при этом бета-цепь F третьего FnIII домена тенасцина С человека (SEQ ID NO: 48) замещена вариантом бета-цепи F (SEQ ID NO: 49), включающем С-терминальный цистеин. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают модуль Tn3, при этом одна или более бета цепей включают, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, за исключением того, что остатки цистеина в С и F бета цепях (SEQ ID NO: 45 или 131; и SEQ ID NO: 49, соответственно) могут быть не замещены.

[0166] Петли, соединяющие различные бета цепи скаффолдов по изобретению, могут быть рандомизированы на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению имеют, по меньшей мере, одну петлю, рандомизированную на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В одном варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или, по меньшей мере, шесть петель скаффолда рандомизированы на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В одном варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна петля скаффолдов по изобретению сохраняется константной, в то время как, по меньшей мере, одна дополнительная петля рандомизирована на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В другом варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две или все три петли АВ, CD и EF сохраняются константными, в то время как, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две или все три петли ВС, DE и FG рандомизированы на предмет длины или разнообразия последовательности. В другом варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две или, по меньшей мере, все три петли АВ, CD и EF рандомизированные, в то время как, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две или все три петли ВС, DE и FG рандомизированы на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В еще одном варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две, по меньшей мере, все три петли, по меньшей мере, 4, по меньшей мере, пять или, по меньшей мере, все шесть петель АВ, CD, EF, ВС, DE и FG рандомизированы на предмет длины или разнообразия последовательности.

[0167] В некоторых вариантах воплощения изобретения один или более остатков в петли сохраняются константными, в то время как другие остатки рандомизированы на предмер длины и/или разнообразия последовательности. В некоторых вариантах воплощения изобретения один или более остатков в петли являются предварительно определенными и содержат ограниченное количество различных аминокислот, в то время как другие остатки рандомизированы на предмер длины и/или разнообразия последовательности. В соответствии с этим, скаффолды по изобретению могут включать одну или более петель, имеющих дегенеративную консенсусную последовательность и/или один или более инвариантных аминокислотных остатков. В одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю АВ, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: K-X-X-X-X-X-a, при этом Х представляет собой аспарагин, аспарагиновую кислоту, гистидин, тирозин, изолейцин, валин, лейцин, фенилаланин, треонин, аланин, пролин или серии, и при этом (а) представляет собой серин, треонин, аланин или глицин. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю АВ, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: K-X-X-X-X-X-X-X-a, при этом Х представляет собой аспарагин, аспарагиновую кислоту, гистидин, тирозин, изолейцин, валин, лейцин, фенилаланин, треонин, аланин, пролин или серин, и при этом (а) представляет собой серин, треонин, аланин или глицин.

[0168] В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю ВС, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: S-X-a-X-b-X-X-X-G, при этом Х представляет собой любую аминокислоту, (а) представляет собой пролин или аланин, и (b) представляет собой аланин или глицин. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю ВС, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G, при этом Х представляет собой любую аминокислоту и (с) представляет собой пролин, серин или глицин. В еще одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю ВС, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: A-d-P-X-X-X-e-f-X-1-X-G, при этом Х представляет собой любую аминокислоту, (d) представляет собой пролин, глутамат или лизин, (е) представляет собой аспарагин или глицин и (f) представляет собой серин или глицин.

[0169] В одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю CD, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: X_n, при этом Х представляет собой любую аминокислоту и n=6, 7, 8, 9 или 10. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю CD, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: X_n, при этом Х представляет собой аспарагин, аспарагиновую кислоту, гистидин, тирозин, изолейцин, валин, лейцин, фенилаланин, треонин, аланин, пролин или серии, и при этом n=7, 8 или 9.

[0170] В одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю DE, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: Х-Х-Х-Х-Х-Х, при этом Х представляет собой любую аминокислоту.

[0171] В одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю EF, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: X-b-L-X-P-X-c-X, при этом Х представляет собой аспарагин, аспарагиновую кислоту, гистидин, тирозин, изолейцин, валин, лейцин, фенилаланин, треонин, аланин, пролин или серин, (b) представляет собой аспарагин, лизин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или глицин, и при этом (с) представляет собой изолейцин, треонин, серин, валин, аланин или глицин.

[0172] В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю FG, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: X-a-X-X-G-X-X-X-b, при этом Х представляет собой любую аминокислоту, (а) представляет собой аспарагин, треонин или лизин, и (b) представляет собой серин или аланин. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю FG, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: Х-Х-Х-Х-Х-Х-Х-Х-Х (Х₉), при этом Х представляет собой любую аминокислоту. В еще одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю FG, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: X-a-X-X-X-X-b-N-P-A, при этом Х представляет собой любую аминокислоту, (а) представляет собой аспарагин, треонин или лизин, и (b) представляет собой серин или глицин. В специфическом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю FG, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A, при этом Х представляет собой любую аминокислоту и (а) представляет собой аспарагин, треонин или лизин.

[0173] В определенных вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают петлю FG, которая, по меньшей мере, на один аминокислотный остаток короче, чем когнатная петля FG третьего домена FnIII тенасцина С человека, и дополнительно рандомизирована в одном или более положениях.

[0174] В специфических вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, одна петля ВС, DE и FG рандомизирована, при этом А бета цепь включает SEQ ID NO: 41 или 42, В бета цепь включает SEQ ID NO: 43, С бета цепь включает SEQ ID NO: 44, D бета цепь включает SEQ ID NO: 46, Е бета цепь включает SEQ ID NO: 47, F бета цепь включает SEQ ID NO: 48, 49, 50 или 51, и G бета цепь включает SEQ ID NO: 52 или 53, АВ петля включает SEQ ID NO: 35, CD петля включает SEQ ID NO: 37 и EF петля включает SEQ ID NO: 39.

[0175] В других специфических вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, одна петля АВ, CD и EF рандомизирована, при этом А бета цепь включает SEQ ID NO: 41 или 42, В бета цепь включает SEQ ID NO: 43, С бета цепь включает SEQ ID NO: 44 или 45, D бета цепь включает SEQ ID NO: 46, Е бета цепь включает SEQ ID NO: 47, F бета цепь включает SEQ ID NO: 48, 49, 50 или 51, и G бета цепь включает SEQ ID NO: 52 или 53, ВС петля включает SEQ ID NO: 36, DE петля включает SEQ ID NO: 38 и FG петля включает SEQ ID NO: 40.

Повышенная стабильность скаффолда

Не встречающиеся в природе дисульфидные связи

[0176] Стабильность скаффолдов Tn3 по изобретению может быть повышена с использованием многих различных способов. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению могут быть стабилизированы путем продления N- и/или С-терминальных участков. N- и/или С-терминальные участки могут быть продлены на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более 10 аминокислот. В других вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению могут быть стабилизированы путем введения изменения, которое повышает период полужизни в сыворотке, как это описано в тексте данной заявки. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению включают вставку, делецию или замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка для стабилизации гидрофобного ядра скаффолда.

[0177] Скаффолды по изобретению Tn3 могут быть эффективно стабилизированы с использованием рекомбинантных и не встречающихся в природе дисульфидных связей. Такие рекомбинантные скаффолды могут быть эффективно экспрессированы как часть мультимерных скаффолдов. Правильное образование дисульфидных связей и правильное скручивание рекомбинантного скаффолда может быть проконтролировано по сохранению биологической активности скаффолда. Тот факт, то рекомбинантный скаффолд, включающий не встречающиеся в природе дисульфидные связи, может связываться одновременно, по меньшей мере, с двумя мишенями (см., например, Пример 8) или тремя мишенями (см., например, Пример 12), указывает на то, что трехмерная структура скаффолда незначительно изменена рекомбинантными дисульфидными связями и что относительные положения мишеньсвязывающих петель сохранены. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают не встречающиеся в природе дисульфидные связи, как это описано в публикации РСТ No: WO 2009/058379. Биоинформатический способ может использоваться для идентификации кандидатных положений, подходящих для введения рекомбинантных дисульфидных связей.

[0178] В одном варианте воплощения изобретения мономерный скаффолд Tn3 по изобретению включает, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, или, по меньшей мере, пять не встречающихся в природе интрамолекулярных дисульфидных связей. В специфическом варианте воплощения изобретения описан способ получения скаффолда Tn3 с повышенной стабильностью в сравнении с третьим доменом FnIII тенасцина С человека, включающего две, три, четыре или более рекомбинантных интрамолекулярных дисульфидных связей.

[0179] В одном варианте воплощения изобретения мономерный скаффолд Tn3 по изобретению включает, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе интрамолекулярную дисульфидную связь, при этом указанная, по меньшей мере, одна не встречающаяся в природе дисульфидная связь стабилизирует мономерный скаффолд.

[0180] В другом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе дисульфидную связь, при этом указанная связь расположена между двумя отличными мономерными скаффолдами в одном и том же мультимерном скаффолде. В еще одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе дисульфидную связь, при этом указанная связь расположена между двумя различными мономерными скаффолдами, т.е. дисульфидная связь является межмолекулярной дисульфидной связью. Например, дисульфидная связь может соединять различные скаффолды (например, два выделенных мономерных скаффолда Tn3, выделенный мономерный скаффолд Tn3 и мультимерный скаффолд, или два мультимерных скаффолда), скаффолд Tn3 и линкер, скаффолд Tn3 и домен Fn, или скаффолд Tn3 и антитело или его фрагмент. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе межмолекулярную дисульфидную связь, которая соединяет скаффолд и выделенную гетерологичную молекулу, скаффолд и гетерологичную молекулу, слитую или конъюгированную с этим же скаффолдом, или скаффолд и гетерологичную молекулу, слитую или конъюгированную с другим скаффолдом.

[0181] В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают дисульфидную связь, которая образует мультимерный скаффолд, по меньшей мере, с 2, по меньшей мере, с 3, по меньшей мере, с 4 или более скаффолдами.

[0182] В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению могут быть включать продление N- и/или С-терминальных участков. В одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают изменение для повышения периода полужизни в сыворотке, как это описано в тексте данной заявки. В еще одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают вставку, делецию или замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка для стабилизации гидрофобного ядра скаффолда.

[0183] В специфическом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе интрамолекулярную дисульфидную связь, при этом домен А бета цепи включает SEQ ID NO: 42, В бета цепи включает SEQ ID NO: 43, С бета цепи включает SEQ ID NO: 45, D бета цепи включает SEQ ID NO: 46, Е бета цепи включает SEQ ID NO: 47, F бета цепи включает SEQ ID NO: 49 и G бета цепи включает SEQ ID NO: 52.

[0184] В специфическом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе интрамолекулярную дисульфидную связь, при этом домен А бета цепи состоит из SEQ ID NO: 42, В бета цепи состоит из SEQ ID NO: 43, С бета цепи состоит из SEQ ID NO: 45, D бета цепи состоит из SEQ ID NO: 46, Е бета цепи состоит из SEQ ID NO: 47, F бета цепи состоит из SEQ ID NO: 49 и G бета цепи состоит из SEQ ID NO: 52.

[0185] В специфическом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе интрамолекулярную дисульфидную связь, при этом домен А бета цепи состоит по существу из SEQ ID NO: 42 В бета цепи состоит по существу из SEQ ID NO: 43, С бета цепи состоит по существу из SEQ ID NO: 45, D бета цепи состоит по существу из SEQ ID NO: 46, Е бета цепи состоит по существу из SEQ ID NO: 47, F бета цепи состоит по существу из SEQ ID NO: 49 и G бета цепи состоит по существу из SEQ ID NO: 52.

Повышенная стабильность скаффолда: Длина петли FG

[0186] Исследователями были обнаружено, что длина петли FG играет роль в стабильности скаффолдов Tn3. В частности, скаффолды Tn3, включающие не встречающиеся в природе варианты петель FG, которые, по меньшей мере, короче на одну аминокислоту в сравнении с петлей FG из FOI, имеют повышенную стабильность. В определенных вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению включают не встречающийся в природе вариант петли FG, который, по меньшей мере, короче на один аминокислотный остаток в сравнении с петлей FG из третьего домена FnIII тенасцина С человека.

[0187] В специфическом варианте воплощения изобретения стабильность скаффолда Tn3 повышена путем делеции, по меньшей мере, одной аминокислоты из петли FG. В другом варианте воплощения изобретения стабильность скаффолда Tn3 может быть повышена путем делеции, по меньшей мере, 1, или, по меньшей мере, 2, или, по меньшей мере, 3, или, по меньшей мере, 4, или, по меньшей мере, 5, или, по меньшей мере, 6, или, по меньшей мере, 7, или, по меньшей мере, 8, или, по меньшей мере, 9, или, по меньшей мере, 10 аминокислот в петле FG. Специфически предусмотрено, что стабилизированный скаффолд Tn3 может включать, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе дисульфидную связь.

[0188] В определенных вариантах воплощения изобретения вариант скаффолда Tn3 также включает, по меньшей мере, одну петлю (т.е. АВ, ВС, CD, DE, EF и/или FG), которая была рандомизирована на предмер длины и/или последовательности. Специфически предусмотрено, что вариант скаффолда Tn3 может включать, по меньшей мере, одну не встречающуюся в природе дисульфидную связь.

[0189] В определенных вариантах воплощения изобретения вариант скаффолда Tn3 включает петлю FG, которая короче, по меньшей мере, на один, или, по меньшей мере, на два, или, по меньшей мере, на 3, или, по меньшей мере, на 4, или, по меньшей мере, на 5, или, по меньшей мере, на 6, или, по меньшей мере, на 7, или, по меньшей мере, на 8, или, по меньшей мере, на 9, или, по меньшей мере, на 10 аминокислотных остатков в сравнении с петлей FG скаффолда Tn3 дикого типа, при этом вариант скаффолда Tn3 дополнительно включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты.

Измерения стабильности

[0190] Повышение стабильности стабилизированных скаффолдов FnIII по изобретению, выделенных или являющихся частью мультимерного скаффолда, может быть легко проведено с использованием способов, хорошо известных в науке, таких как термическая (T_m) и хаотропная денатурация (такая как денатурация в моче или солях гуанидина), обработка протеазой (такая как обработка термолизином) или другие принятые способы для определения стабильности белка. Обширный обзор способов, используемых для измерения стабильности белка, представлен, например, в "Current Protocols in Molecular Biology" и "Current Protocols in Protein Science" by John Wiley and Sons. 2007.

Мультимерные скаффолды

[0191] Один аспект данного изобретения описывает мультимерные скаффолды, включающие, по меньшей мере, два мономерных скаффолда Tn3 по изобретению, соединенных в тандеме. Такие мультимерные скаффолды могут быть собраны в различных формах. В некоторых вариантах воплощения изобретения мономерные скаффолды Tn3 собраны в линейной форме, в то время как в других вариантах воплощения изобретения скаффолды собраны в разветвленной форме (см., например, ФИГ.1). В специфическом аспекте изобретение описывает мультимерные скаффолды, при этом, по меньшей мере, два скаффолда Tn3 соединены в тандеме посредством пептидного линкера. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолд Tn3 в мультимерных скаффолдах по изобретению связывается с TRAIL R2, в то время как другой скаффолд Tn3 связывается с другой мишенью, обладая, тем самым, множественными функциями, и/или с одной и той же мишенью, что повышает валентность и/или авидность связывания с мишенью, другое действие на мишень (-и). В некоторых вариантах воплощения изобретения повышение валентности и/или авидности связывания мишени возникает при связывании множественных скаффолдов с одной и той же мишенью. В некоторых вариантах воплощения изобретения повышение валентности улучшает специфическое действие на мишень, такое как повышение димеризации отдельного белка.

[0192] В специфическом варианте воплощения изобретения мультимерный скаффолд по изобретению включает, по меньшей мере, два скаффолда Tn3 по изобретению, соединенных в тандеме, при этом каждый скаффолд Tn3 связывается, по меньшей мере, с одной мишенью, и при этом каждый скаффолд Tn3 включает множество бета цепей, соединенных с множеством петлевых участков, при этом, по меньшей мере, одна петля представлена не встречающимся в природе вариантом когнатной петли в домене Tn3 дикого типа.

Мультимерные тандемные скаффолды

[0193] В одном варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают два, три, четыре, пять, шесть, восемь или более мономерных скаффолдов Tn3 по изобретению. В некоторых вариантах воплощения изобретения мономерные скаффолды Tn3 соединены в тандеме. В еще одном варианте воплощения изобретения некоторые мономерные скаффолды Tn3 соединены в тандеме и некоторые мономерные скаффолды Tn3 соединены не в тандеме. В специфическом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают два или три, или четыре, или пять, или шесть, или семь, или восемь, или девять, или десять, или более скаффолдов по изобретению, соединенных в тандеме (см., например, ФИГ.1 и ФИГ.2).

[0194] В одном варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды получают посредством ковалентного связывания между мономерными скаффолдами Tn3, например, путем прямого присоединения скаффолдов Tn3 или путем включения линкера, например, пептидного линкера. В отдельных примерах ковалентно присоединенные скаффолды получают путем конструирования генов слияния, кодирующих мономерные скаффолды Tn3, или, с другой стороны, путем рекомбинации кодонов для остатков цистеина в мономерные скаффолды Tn3, что позволяет образовываться дисульфидным связям между продуктами экспрессии.

(0195] В одном варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, два скаффолда Tn3, которые соединены напрямую друг к другу без какой-либо дополнительной введенной аминокислоты. В другом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, два скаффолда Tn3, которые соединены в тандеме посредством линкера, например, пептидного линкера. В специфическом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, два скаффолда Tn3, которые соединены в тандеме посредством пептидного линкера, при этом пептидный линкер включает от 1 до примерно 1000, или от 1 до примерно 500, или от 1 до примерно 250, или от 1 до примерно 100, или от 1 до примерно 50, или от 1 до примерно 25 аминокислот. В специфическом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, два скаффолда Tn3, которые соединены в тандеме посредством пептидного линкера, при этом пептидный линкер включает от 1 до примерно 20, или от 1 до примерно 15, или от 1 до примерно 10, или от 1 до примерно 5 аминокислот.

[0196] В специфическом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают, по меньшей мере, два скаффолда Tn3, которые соединены в тандеме посредством линкера, например, пептидного линкера, при этом линкер является функциональной молекулой. Функциональная молекула может быть выбрана на основе требуемой функции и/или характеристик мультимерного скаффолда. Например, функциональная молекула, используемая для очистки (например, гистидиновый тэг), может использоваться в качестве линкера. Функциональные молекулы, используемые в качестве линкеров, включают, но не ограничиваются этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), цитотоксический агент, радионуклид, агент визуализации, биотин, домен димеризации, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) или его связующий участок FcRn, домен или фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, доменное антитело, альбуминсвязующий домен, молекулу IgG, фермент, лиганд, рецептор, связующий пептид, не-Tn3 скаффолд, тэг антигенной детерминанты, рекомбинантный полипептидный полимер, цитокин и т.п.Специфические пептидные линкеры и функциональные молекулы, которые могут использоваться в качестве линкеров, описаны выше.

[0197] В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 включает, по меньшей мере, два скаффолда Tn3, которые соединены посредством одного или более линкеров, при этом линкеры, расположенные между каждым скаффолдом Tn3, могут быть представлены одними и теми же или различными линкерами. В некоторых вариантах воплощения изобретения линкер может включать множество линкеров, которые могут быть представлены одними и теми же или различными линкерами. В некоторых вариантах воплощения изобретения, если объединено множество линкеров, некоторые или все такие линкеры могут быть функциональными молекулами.

Стехиометрия связывания мультимерного скаффолда

[0198] В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 включает скаффолды, специфичные относительно TRAIL R2. В других вариантах воплощения изобретения мультимерные скаффолды по изобретению включают скаффолды, специфичные относительно различных антигенных детерминант, которые могут быть представлены различными анигенными детерминантами на TRAIL R2 или различных мишенях.

[0199] В специфическом варианте воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может связываться с двумя или более различными антигенными детерминантами (например, неперекрывающимися антигенными детерминантами) на одной и той же молекуле TRAIL R2. В другом специфическом варианте воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может связываться с двумя или более различными антигенными детерминантами на TRAIL R2. В еще одном специфическом варианте воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может связываться с двумя или более различными антигенными детерминантами на TRAIL R2 и, кроме того, связываться, по меньшей мере, с одной антигенной детерминантой на одной или более различных молекулах-мишенях. В еще одном специфическом варианте воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может связываться одной и той же антигенной детерминантой на димере TRAIL R2. В еще одном варианте воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может связываться с одной и той же антигенной детерминантой на, по меньшей мере, двух молекулах TRAIL R2. В определенных вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может связываться с одной и той же антигенной детерминантой на двух или более копиях молекулы TRAIL R2 на прилегающей клеточной поверхности. В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может связываться с одной и той же антигенной детерминантой или разными антигенными детерминантами на TRAIL R2 или на различных мишенях с одной и той же или различными аффинностями связывания и/или авидностью.

[0200] В другом варианте воплощения изобретения мономерные скаффолды в мультимерном скаффолде Tn3 связываются с антигенными детерминантами на одной или нескольких копиях TRAIL R2 в соответствии со схемой специфического связывания, разработанной для достижения или повышения (например, синергичным образом) требуемого действия на мишень, например, димеризацию мишени. Например, скаффолды Tn3 в линейном мультимерном скаффолде могут связываться с одним и тем же TRAIL R2 или множественными TRAIL R2 согласно определенной схеме, например, скаффолды Tn3 в 6 модуле линейного эквивалентного скаффолда могут связываться с двумя мишенями TRAIL R2 А и В согласно схеме АААВВВ, схеме ААВВАА, схеме АВАВАВ, схеме ААААВВ и т.д.; тремя мишенями согласно ААВВСС, схеме АВСАВС, схеме АВССВА и т.д.; четырьмя мишенями согласно схеме ABCDDA, схеме ABCADA и т.д. Кроме того, если мультимерный скаффолд по изобретению включает множество рекомбинантных (например, с дисульфидной связью, с рекомбинантной петлей или с рекомбинантной дисульфидной связью и петлей) и нерекомбинантных скаффолдов, такие мономерные скаффолды могут располагаться согласно определенной схеме для достижения или повышения определенного биологического эффекта. Такие комбинации мономерных скаффолдов Tn3 могут быть комбинаторным образом собраны и впоследствии проанализированы с использованием известных в науке способов.

[0201] В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 в разветвленной форме, например, мультимерные скаффолды в слитом Fc или антителоподобном формате, также могут связываться с одной мишенью TRAIL R2 или множественными мишенями TRAIL R2 согласно определенной схеме. Например, в определенных вариантах воплощения изобретения линейный формат скаффолда Tn3, слитого с тяжелыми цепями IgG в антителоподобном формате мультимерного скаффолда Tn3, может связываться с первой мишенью, в то время как поливалентный линейный скаффолд Tn3, слитый с легкими цепями IgG в антителоподобном формате скаффолда Tn3, может связываться с другой мишенью. В другом варианте воплощения изобретения линейный формат скаффолдов Tn3, слитых с тяжелыми цепями IgG в антителоподобном формате скаффолда Tn3, может связываться с мишенью с определенной аффинностью, в то время как скаффолды с линейным форматом, слитые с легкими цепями IgG в антителоподобном формате скаффолда, могут связываться с одной и той же мишенью с другой аффинностью. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3, слитые с цепями в левой части плеча «Y» антитела, могут связываться с первой мишенью, в то время как скаффолды Tn3, слитые с цепями с правой стороны плеча «Y» антитела, могут связываться со второй мишенью.

Слияния

[0202] Изобретение дополнительно описывает мультимерные скаффолды Tn3, включающие, по меньшей мере, два мономерных скаффолда Tn3, при этом, по меньшей мере, один мономерный скаффолд Tn3 может быть слит с гетерологичной молекулой. В этом контексте гетерологичная молекула не используется для соединения скаффолдов в качестве спейсера, но может обеспечивать дополнительную функциональность мультимерного скаффолда Tn3. Например, в некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3, связывающийся с TRAIL R2, может быть слит с цитотоксическим агентом для облегчения мишень-специфической гибели клеток. В некоторых вариантах воплощения изобретения гетерологичная молекула может функционировать как линкер.

[0203] Данное изобретение описывает использование мультимерных скаффолдов Tn3, конъюгированных или слитых с одной или более гетерологичными молекулами, включая, но не ограничиваясь этим, пептиды, полипептиды, белки, белки слияния, молекулы нуклеиновых кислот, небольшие молекулы, миметические агенты, синтетические препараты, неорганические молекулы и органические молекулы. Данное изобретение описывает использование мультимерных скаффолдов Tn3, которые рекомбинантным образом слиты или химически конъюгированы с гетерологичным белком или полипептидом, или его фрагментом. Конъюгация включает ковалентную и нековалентную конъюгацию. В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может быть слит или химически конъюгирован с полипептидом, включающим, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 50, по меньшей мере, 60, по меньшей мере, 70, по меньшей мере, 80, по меньшей мере, 90, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 200, по меньшей мере, 300, по меньшей мере, 500, или, по меньшей мере, 1000 аминокислот, для получения белков слияния.

[0204] Слияние или конъюгация мультимерного скаффолда Tn3 с одной или более гетерологичными молекулами может быть прямым, т.е. без линкера, расположенного между скаффолдом Tn3 и гетерологичной молекулой, или посредством одной или более описанных здесь линкерных молекул. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды могут использоваться для связывания гетерологичных полипептидов и клеток отдельных типов в условиях in vitro или in vivo, путем слияния или конъюгации скаффолдов Tn3 с антителами, специфичными относительно отдельных рецепторов клеточной поверхности в клетках-мишенях, таких как TRAIL R2. Мультимерные скаффолды Tn3, слитые или конъюгированные с гетерологичными полипептидами, могут также использоваться в иммуноанализах in vitro и способах очистки с использованием известных в науке способов. См., например. International Publication No. WO 93/21232; Европейский патент No. EP 439095; Naramura et al. Immunol. Lett. 39: 91-99, 1994; патент США No.5474981; Gillies et al., PNAS 89: 1428-1432, 1992; и Fell et al., J. Immunol. 146: 2446-2452, 1991 (все источники включены во всей полноте посредством ссылки).

[0205] В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 могут быть интегрированы с иммунным ответом человека путем слияния или конъюгации скаффолда с иммуноглобулином или его доменом, включая, но не ограничиваясь этим, константный участок IgG (Fc), например, посредством N- или С-конца. Подобным образом, слияние между скаффолдом и комплементарным белком, таким как Clq, может использоваться для связывания с клетками. Слияние между мультимерным скаффолдом Tn3 и токсином может использоваться для специфического уничтожения клеток, несущих отдельный антиген, как это описано в тексте данной заявки.

[0206] Различные публикации описывают способы получения физиологически активных молекул, периоды полужизни которых модифицированы путем введения в молекулы FcRn-связывающего полипептида (см., например, WO 97/43316; патент США No.5869046; патент США No. 5747035; WO 96/32478; и WO 91/14438) или путем слияния молекул с антителами с сохраненной аффинностью связывания с FcRn, но сильно пониженной аффинностью связывания с другими рецепторами Fc (см., например, WO 99/43713), или путем слияния молекул с доменами связывания FcRn антител (см., например, WO 00/09560; патент США No.4703039). Специфические методы и способы повышения периода полужизни физиологически активных молекул также описаны в патенте США No.7083784. В частности, предусмотрено, что мультимерные скаффолды Tn3 могут быть слиты с участком Fc из IgG, при этом участок Fc включает мутации в аминокислотных остатках M252Y/S254T/T256E или H433K/N434F/Y436H, при этом положения аминокислот обозначены согласно системы нумерации по Kabat. В некоторых вариантах воплощения изобретения период полужизни мультимерного скаффолда Tn3 может быть повышен путем генетического слияния поливалентного скаффолда Tn3 с неструктурированным рекомбинантным полипептидом (например, полипептидом XTEN™) или путем конъюгации с полиэтиленгликолем (ПЭГ).

[0207] В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 может быть слит с молекулами, повышающими или увеличивающими период полужизни in vivo или в сыворотке. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолд может быть слит или конъюгирован с альбумином, таким как человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), неонатальным рецептором Fc (FcRn), его связующим фрагментом, ПЭГ, полисахаридами, антителами, комплементом, гемоглобином, связующим пептидом, липопротеинами и другими факторами для повышения своего периода полужизни в кровотоке и/или проникновения в ткани. Любое из таких слияний может быть получено с использованием стандартных способов, например, путем экспрессии белка слияния из рекомбинантного гена слияния, построенного с использованием опубликованных генных последовательностей.

[0208] Кроме того, скаффолды по изобретению могут быть слиты с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения очистки. В некоторых вариантах воплощения изобретения маркерная аминокислотная последовательность представлена полигистидиновым пептидом (His-tag), например, окта-гистидин-тэг (His-8-tag) или гекса-гистидин-тэг (His-6-tag), такой как тэг, полученный с помощью вектора экспрессии pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311), других векторов, большая часть из которых представлена на рынке. Как это описано, например, в Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989, полигистидин обеспечивает удобную очистку белка слияния. Другие пептидные тэги, используемые для очистки, включают, но не ограничиваются этим, гемагглютинин («НА») тэг, который соответствует антигенной детерминанте, полученной из белка гемагглютинина гриппа (см., например, Wilson et al., Cell 37: 767, 1984), тэг FLAG, тэг Strep, тэг myc, тэг V5, тэг GFP, тэг AU1, тэг AU5, тэг ECS, тэг GST или тэг OLLAS.

[0209] Дополнительные скаффолды по изобретению, включающие белки слияния, могут быть получены с использованием методов перестановки генов, перестановки мотива, перестановки экзона и/или перестановки кодона (в целом обозначается как «перестановки ДНК»).

[0210] Перестановка ДНК может проводиться для изменения действия скаффолдов Tn3 на мишень (например, для получения скаффолдов с повышенной аффинностью и пониженной скоростью диссоциации, или скаффолда с повышенной способностью димеризировать TRAIL R2). Скаффолды Tn3 могут быть изменены путем случайного мутагенеза с использованием ПЦР пониженной точности, вставки случайного нуклеотида или другими способами, проводимыми до рекомбинации. Один или несколько фрагментов полинуклеотида, кодирующего скаффолд, связывающийся со специфической мишенью, могут быть рекомбинированы с одним или несколькими компонентами, мотивами, секциями, частями, доменами, фрагментами и т.п.одного или нескольких гетерологичных молекул.

Антителоподобные мультимерные скаффолды

[0211] В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд по изобретению включает, по меньшей мере, два скаффолда Tn3, при этом, по меньшей мере, один скаффолд Tn3 слит с доменом или фрагментом антитела (например, IgG), включая, но не ограничиваясь этим, интактное антитело, вариабельный домен антитела, домен СН1, домен Ckappa, домен Clambda, домен Fc, домен СН2 или СН3.

[0212] В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолд Tn3 может быть слит с доменом или фрагментом антитела. Домен или фрагмент антитела может дополнительно повышать авидность и/или аффинность мультимерного скаффолда путем обеспечения, подобно описанному ниже домену Fc, домена димеризации или мультимеризации, что облегчает образование мультимерных скаффолдов по изобретению. Кроме того, домен или фрагмент антитела может дополнительно повышать действие скаффолда на мишень, например, более эффективно димеризировать или мультимеризировать мишень.

[0213] В некоторых вариантах воплощения изобретения с доменом или фрагментом антитела конъюгирован или слит только один мультимерный тандемный скаффолд Tn3, включающий два домена Tn3. Например, единичный мультимерный тандемный скаффолд может быть слит с N-концом полипептидного домена или фрагмента антитела (например, тяжелой цепи или легкой цепи антитела). В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 создаются путем слияния или конъюгации одного или более скаффолдов Tn3 с N-концом и/или С-концом полипептидного домена или фрагмента антитела (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела). В некоторых вариантах воплощения изобретения некоторые или все скаффолды Tn3, слитые с доменом или фрагментом антитела, являются идентичными. В некоторых вариантах воплощения изобретения некоторые или все скаффолды Tn3, слитые с доменом или фрагментом антитела, являются разными.

[0214] В некоторых вариантах воплощения изобретения тандемные скаффолды Tn3, используемые для получения антителоподобного поливалентного скаффолда Tn3, могут содержать одно и то же количество модулей Tn3. В других вариантах воплощения изобретения тандемные скаффолды Tn3, используемые для получения антителоподобного поливалентного скаффолда Tn3, могут содержать разное количество модулей Tn3. Например, тетравалентный скаффолд Tn3 может быть образован, например, путем слияния линейного тетравалентного скаффолда Tn3 в одном положении, или путем слияния одного мономерного скаффолда Tn3 в одном положении и тримерного линейного скаффолда Tn3 в другом положении, или путем слияния двух димерных линейных скаффолдов Tn3 в двух разных положениях, или путем слияния 4 мономерных скаффолдов Tn3, каждый в отдельном положении.

[0215] В специфическом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 по изобретению включают четыре мультимерных линейных скаффолда Tn3, слитых с доменом или фрагментом антитела, при этом каждый мультимерный линейный скаффолд Tn3 включает два мономерных скаффолда Tn3, соединенных в тандеме посредством линкера (ФИГ.1). В других вариантах воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 по изобретению включают, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть, по меньшей мере, семь или, по меньшей мере, восемь мономерных или мультимерных скаффолдов Tn3 по изобретению, слитых с доменом или фрагментом антитела.

[0216] В одном специфическом варианте воплощения изобретения тетра валентны и скаффолд Tn3 может быть получен путем слияния одного скаффолда Tn3 с N-концом каждой из легких цепей и тяжелых цепей домена или фрагмента антитела (см., например, вектор А9 на ФИГ.2).

[0217] Антителоподобный формат мультивалентного скаффолда Tn3 может быть получен путем слияния любой комбинации скаффолдов Tn3 с доменом или фрагментом антитела или модифицированным антителом. Примеры модифицированных антител включают антитела с удаленным доменом, минитела (см., например, патент США No.5837821), тетравалентные минитела, тетравалентные антитела (см., например, Coloma & Morrison, Nature Biotechnol. 15:159-163, 1997; публикацию РСТ No.WO 95/09917), термически стабилизированные антитела, гуманизированные антитела и т.д.

[0218] Каждый линейный скаффолд Tn3, используемый для получения антителоподобного поливалентного скаффолда Tn3 согласно ФИГ. 1, может содержать одинаковые линкеры и распределение линкеров, или различные линкеры и различные распределения линкеров.

Мультимерные скаффолды, слитые с Fc

[0219] В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 по изобретению включает множество мономерных или мультимерных скаффолдов Tn3, соединенных с доменом Fc. Слияние мультимерного скаффолда Tn3 по изобретению с фрагментом антитела, включающем домен Fc, дополнительно повышает авидность и/или активность мультимерного скаффолда FnIII путем предоставления домена димеризации, что облегчает образование димеров мультимерных скаффолдов Tn3.

[0220] В некоторых вариантах воплощения изобретения с доменом Fc слит только один мультимерный скаффолд Tn3. В специфическом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 по изобретению включают два мультимерных скаффолда Tn3, слитых с доменом Fc, при этом каждый мультимерный скаффолд Tn3 включает два или более мономерных скаффолда Tn3, соединенных в тандеме посредством одного или нескольких линкеров (ФИГ.1). Водном специфическом варианте воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 слиты с доменом Fc и представлены линейными скаффолдами.

[0221] В одном специфическом варианте воплощения изобретения два линейных скаффолда Tn3, включающие два домена Tn3 в тандеме, слиты с доменом Fc для получения мультимерного скаффолда Tn3 с валентностью 4 (см., например, вектор А7 на ФИГ.2). В другом специфическом варианте воплощения изобретения два линейных скаффолда, каждый из которых включает четыре мономерных скаффолда Tn3, слиты с доменом Fc для получения мультимерного скаффолда Tn3 с валентностью 8 (см., например, вектор А8 на ФИГ.2).

[0222] В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3, слитые с доменом Fc, включают одинаковое количество модулей Tn3. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3, слитые с доменом Fc, включают разное количество модулей Tn3. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3, слитые с доменом Fc, включают одинаковые линкеры. В других вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3, слитые с доменом Fc, включают разные линкеры.

[0223] В некоторых вариантах воплощения изобретения различные мультимерные скаффолды Tn3 по изобретению могут быть димеризированы путем использования мутаций в домене Fc, что способствует образованию гетеродимеров. В науке известно, что варианты участка Fc (например, аминокислотные замены и/или вставки и/или делеции) повышают или снижают эффекторную функцию антитела и могут изменять фармакокинетические свойства (например, период полужизни) антитела. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения изобретения мультиспецифические скаффолды Tn3 по изобретению включают домен (-ы) Fc, которые включают измененный участок Fc, в котором было сделано одно или более изменений для изменения функциональных и/или фармакокинетических свойств мультимерного скаффолда Tn3.

[0224] Также известно, что гликозилирование участка Fc может быть модифицировано для повышения или снижения эффекторной функции и/или противовоспалительного действия. В соответствии с этим, в одном варианте воплощения изобретения участки Fc мультимерных скаффолдов FnIII по изобретению включают изменение гликозилирования аминокислотных остатков для изменения цитотоксических и/или противовоспалительных свойств мультимерных скаффолдов.

Топология мультимерных скаффолдов

[0225] Специалисту в данной области станет очевидно, что обсужденные выше мультимерные скаффолды, указанные на ФИГ.1 и ФИГ.2, а также по тексту данной заявки, являются только иллюстративными примерами. Топология векторов или форматов, представленная на ФИГ.1 и ФИГ.2, показывает, что в некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению слиты с М-концом составляющих полипептидов доменов Fc и антител. Скаффолды по изобретению могут быть слиты с С-концом доменов Fc, легких цепей антитела и тяжелых цепей антитела в любом подходящем пространственном расположении. Например, в некоторых вариантах воплощения изобретения тетравалентный скаффолд может быть создан путем слияния мономерного скаффолда FnIII с N-концом каждой тяжелой цепи и мономерного скаффолда FnIII с С-концом каждой легкой цепи антитела, путем слияния мономерного скаффолда FnIII с N-концом каждой легкой цепи и мономерного скаффолда FnIII с С-концом каждой тяжелой цепи антитела, или путем слияния мономерного скаффолда FnIII с N-концом каждой легкой цепи и мономерного скаффолда FnIII с N-концом каждой тяжелой цепи антитела. Мономерные и/или мультимерные скаффолды FnIII могут быть слиты с тяжелыми цепями и/или легкими цепями полной длины, включающими вариабельные участки и константные участки. С другой стороны, мономерные и/или мультимерные скаффолды FnIII могут быть слиты с разветвленными тяжелыми и/или легкими цепями, включающими только константные участки (например, как это показано для вектора А9 на ФИГ.2).

[0226] Мультимерные скаффолды Tn3 могут быть созданы путем использования форм, указанных на ФИГ.1, в качестве строительных блоков. Например, антителоподобные формы и формы слияния с Fc представлены комбинациями, включающими упрощенные линейные модули Tn3. В соответствии с этим, в некоторых вариантах воплощения изобретения путем комбинации строительных блоков, представленных на ФИГ.1, могут быть получены более сложные мультимерные скаффолды Tn3.

[0227] ФИГ.1 и 2 также показывают, что в некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 могут быть линейными или разветвленными и обладать различной степенью разветвленности. Например, форма Fc является примером разветвленной формы первого порядка, в то время как антителоподобная форма является примером разветвленной формы второго порядка. Разветвленные формы высшего порядка могут быть получены путем замены строительных блоков линейной формы в антителоподобной форме или форме слияния Fc другими строительными блоками формы слияния Fc и антителоподобной формы, и присоединения их к С-концу или N-концу составляющих полипептидов Fc или антитела.

[0228] ФИГ.1 и 2, а также ТАБЛИЦА 1 показывают тот факт, что в некоторых вариантах воплощения изобретения линкеры в мультимерном скаффолде Tn3 могут структурно и функционально отличаться и обладать множеством участков присоединения. Например, все модули Tn3 в векторах А4 и А5 присоединены линкерами (Gly₄Ser)₃Ala, за исключением 4 и 5 модуля Tn3, которые присоединены линкером (Gly₄Ser)₂GlyThrGlySerAlaMetAlaSer(Gly₄Ser)₁Ala. Например, в векторе А7 первый и второй домены Tn3, а также третий и четвертый домены Tn3 присоединены линкерами (Gly₄Ser)₃Ala, в то время как второй и третий домены Tn3 присоединены доменом Fc в качестве линкера-функциональной молекулы.

[0229] Слияние с Fc, представленное на ФИГ.1, поясняет, что в некоторых вариантах воплощения изобретения мономерные или мультимерные скаффолды Tn3 могут быть слиты с N-концом полипептидов линкера-функциональной молекулы. В некоторых вариантах воплощения изобретения мономерные или мультимерные скаффолды Tn3 по изобретению могут быть легко слиты с С-концом домена Fc в векторе формы слияния с Fc.

[0230] Подобным образом, антитело или модифицированное антитело в антителоподобной форме также является линкером-функциональной молекулой. В этом случае, вместо двух участков присоединения, как в линкере (Gly₄Ser)₃Ala или (Gly₄Ser)₂GlyThrGlySerAlaMetAlaSer(Gly₄Ser)₁Ala, или четырех возможных участков присоединения, как в случае с доменом Fc, антитело, представленное в примере на ФИГ.1, предоставляет 6 возможных участков присоединения. Антителоподобная форма, представленная на ФИГ.1, поясняет, что в некоторых вариантах воплощения изобретения только N-концевые участки присоединения в функциональной молекуле-линкере заняты скаффолдами Tn3. В антителоподобной форме некоторые или все скаффолды Tn3 по изобретению могут быть легко слиты с С-концом тяжелых цепей и легких цепей антитела или модифицированного домена антитела. Могут использоваться и другие стехиометрические параметры слияния, т.е. один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или более скаффолдов Tn3 по изобретению могут быть слиты с антителом или модифицированным антителом.

[0231] ФИГ.1 и 2 также показывают, что в некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерные скаффолды Tn3 могут быть получены путем комбинации других мультимерных скаффолдов Tn3. Например, форма Fc скаффолдов А6, А7 и А8 (ФИГ.2) представлена гомодимерными скаффолдами Tn3, в то время как мультимерный скаффолд Tn3 образован двумя полипептидными цепями, каждая из которых включает линейный скаффолд Tn3, слитый с доменом Fc, который, в свою очередь, присоединен посредством межмолекулярных дисульфидных связей. Антителоподобный скаффолд на ФИГ.1 и 2 представляет гетеротетрамерный скаффолд Tn3, в котором 4 полипептида соответствуют двум различным типам скаффолдов (2 скаффолда Tn3, образованные путем слияния мономерного скаффолда Tn3 с константным участком легкой цепи IgG, и 2 скаффолда Tn3, образованные путем слияния мономерного скаффолда Tn3 с CH1-шарнирным участком-участком Fc IgG) и присоединены посредством межмолекулярных дисульфидных связей.

Получение скаффолдов по изобретению

[0232] Описанные здесь скаффолды Tn3 могут использоваться в любом способе для вовлечения новых или улучшенных белков, связывающихся с мишенями. В одном отдельном примере мишень иммобилизирована на твердой основе, такой как смола колонки или лунка микропланшета, и мишень контактирует с библиотекой кандидатных связующих белков, основанных на скаффолдах. Такая библиотека может состоять из клонов, построенных из скаффолда Tn3 посредством рандомизации последовательности и/или длины CDR-подобных петель.

[0233] В этом случае одним из известных способов является бактериофаговый (фаговый) дисплей, который позволяет проводить скрининг больших библиотек олигопептидов для идентификации члена (-ов) библиотеки, способного специфически связываться с мишенью. Фаговый дисплей является способом, согласно которого на поверхности частиц бактериофагов представлены вариантные полипептиды в виде белков слияния с поверхностным белком фага (Scott, J.К. and Smith, G.P. (1990) Science 249: 386). Для определения длины петли и предпочтений в разнообразии встречающихся в природе доменов FnIII может использоваться биоинформационный подход. Использование такого анализа позволяет применять параметры предпочтения длины петли и разнообразия последовательности для разработки подхода «ограниченной рандомизации». При такой ограниченной рандомизации относительная длина петли и предпочтения в последовательности вводят в разработку стратегии библиотеки. Интеграция анализа длины петли и разнообразия последовательности в разработку библиотеки приводит к ограниченной рандомизации (т.е. определенные положения в рандомизированной петле ограничиваются нахождением определенного аминокислотного остатка).

[0234] Изобретение также описывает рекомбинантные библиотеки, включающие различные популяции не встречающихся в природе скаффолдов Tn3. В одном варианте воплощения изобретения библиотеки включают не встречающиеся в природе скаффолды Tn3, включающие множество бета доменов, присоединенных к множеству петлевых участков, при этом одна или более указанных петель варьирует по делеции, замене или вставке, по меньшей мере, одной аминокислоты. В специфическом варианте воплощения изобретения библиотеки включают скаффолды Tn3, полученные из скаффолда Tn3 дикого типа.

[0235] Как это подробно указано выше, петли, соединяющие различные бета цепи скаффолдов, могут быть рандомизированы на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В одном варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды Tn3, имеющие, по меньшей мере, одну петлю, рандомизированную на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В одном варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или, по меньшей мере, шесть петель скаффолдов Tn3 рандомизированы на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В одном варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна петля сохраняется константной, в то время как, по меньшей мере, одна дополнительная петля рандомизирована на предмет длины и/или разнообразия последовательности. В другом варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две или все три петли АВ, CD и EF сохраняются константными, в то время как, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две или все три петли ВС, DE и FG рандомизированы на предмет длины или разнообразия последовательности. В другом варианте воплощения изобретения, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две или, по меньшей мере, все три петли АВ, CD и EF рандомизированные, в то время как, по меньшей мере, одна, по меньшей мере, две или все три петли ВС, DE и FG рандомизированы на предмет длины и/или разнообразия последовательности.

[0236] Нами было обнаружено, что петли FG, которые короче, по меньшей мере, на одну аминокислоту в сравнении с петлей FG из FOI, обладают повышенной стабильностью. В соответствии с этим, данное изобретение описывает библиотеки, включающие скаффолды Tn3, в которых, по меньшей мере, одна петля рандомизирована на предмет длины и/или разнообразия последовательности, за исключением того, что длина петель FG короче, по меньшей мере, на одну аминокислоту в сравнении с когнатной петлей FG третьего домена FnIII тенасцина С человека, которая включает 10 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды Tn3, при этом каждый скаффолд включает семь бета цепей, обозначенных А, В, С, D, Е, F и G, присоединенных к шести петлевым участкам, при этом каждый петлевой участок соединяет каждую бета цепь и обозначен АВ, ВС, CD, DE, EF и FG; и при этом, по меньшей мере, одна петля является не встречающимся в природе вариантом петли скаффолда Tn3 дикого типа, и при этом петля FG короче, по меньшей мере, на одну аминокислоту, чем когнатная петля скаффолда Tn3 дикого типа.

[0237] В специфическом варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды FnIII, при этом А бета цепь включает SEQ ID NO: 42, В бета цепь включает SEQ ID NO: 43, С бета цепь включает SEQ ID NO: 45, D бета цепь включает SEQ ID NO: 46, Е бета цепь включает SEQ ID NO: 47, F бета цепь включает SEQ ID NO: 49 и G бета цепь включает SEQ ID NO: 52.

[0238] В специфическом варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды FnIII, при этом А бета цепь состоит из SEQ ID NO: 42, В бета цепь состоит из SEQ ID NO: 43, С бета цепь состоит из SEQ ID NO: 45, D бета цепь состоит из SEQ ID NO: 46, Е бета цепь состоит из SEQ ID NO: 47, F бета цепь состоит из SEQ ID NO: 49 и G бета цепь состоит из SEQ ID NO: 52.

[0239] В специфическом варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды FnIII, при этом А бета цепь по существу состоит из SEQ ID NO: 42, В бета цепь по существу состоит из SEQ ID NO: 43, С бета цепь по существу состоит из SEQ ID NO: 45, D бета цепь по существу состоит из SEQ ID NO: 46, Е бета цепь по существу состоит из SEQ ID NO: 47, F бета цепь по существу состоит из SEQ ID NO: 49 и G бета цепь по существу состоит из SEQ ID NO: 52.

[0240] Как это подробно указано выше, один или более остатков в петли сохраняются константными, в то время как другие остатки рандомизированы на предмер длины и/или разнообразия последовательности. В некоторых случаях или с другой стороны, один или более остатков в петли являются предварительно определенными и содержат ограниченное количество различных аминокислот, в то время как другие остатки рандомизированы на предмер длины и/или разнообразия последовательности. В соответствии с этим, библиотеки по изобретению включают скаффолды Tn3, которые могут включать одну или более петель, имеющих дегенеративную консенсусную последовательность и/или один или более инвариантных аминокислотных остатков.

[0241] В другом варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды Tn3, имеющие петлю ВС, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: S-X-a-X-b-X-X-X-G, при этом Х представляет собой любую аминокислоту, (а) представляет собой пролин или аланин, и (b) представляет собой аланин или глицин. В другом варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды Tn3, имеющие петлю ВС, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G, при этом Х представляет собой любую аминокислоту и (с) представляет собой пролин, серин или глицин. В еще одном варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды Tn3, имеющие петлю ВС, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: A-d-P-X-X-X-e-f-X-1-X-G, при этом Х представляет собой любую аминокислоту, (d) представляет собой пролин, глутамат или лизин, (е) представляет собой аспарагин или глицин и (f) представляет собой серин или глицин.

[0242] В одном варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды Tn3, имеющие петлю DE, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: Х-Х-Х-Х-Х-Х, при этом Х представляет собой любую аминокислоту.

[0243] В другом варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды Tn3, имеющие петлю FG, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: X-a-X-X-G-X-X-X-b, при этом Х представляет собой любую аминокислоту, (а) представляет собой аспарагин, треонин или лизин, и (b) представляет собой серин или аланин. В другом варианте воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды FnIII, имеющие петлю FG, которая рандомизирована и имеет следующую консенсусную последовательность: Х-Х-Х-Х-Х-Х-Х-Х-Х (Х₉), при этом Х представляет собой любую аминокислоту.

[0244] В специфическом воплощения изобретения библиотеки по изобретению включают скаффолды, при этом такие скаффолды включают аминокислотную последовательность:

IEV(X_AB)_nALITW(X_BC)_nCELX₁YGI(X_CD)_nTTIDL(X_DE)_nYSI(X_EF)_nYEVSLIC(X_FG)_nKETFTT, при этом X_AB, X_BC, X_CD, X_DE, X_EF и X_FG представляют аминокислотные остатки в петлях АВ, ВС, CD, DE, EF и FG, соответственно, и X₁ представляет аминокислотный остаток А или Т, и n=2-26 и m=1-9.

[0245] Изобретение дополнительно описывает способы идентификации рекомбинантного скаффолда Tn3, который связывается с мишенью, например, TRAIL R2, и имеет повышенную стабильность или улучшенное действие на мишень, например, TRAIL R2, в сравнении со скаффолдом Tn3 дикого типа способом скрининга библиотек по изобретению.

[0246] В определенных вариантах воплощения изобретения способ для идентификации рекомбинантного скаффолда Tn3 с повышенной белковой стабильностью в сравнении со скаффолдом Tn3 дикого типа, связывающегося специфически с мишенью, включает:

а. контакт лиганда мишени с библиотекой по изобретению в условиях, подходящих для образования комплекса скаффолд: лиганд мишени;

b. получение из комплекса скаффолда, который связывается с лигандом мишени;

с. определение того, является ли стабильность скаффолда, полученного на этапе (b), выше, чем такой показатель скаффолда Tn3 дикого типа.

[0247] Такой же способ может использоваться для идентификации рекомбинантного скаффолда Tn3 с повышенной аффинностью связывания, авидностью и т.д. относительно мишени. В одном варианте воплощения изобретения на этапе (а) библиотека скаффолда по изобретению инкубируется с иммобилизированной мишенью. В одном варианте воплощения изобретения на этапе (b) комплекс скаффолд: лиганд мишени промывают для удаления неспецифических связующих веществ, и наиболее связанные связующие вещества элюируют при очень строгих условиях и подвергают ПЦР для восстановления информации о последовательности. Специфически предусмотрено, что связующие вещества и/или информация о последовательности, полученные на этапе (b), могут использоваться для создания новой библиотеки с использованием описанных здесь способов или способов, известных специалисту в данной области, которые могут использоваться для повторения процесса селекции с или без дополнительного мутагенеза последовательности. В некоторых вариантах воплощения изобретения может проводиться целая серия раундов селекции до тех пор, пока не будут получены связующие вещества с достаточной аффинностью к антигену.

[0248] Дополнительный вариант воплощения изобретения представлен коллекцией выделенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих библиотеку, включающую скаффолды по изобретению, как это описано выше.

[0249] Скаффолды по изобретению могут быть подвергнуты созреванию аффинности. В таком принятом в науке процессе специфический связующий белок подвергается воздействию по схеме и отбирается на предмет повышенной аффинности к специфической мишени (см. Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(11): 6037-42). Полученные скаффолды по изобретению могут обладать связующими характеристиками, которые, по меньшей мере, настолько же высокие, как и скаффолды до созревания аффинности.

[0250] Изобретение также описывает способы идентификации аминокислотной последовательности белкового скаффолда, способного связываться с мишенью с образованием комплекса скаффолд: мишень. В одном варианте воплощения изобретения способ включает: а) контакт библиотеки по изобретению с иммобилизированной или сепарированной мишенью; b) сепарация комплексов скаффолд: мишень от несвязанных скаффолдов; с) репликация сепарированных скаффолдов (b) с получением новой полипептидной библиотеки, отличной от (а) наличием пониженного разнообразия и обогащенной скаффолдами, способными связываться с мишенью; d) в некоторых случаях повторение этапов (а) и (b) с использованием новой библиотеки (с); и е) определение последовательности нуклеиновой кислоты участка, кодирующего скаффолд из группы (d) и получение вывода о том, что пептидная последовательность способна связываться с мишенью.

[0251] В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретения могут быть дополнительно рандомизированы после идентификации из библиотеки. В одном варианте воплощения изобретения способы по изобретению включают дополнительную рандомизацию, по меньшей мере, одной, по меньшей мере, двух, по меньшей мере, трех, по меньшей мере, четырех, по меньшей мере, пяти или, по меньшей мере, шести петель скаффолда, идентифицированного из библиотеки с использованием описанного здесь способа. В другом варианте воплощения изобретения дополнительно рандомизированный скаффолд подвергается последующему способу идентификации скаффолда, способного связывать мишень. Такой способ включает (а) контакт указанного и дополнительно рандомизированного скаффолда с иммобилизированной или сепарированной мишенью, (b) сепарацию комплексов дополнительно рандомизированный скаффолд:мишень от несвязанных скаффолдов, (с) репликацию сепарированных скаффолдов (b), в некоторых случаях повторение этапов (а)-(с), и (d) определение последовательности нуклеиновой кислоты участка, кодирующего указанный дополнительно рандомизированный скаффолд и, следовательно, получение вывода о том, что пептидная последовательность способна связывать мишень.

[0252] В дополнительном варианте воплощения изобретения дополнительно рандомизированные скаффолды включают, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или, по меньшей мере, шесть рандомизированных петель, которые были предварительно рандомизированы в первой библиотеке. В альтернативном дополнительном варианте воплощения изобретения дополнительно рандомизированные скаффолды включают, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или, по меньшей мере, шесть рандомизированных петель, которые не были предварительно рандомизированы в первой библиотеке.

[0253] Изобретение также описывает способ получения, по меньшей мере, двух скаффолдов Tn3, которые связываются, по меньшей мере, с одной или более мишенями. Такой способ позволяет проводить скрининг агентов, действующих сообща для вызова отдельного ответа. Использование такого способа может оказаться преимущественным, если требуется агонистическая активность, требующая кооперации более чем одного скаффолда (например, но не ограничиваясь этим, агонизм рецептора, принадлежащего к семейству рецепторов ФНО). Такой способ позволяет проводить скрининг кооперативных агентов без реформатирования библиотеки с образованием мультимерных комплексов. В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт лиганда мишени с библиотекой по изобретению в условиях, позволяющих образоваться комплексу скаффолд: лиганд мишени, использование таких скаффолдов с агентами, образующими перекрестные связи (определены как агенты, соединяющие в непосредственной близости, по меньшей мере, два идентичных или различных скаффолда), при этом образование перекрестных связей между скаффолдами вызывает определяемый ответ и образование комплекса, указывая на связывание скаффолдом мишени. В дополнительном варианте воплощения изобретения агент, образующий перекрестные связи, представлен скаффолд-специфическим антителом или его фрагментом, тэгом антигенной детерминанты специфического антитела или его фрагментом, доменом димеризации, таким как участок Fc, мотивом суперспирали (например, но не ограничиваясь этим, лейциновой молнией), химическим агентом для образования перекрестных связей или другим доменом димеризации, известным в науке.

[0254] Изобретение также описывает способы определения соединения, используя скаффолды по изобретению. Основываясь на специфичности связывания скаффолдов, полученных путем скрининга библиотеки, возможно использовать такие скаффолды в анализах для определения специфической мишени в образце, таких как способы диагностики. В одном варианте воплощения изобретения способ определения соединения включает контакт указанного соединения в образце со скаффолдом по изобретению в условиях, позволяющих образоваться комплексу соединение-скаффолд и определить указанный скаффолд, и, следовательно, указанное соединение в образце. В дополнительных вариантах воплощения изобретения скаффолд помечается (т.е. радиометкой, флуоресцирующей, ферментсвязанной или колориметрической меткой) для облегчения определения соединения.

[0255] Изобретение также описывает способы захвата соединения, используя скаффолды по изобретению. Основываясь на специфичности связывания скаффолдов, полученных путем скрининга библиотеки, возможно использовать такие скаффолды в анализах для захвата специфической мишени в образце, таких как способы очистки. В одном варианте воплощения изобретения способ захвата соединения в образце включает контакт указанного соединения в образце со скаффолдом по изобретению в условиях, позволяющих образоваться комплексу соединение-скаффолд и удалить указанный комплекс из образца, и, следовательно, захватить указанное соединение в образце. В дополнительных вариантах воплощения изобретения скаффолд иммобилизируют для облегчения удаления комплекса соединение-скаффолд.

[0256] В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды, выделенные из библиотек по изобретению, включают, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть или более рандомизированных петель. В некоторых вариантах воплощения изобретения последовательности выделенных петель скаффолда могут быть замещены из донорского скаффолда любой петлей в скаффолде-акцепторе (например, последовательность петли FG из скаффолда-донора может быть перенесена в любую петлю в скаффолде-акцепторе). В специфических вариантах воплощения изобретения последовательности выделенных петель могут быть перенесены в когнатную петлю в скаффолде-акцепторе (например, последовательность петли FG из скаффолда-донора может быть перенесена в положение петли FG в скаффолде-акцепторе). В некоторых вариантах воплощения изобретения последовательности выделенных петель могут быть «перемешаны и сопоставлены» случайным образом с различными скаффолдами-акцепторами.

[0257] В других вариантах воплощения изобретения последовательности выделенных скаффолдов могут быть идентифицированы по последовательности петель. Например, библиотеку, используемую для панорамирования относительно отдельной мишени, и сбор специфических связующих веществ изолируют. Рандомизированные последовательности петель могут быть охарактеризованы как специфические последовательности независимо от основы скаффолда (т.е. скаффолда, который связывается с мишенью X, и при этом указанный скаффолд включает последовательность петли FG SEQ ID NO: X). В альтернативных вариантах воплощения изобретения, когда скаффолд имеет две последовательности петель, которые связывают мишень X, последовательности петель могут быть охарактеризованы как связующие мишень Х в отсутствие последовательности скаффолда. Другими словами, предусматривается, что скаффолды, выделенные из библиотеки и связывающиеся с отдельной мишенью, могут быть экспрессированы как последовательности вариабельных петель, которые связывают мишень независимо от остова скаффолда. Данный процесс будет аналогичен концепции CDR в вариабельных участках антител.

Созревание аффинности

[0258] Разработка скаффолдов TRAIL R2 Tn3 может включать один или более этапов созревания аффинности in vitro или in vivo. Может использоваться любой способ созревания аффинности, который приводит к изменениям в аминокислотах домена Tn3 или петель домена Tn3, что улучшает связывание скаффолда Tn3 с требуемым антигеном.

[0259] Такие изменения в аминокислотах могут быть достигнуты, например, посредством случайного мутагенеза, «прогонного» мутагенеза и «просматривающего» мутагенеза. Такой мутагенез может быть достигнут при использовании, например, ПЦР пониженной точности, «мутированных» штаммов дрожжей или бактерий, введения случайных или определенных изменений в нуклеиновых кислотах во время синтеза ab initio всей или части связующейся молекулы на основе FnIII. Способы проведения созревания аффинности и/или мутагенеза описаны, например, в патентах США No.7195880; 6951725; 7078197; 7022479; 5922545; 5830721; 5605793, 5830650; 6194550; 6699658; 7063943; 5866344 и публикации РСТ WO 06023144.

[0260] Такие способы созревания аффинности могут дополнительно потребовать повышения строгости скрининг-анализа связывания антигена для выбора скаффолдов Tn3 с повышенной аффинностью к антигену. Могут использоваться утвержденные в науке способы для повышения строгости анализа взаимодействия белок-белок. В одном варианте воплощения изобретения варьируют один или более условий анализа (например, концентрация соли в буфере анализа) для снижения аффинности скаффолда Tn3 относительно требуемого антигена. В другом варианте воплощения изобретения длина времени, предоставленного скаффолду Tn3 для связи с требуемым антигеном, уменьшена.

[0261] В другом варианте воплощения изобретения в анализ взаимодействия белок-белок может быть добавлен этап перекрестного связывания. Например, скаффолду Tn3 вначале могут дать связаться с требуемым иммобилизированным антигеном. Затем добавляют специфическую концентрацию неиммобилизированного антигена, что служит конкурентом иммобилизированному антигену, таким образом, скаффолды Tn3 с более низкой аффинностью к антигену элюируют из иммобилизированного антигена, что приводит к селекции скаффолдов Tn3 с повышенной аффинностью связывания антигена. Строгость условий анализа может быть дополнительно повышена путем увеличения концентрации неиммобилизированного антигена, добавляемого в анализ.

[0262] Способы скрининга также могут потребовать проведения множественных раундов селекции для обогащения одного или более скаффолдов Tn3 с улучшенным связыванием антигена. В одном варианте воплощения изобретения на каждом раунде селекции в скаффолд Tn3 вводят дополнительные мутации аминокислот. В другом варианте воплощения изобретения на каждом раунде селекции повышают строгость связывания с требуемым антигеном для селекции скаффолдов Tn3 с повышенной аффинностью относительно антигена.

[0263] В некоторых вариантах воплощения изобретения созревания аффинности проводят насыщающий мутагенез участков петель ВС, DE и FG Tn3. В некоторых вариантах воплощения изобретения насыщающий мутагенез проводят с использованием мутагенеза по Кункелю. В других вариантах воплощения изобретения насыщающий мутагенез проводят с использованием ПЦР.

[0264] В некоторых вариантах воплощения изобретения проводят, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или более пяти раундов созревания аффинности. В некоторых вариантах воплощения изобретения насыщающий мутагенез проводят только для одной петли, в то время как в других вариантах воплощения изобретения только одна петля или участок петли подвергается мутации во время одного раунда созревания аффинности. В некоторых вариантах воплощения изобретения более чем одна петля или участок одной или более петель мутирует во время одного и того же раунда созревания аффинности.

[0265] В других вариантах воплощения изобретения петли ВС, DE и FG мутируют одновременно во время одного и того же раунда созревания аффинности.

[0266] В случае скаффолдов Tn3 при сборке в мультимерные скаффолды, связывающиеся с различными антигенными детерминантами на одной и той же мишени, или в случае биспецифических скаффолдов Tn3, каждая специфичность связывания должна быть подвергнута независимому скринингу. В соответствии с этим, в некоторых вариантах воплощения изобретения первый скрининг для идентификации отдельных связующих молекул Tn3, связывающихся с первой мишенью, например, TRAIL R2, проводят с использованием первой библиотеки скаффолдов Tn3, в которой изменены одна или более аминокислот в одной или более петлях. В некоторых вариантах воплощения изобретения может быть выполнен дополнительный скрининг для идентификации отдельных молекул Tn3, связывающихся с различными мишенями или различными антигенными детерминантами на одной и той же мишени.

[0267] В некоторых вариантах воплощения изобретения петли рандомизированы с использованием библиотеки фаговых дисплеев. В некоторых вариантах воплощения изобретения связывание скаффолда Tn3 с требуемой мишенью может быть определено с использованием известных в науке способов. Кроме того, аминокислотные последовательности скаффолдов Tn3, идентифицированные в ходе скрининга, могут быть определены с использованием известных в науке способов.

[0268] В некоторых вариантах воплощения изобретения мономерные скаффолды с созревшей аффинностью по изобретению обладают повышенной аффинностью относительно TRAIL R2, которая, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере, в 20 раз, по меньшей мере, в 40 раз, по меньшей мере, в 60 раз, по меньшей мере, в 80 раз, или, по меньшей мере, в 100 раз или более больше в сравнении с подобным скаффолдом Tn3 до созревания аффинности, как это измерено с использованием поверхностного плазмонного резонанса или любым другим способом анализа, известным в науке. В некоторых вариантах воплощения изобретения мономерные скаффолды с созревшей аффинностью по изобретению обладают константой диссоциации (K_d), составляющей менее чем 5 мкМ, менее чем 1 мкМ, менее чем 500 мкМ, менее чем 250 мкМ, менее чем 100 мкМ, или менее чем 50 мкМ, как это измерено с использованием поверхностного плазмонного резонанса или любым другим способом анализа, известным в науке.

[0269] Такие способы созревания аффинности могут быть использованы для разработки скаффолдов Tn3 с требуемыми улучшенными связующими свойствами, такими как повышенная аффинность и другие желаемые характеристики, такие как благоприятные фармакокинетические свойства, высокая активность, низкая иммуногенность, повышенная или пониженная перекрестная реакционоспособность с рецепторами TRAIL R2 из Других организмов и т.д.

Получение тандемных повторов

[0270] Связывание тандемных векторов может быть получено путем лигирования олигонуклеотидов в сайтах рестрикции с использованием рестриктаз, известных в науке, включая, но не ограничиваясь этим, рестриктазы типа II и типа IIS.

[0271] Мультимерные скаффолды Tn3 по изобретению могут включать линкер на С-конце и/или N-конце и/или между доменами, как это описано в тексте данной заявки. Кроме того, скаффолды по изобретению, включающие, по меньшей мере, 1, по меньшей мере, 2, по меньшей мере, 3, по меньшей мере, 4, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 7, по меньшей мере, 8 полипептидных скаффолдов, могут быть слиты или конъюгированы с доменом димеризации, включая, но не ограничиваясь этим, молекулу антитела, выбираемую из:

(i) фрагмента Fab с доменами VL, CL, VH и СН1;

(ii) фрагмента Fab’, представленного фрагментом Fab с одним или более остатками цистеина на С-конце домена СН1;

(iii) фрагмента Fd с доменами VH и СН1;

(iv) фрагмента Fd’ с доменами VH и СН1 и одним или более остатками цистеина на С-конце домена СН1;

(v) фрагмента Fv с доменами VL и VH одного плеча антитела;

(vi) фрагмента dAb, включающего домен VH;

(vii) выделенных участков CDR;

(viii) фрагментов F(ab’)2, двухвалентного фрагмента, включая два фрагмента Fab’, соединенных дисульфидных мостиком в шарнирном участке;

(ix) молекул одноцепочечных антител (например, одноцепочечного Fv; scFv);

(х) «диатела» с двумя свитами связывания антигена, включающими вариабельный домен тяжелой цепи (VH), присоединенный к вариабельному домену легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи;

(xi) «линейных антител», которые включают пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих участков;

(xii) антитела полной длины; и

(xiii) участка Fc, включающего СН2-СН3, которые могут дополнительно включать весь или часть шарнирного участка и/или участка СН1. В Примерах ниже приводятся пояснения различной валентности, аффинности и схемы пространственной ориентации.

Получение скаффолда

[0272] Рекомбинантная экспрессия скаффолда по изобретению требует построения вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий скаффолд. Как только получен полинуклеотид, кодирующий скаффолд, вектор для выработки скаффолда может быть получен с использованием способа рекомбинации ДНК известными в науке методами. Таким образом, в данной заявке на изобретение описаны способы получения белка путем экспрессии полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую скаффолд. Для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующий полипептид скаффолда, а также соответствующие контрольные сигналы транскрипции и трансляции специалистом в данной области могут использоваться широко известные в науке способы. Такие способы включают, например, in vitro способы рекомбинантной ДНК, способы синтеза и генная рекомбинация in vivo. Таким образом, изобретение описывает реплицируемые векторы, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую скаффолд по изобретению с присутствием промотора.

[0273] Вектор экспрессии переносится в клетку-хозяина с использованием стандартных способов, и трансфицированные клетки культивируются для получения скаффолда по изобретению с использованием стандартных способов. Таким образом, изобретение описывает клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий скаффолд по изобретению, функционально связанный с гетерологичным промотором. Подходящие клетки-хозяева включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е.coli и B.subtilis).

[0274] Для экспрессии скаффолдов по изобретению может использоваться целый ряд систем векторов экспрессии хозяев. Такие системы экспрессии клеток-хозяев представляют собой носители, с помощью которых могут быть получены необходимые кодирующие последовательности с их дальнейшей очисткой, а также представляют собой клетки, которые при трансформации или трансфицировании соответствующими последовательностями, кодирующими нуклеотиды, экспрессировать скаффолды по изобретению in situ. Они включают, но не ограничиваются, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е.coli и B.subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидную ДНК или векторы экспрессии ДНК космиды, включающие последовательности, кодирующие скаффолд, или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS, СНО, ВНК, 293, NSO и 3Т3).

[0275] Способы, используемые для получения скаффолдов по изобретению, описаны, например, в публикации No: WO 2009/058379. Как только получен скаффолд по изобретению путем рекомбинантной экспрессии, он может быть очищен с использованием любого известного в науке способа для очистки белка.

[0276] Получение скаффолдов по изобретению в исследовательской лаборатории может быть развернуто до получения скаффолдов в аналитических промышленных реакторах или реакторах производственного масштаба, таких как описаны в публикации патента США No. US 2010-0298541 A1.

Масштабируемое производство секретированных скаффолдов

[0277] Скаффолды Tn3 по изобретению могут быть получены внутриклеточно или в виде секретируемой формы. В некоторых вариантах воплощения изобретения секретируемые скаффолды надлежащим образом скручены и полностью функциональны. Скаффолды Tn3 по изобретению могут быть получены путем любого масштабируемого процесса. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды могут быть получены в ходе масштабируемого процесса по изобретению в исследовательской лаборатории, масштабы которого могут быть увеличены для производства скаффолдов по изобретению в аналитических биореакторах (например, но не ограничиваясь этим, биореакторах 5L, 10L, 15L, 30L или 50L). В других вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3 могут быть получены в ходе масштабируемого процесса по изобретению в исследовательской лаборатории, масштабы которого могут быть увеличены для производства скаффолдов Tn3 по изобретению в аналитических биореакторах (например, но не ограничиваясь этим, биореакторах 75L, 100L, 150L, 300L или 500L). В некоторых вариантах воплощения изобретения масштабируемый процесс по изобретению приводит к незначительному или отсутствию снижения эффективности производства в сравнении с производственным процессом, выполняемым в исследовательской лаборатории.

Линкеры

[0278] Скаффолды Tn3 в мультимерном скаффолде могут быть соединены белковыми и/или небелковыми линкерами, при этом каждый линкер слит, по меньшей мере, с двумя скаффолдами Tn3 по изобретению. Подходящий линкер может состоять из белкового линкера, небелкового линкера и их комбинации. Комбинации линкеров могут быть гомомерными или гетеромерными. В некоторых вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 по изобретению включает множество мономерных скаффолдов Tn3, при этом все линкеры идентичны. В других вариантах воплощения изобретения мультимерный скаффолд Tn3 включает множество мономерных скаффолдов Tn3, при этом, по меньшей мере, один линкер функционально или структурно отличается от других линкеров. В некоторых вариантах воплощения изобретения линкеры могут способствовать активности мультимерного скаффолда FnIII путем прямого или косвенного участия в связывании мишени.

[0279] В некоторых вариантах воплощения изобретения белковый линкер представлен полипептидом. Полипептидный линкер должен иметь длину, соответствующую для связывания двух или более мономерных скаффолдов по изобретению или двух или более мультимерных скаффолдов по изобретению таким образом, чтобы они обладали правильной конформацией относительно друг друга с сохранением необходимой активности.

[0280] В одном варианте воплощения изобретения полипептидный линкер включает от 1 до примерно 1000 аминокислотных остатков, от 1 до примерно 50 аминокислотных остатков, 1-25 аминокислотных остатков, 1-20 аминокислотных остатков, 1-15 аминокислотных остатков, 1-10 аминокислотных остатков, 1-5 аминокислотных остатков, 1-3 аминокислотных остатков. Изобретение дополнительно описывает нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, РНК или их комбинации, кодирующие последовательность полипептидного линкера. Аминокислотные остатки, выбранные для включения в полипептидный линкер, должны обладать свойствами не оказывать значительного воздействия на активность или функцию мультимерного скаффолда Tn3 по изобретению. Таким образом, полипептидный линкер в целом не должен иметь заряд, который бы не соответствовал активности или функции мультимерного скаффолда по изобретению, или влиять на внутреннее скручивание, или образовывать связи или другие взаимодействия с аминокислотными остатками в одном или более доменах мономера Tn3, что оказывало бы серьезное влияние на связывание мультимерного скаффолда по изобретению с TRAIL R2.

[0281] Использование встречающихся в природе и искусственных пептидных линкеров для соединения полипептидов в новые соединенные слитые полипептиды хорошо известно в литературе. Согласно этому, линкеры, слитые с двумя или более скаффолдами по изобретению, представлены естественными линкерами, искусственными линкерами или их комбинациями. В некоторых вариантах воплощения изобретения аминокислотные последовательности всех пептидных линкеров, присутствующих в мультимерном скаффолде по изобретению, идентичны. В других вариантах воплощения изобретения аминокислотные последовательности, по меньшей мере, двух пептидных линкеров, присутствующих в мультимерном скаффолде по изобретению, разные.

[0282] В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные линкеры обладают конформационной гибкостью. В специфическом варианте воплощения изобретения последовательность полипептидного линкера включает аминокислотную последовательность (G-G-G-G-S)_x, где x является положительным целым числом. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидный линкер представлен изначально неструктурированным естественным или искусственным полипептидом (см., например, Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27: 1186-1190, 2009; см. также Sickmeier etal., Nucleic Acids Res. 35: D786-93, 2007).

[0283] Пептидный линкер может быть модифицирован таким образом, что может быть введен аминокислотный остаток, включающий присоединенную группу для неполипептидной молекулы. Примеры таких аминокислотных остатков могут быть представлены остатком цистеина (к которому впоследствии присоединяется неполипептиднная молекула), или аминокислотная последовательность может включать сайт in vivo N-гликозилирования (что позволяет присоединить молекулу сахара (in vivo) к пептидному линкеру).

[0284] В некоторых вариантах воплощения изобретения аминокислотные последовательности всех пептидных линкеров, присутствующих в полипептидном мультимере, идентичны. С другой стороны, аминокислотные последовательности всех пептидных линкеров, присутствующих в полипептидном мультимере, могут отличаться.

Мечение или конъюгация скаффолдов

[0285] Скаффолды по изобретению могут использоваться в неконъюгированной форме или конъюгированы, по меньшей мере, с одной или целым рядом гетерологичных молекул для облегчения определения мишени или визуализации, или лечения. Скаффолды могут быть мечены или конъюгированы до или после очистки, при выполнении очистки.

[0286] К скаффолдам по изобретению могут быть присоединены гетерологичные молекулы с нехваткой подходящих функциональных групп. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения изобретения молекула эффектора присоединена к скаффолду посредством линкера, при этом линкер содержит реакционные группы для конъюгации. В некоторых вариантах воплощения изобретения гетерологичная молекула конъюгирована со скаффолдом по изобретению и может служить в качестве линкера. В других вариантах воплощения изобретения молекула конъюгирована со скаффолдом посредством линкера, который может быть расщепляемым или нерасщепляемым. В одном варианте воплощения изобретения молекула расщепляемого линкера представлена окислительно-восстановительной расщепляемой линкерной молекулой, такой как линкерная молекула, расщепляемая в среде с пониженным окислительно-восстановительным потенциалом, такой как цитоплазма и другие участки с повышенными концентрациями молекул с несвязанными сульфгидрильными группами. Примеры линкерных молекул, которые могут расщепляться при изменении окислительно-восстановительного потенциала, включают молекулы, содержащие дисульфиды.

[0287] В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению подвергают рекомбинации для обеспечения реакционных групп для конъюгации. В таких скаффолдах N-конец и/или С-конец также могут служить источником реакционных групп для конъюгации. В других вариантах воплощения изобретения N-конец может быть конъюгирован с одной молекулой (такой как, но не ограничиваясь этим, ПЭГ), в то время как С-конец конъюгирован с другой молекулой (такой как, но не ограничиваясь этим, биотин), или наоборот.

[0288] Термин «полиэтиленгликоль» или «ПЭГ» обозначает соединение полиэтиленгликоля или его производного с или без соединяющих агентов, соединяющих или активирующих молекул (например, с тиолом, трифлатом, трезилатом, азиридином, оксираном, N-гидроксисукцинимидом или малеимидом). Термин «ПЭГ» обозначает полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 500 до 150000 Да, включая его аналоги, при этом, например, терминальная ОН-группа замещена метоксигруппой (обозначается как мПЭГ).

[0289] Скаффолды по изобретению могут быть дериватизированы с полиэтиленгликолем (ПЭГ). ПЭГ является линейным, растворимым в воде полимером повторяющихся единиц этиленоксида с двумя терминальными гидроксильными группами. ПЭГ классифицируют по молекулярному весу, который обычно варьирует от примерно 500 дальтон до примерно 40000 дальтон. В специфическом варианте воплощения изобретения используемый ПЭГ имеет молекулярный вес, варьирующий от 5000 дальтон до примерно 20000 дальтон. ПЭГ, соединенный со скаффолдами по изобретению, может быть разветвленный или неразветвленный. См., например, Monfardini, С. et al. 1995 Bioconjugate Chem 6:62-69. ПЭГ представлены на рынке Nektar Inc., Sigma Chemical Co. и другими компаниями. Такие ПЭГ включают, но не ограничиваются этим, монометоксиполиэтиленгликоль (MePEG-OH), монометоксиполиэтиленгликоль-сукцинат (MePEG-S), монометоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидила сукцинат (MePEG-S-NHS), монометоксиполиэтиленгликоль-амин (MePEG-NH2), монометоксиполиэтиленгликоль-трезилат (MePEG-TRES) и монометоксиполиэтиленгликоль-имидазолил-карбонил (MePEG-1М).

[0290] Другими словами, используемый гидрофильный полимер, например, ПЭГ, присоединен на одном конце инертной группой, такой как метокси или этоксигруппа. Впоследствии полимер активируется на другом конце реакцией с подходящим активирующим агентом, таким как галиды циануровой кислоты (например, хлорид циануровой кислоты, бромид или фторид), карбонилдиимидазол, ангидрид (например, дигалосукциниловый ангидрид, такой как дибромосукциниловый ангидрид), ацил азид, р-диазония бензиловый эфир, 3-(р-диазонияфенокси)-2-гидроксипропиловый эфир) и т.п. Затем активированный полимер реагирует с полипептидом, как это описано в тексте данной заявки, с получением полипептида, дериватизированного полимером. С другой стороны, функциональная группа в скаффолдах по изобретению может быть активирована для реакции с полимером, или две группы могут быть соединены в ходе согласованной реакции соединения с использованием известных способов соединения. Дериватизация полипептидов по изобретению ПЭГ может быть проведена с использованием мириады других реакционных схем, известных и используемых специалистом в данной области. ПЭГ может быть соединен со скаффолдом по изобретению в одной или более функциональных группах на любом конце скаффолда или внутри скаффолда. В определенных вариантах воплощения изобретения ПЭГ соединен на N-конце или С-конце.

[0291] В других вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению, аналоги или их производные могут быть конъюгированы с диагностическим или определяемым агентом. Такие скаффолды могут использоваться для мониторинга или прогнозирования развития или прогрессирования заболевания как часть процедуры клинической оценки, такой как определение эффективности отдельной терапии.

[0292] Данное изобретение дополнительно описывает использование скаффолдов, конъюгированных с терапевтической молекулой. Скаффолд может быть конъюгирован с терапевтической молекулой, такой как цитотоксин, например, цитостатическим или цитоцидным агентом, терапевтическим агентом или ионом радиоактивного металла, например, альфа-излучателями. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, губительно действующий на клетки.

Анализ скаффолдов

[0293] Аффинность связывания и другие свойства связывания скаффолда с антигеном могут быть определены с использованием целого ряда способов анализов in vitro, известных в науке, включая, например, способы равновесия (например, иммуноферментный анализ (ИФА) или кинетики (например, анализ BIACORE*), и другие способы, такие как анализы непрямого связывания, анализы конкурентного связывания, гель-электрофорез и хроматография (например, гель-фильтрация). Эти и другие способы могут использовать мечение одного или нескольких компонентов, подвергаемых исследованию, и/или задействовать целый ряд способов определения, включая, но не ограничиваясь этим, хромогенные, флуоресцирующие, люминесцентные или изотопные метки. Подробное описание аффинности связывания и кинетики приводится в in Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4 th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).

[0294] В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению специфически связываются с мишенью со специфическими кинетическими параметрами. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению могут иметь константу диссоциации или K_d (k_off/k_on) менее чем 1×10^-2 M, 1×10^-3 M, 1×10^-4 M, 1×10^-5 M, 1×10^-6 M, 1×10^-7 M, 1×10^-8 M, 1×10^-9 M, 1×10^-10 M, 1×10^-11 M, 1×10^-12 М, 1×10^-13 M, 1×10^-14 M или менее чем 1×10^-15 М. В специфических вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению имеют значение K_d 500 мкМ, 100 мкМ, 500 нМ, 100 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 100 пМ или менее, как это определено анализом BIAcore® или другими известными в науке способами. В альтернативном варианте воплощения изобретения аффинность скаффолдов по изобретению описывают в понятиях константы ассоциации (К_а), которая рассчитывается как соотношение k_on/k_off, и составляет, по меньшей мере, 1×10² M^-1, 1×10³ M^-1, 1×10⁴ M^-1, 1×10⁵ М^-1, 1×10⁶ M^-1, 1×10⁷ M^-1, 1×10⁸ M^-1, 1×10⁹ M^-1, 1×10¹⁰ M^-1 1×10¹¹ M^-1 1×10¹² M^-1, 1×10¹³ M^-1, 1×10¹⁴ M^-1, 1×10¹⁵ M^-1, или, по меньшей мере, 5×10¹⁵ М^-1. В определенных вариантах воплощения изобретения скорость, при которой скаффолды по изобретению диссоциируют от антигенной детерминанты мишени, может быть более релевантной, чем значение K_d или К_а. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению имеют значение k_off менее чем 10^-3 с^-1, менее чем 5×10^-3 с^-1, менее чем 10^-4 с^-1, менее чем 5×10^-4 с^-1, менее чем 10^-5 с^-1, менее чем 5×10^-5 c^-1, менее чем 10^-6 с^-1, менее чем 5×10^-6 с^-1, менее чем 10^-7 с^-1, менее чем 5×10^-7 с^-1, менее чем 10^-8 с^-1, менее чем 5×10^-8 с^-1, менее чем 10^-9 с^-1, менее чем 5×10^-9 с^-1 или менее чем 10^-10 с^-1. В других определенных вариантах воплощения изобретения скорость, при которой скаффолды по изобретению ассоциируют с антигенной детерминантой мишени, может быть более релевантной, чем значение K_d или К_а. В этом случае скаффолды по изобретению связываются с мишенью со скоростью k_on, по меньшей мере, 10⁵ M^-1c^-1, по меньшей мере, 5×10⁵ M^-1c^-1, по меньшей мере, 10⁶ M^-1c^-1, по меньшей мере, 5×10⁶ M^-1c^-1, по меньшей мере, 10⁷ М^-1c^-1, по меньшей мере, 5×10⁷ М^-1с^-1, или, по меньшей мере, 10⁸ М^-1с^-1, или, по меньшей мере, 10⁹ М^-1с^-1.

[0295] Скаффолды по изобретению также могут быть присоединены к твердым субстратам, что может использоваться для иммуноанализов или очистки антигена-мишени. Такие твердые субстраты включают, но не ограничиваются этим, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирен, поливинилхлорид или полипропилен.

TRAIL R2-специфические скаффолды Tn3

[0296] Белок TRAIL R2 кодируется членом суперсемейства генов рецептора ФНО и содержит внутриклеточный домен смерти. В некоторых случаях он также может быть известен под названием TNFRSFIOB; CD262, DR5, KILLER, KILLER/DR5, TRAILR2, TRICK2 TRICK2A, TRICK2B, TRICKB или ZTNFR9. Этот рецептор может быть активирован лигандом, индуцирующим апоптоз, обусловленный фактором некроза опухолей (TNFSF 10/TRAIL/APO-2L), и передать апоптозный сигнал. Кроме того, апоптоз, индуцированный TRAIL R2, вовлекает каспазы и внутриклеточную адаптер-молекулу FADD/MORT1 (Walczak et al. EMBOJ, (1997), 16, 5386-97).

[0297] Изобретение описывает скаффолды Tn3, которые специфически связываются с TRAIL R2. В специфических вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению специфически связываются с TRAIL R2 человека. В других специфических вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению Tn3 связываются с гомологами TRAIL R2, полученными из мыши, цыпленка, макаки Резус, яванского макака, крысы или кролика. В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению Tn3 связываются с обнаженной антигенной детерминантой TRAIL R2. Такие варианты воплощения изобретения включают TRAIL R2, который эндогенно экспрессируется на клетках и/или клетках, трансфицированных для эктопической экспрессии рецептора.

[0298] В других вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению Tn3 распознают антигенные детерминанты, отображаемые на мономерном TRAIL R2. В других вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению Tn3 распознают антигенные детерминанты, отображаемые на гомодимерной форме TRAIL R2. В еще одних вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению Tn3 связывают мономерные формы TRAIL R2 и облегчают димеризацию или олигомеризацию 2 или более молекул TRAIL R2 (например, но не ограничиваясь этим, мультимерных скаффолдов). В еще одних вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению снижают или ингибируют взаимодействие TRAIL R2 с лигандом TRAIL. В других вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению имитирует взаимодействие лиганда TRAIL с TRAIL R2, В дополнительных вариантах воплощения изобретения скаффолды по изобретению Tn3 агонизируют клеточную сигнализацию TRAIL-R2.

[0299] Изобретение также описывает способы модуляции активности TRAIL R2 с использованием описанных здесь скаффолдов Tn3. В некоторых вариантах воплощения изобретения способы по изобретению включают контакт клетки, экспрессирующей TRAIL R2, с TRAIL R2-специфическими скаффолдами и блокирование взаимодействия с лигандом TRAIL. В других вариантах воплощения изобретения способы по изобретению включают контакт клетки, экспрессирующей TRAIL R2, с TRAIL R2-специфическими скаффолдом Tn3 и имитацию взаимодействия лиганда TRAIL с TRAIL R2.

[0300] В других вариантах воплощения изобретения способы по изобретению включают агонию TRAIL R2 путем контакта с TRAIL R2-специфическим скаффолдом Tn3. В других вариантах воплощения изобретения способы по изобретению включают димеризацию или олигомеризацию TRAIL R2 путем контакта мономера TRAIL R2, экспрессируемого на клетках, с TRAIL R2-специфическим скаффолдом, а также облегчение димеризации или олигомеризации. В дополнительных вариантах воплощения изобретения димеризация TRAIL R2 может быть достигнута посредством использования, например, но не ограничиваясь этим, мультимерных скаффолдов Tn3, которые: имитируют димеры TRAIL R2, стабилизируют образование димера TRAIL R2, дестабилизируют мономеры TRAIL R2 или только распознают димеры TRAIL R2, расположенные на клетках.

[0301] В других вариантах воплощения изобретения димеризация или олигомеризация TRAIL R2 может достигаться посредством использования мономерных скаффолдов Tn3, соединенных с агентами димеризации или олигомеризации скаффолдов. Такие агенты димеризации или олигомеризации скаффолдов могут включать, например, но не ограничиваясь этим, антитело к скаффолду, использование скаффолдов с тэгами антигенных детерминант, соединенных с антителами и тэгами атигенных детерминант, или введение различных мотивов димеризации или олигомеризации белка, описанных в тексте данной заявки и известные в науке. В дополнительном варианте воплощения изобретения димеры или олигомеры TRAIL R2 могут быть введены путем введения мономерных скаффолдов с последующим введением агента димеризации или олигомеризации скаффолда.

[0302] В некоторых вариантах воплощения изобретения способы по изобретению включают введение TRAIL R2-специфического скаффолда, который снижает жизнеспособность клеток, как это измерено с использованием общепринятых в науке анализов. В дополнительных вариантах воплощения изобретения снижение жизнеспособности клеток состоит в активации апоптоза, как это измерено с использованием общепринятых в науке анализов. В других вариантах воплощения изобретения снижение жизнеспособности клеток состоит в ингибировании деления клеток, как это измерено с использованием общепринятых в науке способов. В некоторых вариантах воплощения изобретения жизнеспособность клеток снижена, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90% или более в сравнении с жизнеспособностью клеток в отсутствие лечения.

[0303] В некоторых вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению, связывающие TRAIL R2, агонизируют TRAIL R2 с подобной активностью, что и лиганд TRAIL R2, известный как TRAIL. В других вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению, связывающие TRAIL R2, способны по существу активировать TRAIL R2, что приводит к активации одного или более внутриклеточных сигнальных путей, включая активацию каспазы 3, каспазы 8, каспазы 10 или FADD. В других вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению, связывающие TRAIL R2, активируют апоптоз, по меньшей мере, в раковых клетках одного типа. В дополнительных вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению, связывающие TRAIL R2, демонстрируют усиленную активацию апоптоза, по меньшей мере, в клетках одного типа, в сравнении с TRAIL.

[0304] В других вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению, связывающие TRAIL R2, могут связываться или конкурировать за связывание с одной и той же антигенной детерминантой на TRAIL R2, что и TRAIL (лиганд). В таких вариантах воплощения изобретения скаффолды, связывающие TRAIL R2, способны блокировать или ингибировать взаимодействие TRAIL R2 с TRAIL, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90% или более, что может быть определено в ходе анализа конкурентного связывания in vitro с использованием растворимого лиганда TRAIL (такого как фрагмент 114-281 лиганда TRAIL), кристаллографических исследований или других известных исследований in vivo или in vitro.

Способы использования Tn3 TRAIL R2-специфических скаффолдов в лечении

[0305] Известно, что TRAIL R2 опосредует сигнализацию апоптоза. Несмотря на то, что TRAIL R2 экспрессируют несколько типов здоровых клеток, передача сигнала апоптоза посредством такого рецептора ограничена преимущественно опухолевыми клетками, которые становятся более восприимчивыми к апоптозу, опосредованному рецептором смерти в контексте своей трансформации под действием онкогенов, таких как Мус или Ras (Wang et al., Cancer Cell 5: 501-12 (2004); Nesterov et al., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). TRAIL R2 часто экспрессируется линиями раковых клеток человека, а также клетками первичных опухолей.

[0306] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические скаффолды по изобретению вводятся субъекту, нуждающемуся в лечении (т.е. пациенту с раком). В таких вариантах воплощения изобретения нуждающемуся субъекту вводят стерильную, апирогенную композицию, включающую TRAIL R2-специфический скаффолд. Эффективность лечения может быть измерена с использованием целого ряда анализов in vitro и in vivo, которые хорошо известны в науке и включают, но не ограничиваясь этим, апоптозную активность, использование активации каспазой связывания аннексина V, а также снижение опухолевой нагрузки или объема опухоли.

[0307] В других вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические скаффолды по изобретению используют для диагностики и определения рака или других заболеваний, связанных с TRAIL R2. В таких вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические скаффолды по изобретению присоединены к агенту для определения, такому как, но не ограничиваясь этим, радиоизотопу, флуоресцентной или хемилюминесцентной метке. Такие присоединенные агенты используют в способах для определения или диагностики рака или заболеваний, связанных TRAIL R2, у субъекта, или в образце, взятом у такого субъекта. Кроме того, TRAIL R2-специфические скаффолды используют в диагностике и лечении других связанных с TRAIL R2 патологических состояний, таких как иммунные заболевания у млекопитающих, включая человека.

Специфические связующиеся последовательности TRAIL R2

[0308] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 по изобретению включают, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или, по меньшей мере, шесть петлевых последовательностей, связывающихся с TRAIL R2.

[0309] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 по изобретению включают, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или, по меньшей мере, шесть петлевых последовательностей клонов мономерного скаффолда, связывающихся с TRAIL R2, выбираемых из: 1С12 (SEQ ID NO: 132), G3 (SEQ ID NO: 133), 1E11 (SEQ ID NO: 134), C4 (SEQ ID NO: 135), С11 (SEQ ID NO: 136), F4 (SEQ ID NO: 137) и G6 (SEQ ID NO: 138).

[0310] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 включают, по меньшей мере, одну петлевую последовательность, выбираемую из последовательностей петель, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4. В других вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 включают, по меньшей мере, одну петлевую последовательность ВС, выбираемую из последовательностей петель ВС, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4. В других вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 включают, по меньшей мере, одну петлевую последовательность DE, выбираемую из последовательностей петель DE, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4. В других вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 включают, по меньшей мере, одну петлевую последовательность FG, выбираемую из последовательностей петель FG, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4.

[0311] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 включают последовательность петли ВС, выбираемую из последовательностей петель ВС, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4; и последовательность петли DE, выбираемую из последовательностей петель DE, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4. В других вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды включают последовательность петли ВС, выбираемую из последовательностей петель ВС, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4; и последовательность петли FG, выбираемую из последовательностей петель FG, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4. В других вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические скаффолды включают последовательность петли DE, выбираемую из последовательностей петель DE, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4; и последовательность петли FG, выбираемую из последовательностей петель FG, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 4. В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 включают последовательность петли из одного, двух или трех различных клонов Tn3.

[0312] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 представлены линейными мультимерами, например, димерами, такими как 1Е11 тандем 2 скаффолда SEQ ID NO: 139, тетрамерами, такими как 1Е11 тандем 4 скаффолда SEQ ID NO: 140 или G6 тандем 4 скаффолда SEQ ID NO: 143, гексамерами, такими как 1Е11 тандем 6 скаффолда SEQ ID NO: 141, G6 тандем 6 скаффолда SEQ ID NO: 144 или F4mod12 тандем 6 SEQ ID NO: 167, или октамерами, такими как 1Е11 тандем 8 скаффолда SEQ ID NO: 142, G6 тандем 8 скаффолда SEQ ID NO: 145, или F4mod12 тандем 8 скаффолда SEQ ID NO: 166.

[0313] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 представлены слияниями с Fc, например, слиянием 1С12 Fc SEQ ID NO: 149, G3 Fc слиянием SEQ ID NO: 150, 1E11 Fc слиянием SEQ ID NO: 151, C4 Fc слиянием SEQ ID NO: 152, или G6 Fc слиянием SEQ ID NO: 153.

[0314] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 представлены антителоподобными слияниями, например, скаффолдом, полученным в результате ассоциации скаффолда константного участка тяжелой цепи 1С12 IgG1 SEQ ID NO: 154 с 1С12 скаффолдом каппа легкой цепи SEQ ID NO: 155, скаффолдом, полученным в результате ассоциации скаффолда тяжелой цепи G3 IgG1 SEQ ID NO: 156 с G3 скаффолдом каппа легкой цепи SEQ ID NO: 157, скаффолдом, полученным в результате ассоциации скаффолда тяжелой цепи 1E11 IgG1 SEQ ID NO: 158 со 1E11 скаффолдом каппа легкой цепи SEQ ID NO: 159, скаффолдом, полученным в результате ассоциации скаффолда тяжелой цепи C4 IgG1 SEQ ID NO: 160 со C4 скаффолдом каппа легкой цепи SEQ ID NO: 161, или скаффолдом, полученным в результате ассоциации скаффолда тяжелой цепи G6 IgG1 SEQ ID NO: 162 со G6 скаффолдом каппа легкой цепи SEQ IDNO: 163.

[0315] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 комбинируют форму слияния Fc с линейной формой, например, тандема 1E11 2 Fc слияния SEQ ID NO: 164, или 1E11 тандема 4 Fc слияния SEQ ID NO: 165.

[0316] В определенных вариантах воплощения изобретения, если TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 включают линкер и/или гистидиновый тэг на С-конце последовательности, такой С-терминальный линкер и/или гистидиновый тэг может быть удален, таким образом, соответствующая аминокислотная последовательность будет включать делецию в последовательностях С-терминального линкера и гистидинового тэга.

[0317] В некоторых вариантах воплощения изобретения TRAIL R2-специфические мономерные скаффолды Tn3 конъюгированы с ПЭГ. В специфических вариантах воплощения изобретения скаффолды F4mod12 тандема 6 (SEQ ID NO: 167) или F4mod12 тандема 8 (SEQ ID NO: 166) конъюгированы с ПЭГ. В дополнительных вариантах воплощения изобретения ПЭГ конъюгирован на N-конце или С-конце молекулы мультимерного скаффолда.

Фармацевтические композиции

[0318] В другом аспекте данное изобретение описывает композицию, например, но не ограничиваясь этим, фармацевтическую композицию, состоящую из одного или комбинации скаффолдов или мультимерных скаффолдов по данному изобретению, а также фармацевтически приемлемого носителя. Такие композиции могут включать один или комбинацию, например (но не ограничиваясь этим), двух или более различных скаффолдов по изобретению. Например, фармацевтическая композиция по изобретению может состоять из комбинации скаффолдов, которые связываются с различными антигенными детерминантами на антигене-мишени или обладающие комплементарной активностью. В специфическом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция включает мультимерный скаффолд по изобретению.

[0319] Фармацевтические композиции по изобретению также могут вводиться в ходе комбинированной терапии, например, комбинированной с другими агентами. Например, комбинированная терапия может состоять из скаффолда по данному изобретению, комбинированного с, по меньшей мере, одной другой терапией, при этом такая терапия может быть представлена иммунотерапией, химиотерапией, лучевой терапией или терапией лекарственными средствами. Фармацевтические соединения по изобретению могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей.

Фармацевтические дозы и введение

[0320] Для приготовления фармацевтических или стерильных композиций, включая скаффолд Tn3 по изобретению, скаффолд смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом. Выбор режима введения для лечения зависит от нескольких факторов, включая скорость циркуляции в сыворотке или ткани, степень выраженности симптомов, иммуногенности вещества, а также доступность клеток-мишеней в биологическом матриксе. В определенных вариантах воплощения изобретения режим введения максимально повышает количество лекарственного средства, доставленного пациенту, что соответствует приемлемому уровню побочных эффектов. Фактически уровни дозы активных действующих веществ в фармацевтических композициях по данному изобретению могут различаться для получения количества активного действующего вещества, эффективного для достижения необходимого терапевтического ответа для отдельного пациента, а также разработки пути введения без какой-либо токсичности для пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от целого ряда фармакокинетических факторов, включая активность отдельных композиций по данному изобретению, или их эфиров, соли или амида, путь введения, время введения, степень экскреции отдельного используемого соединения, длительность лечения, другие препараты и/или материалы, используемые в комбинации с отдельными используемыми композициями, пол, возраст, вес, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую историю болезни подвергнутого лечению пациента, а также подобные факторы, известные медицинской науке.

[0321] Композиция по данному изобретению также может быть введена посредством одного или нескольких путей введения с использованием одного или нескольких способов, известных науке. В определенных вариантах воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению могут быть разработаны таким образом, чтобы обеспечить надлежащее распределение in vivo.

Способы использования скаффолдов

[0322] Скаффолды Tn3 по данному изобретению используют в in vitro и in vivo диагностических и лечебных целях. Например, такие молекулы могут быть введены в клетки в культуре, например, in vitro или ex vivo, или пациенту, например, in vivo, для лечения, профилактики или диагностики целого ряда расстройств.

[0323] Кроме того, следствием перекрестного связывания субъединиц является активация или деактивация множества рецепторов клеточной поверхности. Скаффолды Tn3 по изобретению могут использоваться для стимуляции или ингибирования ответа в клетке-мишени путем образования перекрестных связей с рецепторами клеточной поверхности, такими как TRAIL R2. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению могут использоваться для блокирования взаимодействия множественных рецепторов клеточной поверхности с антигенами. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению могут использоваться для усиления взаимодействия множественных рецепторов клеточной поверхности с антигенами. В другом варианте воплощения изобретения возможно образование перекрестных связей с гомо- или гетеродимерами рецепторов клеточной поверхности с использованием скаффолдов Tn3 по изобретению, содержащих связующиеся домены, которые обладают специфичностью к одному и тому же антигену, или связываться с двумя различными антигенами. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению могут использоваться для доставки лиганда или аналога лиганда к специфическому рецептору клеточной поверхности.

[0324] Изобретение также описывает способы связывания с антигенными детерминантами, что не всегда сопровождается использованием традиционных антител. Например, в одном варианте воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению могут использоваться для первичного связывания прилегающего антигена, и после связывания для связывания требуемого антигена может использоваться другой связующий домен.

[0325] Изобретение также описывает способы использования скаффолдов Tn3 по изобретению для привлечения клеток различных типов. В одном варианте воплощения изобретения скаффолды по изобретению могут связываться с клеткой-мишенью с одним связующим доменом и задействовать другую клетку посредством другого связующего домена. В другом варианте воплощения изобретения первая клетка может быть представлена раковой клеткой, и вторая клетка представлена иммунной эффекторной клеткой, такой как NK-клетка. В другом варианте воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению могут использоваться для усиления взаимодействия между двумя различными клетками, такими как антигенпредставляющая клетка и Т-клетка для возможного усиления иммунного ответа.

[0326] Изобретение также описывает способы использования скаффолдов Tn3 для ослабления, лечения или профилактики рака или его симптомов. В одном варианте воплощения изобретение описывает способ использования скаффолдов Tn3 по изобретению для снижения популяций TRAIL-резистентных клеток. В этом отношении скаффолды Tn3 по изобретению могут использоваться для лечения определенных типов рака, устойчивых к лечению.

[0327] Изобретение также описывает способы использования скаффолдов Tn3 по изобретению для снижения популяции клеток. В одном варианте воплощения изобретения способы по изобретению используют для снижения количества клеток следующих типов: эозинофилы, базофилы, нейтрофилы, Т-клетки, В-клетки, тучные клетки, моноциты и опухолевые клетки. Изобретение также описывает способы использования скаффолдов для инактивации, ингибирования или снижения популяции цитокинов. Изобретение также описывает способы использования белковых скаффолдов Tn3 в качестве диагностических реагентов. В этом отношении в некоторых вариантах воплощения изобретения связывание скаффолдов Tn3 по изобретению с рецепторами TRAIL R2 может использоваться в диагностике для определения клеток, экспрессирующих TRAIL R2. В других вариантах воплощения изобретения способность скаффолдов Tn3 по изобретению дифференцировать между популяциями клеток, резистентными к TRAIL, но чувствительными к миметикам TRAIL, и клеточными популяциями, резистентными к TRAIL и миметикам TRAIL (см., например, Пример 19), может использоваться в диагностических целях. Скаффолды Tn3 по изобретению могут использоваться в наборах или реагентах, если конкурентным образом необходимо эффективно захватить различные антигены. Также предусматривается, что рак, вызванный аберрациями в апоптозе, может быть подвергнут лечению с использованием способов и композиций по изобретению.

[0328] В другом варианте воплощения изобретение описывает способы профилактики, ведения, лечения или ослабления симптомов рака. TRAIL R2-специфический мультимерный скаффолд Tn3 может использоваться для лечения рака, например, рака легкого, неходжкинской лимфомы, рака яичника, рака толстого кишечника, колоректального рака, рака поджелудочной железы и множественной миеломы. Лечение рака с использованием TRAIL R2-специфического мультимерного Tn3 может дополнительно включать дополнительную терапию, такую как иммунотерапия, терапия биопрепаратами, химиотерапия, лучевая терапия или терапия низкомолекулярными препаратами.

[0329] Способы лечения рака могут включать введение нуждающемуся в этом субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более скаффолдов Tn3 по изобретению в комбинации с операцией или в дополнительной комбинации с введением стандартной или экспериментальной химиотерапии, гормональной терапии, терапии биопрепаратами/иммунотерапии и/или лучевой терапии. В соответствии с такими вариантами воплощения изобретения скаффолды Tn3 по изобретению, используемые для профилактики, ведения, лечения или снижения симптомов рака, аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваний или одного или более симптомов данных заболеваний, могут быть конъюгированы/неконъюгированы или слиты с молекулой (например, терапевтическим агентом или препаратом).

Эквиваленты

[0330] Специалист в данной области сможет установить множество эквивалентов специфическим вариантам воплощения изобретения для выполнения стандартных тестов. Такие эквиваленты должны удовлетворять представленной ниже формуле изобретения.

[0331] Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в данной заявке и включенные сюда посредством ссылки, включены в такой же самой степени, что и отдельные публикации, патент или патентные заявки, что отдельным образом и индивидуально указано здесь посредством ссылки. Данная заявка истребует приоритет относительно временной заявки на патент США No.61/323708 от 13 апреля 2010 г., содержание которой включено сюда во всей своей полноте посредством ссылки. Кроме того, в текст данной заявки во всей своей полноте и посредством ссылки включена заявка РСТ No. PCT/US2008/012398 от 10 октября 2008 г и опубликованная как международная публикация No. WO 2009/058379 А2.

ТАБЛИЦА 1
Последовательности и SEQ ID No молекулярных компонентов для сборки репрезентативных скаффолдов по изобретению
Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
Tn3	IEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT (остатки цистеина дисульфидной связи подчеркнуты)	1
SS3	IEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYCVSLISRRGDMSSNPAKECFTT (остатки цистеина дисульфидной связи подчеркнуты)	2
Tn3+SS3	IEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGCELTYGIKDVPGDRTTDLTEDENQYSIGNLKPDTEYCVSLICRRGDMSSNPAKECFTT (остатки цистеина дисульфидной связи подчеркнуты)	3
3й FnIII тенасцина С	RLDAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLISRRGDMSSNPAKETFTT	4

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
(w/N-term aa)	(подчеркнутые остатки А бета цепи могут быть удалены)
10й FnIII фибронектина	LEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT	5
3й FnIII фибронектина	PTVDQVDDTSIVVRWSRPQAPITGYRIVYSPSVEGSSTELNLPETANSVTLSDLQPGVQYNITIYAVEENQESTPVVIQQET	6
6й FnIII фибронектина	PYNTEVTETTIVITWTPAPRIGFKLGVRPSQGGEAPREVTSDSGSIVVSGLTPGVEYVYTIQVLRDGQERDAPIVNKVVT	7
FnIII из гормона роста R	PPIALNWTLLNVSLTGIHADIQVRWEAPRNADIQKGWMVLEYELQYKEVNETKWKMMDPILTTSVPVYSLKVDKEYEVRVRSKQRNSGNYGEFSEVLYVTLP	8
FnIII из β общий R	PPSLNVTKDGDSYSLRWETMKMRYEHIDHTFEIQYRKDTATWKDSKTETLQNAHSMALPALEPSTRYWARVRVRTSRTGYNGIWSEWSEARSWDTE	9
FnIII из ИЛ-5R	PPVNFTIKVTGLAQVLLQWKPNPDQEQRNVNLEYQVKINAPKEDDYETRITESKIVTILHKGFSASVRTILQNDHSLLASSWASAELHA	10
29й FnIII из тенасцина ХВ	LSVTDVTTSSLRLNWEAPPGAFDSFLLRFGVPSPSTLEPHPRPLLQRELMVPGTRHSAVLRDLRSGTLYSLTLYGLRGPHKADSIQGTART	11
31й FnIII из тенасцина ХВ	LRALNLTEGFAVLHWKPPQNPVDTYDIQVTAPGAPPLQAETPGSAVDYPLHDLVLHTNYTATVRGLRGPNLTSPASITFTT	12
32й FnIII из тенасцина ХВ	LEAKEVTPRTALLTWTEPPVRPAGYLLSFHTPGGQTQEILLPGGITSHQLLGLFPSTSYNARLQAMWGQSLLPPVSTSFTT	13
Разветвленный 3й FnIII из тенасцина С	IEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLISRRGDMSSNPAKETFTT	14
FnIII - гормон роста R	PKFTKCRSPERETFSCHWTDEVHHGTKNLGPIQLFYTRRNTQEWTQEWKECPDYVSAGENSCYFNSSFTSIWIPYCIKLTSNGGTVDEKCFSV	15
FnIII из PTPR-F	PSGFPQNLHVTGLTTSTTELAWDPPVLAERNGRIISYTVVFRDINSQQELQNITTDTRFTLTGLKPDTTYDIKVRAWTSKGSGPLSPSIQSRTMPVE	16
FnIII из PTPR-F	PKPPIDLVVTETTATSVTLTWDSGNSEPVTYYGIQYRAAGTEGPFQEVDGVATTRYSIGGL	17

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
	SPFSEYAFRVLAVNSIGRGPPSEAVRARTGE
FnIII из коллагена типа XIV	LSPPRNLRISNVGSNSARLTWDPTSRQINGYRIVYNNADGTEINEVEVDPITTFPLKGLTPLTEYTIAIFSIYDEGQSEPLTGVFTT	18
3й FnIII из тенасцина С-вариант	IEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIQLTYGIKDVPGDRTTINLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLISRRGDMSSNPAKQTFTT	19
Archaeoglobus fulgidus DSM 4304	PAISNVRVSDVTNSSATIRWDVSLAANNRVLFSTNSDLSSPQWSAWDNSTDSPMITLSGLSAGTAYYFSVYSFRPDNASLYSNSSIMSFTT	20
NCBI Acc. #:
NC_000917
Staphylothermus marinus F1	SEPQNLKATAGNNNITLTWDPPIDDGGCRIVEYRIYRGTNNNNLEYYASVNGSTTTFIDKNIVYSQTYYYKVSAVNNIVEGPKSNTASATPTSS	21
NCBI Acc.#:
NC_009033
Sulfolobus acidocaldarius DSM 639	PPPKPVIRFAQAGNNSISLSWYDTNTSGYYIQWWSSIDNNKSTINVGNVSSYLFINLTNGVTYYFRIIPYNQAGNGTSSDIISLTPGAV	22
NCBI Acc. #:
NC_007181
1й FnIII
Sulfolobus acidocaldarius DSM 639	PDSPSVKVIVGDRNATVIWSKPYNGGFPILGYYLTVKTDNSSYTINVGNVSKYTLTNLTPEVLYEVMVVAYNKLGNSSPGIVNFVALTT	23
NCBI Acc. #:
NC_007181
2й FnIII
Sulfolobus acidocaldarius	LTTASISVSVYKKVNGVLISWNKTENTTYNLLISDKKGKIIVNITTTNTSYFAYIPYGIYNVTIRATNQVGTNSTSFPIVFYIPPFI	24

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
DSM 639
NCBI Acc. #:
NC_007181
3й FnIII
Sulfolobus acidocaldarius DSM 639	PLVKFSIGNNSILNLKWNNVTGATFYLVYVNTTLIANVTTDSYSLNLTPGFHVIRVVAANPIYNSSPASLGILIQQHSVTSSIT	25
NCBI Acc. #:
NC_007181
4й FnIII
Sulfolobus solfataricus P2	PLPPKITSYSAGNESVTLGWNPVRLSSGYEIIYWNNMGFNSSINVGNVTSYTVTGLKDGITYYFEVLAYNSIGYSSPSSIIALTPASV	26
NCBI Acc. #:
NC_002754
1й FnIII
Sulfolobus solfataricus P2	PNPPQLVSVKYGNDNVTLNWLPPTFSGGYLLLGYYVIVKNENSMVSSHFVNSTSLTISNLTPNVTYNVFIYAVNKLGNSSPLVLTVVPITKA	27
NCBI Acc. #:
NC_002754
2й FnIII
Sulfolobus solfataricus P2	PITKASVFAFITKLGNGILVNWTTSFPANITLELYNPNGNLISQIAAIKGNSSYLFRVPQGNYTLVIIASNSAGVSKYVYQVVYYL	28
NCBI Acc. #:
NC_002754
3й FnIII
Sulfolobus solfataricus P2	PPASPQVSLIGFGNNLYISWNNEANVITYLVYVNNSLVYEGPSNSIVTNISNGTYLVKVIGVNPAGSSSPGIAVIHYTGDYVT	29

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
NCBI Acc. #:
NC_002754
4й FnIII
Sulfolobus tokodaii str.7	PPKPQIASIASGNETITVKWYDTNASGYYITYWSNFSQKVTINVGNVTSYTIKHLKDGVTYYIQIVPYNSLGNGTPSDIISATPSSV	30
NCBI Acc. #:
NC_003106
1й FnIII
Sulfolobus tokodaii str.7	PNPPIIKVKIGNLNATLTWYDTFNGGYPIEGYYLYVNGKGINVGNITSYVLTNLTAGELYTIELIAYNKIGNSSISSVSFIAASKA	31
NCBI Acc. #:
NC_003106
2й FnIII
Sulfolobus tokodaii str.7	ASKANLTVTVYKKINGFLVSWNSTSKAKYILTVSKENVVLLNVSTTNTSYFVKVPFGVYNISLEAVNIVGITKYAFILIYYIQ	32
NCBI Acc. #:
NC_003106
3й FnIII
Sulfolobus tokodaii str.7	PASPTVNWSITLNTVSLNWSKVSGAEYYLIYDNGKLITNTTNTAFTFNLTIGQNEIEVYAANAYYKSAPYIINDVRNYIVV	33
NCBI Acc. #:
NC_003106
4й FnIII
14й FnIII фибронектина	ARVTDATETTITISWRTKTETITGFQVDAVPANGQTPIQRTIKPDVRSYTITGLQPGTDYKIYLYTLNDNARSSPWIDAST	34
3й FnIII тенасцина С, АВ петля	KDVTDTT	35

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
3й FnIII тенасцина С, ВС петля	FKPLAEIDG	36
3й FnIII тенасцина С, CD петля	KDVPGDR	37
3й FnIII тенасцина С, DE петля	TEDENQ	38
3й FnIII тенасцина С, EF петля	GNLKPDTE	39
3й FnIII тенасцина С, FG петля	RRGDMSSNPA	40
3й FnIII тенасцина С, А бета цепь	RLDAPSQIEV	41
3й FnIII тенасцина С, бета-цепь A N-терминальное разветвление	IEV	42
3й FnIII тенасцина С, В бета цепь	ALITW	43
3й FnIII тенасцина С, С бета цепь	IELTYGI	44

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
3й FnIII тенасцина С, С бета цепь (Tn3)	CELTYGI	45
3й FnIII тенасцина С, D бета цепь	TTIDL	46
3й FnIII тенасцина С, Е бета цепь	YSI	47
3й FnIII тенасцина С, F бета цепь	YEVSLIS	48
3й FnIII тенасцина С, F бета цепь (Tn3)	YEVSLIC	49
3й FnIII тенасцина С,F бета цепь (SS3)	YCVSLIS	50
3й FnIII тенасцина С, F бета цепь (Tn3+SS3)	YCVSLIC	51
3й FnIII тенасцина С, G бета цепь	KETFTT	52
3й FnIII тенасцина С, G бета цепь (SS3 и Tn3+SS3)	KECFTT	53

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ IDNO
WT 10 FnIII фибронектина	VSDVPRDLEWAATPTSLL1SWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISG LKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT	54
(с N-терм аа)	(подчеркнутые остатки А бета цепи могут быть удалены)
WT 10 FnIII фибронектина,АВ петля	VAATPTS	55
WT 10 FnIII фибронектина,ВС петля	DAPAVTVRY	56
WT 10 FnIII фибронектина,CD петля	TGGNSPV	57
WT 10 FnIII фибронектина,DE петля	PGSKST	58
WT 10 FnIII фибронектина,EF петля	SGLKPGVD	59
WT 10 FnIII фибронектина,FG петля	VTGRGDSPASSKPI	60
WT 10 FnIII фибронектина, бета цепь А	VSDVPRDLEV	61
WT 10 FnIII фибронектина,	LEV	62

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
бета цепь AN-терминальное разветвление
WT 10 FnIII фибронектина, бета цепь В	LLISW	63
WT 10 FnIII фибронектина, бета цепь С	YRITYGE	64
WT 10 FnIII фибронектина, бета цепь D	QEFTV	65
WT 10 FnIII фибронектина, бета цепь Е	ATI	66
WT 10 FnIII фибронектина, бета цепь F	YTITVYA	67
WT 10 FnIII фибронектина, бета цепь G	SINYRT	68

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ IDNO
WT 14 FnIII фибронектина,	VSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFQVDAVPANGQTPIQRTIKPDVRSYTITGLQP GTDYKIYLYTLNDNARSSPVVIDAST	69
(N-терм аа)	(подчеркнутые остатки А бета цепи могут быть удалены)
WT 14 FnIII фибронектина, АВ петля	TDATETT	70
WT 14 FnIII фибронектина, ВС петля	RTKTETITG	71
WT 14 FnIII фибронектина, CD петля	ANGQTP	72
WT 14 FnIII фибронектина, DE петля	KPDVRS	73
WT 14 FnIII фибронектина, EF петля	TGLQPGTD	74
WT 14 FnIII фибронектина, FG петля	LNDNARSSPV	75
WT 14 FnIII фибронектина, бета цепь А	SPPRRARV	76
WT 14 FnIII	ARV	77

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
фибронектина, бета цепь A N-терминальное разветвление
WT 14 FnIII фибронектина, бета цепь В	ITISW	78
WT 14 FnIII фибронектина, бета цепь С	FQVDAVP	79
WT 14 FnIII фибронектина, бета цепь D	IQRTI	80
WT 14 FnIII фибронектина, бета цепь Е	YTI	81
WT 14 FnIII фибронектина, бета цепь F	YKIYLYT	82
WT 14 FnIII фибронектина, бета цепь G	VIDAST	83
Fc участок с шарнирным участком	EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	84

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
СН1-шарнирный-Fc участок	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEGYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	85
Каппа легкая цепь	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	86
Лямбда легкая цепь	QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC	87
Линкерный участок 1	GGGGSGGGGSGGGGSA	88
Линкерный участок 2	GGGGSGGGGSGTGSAMASGGGGSA	89
Линкерный участок из С1	AGGGGSRLDAPGQ (G-G-G-G-S) единицы указаны жирным шрифтом; подчеркнута естественная последовательность тенасцина С	90
Линкерный участок из С2 и С8	GGGGSGGGG5GGGGSRLDAPGQ (G-G-G-G-S) единицы указаны жирным шрифтом; подчеркнута естественная последовательность тенасцина С	91
Линкерный участок из С3	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPGQ (G-G-G-G-S) единицы указаны жирным шрифтом; подчеркнута естественная последовательность тенасцина С	92
Линкерный участок из С4	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG5GGGGSRLDAPGQ (G-G-G-G-S) единицы указаны жирным шрифтом; подчеркнута естественная последовательность тенасцина С	93
Линкерный	TRLDAPGQ	94

Название/краткое описание	Последовательность	SEQ ID NO
участок из С5	подчеркнута естественная последовательность тенасцина С
Линкерный участок из С6	GGGGSRLDAPGQ (G-G-G-G-S) единицы указаны жирным шрифтом; подчеркнута естественная последовательность тенасцина С	95
Линкерный участок из С7	GGGGSGGGGSRLDAPGQ (G-G-G-G-S) единицы указаны жирным шрифтом; подчеркнута естественная последовательность тенасцина С	96

ПРИМЕРЫ

[0332] В данной заявке изобретение описывается согласно следующим примерам. Эти примеры приводятся только в иллюстративных целях, и изобретение не должно никоим образом быть ограниченно данными примерами, которые, скорее, следует рассматривать, чтобы охватить любые и все изменения, которые могут оказаться очевидными в результате представленной здесь информации.

Пример 1

Разработка различных поливалентных форм Tn3

[0333] Были разработаны различные поливалентные формы скаффолда Tn3. Поливалентные формы включают один или более модулей Tn3, слитых меду собой, слитых с другими белковыми мотивами, которые могут олигомеризировать, или слиты между собой и с другими белковыми мотивами, которые могут олигомеризировать, как это показано на ФИГ.1. В каждом случае полученная молекула включает, по меньшей мере, 2 модуля Tn3. Полипептидные линкеры, соединяющие модули Tn3 друг с другом или другими белковыми мотивами, могут быть структурированы или неструктурированы и обладать или не обладать функцией. Представлены три типичных класса поливалентных скаффолд-белков Tn3: (i) линейные (L) поливалентные белки, содержащие модули Tn3, слитые друг с другом посредством полипептидного линкера; (ii) антителоподобные (Ig) поливалентные белки, содержащие один или более слитых линейно модулей Tn3, слитых с легкой и тяжелой цепями антитела или фрагмента антитела, и (iii) Fc-содержащие поливалентные белки, содержащие один или более линейно слитых модулей Tn3, слитых с участком Fc антитела (ФИГ.1).

Пример 2

Экспрессия и очистка поливалентных TRAIL R2-специфических и Tn3-содержащих белков

[0334] Была получена серия восьми поливалентных и содержащих модуль Tn3 скаффолд-белков (также обозначаемых как «белки Tn3» или «скаффолды Tn3») со специфичностью связывания с TRAIL R2 человека. Примеры были получены для каждой из трех поливалентных форм, описанных в Примере 1, и все такие белки включают 2 или более TRAIL R2-связующих модулей А1 Tn3 (клон 1Е11, G6 или 1С12). Для некоторых TRAIL R2-специфическиз поливалентных белков Tn3 также был получен соответствующий контрольный белок Tn3 (клон D1, домен Tn3, специфичный относительно антитела Synagis"), не связывающийся с TRAIL R2, отличаясь только в составе последовательности и специфичности связывания компонентных модулей Tn3. Клон Tn3 D1 представлен белком Tn3, при этом петли ВС, DE и FG клона 1Е11 замещены альтернативными петлями с последовательностями, соответствующими SEQ ID NO: 99, 38 и 107, соответственно (см. ТАБЛИЦУ 4), Показатель идентичности последовательностей поливалентных белковых векторов Tn3, которые были экспрессированы, представлены в ТАБЛИЦЕ 2, а все возможные векторы представлены схематически в ТАБЛИЦЕ 3 и на ФИГ.2. Петлевые последовательности для клонов представлены в ТАБЛИЦЕ 4.

ТАБЛИЦА 2
Названия, форматы, валентности и специфичность экспрессированных белков, содержащих Tn3
Название (клон)	Тип формата	SEQ ID NO	Количество модулей Tn3	Специфичность
А1 (1Е11)	Мономер	134	1	TRAIL R2
А2 (1Е11)	L	139	2	TRAIL R2
А3 (1Е11)	L	140	4	TRAIL R2
А4 (1Е11)	L	141	6	TRAIL R2
А5 (1Е11)	L	142	8	TRAIL R2
A5 (G6)	L	145	8	TRAIL R2
A6 (1E11)	Fc	151	2	TRAIL R2
A7 (1E11)	Fc	164	4	TRAIL R2
A8 (1E11)	Fc	165	8	TRAIL R2
A9 (1C12)	Ig	154 (НС), 154 (LC)	4	TRAIL R2
A9 (1E11)	Ig	158 (НС), 159 (LC)	4	TRAIL R2
B1 (D1)	Мономер	180	1	контроль связывания А1, не являющийся TRAIL R2
B2 (D1)	L	не экспрессируется	2	контроль связывания А2, не являющийся TRAIL R2
B3 (D1)	L	146	4	контроль связывания A3, не являющийся TRAIL R2
B4 (D1)	L	147	6	контроль связывания А4, не являющийся TRAIL R2
B5 (D1)	L	148	8	контроль связывания А5, не являющийся TRAIL R2
B6 (D1)	Fc	181	2	контроль связывания А6, не являющийся TRAIL R2
B7 (D1)	Fc	не экспрессируется	4	контроль связывания А7, не являющийся TRAIL R2
B8 (D1)	Fc	не экспрессируется	8	контроль связывания А8, не являющийся TRAIL R2
B9 (D1)	Ig	182 (НС), 183 (LC)	4	контроль связывания А9, не являющийся TRAIL R2
L = линейные белки слияния Tn3, Fc = слияния Fc-Tn3, Ig = антителоподобные слияния Tn3.

ТАБЛИЦА 4
Последовательности петель клонов Tn3, используемых в указанных исследованиях
Клон	Петля АВ (SEQ ID NO)	Петля ВС (SEQ ID NO)	Петля CD (SEQ ID NO)	Петля DE (SEQ ID NO)	Петля EF (SEQ ID NO)	Петля FG (SEQ ID NO)
1Е11†	KDVTDTT (NO: 35)	AKPWVDPPPLWG (NO: 97)	KDVPGDR (NO: 37)	QQKHTA (NO: 102)	GNLKPDTE (NO: 39)	FDPYGAKSNPA (NO: 106)
D1	KDVTDTT (NO: 35)	SPGERIWMFTG (NO: 99)	KDVPGDR (NO: 37)	TEDENQ (NO: 38)	GNLKPDTE (NO: 39)	PNYERISNPA(NO: 107)
G6†	KDVTDTT (NO: 35)	AKPWVDPPPLWG (NO: 97)	KDVPGDR (NO: 37)	QQKHTA (NO: 102)	GNLKPDTE (NO: 39)	FDPYGMRSKPA (NO: 108)
1С12†	KDVTDTT (NO: 35)	AKPEKWDGSIYG (NO: 98)	KDVPGDR (NO: 37)	NSRHTA (NO: 103)	GNLKPDTE (NO: 39)	FTPYGAKSNPA (NO: 109)
М13	KDVTDTT (NO: 35)	HDAFGYDFG (NO: 100)	KDVPGDR (NO: 37)	PDHFHN (NO: 104)	GNLKPDTE (NO: 39)	ANDHGFDSNPA (NO: 110)
79	KDVTDTT (NO: 35)	IPPHNADSSIIG (NO: 101)	KDVPGDR (NO: 37)	YDVAFD (NO: 105)	GNLKPDTE (NO: 39)	DTFYGFDSNPA (NO: 111)
G3†	KDVTDTT (NO: 35)	AKPEKWDGPPLW (NO: 168)	KDVPGDR (NO: 37)	NSRHTA (NO: 103)	GNLKPDTE (NO: 39)	FTPYGAKSNPA (NO: 109)
С4†	KDVTDTT (NO: 35)	AKPWVDPPPLWG (NO: 97)	KDVPGDR (NO: 37)	QQKHTA (NO: 102)	GNLKPDTE (NO: 39)	FDPYNKRNVPA (NO: 169)
F4†	KDVTDTT (NO: 35)	AKPWVDPPPLWG (NO: 97)	KDVPGDR (NO: 37)	QQKHTA (NO: 102)	GNLKPDTE (NO: 39)	FDPYGLKSRPA (NO: 170)
F4mod1†	KDVTDTT (NO: 35)	AKPWVDPPPLWG (NO: 97)	KDVPGDR (NO: 37)	QQKHTA (NO: 102)	GNLKPDTE (NO: 39)	FDPYGLKSRPA (NO: 170)
F4mod2	KDVTDTT (NO: 35)	AKPWVDPPPLWG (NO: 97)	KDVPGDR (NO: 37)	QQKHNQ (NO: 179)	GNLKPDTE (NO: 39)	FDPYGLKSRPA (NO: 170)

† Клоны, включающие С бета цепь с последовательностью CELAYGI (SEQ ID NO: 131), и все другие клоны включают С бета цепь с последовательностью CELTYGI (SEQ ID NO: 45)

[0335] Получение векторов экспрессии: Используемые ферменты были получены из New England Biolabs (Ipswich, MA), наборы для очистки ДНК были получены у Qiagen (Germantown, MD), а праймеры ДНК были получены у IDT (Coralville, IA). Подготовка векторов экспрессии, кодирующих 2 или более линейно слитых модулей Tn3 проводилась следующим образом. ДНК, кодирующая TRAIL R2-специфический модуль Tn3 (например, 1Е11; SEQ ID NO: 134; G6, SEQ ID NO: 138; и т.д.), была амплифицирована ПЦР с праймерами «Tn3 gly4ser1 модуль передний» (SEQ ID NO: 112) и «Tn3 gly4ser2 модуль обратный» (SEQ ID NO: 113) (ТАБЛИЦА 5).

[0336] После очистки продукта ПЦР, амплифицированная ДНК была разделена на две части, при этом одна половина была расщеплена Bpml, а другая половина была расщеплена Acul. Расщепленные образцы были очищены с использованием набора для очистки ПЦР и лигированы с использованием Т4 ДНК лигазы для получения продукта ДНК, кодирующей два модуля Tn3 (А2). Данный материал был очищен с использованием гель-электрофореза в агарозе, и продукт был снова разделен на две части. Расщепление Ncol и Kpnl с последующим лигированием в расщепленные Ncol//Kpnl pSec-oppA(L25M) (описано в WO 2009/058379 А2, Пример 18), после чего был получен вектор бактериальной экспрессии для белка А2. Лигирование нерасщепленного продукта в вектор pCR 2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) обеспечило получение генетического материала для получения слияний высшего порядка. Для получения фрагмента ДНК, кодирующего четыре модуля Tn3 (A3), клонированная ТОРО А2 ДНК была амплифицирована с использованием ПЦР и праймеров «модуль amp передний» (SEQ ID NO: 114) и «модуль amp обратный» (SEQ ID NO: 115) (ТАБЛИЦА 5), очищена и разделена на две части для расщепления с использованием Acul или Bpml. Оставшаяся часть процесса для получения вектора экспрессии A3 была такой же, как и процесс, используемый для получения вектора А2, при этом ДНК, кодирующая A3, была собрана из строительных блоков А2. И снова, конкурентное клонирование собранной ДНК A3 в pCR 2.1-TOPO обеспечило генный материал для получения слияния высших порядков.

[0337] Для получения векторов бактериальной экспрессии А4 и А5, на 3’-конце мульти-Tn3-кодирующей последовательности в векторе экспрессии A3, был введен адаптерный модуль. Для этого вектор экспрессии A3 вначале был расщеплен Kpnl и EcoRI, и вырезанный фрагмент был замещен дуплексной кассетой, содержащей олигонуклеотиды «insert BamHI in pSec передний» (SEQ ID NO: 116) и «insert BomHI in pSec обратный» (SEQ ID NO: 117) (ТАБЛИЦА 5). Амплификация ПЦР последовательностей А2 и A3 из соответствующих векторов pCR 2.1 ТОРО проводилась с использованием праймеров «модуль insert BamHI передний» (SEQ ID NO: 118) и «модуль amp обратный» (SEQ ID NO: 115) (ТАБЛИЦА 5). Амплифицированные продукты были расщеплены дважды с использованием BamHI//Kpnl, и клонированы в подобным образом расщепленные векторы экспрессии A3.

[0338] Белки А6-А9 были экспрессированы клетками 293F с временной трансфекцией, как это описано в Примере 16 WO 2009/058379 А2. Краткое описание: векторы экспрессии были получены путем ПЦР амплификации модуля Tn3 (или модулей) из векторов бактериальной экспрессии, и клонированием их в имеющиеся векторы, кодирующие участок Fc, константный участок легкой каппа-цепи и/или константные участки СН1-шарнирного участка-СН2-СН3 тяжелой цепи для экспрессии слияния Fc или белков антитела. Для белка А9, модули Tn3 замещают вариабельные участки антитела в тяжелой цепи IgG1 человека и легкой каппа-цепи. Праймеры, которые добавляют совместимые сайты Nhel и Kasl для получения слияний Fc тандемных векторов, представлены в ТАБЛИЦЕ 5.

ТАБЛИЦА 5
Последовательности праймера, используемые в построении мультивалентных белков Tn3
Название последовательности	Последовательность	SEQ ID NO
Tn3 gly4ser1 модуль передний	GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGAGTGCGGCCATGGCCAGCGGGGGCGGAGGGAGTGCCATTGAAGTGAAAGATGTGACCGATACC	112
Tn3 gly4ser2 модуль обратный	CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCTACGCAGGTACCGCTACCGCCACCTCCGCTCCCACCGCCACCGGTGGTAAAGGTTTC	113
Модуль amp передний	GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGAGTGCGG	114
Модуль amp обратный	CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCTACGCAGG	115
Модуль вставочный BamHI в pSec переднем	GGGATCCGCTACGGGCCACTCGATCGAGGTCCGTGCTGATCGAGCGA TCGGTACCCTGGGCCATCATCATCATCATCACCACCACTGAG	116
Модуль вставочный BomHI в pSec обратном	AATTCTCAGTGGTGGTGATGATGATGATGATGGCCCAGGGTACCGAT CGCTCGATCAGCACGGACCTCGATCGAGTGGCCCGTAGCGGATCCCG TAC	117
Модуль вставочный SomHI передний	GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGGGATCCGCCATGGCCAGC	118
Модуль вставочный Nhel передний	GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGCTAGCTGCCATGGCCAGC	119
Модуль вставочный Kasl обратный	CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCGGCGCCGGTACC	120

[0339] Экспрессия и очистка белков: Одновалентные или линейные белки Tn3 были экспрессированы в BL21(DE3) E.coli (EMD/Novagen, Gibbstown, NJ), и белки с тэгом His были очищены от питательной среды с использованием смолы Ni NTA Superflow resin (Qiagen). Интересным является то, что, несмотря на большие различия в молекулярном весе, все такие векторы были экспрессированы в среде при высоком уровне в Е.coli и были эффективно секретированы в среде (ТАБЛИЦА 6 и ФИГ.3).

[0340] Для экспрессии слияния Fc и антителоподобных белков (А6-А9), клетки 293F были временно трансфецированы соответствующими векторами экспрессии. Полученный супернатант был собран на 6 и 10 дни, и белок был очищен с использованием аффинной хроматографии с белком А.

[0341] Все очищенные белки были проанализированы с использованием SDS-PAGE на бистрис гелях NuPage Novex 4-12% в буфере MES без восстановителя, а затем были визуализированы с использованием SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA). Эксклюзионная хроматография также использовалась для анализа очищенных белков, и, где это было необходимо, собранный материал на колонке Superdex 75 10/300GL или Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Piscataway, NJ) был удален, и финальный уровень был ниже 10% общего уровня белка. Единица Acrodisc с мембраной Mustang E (Pall Corporation, Port Washington, NY) использовалась в соответствии с указанием производителя для удаления эндотоксина из бактериально экспрессируемых белковых препаратов.

ТАБЛИЦА 6
Выход после очистки репрезентативных поливалентных форм белка Tn3
Протеин(клон)	Выход (мг/л)
A1 (1E11)	400
А2 (1E11)	300
A3 (1E11)	135
А4 (1Е11)	90
А5 (1Е11)	40

Пример 3

TRAIL R2-связующая аффинность для одно- и поливалентных белков Tn3

[0342] Для измерения влияния валентности Tn3 на аффинность связывания для серии TRAIL R2-специфических белков Tn3, был проведен эксперимент конкурентного ИФА. 96-луночный планшет NUNC MaxiSorp (Thermo Fisher, Rochester, NY) был покрыт А9(1С12) (SEQ ID NO: 154+SEQ ID NO: 145) TRAIL R2-специфическим скаффолдом в антителоподобной форме в ФСБ при концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при 4°С. Планшеты были блокированы с ФСБ 0,1% Твин 20+10 мг/мл БСА. Разведения A1 (1E11 мономер), и линейные А2 (1E11 двухвалентные) или A3 (1E11 тетравалентные) мультимерные скаффолды были инкубированы на покрытом планшете с 0,7 нМ биотинилированного TRAIL R2-Fc в течение 2 ч при комнатной температуре в ФСБ 0,1% Твин 20+1 мг/мл БСА, промыты. Связанный биотинилированный TRAIL R2 Fc был определен с использованием стрептавидина, ТМВ, и нейтрализирован кислотой. Поглощение было определено при 450 нм. Данные представлены на ФИГ.4. Аффинность связывания (IC₅₀) представлена в ТАБЛИЦЕ 7 и была рассчитана как концентрация конкурирующего белка, требуемого для снижения максимального связывания биотинилированного TRAIL R2-Fc на 50%.

[0343] Значения IC₅₀ для А2 и A3 были, по меньшей мере, в 30 раз ниже, чем значения мономера А1 и являются пределом данного анализа (т.е. примерно равные концентрации биотинилированного TRAIL R2-Fc). Связывание биотинилированного TRAIL R2-Fc с иммобилизированным TRAIL R2-специфическим Tn3 было анализировано по векторам связывания TRAIL R2.

[0344] Относительно мономерного белка А1, двух- и тетравалентные белки А2 и A3, связанные с TRAIL R2-Fc с аффинностью, которая в 30-40 раз выше, что является показателем того, что множественные модули Tn3 сохраняют свою активность связывания и способствуют большей аффинности посредством эффекта авидности. Истинное различие в аффинности между одно- и двух- или тетра валентными белками Tn3 может быть больше, чем в 30-40 раз, при условии, что значения IC₅₀ Для А2 и A3 были примерно равны концентрации биотинилированного TRAIL R2-Fc, используемого в анализе (0,75 нМ).

ТАБЛИЦА 7
Значения IC50 для ингибирования связывания TRAIL R2-Fc относительно связывания иммобилизированного белка TRAIL R2 А9(1С12) Tn3
Клон	Валентность	IC50 (нМ)
А1 (1Е11)	1	16
А2 (1Е11)	2	0,5
А3 (1Е11)	4	0,4

Пример 4

Проточная цитометрия для подтверждения связывания клеток [0345] Проточная цитометрия использовалась для подтверждения специфичности связывания поливалентного TRAIL R2-специфического Tn3 белка с эндогенным TRAIL R2, экспрессированным на поверхности клеток Н2122. Клетки Н2122 (линия клеток немелкоклеточной аденокарциномы легких) были выделены из колб с культурой ткани с использованием акутазы (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA). Клетки были промыты в полной среде (среда RPMI 1640, дополненная 10% ФБС) и ресуспендированы в ФСБ/2% ФБС при концентрации примерно 2×10⁶ клеток/мл. Белок Tn3 А9(1Е11) (SEQ ID NO: 158 + SEQ ID NO: 159), тетравалентная антителоподобная форма мультимерного скаффолда или контрольный и соответствующий белок В9 Tn3 (клон D1) были получены в концентрациях 40 нМ в ФСБ/2% ФБС.

[0346] Клетки были распределены на 96-луночном U-образном планшете в концентрации 75 мкл/лунка, и образцы белков были добавлены в концентрации 25 мкл/лунка (до финальной концентрации 10 нМ). Планшеты были инкубированы при 4°С в течение примерно 1 часа, затем промыты 3 раза в ФСБ/2% ФБС. Было добавлено конъюгированное вторичное антитело IgG Alexa Fluor 488 (100 мкл/лунка), и планшеты были инкубированы при 4°С в течение примерно 30 минут и промыты, как это описано выше. Клетки были ресуспендированы в 100 мкл ФСБ/2% ФБС, и анализ проточной цитометрии был проведен с использованием цитометра BD LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA). Смещение (повышение) в меченных флуоресцентно клетках Н2122 при инкубации с TRAIL R2-специфическим белком Tn3 относительно контроля подтвердило, что TRAIL R2-специфический белок Tn3 может связываться с TRAIL R2 клеток (ФИГ.5).

Пример 5

Влияние валентности и формы на апоптоз клеток Н2122 под действием TRAIL R2-специфических бел ков Tn3

[0347] Апоптозная гибель клеток может быть индуцирована в линиях раковых клеток путем образования перекрестных связей на поверхности клеток с TRAIL R2. Такой эффект может быть определен в ходе анализов клеток, которые измеряют количество жизнеспособных клеток. Вследствие этого клетки Н2122 линии карциномы легкого были распределены по 96-луночному планшету с плотностью 10000 клеток/лунка в полной среде 75 мкл (среда RPMI 1640, дополненная 10% ФБС). После инкубации в течение ночи при 37°С. среда была дополнена 25 мкл дополнительной среды, содержащей серийное разведение TRAIL R2-специфического (клон 1Е11) или отрицательного контрольного (клон D1) белков Tn3. Все процедуры дублировались. Представленный на рынке лиганд TRAIL (Chemicon/Millipore, Billerica, MA) был использован в качестве положительного контроля для гибели клеток, индуцируемой рецептором TRAIL Спустя 72 часа бы использован набор CellTiter-Glo от Promega (Madison, WI) в соответствии с указаниями производителя для анализа уровней АТФ, что является мерой числа жизнеспособных клеток в культуре, Люминесценция анализа была измерена на планшете-ридере Envision (PerkinElmer, Waltham, MA). Ингибирование жизнеспособности клеток было определено путем деления значения люминесценции обработанных клеток на среднее значение люминесценции необработанных живых клеток. Были построены графики зависимости ингибирования от концентрации соединения, и значение активности в гибели клеток (EC₅₀) было определено как концентрация белка, необходимого для ингибирования 50% клеточной жизнеспособности.

[0348] Для исследования влияния валентности на проапоптозную активность поливалентных TRAIL R2-специфических белков Tn3, клетки Н2122 были обработаны одновалентным белком Tn3 А1 (клон 1Е11) и серией линейно слитых белков М А2-А5 (каждый клон 1Е11), которые содержат 2, 4, 6 или 8 модулей Tn3. В то время как одно- и двухвалентные белки Tn3 не оказывали или оказывали незначительную активность относительно гибели клеток, белки, содержащие 4, 6 и 8 модулей Tn3, существенно ингибировали жизнеспособность клеток Н2122, при этом сила повышалась как функция валентности (ФИГ.6А; ТАБЛИЦА 8). Белок A3 (тетравалентный) обладал такой же силой относительно TRAIL, естественного лиганда TRAIL R2, в то время как белки А4 (гексавалентный) и А5 (октавалентный) были на 1-2 log более сильные. Из этого анализа видно, что для данного молекулярного формата гибель клеток повышается с повышением валентности до момента, когда дискриминация в анализе более не будет возможной.

ТАБЛИЦА 8
Значения EC50 для гибели Н2122 под действием поливалентных векторов
Клон	EC50 (нМ)	Максимальное ингибирование, %
А3 (1Е11)	0,013	91
А4 (1Е11)	0,0009	97
А5 (1Е11)	0,0006	97
TRAIL человека	0,027	98

[0349] Для демонстрации того, что ингибирование жизнеспособности клеток зависит от связывания TRAIL R2, 100 пМ белка А5 (клон G6) (т.е. 167× EC₅₀) был инкубирован с клетками Н2122 в присутствии растворимого белка TRAIL R2-Fc. Дозозависимая регрессия гибели клеток под действием растворимого TRAIL R2-Fc является указателем того, что гибель клеток зависит от связывания белка А5 с поверхностью клеток TRAIL R2 (ФИГ.6В). Подобные результаты отмечались для белка А5, включающего петли клона 1Е11 (данные не указаны).

[0350] Кроме целого ряда связующих модулей, активность одновалентных белков Tn3 также может быть подвержена воздействию молекулярной формы, используемой для предотвращения связывания отдельных единиц. Для исследования эффекта молекулярной формы на активности, клетки Н2122 были обработаны разными TRAIL R2-специфическими белками Tn3, имеющими одинаковое количество модулей связывания Tn3. Способность тетравалентных белков A3, А7 и А9 (каждый клон 1Е11) индуцировать гибель клеток Н2122 была исследована в ходе анализа жизнеспособности клеток, как и для пары октавалентных белков Tn3 А5 и А8 (каждый клон 1Е11). Неактивные одно- и двухвалентные белки были включены в виде отрицательного контроля, a TRAIL служил положительным контролем (ФИГ.7; ТАБЛИЦА 9 и ТАБЛИЦА 10). На ФИГ.7А. где три вектора анализировались с валентностью четыре, видно, что A3 (линейная форма) и А7 (Fc-слитая форма) подобны в своей активности гибели клеток и более сильны в гибели клеток Н2122, чем А9 (антителоподобная форма). Это четким образом показывает, что пространственная ориентация модулей Tn3 может оказывать существенный эффект на биоактивность, в то время как A3 примерно в 150 раз более сильный, чем белок А9 в ингибировании жизнеспособности клеток Н2122 (ТАБЛИЦА 9). ФИГ.7В показывает, что обе формы октавалентных TRAIL R2-связующих белков Tn3, А5 (линейный) и А8 (слияние с Fc), обладают подобной эффективностью в ингибировании жизнеспособности клеток Н2122. Данные EC₅₀ для таких векторов представлены в ТАБЛИЦЕ 9. Способность подстраиваться под аффинность, валентность и пространственную ориентацию предоставляет большие преимущества в плане способности точно получить требуемый терапевтический результат.

ТАБЛИЦА 9
Значения EC50 для гибели Н2122 под действием поливалентных векторов с валентностью четыре
Клон	EC50 (нМ)	Максимальное ингибирование, %
А9 (1Е11)	1,98	80
А7 (1Е11)	0,02	88
A3 (1Е11)	0,013	91
TRAIL человека	0,027	98

ТАБЛИЦА 10
Значения ЕС50 для гибели Н2122 под действием поливалентных векторов с валентностью восемь
Клон	EC50 (нМ)	Максимальное ингибирование, %
А5 (1Е11)	0,0006	97
А8 (1Е11)	0,0002	98
TRAIL человека	0,027	98

Пример 6

Дозозависимая гибель клеток в линиях клеток Colo205 и Jurkat

[0351] Для демонстрации того, что поливалентные TRAIL R2-специфические белки Tn3 могут вызвать гибель в линиях раковых клеток, отличных от Н2122, также были тестированы другие линии клеток, экспрессирующих TRAIL R2. Линия клеток колоректальной аденокарциномы Colo205 (ФИГ.8А) и линия клеток Jurkat Т-клеточного лейкоза (ФИГ. 8 В) были протестированы на предмет своей способности гибнуть под действием белков A3 (тетравалентный, линейная форма) (SEQ ID NO: 143) и А5 (октавалентный, линейная форма) (SEQ ID NO: 145) (каждый клон G6). Каждая линия клеток была инкубирована с A3, А5, положительным контролем TRAIL или отрицательным контрольным белком В5 (SEQ ID NO: 148), который не связывается с TRAIL R2, и анализ жизнеспособности клеток проводили, как это описано для Н2122. В каждой из такой линии клеток А5 обладал чрезвычайно сильным ингибированием жизнеспособности клеток. Белок A3 с пониженной валентностью также индуцировал гибель клеток, однако в меньшей степени, чем А5. Таким образом, вектор с более высокой валентностью обладал большей активностью. Как и ожидалось, TRAIL также мог ингибировать жизнеспособность клеток, в отличие от октавалентного контрольного белка В5, который не связывался с TRAIL R2.

ТАБЛИЦА 11
Значения ЕС50 для гибели Colo205 под действием линейных тандемных векторов
Клон	EC50 (нМ)	Максимальное ингибирование, %
A3 (G6)	0,04	97
А5 (G6)	0,0005	100
TRAIL человека	0,08	100

ТАБЛИЦА 12
Значения EC50 для гибели клеток Jurkat под действием линейных тандемных векторов
Клон	EC50 (нМ)	Максимальное ингибирование, %
A3 (G6)	0,05	83
А5 (G6)	0,0001	100
TRAIL человека	0,009	99

Клетки были проанализированы в анализе CellTiter-Glo, как это описано в Примере 5.

Пример 7

Разработка, экспрессия и активность мышиных CD40L-специфических двухвалентных тандемных скаффолдов

[0352] Двухвалентные мышиные CD40L-специфические белки Tn3 (ТАБЛИЦА 13) были получены путем слияния пары идентичных модулей Tn3. М13 представлен белком Tn3, который специфически связывается с CD40L мыши. Последовательность М13 соответствует последовательности Tn3, при этом последовательности в петлях ВС, DE и FG замещены альтернативными петлями с последовательностями, соответствующими SEQ ID NO: 100, 104 и 110, соответственно (см. ТАБЛИЦУ 4). Линкерсодержащие копии 1 (вектор С1 (М13)), 3 (вектор С2 (М13)), 5 (вектор С3 (М13)) или 7 (вектор С4 (М13)) единицы Gly₄Ser (GS) были использованы, что привело к образованию полной длины линкера от 13 до 43 аминокислот (см. ФИГ.9А и ТАБЛИЦУ 3).

ТАБЛИЦА 13
Названия, валентности и специфичность экспрессированных белков, содержащих Tn3
Название (клон)	Количество модулей Tn3	Длина линкера	Специфичность
М13 (М13)	1	Н/O	CD40L мыши
С1 (М13)	2	13	CD40L мыши
С2 (М13)	2	23	CD40L мыши
С3 (М13)	2	33	CD40L мыши
С4 (М13)	2	43	CD40L мыши

[0353] Краткое описание: векторы экспрессии были получены следующим образом: Фрагмент А был получен путем ПЦР амплификации мышиного CD40L биндера pSec-M13, клонированного в вектор pSec-oppA(L25M), описанный в Примере 1, с праймером, специфичным относительно верхней части вектора pSec гена Tn3, и праймером «1-3 GS линкер прямой» (SEQ ID NO: 123) (см. ТАБЛИЦУ 14, где указаны последовательности специфических используемых праймеров Tn3). Фрагменты B1GS и B3GS были получены путем ПЦР амплификации одного и того же шаблона праймерами «1 GS линкер» (SEQ ID NO: 121) или «З GS линкер» (SEQ ID NO: 122), соответственно, а также праймером, специфичным относительно нижележащего вектора pSec гена Tn3. После гелевой очистки фрагментов, Фрагмент А и B1GS или Фрагмент А и B3GS были смешаны, и тандемные векторы были получены путем перекрывания ПЦР в реакции ПЦР с двумя специфическими праймерами вектора pSec. Продукты были расщеплены с использованием Ncol и Kpnl и клонированы обратно в вектор pSec-oppA(L25M), как это описано в Примере 1, что привело к получению двух векторов: С1 (М13) и С2 (М13). Для получения 5 и 7 линкерных молекул GS, линкерные вставки, созданные путем амплификации ПЦР олигонуклеотидов «5 GSLinker» (SEQ ID NO: 124) и «7 GSLinker» (SEQ ID NO: 125), соответственно, с праймерами «GS L Amp передний» (SEQ ID NO: 126) и «GS L Amp обратный» (SEQ ID NO: 127) были расщеплены с использованием Pstl и Xmal и клонированы в фрагмент вектора, полученного путем урезания pSecM13-lGS-M13 с использованием Pstl и Xmal с получением векторов С3 (М13) и С4 (М13).

ТАБЛИЦА 14
Последовательности праймера, используемые в построении тандемных двухвалентных специфических векторов MuCD40L
Название последовательности	Последовательность	SEQ ID NO
1 GSLinker	AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT	121
3 GSLinker	AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAA GTGAAAGATGTGACCGAT	122
1-3 GSIinker обратный	CTGCAGTGGTAAAGGTTTCTTTCG	123
5 GSLinker	AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGG GTAGCCGCTTGGATGCCCCCGGGCA	124
7 GSLinker	AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCCGCTTGGATGCCCCCGGGCA	125
GS LAmp прямой	AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGT	126
GS LAmp обратный	TTCAATCTGCCCGGGGGCATCCAA	127

[0354] Одновалентные и двухвалентные тандемные векторы, включающие идентичные скаффолды Tn3, были рекомбинантно экспрессированы и очищены из Е.coli, как это описано в Примере 2. ФИГ.9В отображает анализ SDS-PAGE очищенного белкового препарата в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

[0355] Для исследования эффективности связывания двухвалентных тандемных векторов М13-М13 и сравнения их с одновалентным скаффолдом М13, было протестировано конкурентное ингибирование связывания CD40L мыши относительно рецептора CD40 мыши, иммобилизированного на биосенсорном чипе.

[0356] Краткое описание: фрагмент рецептора CD40 мыши в форме химерного слияния с участком Fc IgG1 был иммобилизирован на чипе GLC (Bio-Rad) при плотности примерно 3000 единиц ответа. Для проведения анализов конкурентного связывания 3-кратные серийные разведения одновалентного М13 или тандемных двухвалентных векторов М13 с линкером различной длины были инкубированы в течение 20 минут при фиксированной концентрации Е.coli, вырабатывающей рекомбинантный мышиный CD40L (0,5 мкг/мл) в ФСБ, содержащей 0,1% (о/о) Твин-20 и 0,5 мг/мл БСА. Такие образцы затем были введены на чип GLC при скорости потока 30 мкл/мин в течение 300 секунд, и уровень связанного CD40L был записан при фиксированном моменте времени в сенсограмме и сопоставлен с соответствующим уровнем связанного белка в отсутствие любого конкурента. После каждого измерения связывания, остаточный CD40L был десорбирован с поверхности чипа путем инъецирования 10 мМ глицин-HCl (рН 2,0). Неспецифические эффекты связывания были скорректированы путем вычитания сенсограмм между пятнами чипа. Значения IC₅₀, соответствующие концентрациям векторов Tn3, необходимых для замещения 50% CD40L мыши, были рассчитаны с использованием GraphPad Prism.

[0357] Как это указано на ФИГ. 9С, половина максимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀) Для мономера М13 составила 71 нМ, в то время как IC₅₀ для двухвалентного тандемного вектора С1 (М13) составило 29 нМ. Подобные значения IC₅₀ 5 или 6 нМ получены для двухвалентных векторов, содержащих более длинные линкеры (векторы С2 (М13), С3 (М13) и С4 (М13), соответственно). По причине концентрации CD40L, используемой в анализе, данные значения являются нижним пределом IC₅₀, который может отмечаться в данном анализе. Все двухвалентные векторы имели пониженное значение IC₅₀ в сравнении с одновалентным вектором, что указывало по повышенную активность связывания двухвалентных тандемных векторов в сравнении с одинарным модулем М13 Tn3. Длина линкера в таких двухвалентных векторах обладает таким же самым эффектом на точность анализа, при этом короткая длина линкера указывает на промежуточную силу, в то время как линкеры с 23 или более аминокислотами в данном анализе являются эквивалентами.

[0358] Для исследования активность двухвалентных тандемных векторов Tn3 относительно клеточной активности и сравнения их с одновалентным скаффолдом М13, было исследовано ингибирование экспрессии CD86 на В-клетках, индуцированное CD40L мыши. В качестве контроля параллельно исследовали представленное на рынке специфическое антитело к CD40L мыши (MR1).

[0359] В анализе использовали МКПК, полученные из крови здоровых добровольцев. Краткое описание: свежесобранная кровь была собрана в пробирки для клеточных препаратов BD Vacutainer® CPT™ в присутствии гепарина. После центрифугирования, клеточный слой, содержащий МКПК, был собран и промыт дважды в ФСБ и один раз в среде RPMI 1640. Клетки были ресуспендированы в полной среде RPMI 1640 (дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, инактивированной нагреванием, 1% P/S) в концентрации 5×10⁶ клеток/мл.

[0360] Линия клеток D10.G4.1 Th2, экспрессирующих CD40L мыши, была промыта и ресуспендирована в полной среде RPMI 160 при концентрации 1×10⁶ клеток/мл.

[0361] Тандемные двухвалентные векторы М13, М13-М13 С1-С4, или антитело MR1 (BioLegend Cat. No: 106508) были серийно разведены (1:3) в полной среде RPMI 1640. 50 мкл образца каждого разведения было добавлено в лунки в 96-луночного U-образного планшета для культивации ткани. Затем в каждую лунку было внесено 50 мкл клеток D10.G4.1 (5×10⁴), и после смешивания, планшеты были инкубированы при 37°С в течение 1 часа. Затем в каждую лунку было добавлено 100 мкл ресуспендированных МКПК (5×10⁵ клеток) и инкубировано при 37°С в течение 20-24 ч.

[0362] МКПК были собраны и окрашены антителом АРС к CD86 человека (BD bioscience, Cat# 555660) и CD19 к FITC человека (BD bioscience, Cat# 555412) в буфере FACS (ФСБ рН 7,4, 1% БСА, 0,1% натрия азид) при 4°С в течение 30 минут в темноте. После двух промываний в буфере FACS, образцы были проанализированы FACS LSRII (Becton Dickinson). Была оценена экспрессия CD86 на В-клетках с выработкой CD19. Анализ экспрессии CD86 как функции от исследуемого белка проводился с использованием программы GraphPad Prism.

[0363] Как это показано на ФИГ. 9D, двухвалентные тандемные векторы М13-М13 ингибировали экспрессию CD86 со значением IC₅₀ 100-200 рМ, что сопоставимо с IC₅₀ антитела MR1 (100 пМ) и примерно на 3 log сильнее, чем одновалентный скаффолд М13. В отличие от биохимического анализа, в данном анализе на основе клеток не отмечалось какого либо эффекта длины линкера, и двухвалентные векторы с линкерами, варьирующими от 13 до 43 аминокислот в длину, имели эквивалентную способность повышать активность относительно одновалентного белка.

Пример 8

Экспрессия биспецифических тандемных скаффолдов

[0364] Для получения биспецифических векторов Tn3 со специфичностью относительно TRAIL R2 и CD40L человека (HuCD40L), два модуля Tn3, один специфичный относительно TRAIL R2 (клон 1Е11), а другой специфичный относительно CD40L человека (клон 79), были слиты вместе с линкерами вариабельной длины, разделяющими два модуля (ТАБЛИЦА 3 и ТАБЛИЦА 15). Последовательность белка клона 79 (SEQ ID NO: 184) соответствует последовательности модуля Tn3, в то время как петли ВС, DE и EF были замещены альтернативными петлями, соответствующими SEQ ID NO: 101, 105 и 111, соответственно. Векторы экспрессии для тандемных биспецифических скаффолдов, содержащих линкеры с повторностями 1 и 3 Gly₄Ser (GS) (векторы С6 и С8, соответственно) были получены, как это описано в Примере 7, за исключением того, что плазмиды, несущие варианты Tn3 А1 и 79 были использованы изначально как матрицы ПЦР. Вектор С5 (содержащий короткий линкер, полученный из естественной последовательности, соединяющей второй и третий домены FnIII тенасцина С человека, что может рассматриваться как часть А бета цепи третьего домена FnIII, однако не требуется для связывания скаффолда) и вектор С7 были получены подобным образом, как получены С6 и С8, с использованием дополнительных праймеров, перечисленных в ТАБЛИЦЕ 16, за исключением того, что «0 GSIinker обратный» использовали вместо «1-3 GSLinker обратный» для С5.

ТАБЛИЦА 15
Названия, валентности и специфичность экспрессированных белков, содержащих Tn3
Название	Количество модулей Tn3	Длина линкера	Специфичность
А1 (1Е11)	1	N/A	TRAIL R2
79 (79)	1	N/A	HuCD40L
С5 (1Е11&79)	2	8	TRAIL R2 + HuCD40L
С6 (1Е11&79)	2	13	TRAIL R2 + HuCD40L
С7 (1Е11&79)	2	18	TRAIL R2 + HuCD40L
С8 (1Е11&79)	2	23	TRAIL R2 + HuCD40L

ТАБЛИЦА 16
Последовательности дополнительных праймеров в построении биспецифических тандемных векторов
Название последовательности	Последовательность	SEQ ID NO
0 GSLinker	AAAGAAACCTTTACCACCACGCGTTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT	128
0 GSIinker обратный	CGTGGTGGTAAAGGTTTCTTTCG	129
2 GSLinker	AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT	130

[0365] Одновалентные и тандемные биспецифические скаффолды Tn3 были рекомбинантным образом экспрессированы в среде E.coli, как это описано в Примере 2. Уровни экспрессии растворимых векторов были проанализированы с использованием SDS-PAGE. ФИГ. 10 отображает приемлемые уровни экспрессии для исследуемых векторов.

Пример 9

Специфическое связывание биспецифических тандемных скаффолдов

[0366] Для измерения связывания биспецифических векторов Tn3 с CD40L и TRAIL R2 использовали ИФА. Краткое описание: белковые векторы с тэгом 8Х His: А1, 79, С5 С6 С7 или С8 (см. ТАБЛИЦУ 15) были захвачены из среды E.coli и распределены по лункам, покрытым антителом к His, следующим образом. 96-луночный планшет MaxiSorb был покрыт антителом Qiagen к His в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи. Покрытый планшет был блокирован ФСБ, содержащим 0,1% о/о Твин-20 и 4% в/о сухого обезжиренного молока (PBST 4% молока) в течение 1,5 ч. Покрытый планшет был промыт PBST и разведенной бактериальной средой (в 30 раз), содержащей растворенные экспрессируемые белки, затем планшеты были инкубированы при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывания PBST, клетки, содержащие захваченные векторы, были инкубированы в течение 1,5 ч с различными концентрациями биотинилированного TRAIL R2 (ФИГ.11А) или комплекса, полученного путем преинкубации Е.coli, вырабатываемой HuCD40L с тэгом His с биотинилированным антителом к His (ФИГ.11В). После промывания PBST, было определено связывание TRAIL R2 или HuCD40L/антитела к His с использованием стрептавидина-пероксидазы хрена (RPN1231V; GE Healthcare; 1000x рабочее разведение) в течение 20 минут, с последующим промыванием PBST и колориметрическим определением при добавлении субстрата ТМВ (Pierce). Поглощение было определено при 450 нм.

[0367] Связывание биспецифических тандемных скаффолдов TRAIL R2-HuCD40L с TRAIL R2 и связывание биспецифических тандемных скаффолдов TRAIL R2-HuCD40L с HuCD40L отображено на ФИГ.11А и ФИГ.11В, соответственно. Биспецифические тандемные скаффолды, обозначенные С5-С8, включающие TRAIL R2-специфический домен Tn3, слитый с HuCD40L-специфическим доменом Tn3, связывал TRAIL R2 и HuCD40L; однако мономерные/моноспецифические векторы Tn3 А1 и 79 связывали TRAIL R2 или HuCD40L согласно известной специфичности, и не связывали обе мишени.

[0368] Одновременное связывание тандемных TRAIL R2-HuCD40L-специфических векторов с TRAIL R2 и HuCD40L было определено с использованием анализа AlphaScreen™. Разведения белков А1, 79, С5, С6, С7 и С8 в среде, содержащей Е.coli, были инкубированы с 10 нМ белка слияния TRAIL R2-Fc, 50 нМ биотинилированного HuCD40L (выработанного в Е.coli), донорских гранул стрептавидина AlphaScreen (0,02 мг/мл) и акцепторных гранул белка A AlphaScreen (0,02 мг/мл) в ФСБ+0,01% Твин + 0,1% БСА. Образцы были инкубированы в течение 1 ч в темноте перед проведением считывания на ридере PerkinElmer Envision. Популяция донорских гранул была возбуждена лазером при 680 нм, что вызвало высвобождение синглетного кислорода. Синглетный кислород имеет ограниченное время жизни, что позволяет отследить его до 200 нм по диффузии перед преобразованием в основное состояние. Синглетный кислород возбуждает акцепторные гранулы, вызывая эмиссию света между 520-620 нм, что измеряют ридером Envision. Сигнал генерируется только тогда, когда донорские и акцепторные гранулы находятся в непосредственной близости. Таким образом, повышение сигнала наблюдается тогда, когда гранулы двух типов приближаются молекулами, взаимодействующими с двумя мишенями одновременно. В отсутствие связывания с любой мишенью сигнал не может быть определен.

[0369] Как это показано на ФИГ. 12, тандемные биспецифические векторы одновременно связывают TRAIL R2 и HuCD40L, что приводит к возникновению сильного сигнала AlphaScreen; однако одновалентные скаффолды Tn3 А1 и 79 не приводят к образованию сигнала, указывая на то, что они не могут приближать донорские и акцепторные гранулы путем одновременного связывания с обеими мишенями.

Пример 10

Повышенная стабильность скаффолдов Tn3, имеющих 9 аминокислот в петле FG

[0370] Для измерения влияния длины путли FG на стабильность Tn3, раскручивание шести HuCD40L-специфических скаффолдов Tn3 под действием гуанидин гидрохлорида (GuHCl) при рН 7,0 было оценено по свойственной флуоресценции триптофана. Такие мономерные скаффолды Tn3 включают петлю FG с длиной 9, 10 или 11 аминокислот. Образцы 0,05 мг/мл скаффолда Tn3, содержащие различные концентрации гуанидин хлорида, были приготовлены в 50 мМ натрия фосфате при рН 7,0. Флуоресцирующие эмиссионные спектры были получены с использованием спектрофотометра Horiba Fluoromax-4 при возбуждающей длине волны 280 нм. Относительная интенсивность флуоресцирующей эмиссии при 360 нм была нанесена как функция от концентрации GuHCl для каждого белка. Каждый скаффолд содержал уникальные последовательности петель ВС, DE и FG. Клоны A3 (SEQ ID NO: 185; обратите внимание, что мономерный скаффолд A3 в данном примере отличается от вектора, обозначенного A3 в Таблице 3), 71 (SEQ ID NO: 186), 79 (SEQ ID NO: 184), 127 (SEQ ID NO: 187), 252 (SEQ ID NO: 188) и 230 (SEQ ID NO: 189) были более чем на 50% раскручены в 3,0 М GuHCl при рН 7,0, при этом концентрация GuHCl играла важную роль для раскручивания 50% (C_m) исходных Tn3. Значения C_m для клонов A3, 79, 127, 252 и 230 составили 2,2М, 2,7М, 2,4М, 2,7М, 2,4М, соответственно. Длина петель FG в таких клонах составила 11, 11, 11, 10 и 11 аминокислот, соответственно, при этом петля FG в исходном Tn3 составила 10 аминокислот. Интересным является тот факт, что клон 71 был единственным вариантом, имеющем 9 аминокислот в петле FG, значение Cm 4,2М, по существу более высокая стабильность, чем стабильность исходного скаффолда Tn3 или другие исследуемые варианты. Результаты приводятся на ФИГ.13.

[0371] Для определения того, является ли повышенная стабильность клона 71 Tn3 свойственной его последовательности или это является следствием укорочения длины петли FG, данный клон и два дополнительные мономерных скаффолд-белка Tn3 (А6 (SEQ ID NO: 190; обратите внимание, что мономерный скаффолд A3 в данном примере отличается от вектора, обозначенного A3 в Таблице 3) и Р1С01 (SEQ ID NO: 191)) с длиной петли FG 9 аминокислот (отличается от последовательности петель ВС, DE и FG) были проанализированы путем дифференциальной сканирующей колориметрии (ДСК) и сопоставлены с исходным скаффолдом Tn3, который включает петлю FG из 10 аминокислот. Были проанализированы образцы белка Tn3 при 1 мг/мл в ФСБ рН 7,2. Во всех случаях срединная точка термального раскручивания была выше для клонов с 9 остатками в петлях FG в сравнении с исходным (WT) Tn3, где в петле FG было 10 остатков. Термальное раскручивание было обратимым или частично обратимым (клон А6), о чем свидетельствовало суперналагаемые термограммы при охлаждении и повторном нагревании одного и того же образца. Как это указано на ФИГ.14, температура плавления (T_m) для исходного Tn3 составила 72,1°С, для Р1С01 T_m составила 75,2°С, для А6 T_m составила 77,5°С и для 71 T_m составила 74,4°С.

[0372] Такие результаты были подтверждены тестированием этих же белковых вариантов Tn3 в ходе эксперимента стабильности в гуанидин хлориде. Раскручивание исходного (WT) Tn3, Р1С01, А6 и 71 под действием гуанидин хлорида (GuHCI) при рН 7,0 было оценено по свойственной флуоресценции триптофана, как это описано выше. Как это указано на ФИГ. 15, было согласовано с данными ДСК из ФИГ. 14, что клоны Tn3 А6, 71 и Р1С01 имеют срединные точки раскручивания при по существу высоких концентрациях GuHCl в сравнении с сходным скаффолдом (WT) Tn3, что указывает на стабильность белков Tn3 с петлями FG из 9 аминокислот, т.е. петлями, которые короче, чем петли в исходном скаффолде Tn3.

Пример 11

Анализ стабильности длины петли FG

[0373] Как это описано выше, предварительный анализ показал, что молекулы Tn3 с петлей FG из 9 остатков, по существу более стабильны, чем другие молекулы с более длинными петлями FG. В данных исследованиях мы проводили анализ стабильности на группе случайных Tn3 для оценки влияния длины петли FG на термическую стабильность.

[0374] Библиотека Tn3 была субклонирована в вектор экспрессии pSEC. Такая библиотека кодирует Tn3 с петлями ВС, DE с FG с различной последовательностью, а также различной длиной. Петля FG, являющаяся основной в данных исследованиях, может иметь в длину 9, 10 или 11 остатков. Петля ВС может иметь в длину 9,11 или 12 остатков. Петля DE в данной библиотеке имеет фиксированную длину из 6 остатков. Субклонированная библиотека использовалась для трансформации компетентных клеток DH5α, из которых был очищен плазмидный пул и использован для трансформации клеток BL21 (DE3). Колонии BL21 были секвенированы для идентификации 96 клонов, кодирующих Tn3 полной длины. Финальные 96 клонов были выращены на 96-луночном планшете при масштабе 500 мкл с использованием стандартной экспрессии в Magic Media (встряхивание при 37°С в течение 24 часов после инокуляции) и анализированы с использованием SDS-PAGE. 29 случайных клонов с уровнями экспрессии от умеренного до высокого были масштабированы по шкале 50 мл и очищены с использованием стандартной аффинной хроматографии с иммобилизацией на металле. Идентичность всех белков была подтверждена масс-спектрометрией.

[0375] Случайные клоны было проанализированы на предмет стабильности с помощью ДСК. Измерения ДСК проводили с использованием VP-Capillary DSC (MicroCal). Белки были помещены в ФСБ (рН 7,2) в течение эктенсивного диализа, и концентрация была приведена до 0,25-0,5 мг/мл для проведения анализа ДСК. Образцы были сканированы при 20-95°С при скорости сканирования 90°С/час без какого-либо повторного сканирования. Результаты приведены в ТАБЛИЦЕ 17.

ТАБЛИЦА 17
Сравнение значений Tm Tn3 с FG9 в сравнении с FG10/11
FG9	Tm (°C)		FG10/11	Tm (°C)
А1	64.8		E12 (FG10)	65.0
A3	71.8		F5 (FG10)	60.0
В2	70.0		G1 (FG11)	64.3
В4	69.4		G4 (FG11)	67.6
С5	66.6		G8 (FG11)	64.2
С7	66.0		H6 (FG11)	70.3
С8	64.1		H7 (FG11)	71.7
С11	59.5		H8 (FG10)	61.9
D1	73.7		H9 (FG10)	59.5
D8	72.1		Н10 (FG11)	67.6
D10	65.6		Н11 (FG11)	63.7
D11	65.6		Н12 (FG11)	65.6
D12	66.4
Е1	75.0
Е3	66.0
Е9	75.3
E11	61.9
n=17			n=12
Среднее	67.9		Среднее	65.1

[0376] В данном исследовании сопоставляли термическую стабильность Tn3 с длиной петли FG9 или FG10 и 11. Тенденция показала, что домены Tn3 с петлей FG из 9 остатков более термостабильны, чем домены с длиной петли FG10 или 11. Контроль - домен Tn3 дикого типа (с петлей FG из 10 остатков) имел значение T_m 72°С при исследовании параллельно указанным образцам. Диапазон значений T_m, отмечаемых для каждой длины волны, указывает, что другие факторы также играют роль в определении термостабильности домена Tn3.

Пример 12

Получение и характеристика триспецифических Tn3

[0377] В данных экспериментах была получена и охарактеризована молекула Tn3 со специфичностью связывания с тремя различными мишенями. D1, домен Tn3, специфический относительно антитела Synagis', был соединен с 1Е11. доменом Tn3, специфичным относительно рецептора TRAIL 2, и 79, домен Tn3, специфичный относительно CD40L, соответственно (ФИГ.16А). Вектор был экспрессирован в клетках BL21 (DE3) Е.coli и очищен с использованием стандартных способов (см. ФИГ.16В).

[0378] Для подтверждения того, что триспецифические вектора способны образовывать пары со всеми тремя мишенями одновременно, были проведены эксперименты AlphaScreen и ИФА. Для экспериментов AlphaScreen триспецифические Tn3, подгруппа двух из трех молекул-мишеней (одна биотинилированная и другая содержит участок антитела к Fc), донорские белковые гранулы белка А и акцепторные гранулы стрептавидина были скомбинированы в 384-лучночном белом планшете Optiplate, как это описано выше. Сигнал AlphaScreen может наблюдаться только тогда, когда донорская гранула стрептавидина и акцепторная гранула белка А находятся вблизи друг от друга (200 нм друг от друга), что в данном анализе достигается путем использования триспецифической молекулы. Способность D1-1E11-79 одновременно связываться с huCD40L и TRAIL R2-Fc (ФМГ.17А), и одновременно связываться с huCD40L и Synagis* (ФИГ.17В) была подтверждена в ходе анализа AlphaScreen следующим образом: в 384-луночном белом планшете Optiplate были скомбинированы следующие компоненты в общем объеме 30 мкл: 20 мМ очищенного D1-1E11-79, 50 мМ биотинилированного huCD40L, (0, 1, 2,5, 5, 10 или 42 нМ) TrailR2-Fc (ФИГ.18А) или (0, 1, 2,5, 5, 10 или 42 нМ) Synagis (ФИГ.18В), 5 мкл каждого разведения 1/50 акцепторных гранул белка A AlphaScreen и донорских гранул стрептавидина. После 1 часа инкубации в темноте, планшет был считан на планшете-ридере Envision в режиме AlphaScreen.

[0379] Принимая во внимание, что Synagis* и TRAIL R2-Fc содержат домен Fc, анализ AlphaScreen не может использоваться для демонстрации одновременного связывания таких молекул с триспецифическим вектором. Вместо этого был проведен эксперимент ИФА. Планшеты MaxiSorp были покрыты TRAIL R2-Fc (100 мкл при 1 мкг/мл), блокированы 4% молоком, затем были добавлены различные концентрации триспецифической молекулы. Биотинилированный Synagis, второй лиганд мишени, был добавлен и определен путем добавления HRP-стретавидина (ФИГ.18). Было также показано, что D1-1E11-79 способен связываться с TRAIL R2-Fc и Synagis* одновременно, о чем свидетельствуют результаты ИФА на ФИГ.18. Таким образом, мы можем прийти к выводу, что данный вектор связывается со всеми тремя парами своих мишеней одновременно.

Пример 13

Ведущее выделение

[0380] Первый этап в разработке агониста Tn3 состоит в выделении мономера Tn3, который может связываться с TRAIL R2, и при связывании в поливалентной форме может связываться с двумя или более внеклеточными доменами TRAIL R2 таким образом, что вовлекается в путь апоптоза. Поскольку не все связующие молекулы действуют в качестве агонистов, мы решили вначале выделить параллель связующих молекул, и затем провести скрининг на предмет агонизма в ходе вторичного анализа гибели клеток in vitro. Вначале мы получили большую библиотеку фаговых дисплеев для Tn3 с варьированием в петлях ВС, DE и FG на рекомбинантном TRAIL R2-Fc для выделения первичной панели связующих молекул. Выбранный скаффолд Tn3 как основа для библиотеки не был нативным 3м доменом FnIII из тенасцина С, он был представлен версией с рекомбинантным дисульфидом для улучшения стабильности. Библиотека фаговых дисплеев с наличием Tn3/3 гена была построена с включением рандомизации в петлях ВС, DE и FG. С помощью ИФА фагов было найдено множество связующих молекул, в ходе данных анализов TRAIL R2 был непосредственно нанесен на планшет и связывание проводили в соотношении 1:3 разведенного фага в ФСБ+0,1% Твина 20 (PBST) 1% молоке с определением конъюгированного антитела к пероксидазе и М13 (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ). Целый ряд связующих молекул содержит нежелательный несвязанный цистеин в одной петле и такие молекулы не были выбраны для дальнейшего исследования. Подгруппа клонов с отсутствием несвязанного цистеина была клонирована в векторы экспрессии, генерирующие слияние Fc или антителоподобный вектор (ФИГ.1), с последующим тестированием на линии опухолевых клеток Н2122 на предмет гибели клеток (данные не указаны). Несмотря на то, что форма слияния Fc не вызывала гибель клеток независимо от слитого Tn3, антителоподобная форма вызывала ответ для более чем одной связующей молекулы.

Пример 14

Созревание аффинности

[0381] Клон 1С12 (SEQ ID NO: 132) (см. ФИГ.19) обладал наилучшими свойствами относительно гибели клеток в первичных скрининговых анализах и, следовательно, был выбран для созревания аффинности. Созревание аффинности проводили с использованием насыщающего мутагенеза участков петель и принципов мутагенеза по Кункелю или ПЦР с олигонуклеотидами, включая рандомизацию, сборку и лигирование в вектор фагового дисплея. Первый и третий раунды включали насыщающий мутагенез части петель ВС и FG, соответственно, и раунд 2 комбинировал насыщающий мутагенез в части всех петель по отдельности, панорамирование, перемешивание генов и затем панорамирование перемешанных мутантов с получением клона с наивысшей аффинностью. Пулы клонов с созревшей аффинностью были восстановлены после панорамирования с использованием ПЦР непосредственно из фага или путем использования одноцепочечной ДНК и набора Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) с последующей ПЦР. Продукты ПЦР были расщеплены Ncol и Kpnl (New England Biolabs, Ipswich, MA) и клонированы в вектор экспрессии pSEC. Клоны были экспрессированы в MagicMedia (Invitrogen. Carlsbad, CA) и запущены в гель для верификации того, что экспрессия между клонами по существу не отличалась. Улучшенные клоны были идентифицированы с использованием конкурентного ИФА, в ходе которого планшеты были покрыты тетравалентным, антителоподобным 1С12 (SEQ ID NO: 154 и 155), а ингибирование связывания 0,75 нМ TRAIL R2 биотина в присутствии разведении Tn3 в MagicMedia было измерено с использованием стрептавидина-пероксидазы хрена (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ). TMB (KPL, Gaithersburg, MD) был добавлен и нейтрализован кислотой. Поглощение было определено при 450 нм.

[0382] Измерение аффинности проводили на системе оценки взаимодействия белков ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA) с сенсорным чипом GLC при 25°C. Забуференный физиологический раствор ProteOn с 0,005% Твина 20, рН 7,4 (ФСБ/Твин) использовали в качестве буфера для прогона. TRAIL R2 был иммобилизирован на чипе, после чего были приготовлены двукратные, 12-точечные серийные разведения связующих Tn3 (1С12 (SEQ ID NO: 132), 1Е11 (SEQ ID NO: 134), G3 (SEQ ID NO: 133), C4 (SEQ ID NO: 135) и G6 (SEQ ID NO: 138)) в ФСБ/Твин/0,5 мг/мл БСА, рН 7,4 при начальных концентрациях, варьирующих от 36 мкМ до 700 нМ. Образцы каждой концентрации были нъецированы в шесть каналов для аналитов при скорости потока 30 мкл/мин в течение 300 секунд. Значение K_d было определено с использованием анализа равновесия и программы ProteOn. Последовательности наилучших клонов из каждого раунда представлены на ФИГ.19. Общее улучшение аффинности после трех раундов созревания аффинности было практически на два порядка выше для наилучших клонов с аффинностью 40-50 нМ (ТАБЛИЦА 18).

ТАБЛИЦА 18
Равновесные константы связывания лучших мономерных клонов после созревания аффинности ведущего клона 1С12, как это измерено путем поверхностного плазменного резонанса (ППР)
Раунд	Клон	Kd (нМ)	Кратность улучшения
Ведущее выделение	1С12	4130±281
Созревание аффинности 1	G3	422±45	10
Созревание аффинности 2	1Е11	103±9	40
Созревание аффинности 3	С4	50±2	83
Созревание аффинности 3	G6	43±2	96

Пример 15

Влияние аффинности на силу действия антителоподобной формы

[0383] Для оценки влияния аффинности отдельной субъединицы TN3 на силу, все клоны из ТАБЛИЦЫ 18 были реформированы в антителоподобные векторы, указанные на ФИГ.1. Для экспрессии слияния антителоподобных белков, клетки 293F были временно трансфицированы соответствующими векторами экспрессии. Полученный супернатант был собран на 6 и 10 дни, и белок был очищен с использованием аффинной хроматографии с белком А. Все очищенные белки были проанализированы с использованием SDS-PAGE на бистрис гелях NuPage Novex 4-12% в буфере MES без восстановителя, а затем были визуализированы с использованием SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0384] Эксклюзионная хроматография также использовалась для анализа очищенных белков, и, где это было необходимо, собранный материал на колонке Superdex 75 10/300GL или Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Piscataway. NJ) был удален, и финальный уровень был ниже 10% общего уровня белка. Единица Acrodisc с мембраной Mustang E (Pall Corporation, Port Washington, NY) использовалась в соответствии с указанием производителя для удаления эндотоксина из бактериально экспрессируемых белковых препаратов.

[0385] Клетки Н2122 затем были тестированы на предмет чувствительности к агонистическим антителоподобным векторам с использованием анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo. В ходе данного анализа люминесценция прямо пропорциональна уровням АТФ в отдельной лунке 96-луночного планшета, что, в свою очередь, прямо пропорционально количеству метаболически активных жизнеспособных клеток. Клетки Н2122 линии были распределены по 96-луночному планшету с плотностью 10000 клеток/лунка в полной среде 75 мкл (среда RPMI 1640, дополненная 10 ФБС). После инкубации в течение ночи при 37°С, среда была дополнена 25 мкл дополнительной среды. содержащей серийное разведение TRAIL R2-специфического или отрицательного контрольного белков Tn3. Все процедуры дублировались. Представленный на рынке лиганд TRAIL (Chemicon/Millipore, Billerica, MA) был использован в качестве положительного контроля для гибели клеток, индуцируемой рецептором TRAIL.

[0386] Спустя 72 часа использовали набор CellTiter-Glo в соответствии с инструкциями производителя. Люминесценция анализа была измерена на планшете-ридере Envision (PerkinElmer, Waltham, MA). Ингибирование жизнеспособности клеток было определено путем деления значения люминесценции обработанных клеток на среднее значение люминесценции необработанных живых клеток.

[0387] Было определено два переменных силы: концентрация, при которой вектор ингибирует жизнеспособность клеток на 50% (EC₅₀), и максимальное ингибирование жизнеспособности клеток. На ФИГ.20 показано, что, согласно общей тенденции, большая аффинность мономера Tn3 приводит к пониженному значению EC₅₀ антителоподобных векторов, т.к. G6 имеет меньшее значение EC₅₀ чем 1Е11 и 1Е11 имеет меньшее значение EC₅₀ чем 1С12.

Пример 16

Фармакокинетика линейных Tn3

[0388] Для определения периода полужизни линейных тандемов Tn3 как функцию от количества модулей Tn3 на тандем, мономер G6 (SEQ ID NO: 138), тандем G6 4 (SEQ ID NO: 143), тандем G6 6 (SEQ ID NO: 192) и G6 тандем 8 (SEQ ID NO: 145) были инъецированы мыши, и сывороточные концентрации Tn3 мониторили с использованием ИФА. Путь введения был представлен интраперитонеальной (и/п) инъекцией. Схема эксперимента представлена в ТАБЛИЦЕ 19. В определенной временной точке у мышей брали кровь 150 мкл. Tn3 были определены в сыворотке с помощью ИФА, в ходе которого планшеты с нанесенными TRAIL R2 инкубировали с сывороткой, разведенной в PBST 1% молоке. Для определения правильного диапазона разведения в отдельной временной точке и установления сигнала в динамическом диапазоне анализе, были проведены первичные ИФА. Связанный Tn3 был определен в 1 в 1000 разведении поликлонального сывороточного антитела кролика к Tn3 в PBST 1% молока (Covance, Princeton, NJ), а затем в1 в 10000 разведении в PBST 1% молока антитела осла к HRP кролика (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Для каждого вектора была построена стандартная кривая. Статистический анализ проводили с использованием внутренней статистической программы.

[0389] Термин «максимальная концентрация в плазме» («C_max») обозначает максимальную наблюдаемую концентрацию тандема Tn3 в плазме после введения исследуемого материала пациенту.

[0390] Термин «T_max» обозначает время для достижения максимальной концентрации в плазме C_max.

[0391] Термин «площадь под кривой» («ППК») обозначает площадь под кривой на график концентрации тандемного Tn3 в плазме относительно времени. ППК может быть измерена как интеграл мгновенной плазменной концентрации (С_р) во время интервала времени и обозначается в единицах масса*время/объем. Однако ППК обычно предоставляет для временного интервала от нуля до бесконечности. Таким образом, термин «ППК_inf» обозначает ППК в течение неограниченного периода времени.

[0392] Термин «биологический период полужизни» («T_1/2») обозначает время, необходимое для достижения плазменной концентрации тандема Tn3 половины от своего начального значения.

[0393] Термин «CL/F» обозначает очевидный общий клиренс организма, рассчитанный как Доза/nnKmf.

[0394] Биологический период полужизни Tn3 (T_1/2) повышается с увеличением количества тандемных Tn3 в линейной молекуле. Добавление семи Tn3 для получения тандема из 8 мономеров повышает период полужизни по существу на 50%. Повышение валентности не влияет на T_max. Однако повышение валентности от 1 до 8 приводит примерно к десятикратному и 7-кратному повышению значений C_max и ППК_inf, соответственно, Кроме того, при увеличении валентности от 1 до 8, наблюдается снижение клиренса (CL/F) в 7 раз.

ТАБЛИЦА 19
Схема эксперимента фармакокинетического анализа линейного тандема к TRAIL R2
Группа#	Тест	Доза	Путь введения	Объем	Временной интервал	№ мыши
1	G6 мономер	10 мг/кг	и/п	10 мл/кг	(15 мин, 1 ч, 16 ч), (30 мин, 4 ч, 24 ч) (2 ч, 6 ч, 48 ч)	(3) (3) (3)
2	G6 тандем 4	10 мг/кг	и/п	10 мл/кг	(15 мин, 1 ч, 16 ч), (30 мин, 4 ч, 24 ч) (2 ч, 6 ч, 48 ч)	(3) (3) (3)
3	G6 тандем 6	10 мг/кг	и/п	10 мл/кг	(15 мин, 1 ч, 16 ч), (30 мин, 4 ч, 24 ч) (2 ч, 6 ч, 48 ч)	(3) (3) (3)
4	G6 тандем 8	10 мг/кг	и/п	10 мл/кг	(15 мин, 1 ч, 16 ч), (30 мин, 4 ч, 24 ч) (2 ч, 6 ч, 48 ч)	(3) (3) (3)
	Всего	36

ТАБЛИЦА 20
Фармакокинетические свойства тандемных Tn3
Исследуемый материал	Фармакокинетический параметр
	Cmax	Tmax	ППКinf	T1/2	CL/F
(мкг/мл)	(ч)	(ч*мкг/мл)	(ч)	(мл/ч/кг)
G6 мономер	3.65	1	9.31	1.22	1070
G6 тандем 4	8.07	1	23.2	1.46	431
G6 тандем б	24.6	1	36.5	1.69	274
G6 тандем 8	38.6	1	64.2	1.76	156

Пример 17

Рекомбинантное повышение реакционноспособности у яванского макака

[0395] Для доклинических исследований токсичности у яванского макака (Масаса fascicularis), желательно разработать антитело к TRAIL R2-Tn3, которое реагировало бы перекрестным образом с TRAIL R2 яванского макака (cyno TRAIL R2). Наши полученные ранее ведущие клоны с созревшей аффинностью обладали плохой перекрестной реакционной способностью с cyno TRAIL R2, несмотря на то, что гомология с TRAIL R2 человека составила 88%. Перекрестная реакционная способность была повышена путем создания библиотеки на основе клона F4 (SEQ ID NO: 137), который был представлен клоном с наилучшем перекрестной реакционной способностью к cyno среди клонов, полученных после созревания аффинности.

[0396] С использованием насыщающего мутагенеза было получено две библиотеки: одна с разнообразием в петле FG и другая с разнообразием в петлях ВС и FG. Для введения мутаций снаружи петли, которые могут быть преимущественными для повышения связывания cyno TRAIL R2, использовали мутагенную ПЦР с низким показателем ошибок. Было проведено четыре раунда пэннинга фагов с использованием cyno TRAIL R2, и результаты были клонированы в вектор экспрессии pSEC. Для скрининга начальных результатов в ИФА, Tn3 были секретированы в MagicMedia (Invitrogen, Carlsbad, CA) и были захвачены из супернатанты с использованием антитела с тэгом his (R and D Systems, Minneapolis, MN).

[0397] Связывание cyno TRAIL R2-Fc или TRAIL R2-Fc человека в растворе для улавливания Tn3 было определено с использованием антитела к Fc-HRP человека. Клоны с значительным связыванием с cyno TRAIL R2-Fc без утраты связывания с TRAIL R2-Fc человека были выбраны для последующего скрининга ИФА, в котором на планшет наносили cyno TRAIL R2-Fc или TRAIL R2-Fc человека, и супернатанты Tn3 были титрованы с последующим определением антитела HRP с тэгом his. Принимая во внимание, что степень варьирования уровней экспрессии от клона к клону была низкой, а также то, что авидность двухвалентного TRAIL R2-Fc не могла замаскировать разницу в аффинности Tn3, данный ИФА подходил для дискриминации аффинности. Было выявлено, что одна мутация, а именно мутация от D до G в двух аминокислотах до петли DE, присутствовала во всех рекомбинантных cyno клонах с перекрестной способностью (ФИГ.22А). Такая мутация от D до G была введена рекомбинантно в оригинальный F4 для получения клона, названного F4mod1 (SEQ ID NO: 193), вслед за чем была существенно повышена реакционная способность cyno без снижения связывания с TRAIL R2 человека (ФИГ.22В). В ходе данного ИФА было измерено ингибирование связывания 0,75 нМ cyno TRAIL R2-Fc или TRAIL R2-Fc человека с нанесенными на планшет F4mod1 путем очистки F4 или F4mod1.

[0398] Желательно, чтобы связывание cyno клона с перекрестной способностью с cyno trail-R2-fc в 10 раз превышало связывание с TRAIL R2-Fc человека. Кроме того, желательно, чтобы связывание cyno клона с перекрестной способностью с супо TRAIL-R2-FC в 10 раз превышало связывание F4 с TRAIL R2-Fc человека. Значение IC₅₀ для F4mod1, связывающегося с cyno TRAIL R2, отличается менее чем в три раза от значения IC₅₀ для F4mod1, связывающегося с TRAIL R2 человека. Кроме того, значение IC₅₀ для F4mod1, связывающегося с TRAIL R2 человека в 6 раз больше, чем значение IC₅₀ для F4, связывающегося с TRAIL R2 человека. В соответствии с этим, F4mod1 удовлетворяет необходимым требования в перекрестной реакционной способности.

Пример 18

Гуманизированная рекомбинация улучшенного клона яванского макака с перекрестной реакционной способностью

[0399] Клон F4mod1 был дополнительно рекомбинирован для элиминации не играющих важной роли мутаций из гуманизированной линии для снижения возможного риска иммуногенности. Была создана панель из двенадцати разных модификаций для определения наличия эффекта данной мутации на связывание супо TRAIL R2 и TRAIL R2 человека. На ФИГ.23А представлено сравнение финального клона F4mod12 (SEQ ID NO: 194), который включает все исследуемые гуманизированные мутации, которые не влияют на связывание с другими векторами, а именно гуманизированный Tn3, оригинальный исходный F4 и клон F4mod1 (начальный усовершенствованный рекомбинантный клон cyno с перекрестной реакционной способностью).

[0400] Аминокислотная последовательность F4mod12 начинается от нативной последовательности Tn3 SQ, заканчивается L, включает реверсию шарнирного участка 2 с мутацией от А до Т, и имеет реверсию двух конечных аминокислот петли DE от ТА до NQ. ФИГ.23В показывает, что способность связывания F4, F4mod1 и F4mod12 с TRAIL R2 отличается в шестикратном размере. Также показано, что разница между связыванием F4mod1 и F4mod12 с супо TRAIL R2 отличается в два раза.

[0401] F4mod12 был реформирован в тандем 6 (SEQ ID NO: 167) and tandem 8 (SEQ ID NO: 166) и тестирован для подтверждения отсутствия утраты активности относительно тандема G6 6 (SEQ ID NO: 144) и тандема 8 (SEQ ID NO: 145). ФИГ.23С и ФИГ.23D отображают отсутствие утраты активности относительно гуманизированных, рекомбинантных с повышенной перекрестной реакционной способностью тандемов cyno F4mod12 в сравнение с тандемами G6 в линии клеток Colo205.

Пример 19

Активность тандема G6 8 в TRAIL-резистентных линиях клеток

[0402] Множественные линии клеток резистентны к гибели под действием TRAIL. Таким образом, мы оценивали факт трансляции повышенной активности тандемов G6 8 относительно TRAIL в чувствительных к TRAIL линиях клеток в активность тандема G6 8 в TRAIL-резистентных линиях клеток. Чувствительность к Apo2L/TRAIL в нескольких линиях раковых клеток была определена с использованием анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent (Promega, Madison, Wl). Краткое описание: клетки были распределены по 96-луночному планшету, им дали отстояться в течение ночи, после чего в них были внесены различные концентрации рекомбинантного Apo2L/TRAIL и TRAIL-миметического тандема G6 8 в среде, содержащей 10% ФБС. После периода 48-72 ч, была определена жизнеспособность клеток с соблюдением протоколов производителя. ФИГ. 24 отображает, что TRAIL-резистентная линия клеток тандема НТ29 G6 8 обладает сильной апоптозной активностью, в отличие от TRAIL. В ТАБЛИЦЕ 21 указано, что тандем G6 8 обладает активностью относительно гибели клеток в большинстве, но не во всех исследуемых линиях клеток, резистентных к TRAIL. Повышенная активность может быть вызвана более высокой валентностью тандема относительно TRAIL, однако пространственная ориентация модулей связывания также может оказывать влияние.

ТАБЛИЦА 21 Активность тандема G6 8 и TRAIL в TRAIL-резистентной линии клеток
Резистентность к TRAIL, но чувствительность к миметикам TRAIL		TRAIL IC50 [nM]	G6 Tandem 3 IC50 [nM]	TRAIL % Max Kill	Tandem 8% Max Kill
	ТО4	>0.0	0.247	14.44	71.50
	LoVo	>8.3	0.035	45.99	74.22
	СаСо-2	>8.3	0.044	18.23	54.84
	НТ29	>8.3	0.01	28.00	85.40
	HPAF-II	>8.3	0.016	45.33	91.33
	Hep3B	>8.3	0.023	13.35	70.15
	SKHEP-1	>8.3	0.055	19.48	80.19
HepO2	>8.3	0.040	33.31	84.00
Резистентность к TRAIL имиметикам TRAIL	SW620	>8.3	>10	-5.71	4.Б5
	SW837	>8.3	>10	19.98	25.32
	Hs766T	>8.3	>10	20.99	47,86
	VCI-Н522	>8.3	>10	32.69	31.38
	NC-H23	>8.3	>10	22.08	39.59
	ВТ-549	>8.3	>10	4.49	27.99
	SNB-75	>8.3	>10	8.9	4.7
	786-0	>8.3	>10	-0.12	7.19
	SNU-387	>8.3	>10	-0.33	33.1
	SNU-475	>8.3	>10	0.49	20.S8
SNU-398	>8.3	>10	1.50	0.46

Пример 20

Исследование иммуногенности TRAIL R2-связующих мономеров

[0403] Иммуногенность является потенциальной проблемой для любого лечебного белка, даже если он человеческого происхождения. Иммуногенный ответ может ограничить эффективность посредством нейтрализации антител, что может привести к воспалению. Один из наиболее важных факторов в развитии иммунного ответа является присутствие антигенных детерминант, которые могут стимулировать пролиферацию CD4+Т-клеток. В ходе теста EpiScreen (Antitope, Cambridge, UK), мононуклеарные клетки периферической крови, обедненные CD8+Т-клетками (МКПК), инкубируют с исследуемыми белками, после чего проводят мониторинг CD4+Т-клеточной пролиферации и секреции ИЛ-2 (см. Baker & Jones, Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 10:219-227. 2007; Jaber & Baker, J. Pharma. Biomed. Anal. 43:1256-1261, 2007;. Jones et al., J. Thrombosis and Haemostasis 3:991-1000, 2005; Jones et al., J. Interferon Cytokine Res. 24:560-72, 2004). МКПК выделяют из пула доноров, и они представляют собой аллотипы HLA-DR, экспрессируемые среди мировой популяции.

[0404] Мономеры Tn3, указанные на ФИГ. 25, были экспрессированы (с GGGGHHHHHHHH линкером-His тэгом), очищены и верифицированы на предмет мономерии путем SEC, профильтрованы для удаления эндотоксина, как это описано выше. Все клоны, не являющимися клонами дикого типа, были получены путем рекомбинации для повышения перекрестной реакционной способности cyno (ФИГ.22А). Однако такие клоны имели мутации при гуманизации, которые, как это было показано, не влияли на связывание в присутствии F4mod1. Такие клоны были тестированы в ходе ИФА для верификации того, что гуманизированные мутации не влияют на связывание. В ходе анализа пролиферации Т-клеток и анализа секреции ИЛ-2 в качестве положительного ответа для отдельного донора был установлен индекс стимуляции (ИС), превышающий 2. Срединное значение ИС или среднее значение ИС для популяции с положительным ответом является индикатором силы ответа. В оба анализа был включен контрольный белок, который, как известно, вызывает сильный ответ, а именно гемоцианин фиссуреллы (KLH).

[0405] В ТАБЛИЦЕ 22 указаны средние значения ИС для всех исследуемых белков, которые по существу ниже, чем значения для KLH, и незначительно превышали порог 2 для положительного среднего значения ИС. Кроме того, частота ответа для исследуемых белков была очень низкой (десять процентов или менее для всех исследуемых белков, за исключением контроля, ответ у которого превышал 90%). Проведенные ранее исследования Antitope выявили, что ответ EpiScreen менее 10% является индикатором низкого клинического риска иммуногенности. Таким образом, наше наблюдение того, что все исследуемые выше Tn3 имели показатель 10% или менее частоты ответа указывает на низкий риск клинической иммуногенности.

ТАБЛИЦА 22 Результаты анализа иммуногенности Antitope EpiScreen. Исследуемые Tn3 ранжированы от 1 (более иммуногенный) до 4 (менее иммуногенный)
Sample	Mean SI	Frequency (%) of Response	Ranking
Prolif	IL-2	Prolif	IL-2
F4mod12	2.82	2.30	4	4	4=
00322S-A07	2.91	2.06	8	8	2
00322S-G09	2.88	2.26	10	10	1
00322V-A10	2.67	2.33	8	6	3=
00322V-F11	3.14	2.37	6	6	3=
wild type	2.05	2,00	6	4	4=
KLH	6.51	3.98	96	92	N/A

Пример 21

Агрегационное состояние неочищенного и очищенного тандема G6 8 Tn3

[0406] В науке известно, что белки, содержащие множественные цистеины, например, белок, состоящий из повторяющихся тандемов, которые содержат внутреннюю дисульфидную связь, часто не обладают надлежащей способностью связывания с дисульфидами. Перемещение дисульфидов может снизить или элиминировать экспрессию в среде. Если белок не экспрессируется в среде, возможно существование смеси из неправильно скрученных белков с межмолекулярными и несоответствующими внутримолекулярными дисульфидными парами, что ведет к агрегации. Полученные нами данные SEC выявили, что большинство тандемных белков в среде бактериальной экспрессиии находились в мономерном и надлежащим образом скрученном состоянии. После очистки Ni-NTA тандема G6 8 с меткой His было агрегировано примерно 15% белка. Наблюдаемая агрегация была снижена до 4% (ФИГ.26А) путем снижения с использованием 2 мМ DTT, указывая, что большинство явлений агрегации было опосредовано дисульфидом. Большая часть агрегатов была удалена путем очистки SEC (ФИГ.26В), как это описано выше.

Пример 22

Определение миметиков TRAIL, G6TN6 и G6TN8, ингибирования роста в моделях ксенотрансплантатов колоректального рака Colo205

[0407] Противоопухолевая активность миметиков TRAIL Tn3, тандема G6 6 (G6TN6) (SEQ ID NO: 144) и тандема G6 8 (G6TN8) (SEQ ID NO: 145) была исследована с использованием Colo205, модели ксенотрансплантата колоректальной карциномы человека. Клетки Colo205 содержались в виде полиадгезивной монослойной культуры при 37°С при 5% СО₂ в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Клетки, собранные путем трипсинизации, были ресуспендированы до финальной концентрации 3×10 клеток/мл в сбалансированном соляном растворе Хэнка (HBSS). В правую верхнюю конечность бестимусных самок мышей было подкожно (п/к) введено 3×10⁶ клеток Colo205. Исследование было начато, когда опухоль достигла в среднем ~177 мм³. Схема эксперимента представлена в ТАБЛИЦЕ 23. TRAIL был разведен из маточного раствора с 20 мМ Tris-HCI 300 мМ аргинин-HCl РН 7 и введен внутривенно (в/в) в дозе, указанной в ТАБЛИЦЕ 23, ежедневно в количестве в целом 5 доз в соответствии с массой тела (10 мл/кг). Тандем G6 6 (G6TN6) и тандем G6 8 (G6TN8) были разведены из маточного раствора с использованием ФСБ и введены внутривенно (в/в) в дозах, указанных в ТАБЛИЦЕ 23, ежедневно в количестве в целом 5 доз в соответствии с массой тела (10 мл/кг). Были записаны объемы опухолей и масса тела. Измерение опухолей проводили с использованием электронного толщиномера, и объем опухоли (мм³) был рассчитан с использованием формулы объема опухоли = [длина (мм) × ширина (мм)²]/2. Ингибирование роста опухоли (TGI) было рассчитано как процент TGI=(1-Т/С)×100, где Т = финальные объемы опухолей из группы лечения после последней дозы, и С = финальные объемы опухолей контрольной группы после последней дозы.

[0408] В течение фазы введения дозы (DP) (ФИГ.27), 3 мг/кг и 30 мг/кг G6TN6 привели к существенному TG1 92% (р<0,0001) и 93% (р<0,0001), соответственно (ТАБЛИЦА 24). Подобным образом, после эквимолярной корректировки финальной концентрации, 2,25 мг/кг и 25,5 мг/кг G6TN8 привели к значительному значению TG1 93% (р<0,0001) и 94% (р<0,0001), соответственно (ТАБЛИЦА 24). 30 мг/кг TRAIL привели к значению TGI 60% (р<0,001), (ТАБЛИЦА 24).

[0409] Ко дню 34 фазы обратного роста (RP) (ФИГ.27), в то время как 3 мг/кг G6TN6 не привел к какому-либо значимому значению CR (CR; процент мышей в группе, у которых опухоль не пальпировалась в течение двух успешных измерений), 2,25 мг/кг G6TN8 привел к значению CR 90%. При более высокой дозе 30 мг/кг G6TN6 было достигнуто значение CR 50%. С другой стороны, 25,5 мг/кг G6TN8 привели к значению CR 100% (ТАБЛИЦА 25). Результаты от обеих доз указывают на то, что G6TN8 провел к большей эффективности в сравнении с G6TN6. Однако G6TN6 и G6TN8 обладали эффективностью в определенных дозах. Кроме того, оба вектора по существу превосходили TRAIL, не приведший к PR или CR.

[0410] Как указано на ФИГ.28, при введении G6TN6 и G6TN8 во всех дозах в течение фаз обратного роста и введения доз исследования потеря массы тела не отмечалась.

ТАБЛИЦА 23
Схема исследования для TRAIL и миметиков TRAIL (G6TN6 и G6TN8) в модели ксенотрансплантата опухоли Colo205
Группа	Исследуемый материал	Доза (мг/кг)	Объем дозы (мл/кг)	Путь введения	График введения дозы
1	Лечение отсутствовало	Н/Д	Н/Д	Н/Д	Н/Д
2	PBS	NA	10	в/в	QDX5
3	TRAIL	30 мг/кг	10	в/в	QDX5
4	G6TN6	30 мг/кг	10	в/в	QDX5
5	G6TN6	3 мг/кг	10	в/в	QDX5
6	G6TN8	25,5 мг/кг	10	в/в	QDX5
7	G6TN8	2,25 мг/кг	10	в/в	QDX5

ТАБЛИЦА 24
Влияние TRAIL и миметиков TRAIL (G6TN6 и G6TN8) на TGI во время фазы введения дозы исследования
Группа лечения	% TGI	Значение р (в сравнении с не подвергнутым лечению контролем)
TRAIL 30 мг/кг	60	Р<0,001
G6TN6 30 мг/кг	93	Р<0,0001
G6TN6 3 мг/кг	92	Р<0,0001
G6TN8 25,5 мг/кг	94	Р<0,0001
G6TN8 2,25 мг/кг	93	Р<0,0001

ТАБЛИЦА 25
Влияние TRAIL и миметиков TRAIL (G6TN6 и G6TN8) на TGI во время фазы обратного роста на день 34 исследования
Группа лечения	PRa (%)	CRb (%)
Хвост	-	-
G6TN6 30 мг/кг	50	50
G6TN6 3 мг/кг	100	-
G6TN8 25,5 мг/кг	-	100
G6TN8 2,25 мг/кг	10	90
a процент частичной регрессии (PR; процент мышей в группе, у которых объем опухоли меньше 50% объема на время проведения двух успешных измерений)
b процент полной регрессии (CR; процент мышей в группе, у которых не пальпируется опухоль на время проведения двух успешных измерений)

[0411] Представленные выше примеры являются различными иллюстративными аспектами изобретения и практическим применением способов по изобретению. Такие примеры не предназначены для предоставления обширного описания множества различных вариантов воплощения изобретения. Таким образом, несмотря на то, что изобретение было описано подробно путем иллюстрации и примеров в целях пояснения принципов, специалисту в данной области будет понятно, что разрешено внесение множества изменений и модификаций без отклонения от общего объема прилагаемой формулы изобретения.

[0412] Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в данной заявке и включенные сюда посредством ссылки, включены в такой же самой степени, что и отдельные публикации, патенты или патентные заявки, что отдельным образом и индивидуально указано здесь посредством ссылки.

[0413] Представленные выше примеры являются различными иллюстративными аспектами изобретения и практическим применением способов по изобретению. Такие примеры не предназначены для предоставления обширного описания множества различных вариантов воплощения изобретения. Таким образом, несмотря на то, что изобретение было описано подробно путем иллюстрации и примеров в целях пояснения принципов, специалисту в данной области будет понятно, что разрешено внесение множества изменений и модификаций без отклонения от общего объема прилагаемой формулы изобретения.

[0414] Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в данной заявке и включенные сюда посредством ссылки, включены в такой же самой степени, что и отдельные публикации, патенты или патентные заявки, что отдельным образом и индивидуально указано здесь посредством ссылки.

1. TRAIL R2-специфический рекомбинантный мультимерный скаффолд, включающий шесть, семь или восемь TRAIL R2-специфических мономерных скаффолдов Tn3, где

(а) каждый мономерный скаффолд Tn3 включает семь бета-цепей, обозначенных А, В, С, D, Е, F и G, присоединенных к шести петлевым участкам, обозначенным АВ, ВС, CD, DE, EF и FG, где петля АВ включает SEQ ID NO: 35, петля ВС включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 97, 98 и 168, петля CD включает SEQ ID NO: 37, петля DE включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 102, 103 и 179, петля EF включает SEQ ID NO: 39 и петля FG включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 106, 108, 109, 169 и 170,

(б) мономерные скаффолды Tn3 соединены в линейном тандемном формате,

(в) рекомбинантный мультимерный скаффолд специфически связывается с TRAIL R2, и

(г) где мономерный скаффолд Tn3 включает по меньшей мере одну дисульфидную связь для соединения любых двух из указанных семи доменов бета-цепей.

2. Мультимерный скаффолд по п.1, где по меньшей мере два мономера-скаффолда Tn3 соединены напрямую, без линкера, разделяющего мономеры-скаффолды Tn3.

3. Мультимерный скаффолд по п.1, где по меньшей мере два мономера-скаффолда Tn3 соединены посредством линкера.

4. Мультимерный скаффолд по п.3, где линкер включает пептидный линкер.

5. Мультимерный скаффолд по п.4, где пептидный линкер включает последовательность (G_xS)_y, где х и y являются целыми числами, х=1, 2, 3 или 4 и y=1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

6. Мультимерный скаффолд по п.1, где связывание мультимерного скаффолда с TRAIL R2 улучшено в сравнении с TRAIL R2-специфическим мономерным скаффолдом Tn3.

7. Мультимерный скаффолд по п.1, где связывание мультимерного скаффолда с TRAIL R2 улучшает действие на мишень в сравнении с TRAIL R2-специфическим мономерным скаффолдом Tn3.

8. Мультимерный скаффолд по п.6, где авидность связывания TRAIL R2 и стабильность белка улучшены в сравнении с TRAIL R2-специфическим мономером-скаффолдом Tn3.

9. Мультимерный скаффолд по п.1, где по меньшей мере один мономерный скаффолд Tn3 слит с гетерологичной молекулой.

10. Мультимерный скаффолд по п.9, где гетерологичная молекула включает композицию, выбираемую и группы, состоящей из: белка, пептида, белкового домена, линкера, лекарства, токсина, цитотоксического агента, агента для визуализации, радионуклида, радиоактивного соединения, органического полимера, неорганического полимера, полиэтиленгликоля (ПЭГ), биотина, человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), связующего участка FcRn ЧСА, антитела, домена антитела, фрагмента антитела, одноцепочечного антитела, домена антитела, альбумин-связующего домена, фермента, лиганда, рецептора, связующего пептида, скаффолда, не принадлежащего FnIII, тэга антигенной детерминанты, рекомбинантного полипептидного полимера, цитокина и комбинации из двух или более указанных молекул.

11. Мультимерный скаффолд по п.10, где скаффолд конъюгирован с ПЭГ.

12. Мультимерный скаффолд по п.11, где ПЭГ конъюгирован со скаффолдом на N-конце или С-конце.

13. Мультимерный скаффолд по п.1, где мультимерный скаффолд представлен агонистом рецептора.

14. Мультимерный скаффолд по п.1, где по меньшей мере два мономерных скаффолда Tn3 включают аминокислотную последовательность:

IEV(X_AB)_nALITW(X_BC)_nCELX₁YGI(X_CD)_nTTIX₂L(X_DE)_nYSI(X_EF)_nYEVSLIC(X_FG)_nKX₃TFTT,

где Х_АВ, X_BC, X_CD, X_DE, X_EF и X_FG представляют аминокислотные остатки, присутствующие в петлях АВ, ВС, CD, DE, EF и FG соответственно, где X₁ представляет аминокислотный остаток А или Т, где Х₂ представляет аминокислотный остаток D или G, где Х₃ представляет аминокислоту Е или G и где длина петли n представлена целым числом между 2 и 26.

15. Мультимерный скаффолд по п.14, где петля ВС включает последовательность SEQ ID NO: 97, петля DE включает последовательность SEQ ID NO: 179 и петля FG включает последовательность SEQ ID NO: 170.

16. Мультимерный скаффолд по п.15, где скаффолд включает SEQ ID NO: 209 или 204.

17. Мультимерный скаффолд по п.1, где скаффолд включает SEQ ID NO: 167, 202, 203, 204 или 209.

18. Мультимерный скаффолд по п.1, где скаффолд связывается с рецептором TRAIL R2 с аффинностью (K_d) 1 мкМ или менее.

19. Мультимерный скаффолд по п.1, где скаффолд связывается с рецептором TRAIL R2 с аффинностью (K_d) 500 нМ или менее.

20. Мультимерный скаффолд по п.1, где скаффолд связывается с рецептором TRAIL R2 с аффинностью (K_d) 100 нМ или менее.

21. Мультимерный скаффолд по любому из предшествующих пунктов, где TRAIL R2 представлен TRAIL R2 человека.

22. Мультимерный скаффолд по любому из пп.1-20, где скаффолд связывается с TRAIL R2 и:

(а) агонизирует рецептор TRAIL R2,

(б) имитирует связывание TRAIL с рецептором TRAIL R2,

(в) облегчает димеризацию или олигомеризацию рецептора TRAIL R2,

(г) индуцирует апоптоз,

(д) снижает или ингибирует жизнеспособность клеток, или

(е) имеет комбинацию действий (а), (б), (в), (г) и (д).

23. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мультимерный скаффолд по п.1.

24. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п.23.

25. Клетка-хозяин, способная экспрессировать мультимерный скаффолд по любому из пп.1-20, включающая вектор по п.24.

26. Способ получения рекомбинантного мультимерного скаффолда, включающий культивирование клетки-хозяина по п.25 в условиях, при которых экспрессируется мультимерный скаффолд, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты.

27. Фармацевтическая композиция для профилактики, лечения или снижения симптомов рака, при котором клетки экспрессируют TRAIL R2, включающая эффективное количество рекомбинантного мультимерного скаффолда по любому из пп.1-20 в фармацевтически приемлемом эксципиенте.

28. Способ профилактики, лечения или снижения симптомов рака, при котором клетки экспрессируют TRAIL R2, у нуждающегося в этом пациента путем введения эффективного количества композиции по п.27.

29. Способ по п.28, где указанный рак выбирают из рака легкого, неходжкинской лимфомы, рака яичника, рака толстого кишечника, колоректального рака, рака поджелудочной железы и множественной миеломы.

30. Способ по п.28, где указанный способ включает дополнительную терапию, где указанная терапия представляет собой иммунотерапию, терапию биопрепаратами, химиотерапию, лучевую терапию или терапию низкомолекулярными лекарственными средствами.

31. Способ индуцирования апоптоза в клетке, экспрессирующей TRAIL R2, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством рекомбинантного мультимерного скаффолда по любому из пп.1-20.

32. Способ изменения активности TRAIL R2-экспрессирующей клетки, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством TRAIL R2-специфического мультимерного скаффолда по любому из пп.1-20, где мультимерный скаффолд связывается с TRAIL R2 и:

(а) агонизирует рецептор TRAIL R2,

(б) имитирует связывание TRAIL с рецептором TRAIL R2,

(в) облегчает димеризацию или олигомеризацию рецептора TRAIL R2,

(г) индуцирует апоптоз,

(д) снижает или ингибирует жизнеспособность клеток, или

(е) имеет комбинацию активностей (а), (б), (в), (г) и (д).