Способ прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии



Способ прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии
Способ прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии

 


Владельцы патента RU 2629837:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" (ФИЦ КНЦ СО РАН) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для раннего индивидуального прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии. Способ прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии заключается в том, что у больных внебольничной пневмонией до начала терапии в первые сутки после постановки диагноза с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), рассчитывают коэффициент пластического и энергетического обмена (КПЭО), представляющий собой отношение активности Г6ФДГ к активности ЛДГ, и при значении КПЭО ниже 0,34 прогнозируют развитие осложнений в течение двух недель антибиотикотерапии. Способ позволяет в ранний период заболевания определить риск развития осложнений и может быть рекомендован для применения в клинической практике. 2 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогноза развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии.

Внебольничная пневмония (ВП) - это заболевание, которое характеризуется высокой распространенностью, большой летальностью и серьезными затратами на медицинскую помощь. Согласно данным официальной статистики РФ в 2012 году в России было зарегистрировано 657643 случая внебольничной пневмонии, что составило 4,59%; у лиц в возрасте 18 лет и старше заболеваемость составила 3,84%. Летальность среди больных с тяжелой пневмонией составляет от 21 до 58% [8]. Поэтому представляется весьма актуальной и своевременной разработка методов прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии, что позволило бы оптимизировать лекарственную терапию и улучшить исходы при данной патологии.

Известны способы прогноза развития таких осложнений пневмонии у военнослужащих, как инфекционно-токсический шок (ИТШ), острая дыхательная недостаточность (ОДН) и острая почечная недостаточность (ОПН) [2]. Прогноз ИТШ включает оценку клинической картины заболевания при поступлении больного, включая выявление маркеров ИТШ, и последующий анализ признаков, косвенно свидетельствующие о вероятности развития данного осложнения: характер дебюта ВП, нарушения сознания, наличие одышки, цвет кожных покровов, артериальное давление. Прогноз ОДН осуществляется путем оценки комплекса признаков: выраженность лихорадки, физикальная картина над пораженными сегментами легкого, гемодинамические показатели, данные рентгенологического исследования органов грудной клетки. Прогноз ОПН выполняется с учетом следующих признаков: нарушение сознания, выраженность лихорадки и гемодинамические показатели. Недостатками известных способов являются раздельные для каждого осложнения алгоритмы, разработанные только для мужчин, проходящих военную службу по призыву в возрасте от 18 до 22 лет, а также отсутствие возможности прогноза других осложнений внебольничной пневмонии (абсцесс, сепсис и др.).

Известен способ прогноза развития осложнений пневмонии, включающий оценку пяти параметров анамнеза (время от манифестации заболевания до обращения за медицинской помощью; стаж курения; частота госпитализаций и острых респираторных вирусных инфекций; наличие хронических очагов инфекции верхних дыхательных путей, ротовой полости, герпетическая инфекция; наличие сопутствующих заболеваний) по пятибалльной шкале с последующим расчетом прогностической вероятности развития осложнений пневмонии по математическому уравнению [3]. Недостатком известного способа является отсутствие учета активности воспалительной реакции и реактивности иммунной системы у больных пневмонией.

Наиболее близким аналогом является способ прогнозирования развития осложнений у больных внебольничной пневмонией, включающий измерение уровней прокальцитонина (ПКТ, пг/мл), фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-α, пг/мл), С-реактивного белка (СРБ, мг/л) в сыворотке крови и интегральную оценку показателей путем решения дискриминантного уравнения [4]. Недостатком способа является невысокий уровень совпадения (87,1%). Кроме того, все исследуемые параметры являются показателями воспалительного процесса с бактериальной этиологией и напрямую не характеризуют реактивность клеток иммунной системы - непосредственных участников воспаления.

Задачей изобретения является создание информативного способа раннего прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что до начала терапии, в течение первых суток после постановки диагноза, с помощью биолюминесцентного метода в нейтрофилах крови больных определяют активности ферментов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Затем рассчитывают коэффициент пластического и энергетического обмена (КПЭО), представляющий собой отношение активности Г6ФДГ к активности ЛДГ. При значении КПЭО ниже 0,34 прогнозируют развитие осложнений в течение двух недель антибиотикотерапии.

Значение 0,34 получено опытным путем, на основании сопоставления рассчитываемого КПЭО и данных последующего наблюдения за клиническим состоянием больных внебольничной пневмонией в течение 2-х недель стандартного лечения. Значение КПЭО ниже 0,34 свидетельствует о снижении уровня оттока субстратов на пластические процессы внутриклеточного метаболизма нейтрофилов и превалировании энергетических реакций, следствием чего может явиться недостаточность реакций макромолекулярного синтеза (гликопротеидов, полинуклеотидов и т.д.) и синтеза супероксид-радикала, активация перекисных процессов и, соответственно, понижение функциональной активности нейтрофилов.

Нейтрофильные гранулоциты представляют собой высокореактивное звено в иммунной системе. Они первыми мобилизуются в очаг воспаления, от их фагоцитарной активности во многом зависит эффективность противомикробной защиты организма [5, 9]. Воспринимая многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды, нейтрофилы модулируют свои функции, нацеленные на ее восстановление. Активированные нейтрофилы сами становятся мощными эффекторами пусковых и регуляторных механизмов каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления. Это связано с тем, что нейтрофильные гранулоциты способны не только в качестве эффекторов продуцировать цитотоксические молекулы, но и, как регуляторные клетки, синтезировать широкий спектр различных цитокинов [6]. Функциональная активность нейтрофилов во многом определяется состоянием их внутриклеточной метаболической системы. Именно через метаболическую систему реализуется регуляторное действие ряда различных веществ, в том числе и антигенов. К числу параметров, наиболее объективно отражающих основные параметры внутриклеточного метаболизма, можно отнести несколько дегидрогеназ.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата и кофермента НАДФ. Образовавшийся в ходе данной реакции 6-фосфоглюконо-5-лактон является нестабильным и гидролизуется либо спонтанно, либо с помощью фермента 6-фосфоглюконолактоназы с образованием 6-фосфоглюконата [1]. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла, который является конкурентом гликолиза за субстрат (глюкоза-6-фосфат). В норме доля пентозофосфатного цикла в количественном превращении глюкозы обычно невелика и варьирует в зависимости от функционального состояния клеток.

Лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) - фермент гликолиза, обратимо катализирующий окисление лактата в пировиноградную кислоту с участием в качестве кофермента НАД. ЛДГ занимает ключевое положение в регуляции цитоплазматического уровня НАДН/НАД. В случае избытка НАДН в цитоплазме ЛДГ восстанавливает пируват до лактата, который затем удаляется из клетки (анаэробная реакция ЛДГ). В то же время при активации аэробных процессов ЛДГ может окислять лактат до пирувата с образованием НАДН (аэробная реакция ЛДГ) [1].

Способ осуществляют следующим образом.

У больных до начала терапии в первые сутки после постановки диагноза внебольничной пневмонии забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином в количестве 2 мл. Выделяют нейтрофилы. Центрифугируют в двойном градиенте плотности фиколл-верографина: ρ=1,077 г/см3 - для отделения лимфоцитов; ρ=1,119 г/см3 - для выделения нейтрофилов. Подсчитывают количество нейтрофилов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода нейтрофилов, которая составляет не менее 97%. 1 млн выделенных клеток используют для определения активности Г6ФДГ и ЛДГ нейтрофилов одним из известных способов, например биолюминесцентным [7]. Для этого суспензию выделенных нейтрофилов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем непосредственно определяют активности ферментов Г6ФДГ и ЛДГ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных нейтрофилов. Конкретные значения концентраций субстратов и коферментов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.

После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10-5М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН : ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1М К+, Na+-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра, например, марки "БЛМ-8803" измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные субстратный фон ферментов. Определяют в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активностей исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДН и НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДН или НАДФН в диапазоне 10-9-10-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАД(Ф)Н : ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят для каждого рН буфера. Активность ферментов рассчитывают по формуле:

А=Δ[С]×V/Т,

где А - активность фермента, Е на 1×104 нейтрофилов (1E=1 мкмоль/мин [1]);

Δ[С] - разница концентраций НАДН или НАДФН в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

Т - время инкубации, мин.

Затем по активности дегидрогеназ рассчитывают величину КПЭО как соотношение активностей ферментов Г6ФДГ и ЛДГ, то есть КПЭО=АГ6ФДГЛДГ. При КПЭО ниже 0,34 прогнозируют развитие осложнений у больных внебольничной пневмонией в течение 2-х недель антибиотикотерапии.

Данный способ апробирован на 72 больных внебольничной пневмонией, поступивших на лечение в пульмонологическое отделение МБУЗ «Городская клиническая больница №20» г. Красноярска. Диагноз устанавливался согласно Российским национальным рекомендациям по внебольничной пневмонии (2010), ATS/IDSA (2005, 2007 гг.) [8]. По результатам обследования предлагаемым способом у 46 больных прогнозировалось отсутствие осложнений в течение 2-х недель антибиотикотерапии. Величина КПЭО у них составляла 0,34-454,32 (0,34 и выше). У 26 больных прогнозировалось развитие осложнений в течение 2-х недель антибиотикотерапии. Величина КПЭО у них составляла 0,01-0,33 (ниже 0,34). Результаты обследования представлены в табл. 2.

Все больные в течение двух недель получали парентеральные формы защищенных аминопенициллинов в сочетании с макролидными антибиотиками внутрь или парентерально. У 46 больных течение пневмонии протекало без осложнений с последующим выздоровлением, у 26 больных пневмония осложнилась, а именно острой дыхательной недостаточностью (n=9), абсцессом легкого (n=8), сепсисом (n=1), легочным кровотечением (n=4), плевритом (n=4). Таким образом, отмечено совпадение прогноза у 100% наблюдаемых больных.

Клинический пример 1. Больной К., 42 лет, поступил в стационар с диагнозом: внебольничная пневмония средней степени тяжести.

Проведено исследование заявленным способом. С помощью биолюминесцентного метода, проведенного в первые сутки после постановки диагноза, определены: активность Г6ФДГ в нейтрофилах крови - 0,46 мкЕ; активность ЛДГ - 2,18 мкЕ. Величина КПЭО у больного составила 0,21 (ниже 0,34), что дало основание прогнозировать развитие осложнений внебольничной пневмонии в течение 2-недельного периода антибиотикотерапии. На 2-й неделе лечения у больного развился абсцесс в нижней доле левого легкого.

Клинический пример 2. Больная М., 35 лет, диагноз при поступлении: внебольничная нижнедолевая полисегментарная пневмония левого легкого, тяжелое течение.

Проведено исследование заявленным способом. С помощью биолюминесцентного метода, проведенного в 1-е сутки после постановки диагноза, определены: активность Г6ФДГ в нейтрофилах крови - 18,46 мкЕ, активность ЛДГ - 4,27 мкЕ. Значение КПЭО у больной составило 4,32 (выше 0,34), что дало основание прогнозировать отсутствие осложнений внебольничной пневмонии в течение периода лечения. Прогноз совпал. Пневмония протекала без осложнений.

Клинический пример 3. Больной Н., 31 год, госпитализирован с тяжелой внебольничной пневмонией нижней доли левого легкого. С помощью биолюминесцентного метода, проведенного в 1-е сутки после постановки диагноза, определены: активность Г6ФДГ в нейтрофилах крови - 1,01 мкЕ, активность ЛДГ - 19,85 мкЕ. Значение КПЭО у больного составило 0,05 (ниже 0,34), что дало основание прогнозировать развитие осложнений внебольничной пневмонии в течение 2-недельного периода антибиотикотерапии. В течение первой недели, несмотря на активную антибактериальную терапию, у больного прогрессировал процесс в правом легком полисегментарного характера с развитием клиники сепсиса.

Технический результат предлагаемого способа:

- возможность раннего прогнозирования (в течение первых суток после постановки диагноза) исхода лечения больных внебольничной пневмонией;

- высокий уровень достоверности прогноза - 100%;

- инвазивное вмешательство ограничено однократным забором из вены малого объема крови (2 мл);

- возможность своевременной профилактики развития осложнений на фоне антибиотикотерапии внебольничной пневмонии.

Таким образом, способ информативен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет в ранний период заболевания определить риск развития осложнений и может быть рекомендован для применения в клинической практике.

Источники информации

1. Биохимия. Под ред. Е.С. Северина. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2004. - 784 с.

2. Борисов И.М., Шаповалова Т.Г. Прогнозирование развития осложнений внебольничной пневмонии у военнослужащих // Казанский медицинский журнал. - 2012. - Т. 93, №6. - С. 864-870.

3. Патент РФ №2290075. Способ прогноза развития осложнений пневмонии / Калинина Е.П., Романченко Е.А., Журавская Н.С., Кузьмин А.П. // Опубл. 27.12.2008.

4. Патент РФ №2444017. Способ прогнозирования развития осложнений у больных внебольничной пневмонией / Кочегарова Е.Ю., Колосов В.П., Нарышкина С.В. // Опубл. 27.02.2012.

5. Савченко А.А., Борисов А.Г. Основы клинической иммунометаболомики. Новосибирск: Наука, 2012. 263 с.

6. Савченко А.А., Здзитовецкий Д.Э., Борисов А.Г. Иммунометаболические нарушения при распространенном гнойном перитоните. - Новосибирск: Наука, 2013. - 142 с.

7. Савченко А.А. Определение активности NAD(P)-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах биолюминесцентным методом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159, №5. - С. 656-660.

8. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С, Авдеев С.Н., Тюрин И.Е., Руднов В.А., Рачина С.А., Фесенко О.В. Клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике тяжелой внебольничной пневмонии у взрослых. - Москва, 2014. - 92 с.

9. Wright H.L., Moots R.J., Bucknall R.C., Edwards S.W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases // Rheumatology (Oxford). 2010. V. 49. №9. P. 1618-1631.

Способ прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии, включающий исследование крови, отличающийся тем, что до начала терапии в течение первых суток после постановки диагноза с помощью биолюминесцентного метода в нейтрофилах крови больных определяют активности ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), после чего рассчитывают коэффициент пластического и энергетического обмена (КПЭО), представляющий собой отношение активности Г6ФДТ к активности ЛДГ, и при значении КПЭО ниже 0,34 прогнозируют развитие осложнений в течение двух недель антибиотикотерапии.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и касается способа быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной БЦЖ-вакцины, включающего реконструкцию лиофилизированной вакцины, удаление внеклеточного АТФ с использованием апиразы, экстракцию внутриклеточного АТФ, определение содержания внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом и расчет специфической активности.

Изобретение относится к области нанотехнологий, а также может быть использовано в биологии, медицине, гетерогенном катализе. Способ определения концентрации адсорбатов наночастиц (НЧ) серебра на поверхности нанопористого кремнезема включает приготовление раствора исследуемого вещества, извлечение исследуемого вещества из раствора сорбентом, измерение интенсивности флуоресценции органолюминофора в присутствии исследуемого вещества, определение неизвестной поверхностной концентрации исследуемого вещества по градуировочному графику, где в качестве сорбента используют немодифицированный кремнезем, в качестве адсорбата - монодисперсные наночастицы серебра и молекулы органолюминофора - Родамина 6Ж, интенсивность флуоресценции измеряют при возбуждении на плазмонной длине волны 420 нм, измерение проводят при комнатной температуре.

Изобретение относится к новым производным ряда 2,4,5-тризамещенных тиазолов, а именно к 3-[2-[N′-(2-гидрокси-5-хлорбензилиден)гидразино]-4-(2,5-диметилтиофен-3-ил)тиазол-5-ил]хромен-2-ону формулы I.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и касается способа биохемилюминесцентной оценки токсичности рубцовой жидкости in vitro. Представленный способ включает измерение интенсивности свечения бактерий штамма E.

Предложен способ определения антиоксидантной активности вещества, предусматривающий приготовление контрольных проб, содержащих буферный раствор и биолюминесцентный сенсор, определения исходной интенсивности биолюминесценции.

Изобретение относится к способам анализа и устройствам, пригодным для детектирования электрохемилюминесценции. Изобретение применимо, в особенности, для быстрой количественной диагностики при децентрализованном анализе, когда требуются особенно дешевые материалы для электродов, ячейки, одноразовые диагностические чипы и кассеты.

Изобретение относится к экологии, в частности к экспресс-определению фальсификации бутилированных питьевых вод из подземных источников (скважин) и загрязнения питьевой, бутилированной и природной воды.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к иммунологической диагностике заболеваний крупного рогатого скота (КРС) в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике в стоматологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики процессов повышенного ороговения эпителия у лиц в возрасте от 15 до 45 лет, проживающих в регионе с неблагоприятными факторами окружающей среды.

Изобретение относится к новому полимерному композитному материалу на основе поливинилхлорида, обладающему оптическими хемосенсорными свойствами для определения катионов меди (II), и может быть использовано для создания оптических датчиков, позволяющих количественно определять содержание катионов Cu(II) на уровне их ПДК в водных средах: в биологических жидкостях, питьевой воде, в промышленных водах и стоках, в частности, для контроля за состоянием окружающей среды.
Наверх