Антипролиферативное средство
Владельцы патента RU 2629824:
ФАНО России Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина (ФГБНУ "ВНИИП им. К.И. Скрябина") (RU)
Изобретение относится к области фармакологии, а именно к средству, обладающему антипролиферативным действием. Средство, обладающее антипролиферативным действием, представляющее собой продукт жизнедеятельности гельминтов - жидкость пузырей Echinococcus multilocularis, отобранную от зараженных крыс. Средство, обладающее антипролиферативным действием, представляющее собой продукт жизнедеятельности гельминтов - низкомолекулярную фракцию жидкости Echinococcus multilocularis с молекулярной массой ниже 10 кДа, полученную методом ультрафильтрации и последующего центрифугирования из жидкости пузырей Е. multilocularis, отобранной от зараженных крыс. Вышеописанное средство менее токсично и оказывает выраженное антипролиферативное и цитостатическое действие на моделях опухолевых клеток человека in vitro. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 10 табл., 5 пр.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности к средству, оказывающему антипролиферативное действие.
Современная медицина располагает достаточно обширным арсеналом лекарственных препаратов для химиотерапии опухолей. В основном химиотерапевтические средства представлены группами алкилирующих антинеопластических препаратов, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, противоопухолевых гормональных препаратов, иммуномодуляторов некоторых других с иным механизмом действия. Большинство указанных противоопухолевых препаратов очень токсичны, и поэтому схемы и продолжительность химиотерапии выбирают с учетом проявления побочных эффектов, что отражается на эффективности лечения в целом.
Известны природные противоопухолевые препараты растительного происхождения (алкалоиды барвинка розового (винбластин, винкристин); алкалоиды тисового дерева (таксаны) (паклитаксел, доцетаксел); подофиллотоксины, выделяемые из подофилла щитовидного (этопозид, тенипозид) и алкалоиды безвременника великолепного (демекольцин (колхамин), колхицин)) и бактериального происхождения (рубромицин и др.), которые имеют ограниченное применение также из-за высокой токсичности и узкого терапевтического спектра действия (лечение некоторых разновидностей опухолей, преимущественно с экзофитным ростом).
Следовательно, существует необходимость в новых, высокоэффективных противоопухолевых препаратах природного происхождения, которые имели бы широкий спектр действия и были бы менее токсичными.
Гельминты - общее название паразитических червей, обитающих в организме человека, других животных и растений, вызывающих гельминтозы.
К гельминтам относят представителей ленточных червей, или цестод, сосальщиков, или трематод (обе эти группы относятся к плоским червям) и круглых червей, или нематод.
Возбудителем альвеолярного эхинококкоза является Echinococcus multilocularis. В половозрелой стадии паразитирует в тонкой кишке песца, лисицы, волка, собаки, кошки (окончательные хозяева), а на стадии личинки - у диких мышевидных грызунов (промежуточные хозяева). У человека паразитирует личиночная стадия возбудителя.
Форма, величина и строение ларвоцист альвеолярного эхинококка зависят от хозяина, но в общем ларвоцисты имеют вид гроздевидных конгломератов - пузырьков, в которых находится прозрачная жидкость (далее по тексту «жидкость пузырей Е. multilocularis»), содержащая продукты жизнедеятельности паразита.
Известно, что возбудители инвазий могут оказывать модулирующее влияние на течение многих заболеваний самой различной этиологии (например, Vasilev S. et al. (2015)).
Имеются сообщения о том, что заражение мышей Т. spiralis и введение им антигенов трихинелл приводит к подавлению роста злокачественных опухолей после прививки опухолевых клеток (Molinari J.A., Ebersole J.L. (1977); Pocock D., Meerovitch E. (1982); Kang Y.L. et al. (2013); Wang X.L. et al. (2009); Wang X.L. et al. (2013); Vasilev S. et al. (2015)).
По данным эпидемиологического исследования Н. , М. Tez, А.Е. 
(2003) только у 2 из 2086 пациентов имело место совместное наличие рака и эхинококкоза.
Berriel Е., Russo S., Moni L. et al. (2013) испытали жидкость E. granulosis (возбудитель гидатидозного эхинококкоза), полученную от трех прооперированных пациентов в госпитале Pasteur, Монтевидео, Уругвай, в условиях in vivo. Мышам BALB/c прививали клетки карциномы ободочной кишки (СТ26). Все контрольные мыши (без введения эхинококкозной жидкости) пали в течение 48 суток. В противоположность 40% мышей, которым вводили испытуемую жидкость, остались живыми к концу опыта.
Исследования по оценке противоопухолевой активности жидкости Е. multilocularis не проводились.
Целью изобретения является получение и обработка жидкости из пузырей Е. multilocularis (ее отдельной фракции), оценка ее антипролиферативного действия на моделях опухолевых клеток различных линий и обеспечение ее возможного применения в дальнейшем в качестве эффективного противоопухолевого средства.
Сущность изобретения заключается в том, что средство, обладающее антипролиферативной активностью, представляет жидкость пузырей E. multilocularis, или ее отдельную фракцию, оказывающие выраженное антипролиферативное и цитостатическое действие на моделях опухолевых клеток человека in vitro. Как уже указывалось выше, жидкость пузырей Е. multilocularis, а также ее отдельные фракции, ранее не испытывались на моделях опухолевых клеток человека in vitro.
За счет природного происхождения предлагаемое антипролиферативное средство может быть менее токсичным при наличии высокой противоопухолевой эффективности широкого спектра действия.
Примеры конкретного исполнения
Пример 1. Получение жидкости пузырей E. multilocularis
Жидкость пузырей Е. multilocularis была отобрана от экспериментально зараженных хлопковых крыс. Накопленный биоматериал подвергали центрифугированию при 15000 об/мин в течение 15 минут в центрифуге с охлаждением Optima TLX (настольная центрифуга, контролируемая микропроцессором Beckman Coulter Herneshnal S.A.).
После обработки материала определяли концентрацию белка на анализаторе МИКРОЛАБ 600 (Россия, а/о ЮНИМЕД) (метод с пирогаллоловым красным) при длине волны 600 нм. Определяемая концентрация белка в жидкости пузырей Е. multilocularis составила 0,01 мг/мл. До использования материал хранили при -70°C.
Пример 2. Оценка влияния жидкости пузырей E. multilocularis на культуру клеток лимфомы Беркитта
Целью настоящего опыта была оценка влияния цельной жидкости пузырей Е. multilocularis на пролиферацию клеток лимфомы Беркитта (Raji).
Материалы и методы
Клетки-мишени. Исследования проводили на перевиваемой клеточной линии Raji (перевиваемая линия B-клеточной лимфомы Беркитта). Перед проведением эксперимента суспензионную культуру клеток инкубировали по стандартной методике в культуральных флаконах (CORNING, Flask, 25 cm2, США) в ростовой среде RPMI 1640 (ПанЭко) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотика гентамицина в условиях повышенной влажности СО2-инкубатора (Binder, Germany), при Т=37°C в атмосфере 5% СО2.
Исследуемая жидкость. Цельная жидкость пузырей Е. multilocularis: жидкость не стерильная, концентрация по белку - 0,01 мг/мл. До проведения эксперимента исследуемый образец хранили при температуре -70°C.
Описание исследования
Перед экспериментом жидкость тщательно перемешали и стерилизовали фильтрацией через миллипоровый фильтр 0,45 микрон. Жидкость пузырей Е. multilocularis тестирована в концентрации 2 мкг/мл культуральной среды (разведение от исходного объема образца в 5 раз). Положительным контролем в данном опыте был выбран противоопухолевый лекарственный препарат Эндоксан, тестируемый в концентрации 2 мг/мл. Отрицательным контролем служил растворитель исследуемого вещества - стерильный физиологический раствор, добавляемый в соответствующих объемах в культуральную среду к суспензии клеток лимфомы Беркитта. Исследуемые клетки ресуспендировали в стерильных условиях ламинара и переносили в 12-луночный планшет (SARSTEDT, Германия) в среду культивации RPMI 1640 с 10% FBS в количестве 100000 клеток на лунку (исходный объем среды в 1 лунке 780 мкл, суспензия клеток добавлялась в объеме 420 мкл, достигая конечного объема в лунке 1,2 мл). Образец, размороженный при комнатной температуре, центрифугировали на холоду (Т=4°C) при 25000 об/мин, надосадок отбирали в стерильных условиях и добавляли в объеме 300 мкл к 900 мкл RPMI 1640. Во флакон препарата Эндоксан с концентрацией действующего вещества циклофосфана 200 мг добавляли 10 мл стерильного физиологического раствора, затем отбирали по 120 мкл препарата и вносили в культивационную среду без и с жидкостью пузырей Е. multilocularis. При этом концентрация Эндоксана в среде составляла 2 мг/мл, а концентрация жидкости пузырей Е. multilocularis составляла 2 мкг/мл. Конечный объем во всех лунках составлял 1,2 мл. Каждая группа состояла из 3-х независимых повторяемых лунок планшета с клетками лимфомы Беркитта и исследуемыми веществами. В контрольных лунках объем исследуемых веществ заменялся стерильным физиологическим раствором.
Затем проводили ежедневный подсчет общего количества клеток, отобранных из культуральной среды после ресуспендирования в стерильных условиях. Подсчет проводили в цитометрической камере с сеткой Горяева под микроскопом Leica DM 2000 (Leica, Germany) без предварительного разведения. Весь эксперимент продолжался в течение 96 часов с ежесуточным забором 50 мкл среды с суспензией клеток для подсчета (в течение всего этого времени культивационная среда сохранялась без введения в нее дополнительных веществ).
Результаты
Результаты определения количества клеток после добавления жидкости пузырей Е. multilocularis представлены в таблице 1 (см. в конце описания).
Через 24 часа инкубации (таблица 1) клеток лимфомы Беркитта с жидкостью пузырей Е. multilocularis имело место снижение количества лимфобластов по сравнению с контролем в 2,5 раза, а также снижение числа клеток по сравнению с исходным уровнем в 1,7 раз. Динамика пролиферации клеток в группе контроля представляла ежесуточное увеличение количества клеток в 3, 2,5 и 2 раза на 2-е, 3-и и 4-е сутки исследования соответственно, в то время как в группе с исследуемой жидкостью пузырей Е. multilocularis пролиферации клеток не наблюдалось. Следует отметить, что в этой группе, начиная со вторых суток исследования, наблюдались выраженные морфологические изменения клеток лимфомы Беркитта, характерные для некробиотических процессов: уменьшение размера клеток и сморщивание цитоплазмы, а в культивационной среде в лунках планшета клетки в этой группе не образовывали типичные для этой линии конгломераты, наблюдаемые в контрольной группе. Морфологические изменения клеток в группе с добавлением жидкости пузырей Е. multilocularis и клетки группы контроля на 4-е сутки исследования представлены на рис. 1-4.
При добавлении лекарственного препарата Эндоксан в культуру клеток в концентрации 2 мг/мл торможения пролиферации через 24 часа культивирования не наблюдали; количество клеток лимфомы Беркитта находилось на уровне контроля. Начиная со вторых суток исследования, число клеток в этой группе снижалось и оставалось сниженным до конца эксперимента относительно контроля, но пролиферация медленно продолжалась. Морфологических изменений клеток в этой группе не наблюдалось.
После совместного внесения в среду культивации клеток лимфомы Беркитта лекарственного препарата Эндоксан и жидкости пузырей Е. multilocularis в концентрациях 2 мг/мл и 2 мкг/мл соответственно наблюдали подавление размножения клеток, аналогичное процессу для группы только с жидкостью пузырей Е. multilocularis.
Выводы. Таким образом, цельная жидкость пузырей Е. multilocularis оказывает цитотоксическое действие на клетки лимфомы Беркитта in vitro и полностью сдерживает пролиферацию клеток до 4-х суток исследования.
Пример 3. Оценка влияния жидкости пузырей Е. multilocularis на культуру опухолевых клеток молочной железы человека (MCF-7)
Целью настоящего опыта была оценка влияния концентрированной жидкости пузырей Е. multilocularis на пролиферацию опухолевых клеток MCF-7.
Материалы и методы
Клетки-мишени. Монослойная культура MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека). Перед исследованием клетки инкубировали по стандартной методике в культуральных флаконах (CORNING, Flask, 25 cm2, США) в ростовой среде DMEM GlutaMAX (Gibco) с добавлением 10% FBS и антибиотика/антимикотика (Gibco, ×100) в условиях повышенной влажности СО2-инкубатора (New Brunswick, Galaxy 170R), при Т=37°C в атмосфере 5% СО2.
Исследуемая жидкость. Исследуемый образец представлял концентрированную жидкость пузырей Е. multilocularis. 20 мл цельной жидкости подвергали концентрированию центрифугированием при 5000 об/с в течение 15 минут в устройстве Амикон ультра 4 с выходом 1 мл концентрата с концентрацией белка 0,114 мг/мл. До проведения эксперимента исследуемый образец хранили при температуре -70°C.
Описание исследования
Перед исследованием стоковый раствор разводили полной ростовой средой до концентрации 10 мкг/мл, затем стерилизовали через фильтр-насадку на шприц (0,22 микрона). После этого готовили следующие концентрации исследуемого образца: 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 500 нг/мл, 250 нг/мл, 100 нг/мл и 50 нг/мл. Разведения готовили на ростовой среде DMEM GlutaMAX (DGIBCO) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
В стадии активного роста клетки MCF-7 снимали раствором трипсин/версена (Sigma, США) и высевали в 96-луночные планшеты (SARSTEDT, Германия) по 5×103 клеток на лунку в объеме 100 мкл. Планшеты инкубировали 18-20 часов. Затем удаляли детрит, а лунки с прикрепившимися клетками промывали стерильным раствором Хенкса (ПанЭко, Россия). После промывки в контрольные лунки вносили полную ростовую среду, а в экспериментальные - исследуемые образцы, приготовленные на ростовой среде с 10% FBS. Конечный объем среды в эксперименте и контроле составлял 200 мкл. Исследуемые концентрации вносили вертикальными рядами (в 6 повторностях) в следующей последовательности: 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл, 500 нг/мл, 1 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл.
Жизнеспособность клеток MCF-7 оценивали с помощью колориметрического метода (Mosmann, 1983), МТТ-тестом, через 72 часа после внесения исследуемого образца. МТТ-тест основан на способности живых клеток превращать растворимый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2)-2,5-тетразолия (МТТ, желтого цвета) в нерастворимые пурпурно-синие кристаллы МТТ-формазана (МТТ-Ф). Мертвые клетки такой способностью не обладают. Интенсивность превращения МТТ в МТТ-Ф отражает общий уровень дегидрогеназной активности в клетках.
Насыщенный раствор МТТ готовили в концентрации 5 мг/мл в изотоническом буферном растворе, не содержащем фенолового красного, а затем стерилизовали фильтрацией. Через 72 часа инкубации, для проведения МТТ-теста, в лунки со средой (200 мкл) вносили по 20 мкл насыщенного раствора МТТ (Sigma, США) и инкубировали 4 часа при 37°C. Затем осторожно удаляли супернатант, вносили в каждую лунку по 100 мкл DMSO (Sigma, США) и пипетировали до получения гомогенного окрашивания. Оптический сигнал измеряли на планшетном спектрофотометре (MULTISKAN ЕХ) в режиме ABS, используя фильтр 545 нм в качестве основного и 630 нм - в качестве корректирующего.
Уровень пролиферативной активности (жизнеспособность клеток) оценивали сравнением значений оптических плотностей в эксперименте и контроле. Для построения графика среднеарифметическое значение оптической плотности в контроле принимали за 100%, а жизнеспособность клеток в эксперименте рассчитывали из среднеарифметического значения оптических плотностей, выраженных в процентах относительно контроля.
Результаты
В ходе эксперимента проводили светооптическое наблюдение за характером роста культуры. Через 24 часа культивирования наблюдали выраженное цитотоксическое действие исследуемой жидкости в экспериментальных лунках с концентрацией 1 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл. В этих лунках отсутствовали распластанные клетки; все клетки имели округлую форму, в среде отмечен детрит (рис. 5). При этом в контрольных лунках отмечены активно пролиферирующие колонии, в которых наблюдали клетки в стадии митоза (рис. 6). Экспериментальные лунки, с концентрацией 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл и 500 нг/мл по размеру и количеству пролиферирующих колоний сопоставимы с контролем.
Через 48 часов в эксперименте с концентрацией 500 нг/мл отмечено снижение пролиферативной активности опухолевых клеток по отношению к контрольным лункам. При этом морфологических отличий между клетками данной экспериментальной группы и контролем не отмечено. Практически во всех лунках клетки имели одинаковую степень распластанности, детрита в среде нет. В эксперименте с концентрацией 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл клетки сопоставимы с контролем.
На 3 сутки наблюдали заметное снижение количества клеток в эксперименте при концентрации 500 нг/мл; количество колоний в поле зрения меньше, чем в контрольных лунках. При этом морфологически измененных клеток не обнаружено. В экспериментальных лунках с концентрацией 50 нг/мл, 100 нг/мл и 250 нг/мл плотность клеток сравнима с контролем.
На рис. 7 представлены результаты МТТ-теста через 72 часа культивирования. Из графика видно, что в эксперименте с концентрацией 500 нг/мл количество жизнеспособных клеток в среднем снизилось на 27%. Исходя из этого, можно сделать вывод, что данная концентрация оказывает ингибирующее действие на пролиферативную активность MCF-7 клеток.
Выводы. На основании полученных экспериментальных данных можно заключить, что исследуемая жидкость пузырей Е. multilocularis вызывает цитотоксическое действие на опухолевые клетки молочной железы человека через 24 часа культивирования в концентрациях 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл и 1 мкг/мл. Исследуемый образец, с концентрацией 500 нг/мл, оказывает антипролиферативное действие на клетки MCF-7 через 72 часа инкубации.
Пример 4. Оценка влияния низкомолекулярной фракции жидкости пузырей E. multilocularis на пролиферацию клеток лимфомы Беркитта in vitro
Целью настоящего опыта была оценка влияния низкомолекулярной фракции жидкости пузырей Е. multilocularis на пролиферацию клеток лимфомы Беркитта. То есть, в настоящем опыте была испытана не цельная жидкость Е. multilocularis, а ее отдельная фракция.
Материалы и методы
Клетки-мишени. Исследования проводили на перевиваемой клеточной линии Raji (перевиваемая линия В-клеточной лимфомы Беркитта). Перед проведением эксперимента суспензионную культуру клеток инкубировали по стандартной методике в культуральных флаконах (CORNING, Flask, 25 cm2, США) в ростовой среде RPMI 1640 (ПанЭко) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотика гентамицина в условиях повышенной влажности СО2-инкубатора (Binder, Germany), при Т=37°C в атмосфере 5% СО2.
Исследуемая жидкость. Исходным материалом была жидкость пузырей Е. multilocularis, отобранная от зараженных хлопковых крыс. До проведения эксперимента исследуемый образец хранили при температуре -70°C. Далее готовили низкомолекулярную фракцию, как подробно описано ниже.
Описание исследования
Метод ультрафильтрации в специальной пробирке Амикон ультра 4 (Millipore, Франция) на мембране из регенерированной целлюлозы позволяет отсечь все растворенные в образце вещества с молекулярной массой более 10 кДа. Фракция жидкости пузырей Е. multilocularis, прошедшая через мембранный фильтр Амикон ультра 4, была названа низкомолекулярной фракцией жидкости пузырей Е. multilocularis.
20 мл жидкости Е. multilocularis подверглось центрифугированию при 5000 об/с в течение 15 минут в устройстве Амикон ультра 4 с выходом 18,5 мл низкомолекулярной фракции. Низкомолекулярная фракция жидкости пузырей Е. multilocularis тестирована при разведении в 5 раз в культуральной среде. Положительным контролем в данном опыте был выбран противоопухолевый лекарственный препарат Эндоксан, тестируемый в концентрациях 2 мг/мл и 4 мг/мл. Отрицательным контролем служил растворитель исследуемых веществ - стерильный физиологический раствор, добавляемый в соответствующих объемах в культуральную среду к суспензии клеток лимфомы Беркитта. Исследуемые культивируемые клетки лимфомы Беркитта ресуспендировали в стерильных условиях ламинара и переносили в 12-луночный планшет (SARSTEDT, Германия) в среду культивации RPMI 1640 с 10% FBS в количестве 100000 клеток на лунку (исходный объем среды в 1 лунке 780 мкл, суспензия клеток добавлялась в объеме 420 мкл, достигая конечного объема в лунке 1,2 мл). Образец жидкости из пузырей Е. multilocularis отбирали в стерильных условиях и добавляли в объеме 300 мкл к 900 мкл RPMI 1640. Во флакон препарата Эндоксан с концентрацией действующего вещества циклофосфана 200 мг добавляли 10 мл стерильного физиологического раствора, затем отбирали по 240 мкл препарата и вносили в культивационную среду без и с низкомолекулярной фракцией жидкости пузырей Е. multilocularis. При этом концентрация Эндоксана в среде составляла 4 мг/мл. Конечный объем во всех лунках составлял 1,2 мл. Каждая группа состояла из 3-х независимых повторяемых лунок планшета с клетками лимфомы и исследуемыми препаратами. В контрольных лунках объем исследуемых веществ заменялся культивационной средой RPMI 1640.
Затем проводили ежедневный подсчет общего количества клеток, отобранных из культуральной среды после ресуспендирования в стерильных условиях. Подсчет проводили в цитометрической камере с сеткой Горяева под микроскопом Leica DM 2000 (Leica, Germany) без предварительного разведения. Весь эксперимент продолжался в течение 96 часов с ежесуточным забором 50 мкл среды с суспензией клеток для подсчета (в течение всего этого времени культивационная среда сохранялась без введения в нее дополнительных веществ).
Результаты
Результаты ежесуточного определения количества клеток после добавления низкомолекулярной фракции жидкости пузырей Е. multilocularis представлены в таблице 2 (см. в конце описания).
Через 24 часа исследования (таблица 2) во всех группах наблюдалось снижение количества клеток лимфомы с максимальным снижением в группах с добавлением жидкости пузырей Е. multilocularis в среднем в 4-5 раз относительно как контроля, так и исходного количества клеток. При этом пролиферация клеток во всех группах по сравнению с контролем не наблюдалась вплоть до 3-х суток, а на 4-е сутки увеличение числа клеток было незначительным. Морфологические изменения, представляющие некробиотические процессы в клетках, были выраженными во всех группах.
Выводы. Таким образом, низкомолекулярная фракция жидкости пузырей Е. multilocularis при разведении в 5 раз оказывает на клетки лимфомы Беркитта в модели in vitro цитотоксический эффект. Выраженность подобного эффекта была такой же, как и после внесения в культуральную среду лекарственного препарата Эндоксан в концентрации 4 мг/мл.
Пример 5. Оценка влияния низкомолекулярной фракции жидкости пузырей Е. multilocularis на культуру рака шейки матки человека (Hela) in vitro.
Целью настоящего опыта была оценка влияния низкомолекулярной фракции жидкости пузырей Е. multilocularis на пролиферацию клеток рака шейки матки человека (Hela). То есть, в настоящем опыте была испытана не цельная жидкость Е. multilocularis, а ее отдельная фракция.
Материалы и методы
Клетки-мишени. Клетки рака шейки матки человека линии Hela. Перед проведением эксперимента клетки инкубировали по стандартной методике в культуральных флаконах (CORNING, Flask, 25 cm2, США) в ростовой среде DMEM GlutaMAX (Gibco) с добавлением 10% FBS и антибиотика/антимикотика (Gibco, ×100) в условиях повышенной влажности CO2-инкубатора (New Brunswick, Galaxy 170R), при Т=37°C в атмосфере 5% CO2.
Исследуемая жидкость. Исходным материалом была жидкость пузырей Е. multilocularis, отобранная от зараженных хлопковых крыс. До проведения эксперимента исследуемый образец хранили при температуре -70°C. Далее готовили низкомолекулярную фракцию, как подробно описано ниже.
Описание исследования
Низкомолекулярную фракцию жидкости пузырей Е. multilocularis получали на миллипоровом фильтре с отсекающим диапазоном 10 кДа центрифугированием нативного образца жидкости пузырей Е. multilocularis при 5000 об/с в течение 15 мин, как подробно описано в примере 4.
Отфильтрованная жидкость пузырей Е. multilocularis была тестирована в следующих разведениях 1:4; 1:8; 1:16; 1:20; 1:50; 1:100, 1:200 и 1:400 в культуральной среде. Образцы жидкости подвергались оттаиванию при комнатной температуре в течение часа, затем аккуратно стерильно перемешивались, жидкость пропускалась через миллипоровый фильтр 0,44 микрона. Клетки Hela культивировали в СО2-инкубаторе (New Brunswick, Galaxy 170R) в условиях повышенной влажности при Т=37°C и 5% СО2, в культуральных флаконах (CORNING, Flask, 25 cm2, США) в ростовой среде DMEM (Gibco, Англия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Gibco) и антибиотика/антимикотика (Gibco, ×100) стандартной концентрации. На стадии активного роста клетки снимали раствором трипсин/версена (Sigma, США) и высевали в 96-луночные планшеты (SARSTEDT, Германия) по 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл. Планшеты инкубировали 16-18 часов. Затем из лунок удаляли детрит и дважды промывали раствором Хенкса (ПанЭко, Россия). После промывки в контрольные лунки вносили физиологический раствор в объеме, соответствующем объему внесения исследуемого препарата, а в опытные - исследуемую низкомолекулярную фракцию жидкости пузырей Е. multilocularis в указанных разведениях, приготовленных на стерильном физиологическом растворе. Конечный объем среды в опытных и контрольных лунках составлял 200 мкл. Исследуемую низкомолекулярную фракцию жидкости пузырей Е. multilocularis и контрольное вещество - стерильный физиологический раствор вносили в 4 повторностях вертикальными рядами (для статистического подсчета) и горизонтальными рядами (для посуточной динамики). Исследование было проведено в нескольких последовательных сериях с постановкой разведений контроля в каждой отдельной серии к каждому разведению исследуемой низкомолекулярной фракции жидкости пузырей Е. multilocularis.
Жизнеспособность клеток Hela оценивали с помощью колориметрического метода (Mosmann, 1983), МТТ-тестом, через 2, 24, 48 и 72 часов после инициации эксперимента - внесения исследуемой жидкости пузырей Е. multilocularis и контрольного вещества. Подробное описание МТТ-теста и расчет уровня пролиферативной активности (жизнеспособности клеток) смотри в примере 3.
Результаты
В таблице 3 представлены результаты МТТ-теста для разведения исследуемого препарата 1:4 в посуточной динамике до 72 часов культивирования.
* - достоверно отличается от контроля, (Р≤0,05)
В таблице 4 представлены результаты МТТ-теста для разведения исследуемого препарата 1:8 в посуточной динамике до 72 часов культивирования.
* - достоверно отличается от контроля, (Р≤0,05)
В таблице 5 представлены результаты МТТ-теста для разведения исследуемого препарата 1:16 в посуточной динамике до 72 часов культивирования.
* - достоверно отличается от контроля, (Р≤0,05)
В таблице 6 представлены результаты МТТ-теста для разведения исследуемого препарата 1:20 в посуточной динамике до 72 часов культивирования.
* - достоверно отличается от контроля, (Р≤0,05)
В таблице 7 представлены результаты МТТ-теста для разведения исследуемого препарата 1:50 в посуточной динамике до 72 часов культивирования.
* - достоверно отличается от контроля, (Р≤0,05)
В таблице 8 представлены результаты МТТ-теста для разведения исследуемого препарата 1:100 в посуточной динамике до 72 часов культивирования.
* - достоверно отличается от контроля, (Р≤0,05)
В таблице 9 представлены результаты МТТ-теста для разведения исследуемого препарата 1:200 в посуточной динамике до 72 часов культивирования.
* - достоверно отличается от контроля, (Р≤0,05)
В таблице 10 представлены результаты МТТ-теста для разведения исследуемого препарата 1:400 в посуточной динамике до 72 часов культивирования.
Как следует из данных, представленных в таблицах 3-7, низкомолекулярная фракция жидкости пузырей Е. multilocularis при разведении 1:4; 1:8; 1:16; 1:20 и 1:50 вызывала практически полную гибель клеток линии Hela без восстановления к 72 часам исследования, т.е. оказывала выраженное цитотоксическое действие.
В таблицах 8-9 показаны результаты оценки жизнеспособности клеток Hela после внесения в среду культивации низкомолекулярной фракции жидкости пузырей Е. multilocularis при разведении 1:100 и 1:200. Через 48 и 72 часа исследуемая жидкость сдерживала рост клеток в культуре, т.е. вызывала цитостатический (антипролиферативный) эффект.
В таблице 10 представлены данные после внесения в среду культивации низкомолекулярной фракции жидкости пузырей Е. multilocularis при разведении 1:400; как следует, значимого эффекта на жизнеспособность клеток Hela данная концентрация исследуемой жидкости не оказала.
Выводы. Низкомолекулярная фракция жидкости пузырей Е. multilocularis при разведении 1:4; 1:8; 1:16; 1:20 и 1:50 оказывает выраженное цитотоксическое действие в условиях in vitro на клетки линии Hela; в то время как при разведении 1:100 и 1:200 - цитостатический (антипролиферативный) эффект.
Низкомолекулярная фракция жидкости пузырей Е. multilocularis при разведении 1:400 значимого эффекта на жизнеспособность клеток Hela не оказала.
Литература
1. Berriel Е., Russo S., Moni L. et al. Antitumor activity of human hydatid fluid in a murine model of colon cancer // Hindawi Publishing Corporation The Scientific Word Journal. - V. 2013. - Frticle ID 230176.
2. Akgül H., Tez M., Ünal A.E. Echinococcus against cancer: why not? // Cancer. - 2003. - V. 98 (Issue 9). - P. 1999-2000.
3. Kang Y.J., Jo Jo, Cho M.K. et al. Thrichinella spiralis infection reduces tumor growth and metastasis of B16-F10 melanoma cells // Vet. Parasitol. - 2013. - V. 196(1-2). - P. 106-113.
4. Molinari J.A., Ebersole J.L. Antineoplastic effects of long-term Trichinella spiralis infection on B-16 melanoma // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. - 1977. - V. 55(1-4). - P. 444-448.
5. Pocock D., Meerovitch E. The anti-neoplastic effect of trichinelosis in syngeneic murine model // Parasitology. - 1982. - V. 84 (Pt.3). - P. 463-473.
6. Vasilev S., Ilic N., Gruden-Movsesijan A. et al. Necrosis and apoptosis in Trichinella spiralis-mediated tumour reduction // Cent. Eur. J. Immunology. - 2015. - V. 40(1). - P. 42-53.
7. Wang X.L., Fu B.Q., Yang S.J. et al. Trichinella spiralis - a potential antitumor agent // Vet. Parasitol. - 2009. - V. 159 (3-4). - P. 249-252.
8. Wang X.L., Liu M.Y., Sun S.M. et al. An anti-tumor protein produced by Trichinella spiralis induces apoptosis in human hepatoma H7402 cells // Vet. Parasitol. - 2013. - V. 194 (2-4). - P. 186-188.
1. Средство, обладающее антипролиферативным действием, представляющее собой продукт жизнедеятельности гельминтов - жидкость пузырей Echinococcus multilocularis, отобранную от зараженных крыс.
2. Средство по п. 1, обладает антипролиферативным и дополнительным цитотоксическим действием на моделях опухолевых клеток человека in vitro.
3. Средство, обладающее антипролиферативным действием, представляющее собой продукт жизнедеятельности гельминтов - низкомолекулярную фракцию жидкости Echinococcus multilocularis с молекулярной массой ниже 10 кДа, полученную методом ультрафильтрации и последующего центрифугирования из жидкости пузырей Е. multilocularis, отобранной от зараженных крыс.
4. Средство по п. 3, обладает антипролиферативным и дополнительным цитотоксическим действием на моделях опухолевых клеток человека in vitro.
