Способ механической обработки костных образцов in vitro



Способ механической обработки костных образцов in vitro
Способ механической обработки костных образцов in vitro
Способ механической обработки костных образцов in vitro

 

A01N1/00 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2629664:

Розанов Владимир Викторович (RU)
Ляшенко Павел Николаевич (RU)
Матвейчук Игорь Васильевич (RU)
Матвейчук Лидия Алексеевна (RU)

Изобретение относится к механической обработке костных образцов in vitro и может быть использовано в научных исследованиях в биологии и медицине при изготовлении биологических имплантатов с возможностью дальнейшего хранения в "тканевых банках". Способ механической обработки костного образца in vitro включает механическую обработку с использованием стерильной рабочей жидкости и последующую стерилизацию и консервацию полученных образцов. Сначала осуществляют стерилизацию костного образца озоновоздушной смесью с концентрацией озона 5÷10 мг/л в течение 10÷12 минут, затем механическую обработку проводят режущими инструментами в рабочей жидкости, в качестве которой используют стерильный, охлажденный до температуры +(4÷6)°С раствор Рингера с содержанием сангвиритрина в концентрации 0,01% в пересчете на активное вещество. После этого полученные образцы повторно стерилизуют озоновоздушной смесью аналогичным образом. Предлагаемый способ механической обработки костных образцов обеспечивает достижение 100% стерилизации костных образцов при сохранении их остеоиндуктивных свойств после механической обработки, сохранность морфологических и биопластических свойств стерилизуемых объектов, сокращение трудоемкости и времени подготовки имплантатов к их клиническому использованию и образцов для различных физико-химических исследований. 2 ил., 2 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к механической обработке костных образцов in vitro и может быть использовано в научных исследованиях в биологии и медицине при изготовлении биологических имплантатов с возможностью дальнейшего хранения в "тканевых банках" для обеспечения костнопластическим материалом учреждений здравоохранения.

Для достижения наилучшего клинического результата при изготовлении костного образца необходимо сохранить активность костных морфогенетических белков, не разрушить при механическом воздействии поверхность образца и одновременно добиться его стерильности, которая влияет на продолжительность его хранения.

Высокая степень стерильности необходима в биоимплантологии, в частности, на завершающих стадиях изготовления костного имплантата. При их использовании должна быть исключена возможность инфицирования реципиентов бактериальными, грибковыми и вирусными инфекциями. Поэтому технологический процесс изготовления костных образцов биологической природы должен завершаться надежной и адекватной стерилизацией с максимально возможным сохранением пластических свойств ткани. Отбор донорского материала, выбор технологии изготовления биологических имплантатов в мировой практике регулируется соответствующими стандартами и сопровождается серологическими исследованиями, которые не обладают 100% специфичностью и чувствительностью при диагностике инфекционных заболеваний.

На эндо- и экзопатогенную флору, присутствующую в донорских костных тканях, могут влиять различные факторы - температура, химическое и механическое воздействие, что не исключает денатурацию белковых структур, сведение к минимуму или полному исчезновению комплекса пластических свойств образца при его изготовлении.

Механической обработке кости уделяется недостаточное внимание. Среди методов, применяемых при изготовлении костных образцов, следует выделить традиционные - точение, фрезерование. Известно применение гидродинамической струи, ручной обработки. Необходимым условием при механической обработке кости является применение охлаждения ввиду ее специфических теплофизических свойств и композиционного состава. В качестве охлаждающих сред используются водопроводная, дистиллированная вода, физиологический раствор, глицериновая эмульсия. Это способствует созданию влажностных условий, близких к реальным, в которых кость находится в организме. Применение жидких сред позволяет получать образцы с высоким качеством поверхности.

Регистрируемая в зоне резания температура может достигать (+40÷60)°С при точении, при шлифовании - до +40°С. Непродолжительное действие указанных температур может оказывать отрицательное термическое воздействие на кость. Это подтверждается результатами макро - и микроскопических исследований, проведенных авторами предлагаемого изобретения, свидетельствующих о существенных структурных изменениях, обусловленных механической обработкой.

С учетом решаемых задач существуют различные технологии изготовления костных фрагментов для биоимплантологии и образцов для различных видов структурно-функционального анализа.

Так известен способ изготовления аллотрансплантата, включающий механическую обработку полученной от донора заготовки из костной ткани, последующую промывку ее холодной водой, деминерализацию в 1,2-3,6 н. растворе соляной кислоты, промывку деминерализованной заготовки в дистилляте и в физиологическом растворе, стерилизацию и консервацию заготовки путем помещения и выдерживания ее в соответствующей герметичной таре (упаковке), залитой раствором формальдегида с добавкой антибиотика (Сборник научных трудов ЛНИИТО им Р.Р. Вредена. Заготовка и пересадка деминерализованной костной ткани в эксперименте и клинике. Л.: НИИТО, 1983, с. 3-12). Данный способ позволяет за счет деминерализации костной ткани получать аллотрансплантаты с высокой остеоиндуктивностью. Однако существенным недостатком полученных по этому способу аллотрансплантатов является использование формальдегида в качестве консерванта и стерилизатора, что создает ряд проблем, обусловленных токсичностью формальдегида, необходимостью отмывки приготовленного трансплантата перед клиническим использованием, неудобством хранения и транспортировки трансплантата, погруженного в раствор, ограниченным временем хранения трансплантата (не более 6 месяцев).

Известен способ получения отверстия в кости с применением фрезы (пат. РФ 2558451). При этом к месту механической обработки постоянно подается физиологический солевой раствор (возможна подача под давлением). Такое высверливание в кости отверстия требуется, например, в хирургической стоматологии при выполнении синус-лифтинга. При этом качество внутренней поверхности отверстия является достаточным с учетом возможностей данного вида механической обработки. С помощью физиологического раствора осуществляется удаление костной крошки и частичная стерилизация подготовленного ложа. Данный способ применим только для подготовки ложа для установки импланта.

Известен способ изготовления костного имплантата (пат. РФ №2147800), заключающийся в последовательно проводимых при механической обработке операциях, как правило, в распиливании образцов вручную, промывке костного фрагмента, выполнении в нем сквозных отверстий диаметром 0,6-0,8 мм при плотности их расположения на поверхности заготовки 1-1,5 на см2, деминерализации в растворе соляной кислоты, нейтрализации остатков кислоты, консервации деминерализованной заготовки посредством лиофилизации, стерилизации после окончания сушки, осуществляемой путем облучения заготовки, помещаемой в герметичную упаковку, пучком ускоренных электронов. Однако существенным недостатком полученных по данному способу имплантатов является длительный цикл и сложность получения имплантатов. Кроме того, при механической обработке образца и выполнении в нем сквозных отверстий возможно повреждение как внешней поверхности, так и внутри отверстий от воздействия температуры, возможности распространения в толщу кости разрушений физико-химической природы. Отсутствуют указания о сохранении остеоиндуктивных свойств имплантата.

Наиболее близким прототипом к заявляемому техническому решению относится способ изготовления костного имплантата по пат. РФ №2268060, включающий механическую обработку гидродинамической струей, содержащей частицы углерод-минерального сорбента, доля которых составляет от 5 до 40% от объема применяемой жидкости струи, выполнение множественных сквозных отверстий с минимальным диаметром от 100 до 700 микрон по плоскостному шаблону, деминерализацию заготовки в 0,7-1,1 н. растворе ортофосфорной кислоты, нейтрализацию остатков кислоты, стерилизацию и консервацию заготовки. Недостатком стерилизации является невозможность получения 100% степени стерилизации от бактериальных, грибковых и вирусных инфекций. Такой образец можно изготовить только из костного фрагмента достаточных размеров, обеспечивающих возможность закрепления образца. Выполнение перфораций предусматривает изготовление специального шаблона. Для создания высокого давления гидродинамической струи (до 400 атм) требуется специальное технологическое оборудование и соблюдение особых требований безопасности.

Технической задачей предлагаемого изобретения является достижение 100% стерилизации костных образцов при сохранении их остеоиндуктивных свойств после механической обработки, обеспечение сохранности морфологических и биопластических свойств стерилизуемых объектов, сокращение трудоемкости и времени подготовки имплантатов к их клиническому использованию и образцов для различных физико-химических исследований.

Достижение технического результата возможно при использовании способа механической обработки костного образца in vitro, включающего механическую обработку с использованием стерильной рабочей жидкости и последующую стерилизацию и консервацию полученных образцов. При этом сначала осуществляют стерилизацию костного образца озоновоздушной смесью с концентрацией озона 5÷10 мг/л в течение 10÷12 минут, затем механическую обработку проводят режущими инструментами в рабочей жидкости, в качестве которой используют стерильный, охлажденный до температуры +(4÷6)°С раствор Рингера с содержанием сангвиритрина в концентрации 0,01% в пересчете на активное вещество, после этого полученные образцы повторно стерилизуют озоновоздушной смесью аналогичным образом.

Все костные образцы изготовлены с помощью полых цилиндрических и дисковых отрезных фрез, имеющих в рабочей зоне зубья или алмазное напыление.

Сангвиритрин, регистрационный номер Р N003835/01, торговое название Сангвиритрин. Представляет собой смесь кислых сульфатов двух бензо[с] фенантридиновых алкалоидов сангвинарина и хелеритрина, обладающего антимикробной активностью, обладает противомикробной активностью, действует на грамположительные и грамотрицательные бактерии. Фармакотерапевтическая группа: сильное противомикробное средство. Получают сангвиритрин из надземной части маклеи мелкоплодной. Лекарственная форма: раствор для наружного и местного применения [спиртовой]. Состав: сангвиритрина - 2 г, вспомогательных веществ: этанола 95% - 315 мл, воды очищенной - до получения 1000 мл препарата. Сангвиритрин относится к умеренно токсичным веществам, не обладает мутагенными, тератогенными, канцерогенными и кумулятивными эффектами.

Озон О3 - прекрасный стерилизатор, способный эффективно уничтожать все виды бактерий, вирусов, грибов и простейших. Преимущества стерилизации озоном - низкотемпературный режим, короткая экспозиция, глубокое проникновение в материал, возможность стерилизации термонеустойчивых изделий, создание больших объемов стерилизационной камеры, отсутствие токсичности, а также безопасность для окружающей среды. Согласно исследованиям озон обладает сильно выраженными фунгицидными, бактерицидными, вироцидными свойствами («Клинические аспекты озонотерапии» / Под ред. А.В. Змызговой и В.А. Максимова. М.: НПЦ Озонотерапии, 2003, 288 с.). Следует также отметить, что предложенный способ облегчает соблюдение техники безопасности, т.к. озон создают в непосредственной близости от обрабатываемого объекта, где он полностью разлагается на О* и O*2, имеющие продолжительность "жизни" десятые и сотые доли секунды, не попадает в атмосферу и не скапливается в нижних слоях в недопустимом количестве.

Гистологическое изучение полученных костных образцов заявляемым способом показало, что шероховатость обработанной поверхности не превышала параметры естественных концентраторов напряжений, а механическое воздействие режущего инструмента не приводило к образованию дополнительных дефектов. Отсутствие структурных изменений в поверхностном слое свидетельствует об оптимальности конструктивных решений в использованном режущем инструменте, технологических мероприятий, обеспечивающих надежное охлаждение в зоне резания и не оказывающих термического влияния на кость.

С целью изучения сохранности структуры, отсутствия изменений физико-механических показателей кости, авторами проведено изучение влияния воды, раствора Рингера, раствора Рингера с добавлением сангвиритрина, с использованием озоновоздушной смеси и без ее применения, некоторых температурных режимов обработки на физико-механические свойства компактной кости.

Авторами предложена установка (см. рис. 1), включающая корпус (1) с крышкой (2). Корпус в верхней и нижней части снабжен штуцерами (3). В основании корпуса установлена шаровая опора (4) для обеспечения параллельности оси фрезы и обрабатываемого костного фрагмента в случае конической формы диафиза кости (отклонения ее от цилиндрической), закрепленная с помощью шпильки (5), в верхней части которой посредством гайки (6) закреплена специальная пластина (7), используемая для крепления образца (8) и его разметки на переднюю, заднюю, латеральную и медиальную зоны. Обработка образца производится режущим инструментом (9), например полой фрезой. После закрепления образца в установке при герметично закрытой крышке (2) в корпус подается через верхний штуцер (3) озоновоздушная смесь. Обдув объекта производят непрерывно в течение (10÷15) минут. Затем в корпус заливают предварительно подвергнутый стерилизации рабочий раствор и при открытой крышке проводят механическую обработку образца. После окончания механической обработки костного образца раствор сливается через нижний штуцер (3), закрывается крышка, и в камеру снова подается озоновоздушная смесь для окончательной стерилизации образца.

На рис. 2 в качестве примера представлена схема изготовления цилиндрических образцов различной ориентации с учетом анизотропии кости: а - продольные, б - радиальные, в - тангенциальные.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, в которых в качестве модельных использовали образцы компактного вещества бедренных бычьих костей.

Пример 1. Механическая обработка без физиологического раствора

Для разделения костной ткани использовали полые цилиндрические и отрезные дисковые фрезы. В данной серии экспериментов установлено, что разделение костной ткани сопровождается значительным ее нагревом, изменением структуры поверхностного слоя и значительным (более чем на 20%) повышением его микротвердости (упруго-пластических свойств) по сравнению с аналогичным параметром исходного нативного материала 350-370 МПа. Такие образцы не отвечают и микробиологическим требованиям.

Пример 2, 3. Механическая обработка в присутствии раствора Рингера

В устройство, в котором выполняется механическая обработка, осуществляли подачу раствора Рингера с температурой, равной комнатной +(20±2)°С, и охлажденного до +(4÷6)°С. Охлажденные растворы не приводили к повышению температуры в зоне резания, не вызывали структурно-функциональных изменений поверхностного слоя. Однако оба исследованных раствора не обеспечивали получение стерильных образцов.

Пример 4. Механическая обработка при стерилизации озоном

Озоновоздушную смесь, создаваемую генератором, подают в камеру стерилизации (см. рис. 1), в которую помещен исходный образец, не прошедший механическую обработку. Оптимальный рабочий диапазон концентраций озона составляет (5÷10) мг/л. Обдув костного фрагмента проводят непрерывно в течение (10÷12) минут при температуре +(20±2)°С. Осуществляют механическую обработку, после окончания которой повторно аналогично образец обдувают озоновоздушной смесью. Контроль полноты стерилизации костного образца осуществляли микробиологически с учетом эмпирически установленных значений экспозиции. Кратковременное воздействие обеспечивает получение 100% стерильности образцов, при этом отсутствуют изменения структуры костной ткани, но микротвердость поверхностного слоя толщиной (7-10) микрон может увеличиваться на (10-12)%.

Пример 5. Механическая обработка в растворе Рингера, содержащем сангвиритрин, без стерилизации озоном

В устройство, в котором помещен исходный образец, не прошедший механическую обработку, осуществляют подачу рабочего раствора с температурой +(4÷6)°С. В качестве рабочего раствора используют раствор Рингера с содержанием сангвиритрина в растворе 0,01% в пересчете на активное вещество. Осуществляют механическую обработку. После ее окончания и слива рабочего раствора образец исследуется микробиологически, морфологически и биомеханически. Морфологическое изучение структуры образцов методом световой и сканирующей микроскопии, а также сравнительная оценка величин микротвердости на поверхности и в глубине образца не выявила достоверных различий по сравнению с исходным контролем - нативными образцами. Это служит подтверждением того, что предложенный метод механической обработки кости не вызывает изменений структуры и не приводит к поверхностному упрочнению образцов минерализованного матрикса кости. Однако изготовленные с использованием предложенной технологии образцы имели стерильность, не превышающую 68%. Это указывает на необходимость использования окончательной стерилизации для обеспечения 100% стерильности образцов независимо от целей их применения.

Пример 6. Механическая обработка в растворе Рингера, содержащем сангвиритрин, и при стерилизации озоном

В эксперименте использовали в качестве рабочей жидкости раствор Рингера с содержанием сангвиритрина в концентрации 0,01% в пересчете на активное вещество.

Стерилизацию озоном проводили аналогично примеру 4.

Механическую обработку выполняли в установке (см. рис. 1) при температурах раствора +(4÷6)°С и указанном содержании сангвиритрина в растворе. Изготовленные с использованием предложенной технологии образцы имели 100% стерильность, а их структурно-функциональные характеристики не отличались от контрольных - нативных образцов (табл. 2).

Пример 7. Хранение готовых образцов

При хранении в течение 1 месяца в герметичной упаковке изготовленных образцов по примеру 6 сохранялась их стерильность, не выявлено изменений структуры, композитности. При этом выявлены основные тенденции изменений механических свойств поверхностного слоя кости, представленные в таблице 2, а именно наблюдаются незначительные изменения в связи с частичной дегидратацией.

Все результаты опытов 1-7 сведены в таблицы 1 и 2.

Предложенные согласно заявленному изобретению усовершенствования способа изготовления костных образцов являются результатом обобщения экспериментальных исследований по созданию и практическому использованию трансплантатов (образцов), изготовленных с использованием современных требований, новых по отношению к способу-прототипу действий, условий и параметров режимов их выполнения. Полученные результаты лабораторных испытаний подтверждают возможность решения поставленной в заявленном изобретении задачи.

Предложенные согласно заявленному изобретению усовершенствования способа изготовления костных образцов являются результатом обобщения экспериментальных исследований по созданию и практическому использованию трансплантатов (образцов), изготовленных с использованием современных требований, новых по отношению к способу-прототипу действий, условий и параметров режимов их выполнения. Полученные результаты лабораторных испытаний подтверждают возможность решения поставленной в заявленном изобретении задачи.

Создание нового метода изготовления образцов с применением полых цилиндрических, а также дисковых фрез, позволяет модернизировать существующие процессы механической обработки костных образцов. Существенным отличием от ранее известных способов является технологичность, высокое качество обработанных поверхностей, что достигается использованием универсальных устройств, приспособлений и режущего инструмента, обеспечивающих техническое оснащение всех стадий технологического процесса. Высокая производительность метода (до 50 образцов в час), низкая трудоемкость в сочетании с возможностью обеспечения заданных размеров позволяют использовать его для целей биоматериаловедения, инженерной и медицинской биомеханики, биоимплантологии, судебной медицины.

Предлагаемый способ обеспечивает 100% стерилизацию костных имплантатов при сохранении их остеопластических свойств.

Испытания подтвердили состоятельность предложенного способа по практическому его использованию в медицине для изготовления и стерилизации костных имплантатов.

Способ механической обработки костного образца in vitro, включающий механическую обработку с использованием стерильной рабочей жидкости и последующую стерилизацию и консервацию полученных образцов, отличающийся тем, что сначала осуществляют стерилизацию костного образца озоновоздушной смесью с концентрацией озона 5÷10 мг/л в течение 10÷42 минут, затем механическую обработку проводят режущими инструментами в рабочей жидкости, в качестве которой используют стерильный, охлажденный до температуры +(4÷6)°C раствор Рингера с содержанием сангвиритрина в концентрации 0,01% в пересчете на активное вещество, после этого полученные образцы повторно стерилизуют озоновоздушной смесью аналогичным образом.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к буферным жидким композициям, предназначенным для хранения препаратов ДНК в жидком виде, а также для пропитки пористых носителей, используемых для сбора и хранения биологического материала.
Изобретение относится к биотехнологии и регенеративной медицине. Предложен способ обработки липоаспирата.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Добавка для стимулирования спермы содержит неорганический пирофосфат (PPi) в количестве примерно между 1 мкМ и примерно 200 мкМ.

Изобретение относится к консервации клеток биологических образцов при помощи криогенного охлаждения. Устройство сверхбыстрого охлаждения биологических образцов до криогенных температур с использованием линейного электропривода возвратно-поступательного движения включает расположенный в зоне с температурой окружающей среды линейный электропривод, содержащий коаксиально расположенные неподвижный индуктор и подвижный якорь, обеспечивающий при помощи направляющего штыря прерываемое паузами перемещение контейнера с биологическим образцом, выполненный из теплоизоляционного материала охлаждающий сосуд, на передней стенке которого выполнено проходное отверстие для контейнера, а внутри расположен патрубок с распылителем на конце, обеспечивающий направленный поток жидкого криогенного хладагента, струи которого воздействуют на контейнер с биологическим образцом, нагревательное устройство, смежно расположенное с охлаждающим сосудом, и герметизируемый сосуд с жидким криогенным хладагентом, в верхней части которого расположены вентиль, стравливающий избыточное давление, и соединенный с охлаждающим сосудом при помощи теплоизолированного патрубка.

Изобретение относится к медицине. Криоконсервирование ГСК крови проводят поэтапно.

Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и предназначено для заготовки тромбоцитов длительного хранения, пригодных к трансфузии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансфузиологии, и предназначено для заготовки замороженных тромбоцитов. Для замораживания тромбоцитов осуществляют отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК) с концентрацией тромбоцитов от 1×109/мл до 1,5×109/мл, содержащего функционально активные тромбоциты.

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансфузиологии, и предназначено для заготовки тромбоцитов длительного хранения. Осуществляют отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК) с концентрацией 1×109/мл-1,5×109/мл, содержащих 40-70% тромбоцитов с гранулами и тромбоциты с адгезивной активностью 40-70%.

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию раствора для консервирования клеточных взвесей. Раствор для консервирования клеточных взвесей содержит пектин каллуса раувольфии змеиной, глицерин, трилон Б и воду для инъекций.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Композиция гербицида содержит водный настой натуральной хны в концентрации от 14 до 18% мас.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу изготовления альгинатного гидрогеля с применением липазы, субстрата, гидролизуемого липазой, альгината и карбоната, высвобождающего двухвалентные катионы. Способ получения альгинатного гидрогеля включает смешивание раствора, содержащего липазу, с раствором, содержащим субстрат, гидролизуемый липазой, представляющий собой соединение формулы I: где R1, R2 и R3 независимо друг от друга являются одинаковыми или различными и представляют собой линейную или разветвленную С1-С12-алкил карбонильную цепь. Причем раствор, содержащий указанную липазу, или раствор, содержащий указанный субстрат, также содержит альгинат и карбонат, высвобождающий двухвалентные катионы. Полученный гидрогель пригоден для иммобилизации биологических материалов, предпочтительно сперматозоидов. Изобретения позволяют лучше контролировать скорость реакции гелеобразования, количество образованной кислоты и, соответственно, конечное значение pH в геле. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.
Наверх