Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии нер 2



Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии нер 2
Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии нер 2

 

G01N1/30 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2630060:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Тверской ГМУ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к микробиологии. Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 заключается в том, что осуществляют забор материала, получают из указанного материала суспензию клеток с концентрацией 2×106 кл/мл, определенной на денситометре, смешивают 0,1 мл полученной суспензии клеток с 0,1 мл суспензии бактерий с концентрацией 2×109 кл/мл, инкубируют 30 мин при 37°С, после инкубирования смесь трехкратно отмывают забуференным физраствором при 600 об/мин по 10 мин, далее удаляют супернатант из осадка и делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму, под микроскопом подсчитывают в 10 полях зрения среднее количество адсорбированных микроорганизмов - средний показатель адгезии, проведя не менее трех опытов, и считают степень адгезии от 0 до 1,9 - низкоадгезивной, от 2 до 4,9 - среднеадгезивной, свыше 5 - высокоадгезивной, при условии, что в случае забора эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта его осуществляют медицинским ершиком после предварительного полоскания раствором антисептика хитозана на Абисибе. 2 пр., 2 табл.

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии бактерий на модели эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта и клеточной линии HEp 2.

Известны способы определения среднего показателя адгезии по методу Брилис В.И. (1986) на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+ [1]. При постановке опыта на предметное стекло наносили одну каплю буферного раствора (0,1 М раствор фосфата натрия на изотоническом растворе хлорида натрия, pH 7,2-7,3), в котором суспендировали по одной петле взвесь эритроцитов, предварительно дважды отмытых буферным раствором путем центрифугирования (300-1000 об/мин), концентрацией 100 млн/мл и одну петлю густой суточной суспензии культуры микроорганизмов (№6 по Mc Earland), выращенных в оптимальной жидкой питательной среде. На одно стекло наносили 3 капли суспензии разных микроорганизмов. Предметное стекло с эритроцитами и микробами помещали во влажную камеру на 30 минут при температуре 37°C. Затем препарат высушивали при той же температуре, фиксировали в пламени спиртовки и окрашивали по методу Грама. При микроскопии подсчитывали среднее количество микроорганизмов, прикрепившихся к одному эритроциту. Подсчитывали не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения, это средний показатель адгезии (СПА).

Адгезивность считалась нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой при СПА от 1,01 до 2,0; средней при СПА от 2,01 до 4,0; высокой при СПА свыше 4,0. Вариации результатов при данном методе ±15%.

Недостатком способа является то, что он определяет степень адгезии только к эритроцитам, которые несут определенные адгезины, которые отсутствуют на поверхности других клеток человека и не могут быть показателем адгезии па эпителиальных клетках.

Известен способ определения уровня адгезивной активности штаммов пробиотиков на модели эпителиальных клеток [2]. Забор эпителиальных клеток производят при проведении диагностической гистероскопии и раздельном диагностическом выскабливании стенок шейки матки и цервикального канала при различных неинфекционных заболеваниях тела матки.

В асептических условиях под внутривенной анестезией шейка матки обнажается куско- или ложкообразными зеркалами. После этого производят соскоб эпителия слизистой оболочки боковых стенок влагалища.

После забора материал помещают в транспортный контейнер с жидкой питательной средой 199. Контейнер обкладывают льдом.

Клетки дважды отмывают охлажденным ЗФР (pH 7,2) центрифугированием при 800 об/мин по 10 мин. После определения концентрации клеток с помощью камеры Горяева под световым микроскопом ее разводят до 1,5-2 × 106 кл/мл.

Далее готовят суспензию штамма с концентрацией 2×109 микробных кл/мл, 0,5 мл взвеси эпителиальных клеток смешивают с 0,5 мл взвеси бактериальной культуры.

Клеточно-бактериальную смесь инкубируют в термостате при 37°C в течение 30 мин, периодически встряхивая. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР от не прилипших микробов при 600 об/мин по 10 мин.

Все манипуляции осуществляют на холоде. К осадку добавляют 1-2 капли ЗФР и готовят мазки на стекле. Препараты фиксируют смесью равных частей медицинского эфира и 96° спирта и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Под световым микроскопом подсчитывают среднее количество бактерий, прилипших к 25 эпителиоцитам.

При оценке адгезии каждого штамма опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СПА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.

Степень адгезии считают:

- неадгезивную (СПА = 0);

- слабоадгезивную (СПА = 1-5);

- среднеадгезивную (СПА = 5-10);

- высокоадгезивную (СПА = выше 10).

Недостатками способа являются специфика рецепторов клеток слизистой оболочки влагалища, особенности забора эпителиальных клеток под внутривенной анестезией, использование холода.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии HEp 2 (клетки рака гортани).

Авторы предлагают способ, характеризующийся простотой, удобством, малыми временными затратами и высокой результативностью.

Способ позволяет изучить адгезивные свойства микроорганизмов непосредственно на эпителиальных клетках, при этом клетки располагаются в виде монослоя, что позволяет определить количество адгезивных бактерий с большой точностью.

Техническим результатом заявленного изобретения является хорошая воспроизводимость результатов с использованием минимального количества биомассы микроорганизмов в микрообъемах, отсутствие необходимости использования опасных химических реагентов и анестезии.

Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом.

Перед забором материала с целью элиминации собственных микроорганизмов полости рта испытуемому дают полоскание, состоящее их смеси пищевого хитозана на Абисибе (экстракт сибирской пихты), в течение 1-2 мин. При этом слизистая оболочка освобождается от собственной микрофлоры.

После этого медицинским стерильным ершиком производится забор эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта и вносится в пробирку с 5 мл среды 199.

Клетки дважды отмывают забуференным физраствором (ЗФР) (0,1 М раствор фосфата натрия, приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия, pH 7,2-7,3) и центрифугированием при 800 об/мин по 10 мин. Все манипуляции производят при комнатной температуре.

Концентрацию клеток определяют на денситометре из расчета 2×106 кл/мл.

Затем смешивают 0,1 мл взвеси эпителиальных клеток с 0,1 мл суспензии бактерий (2×109 кл/мл или №6 по Мс Farland), выращенных в оптимальной жидкой или плотной питательной среде. Далее смесь инкубируют при 37°C в течение 30 мин. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР при 600 об/мин по 10 мин. После удаления супернатанта из осадка делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму.

Под световым микроскопом считают среднее количество бактерий на поверхности не менее 25 эпителиоцитов.

В отношении клеточной линии HEp 2 концентрацию выросших клеток сразу определяют на денситометре исходя из указанного расчета, и далее определение проводится так же, как и с эпителиальными клетками.

При оценке адгезии каждого штамма (ОФС 42 - Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения) опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СНА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.

Степень адгезии считают: слабоадгезивную (СПА = 0-1,9); среднеадгезивную (СПА = 2-4,9); высокоадгезивную (СПА = выше 5).

Пример 1. У выделенных из полости рта лактобацилл определяли уровень адгезии по методу Брилис В.И. (1986) на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+ и на клетках эпителия полости рта по предложенному нами методу. Результат СПА представлен в таблице 1. Как видно из таблицы, данные по определению СПА не совпадают и изменяются в основном в большую сторону при определении СПА на эпителиальных клетках полости рта.

Пример 2. Определение СПА у других микроорганизмов полости рта показало несовпадение результатов в сторону увеличения степени адгезии на клетках эпителия полости рта (табл. 2). По-видимому, это связано с наличием большего числа сайтов адгезии на поверхности эпителия полости рта.

Список используемой литературы

1. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лабораторное дело, 1986, №4, с. 210-212.

2. ОФС 42 - Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения.

Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2, заключающийся в том, что осуществляют забор материала, получают из указанного материала суспензию клеток с концентрацией 2×106 кл/мл, определенной на денситометре, смешивают 0,1 мл полученной суспензии клеток с 0,1 мл суспензии бактерий с концентрацией 2×109 кл/мл, инкубируют 30 мин при 37°С, после инкубирования смесь трехкратно отмывают забуференным физраствором при 600 об/мин по 10 мин, далее удаляют супернатант из осадка и делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму, под микроскопом подсчитывают в 10 полях зрения среднее количество адсорбированных микроорганизмов - средний показатель адгезии, проведя не менее трех опытов, и считают степень адгезии от 0 до 1,9 - низкоадгезивной, от 2 до 4,9 - среднеадгезивной, свыше 5 - высокоадгезивной, при условии, что в случае забора эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта его осуществляют медицинским ершиком после предварительного полоскания раствором антисептика хитозана на Абисибе.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии при диагностике врожденных заболеваний, и может быть использовано для ранней диагностики синдрома Алажилля у детей.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования степени риска формирования синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) у девочек-подростков.

Изобретение относится к медицине и фармации, а именно к прижизненной оценке действия реагентов на образование стоматоцитов. Способ прижизненной оценки действия реагентов на образование стоматоцитов, включающий выделение эритроцитов из крови и изучение их формы с помощью светового микроскопа, отличается тем, что суспензию эритроцитов помещают на предметное стекло, опускают в нее объектив микроскопа (100х), после образования эхиноцитов и добавления реагентов проводят микрофотосъемку.

Изобретение относится к областям экологии, ветеринарии, животноводства и предлагается для использования в качестве теста прижизненной оценки уровня аккумуляции свинца в мышечной ткани крупного рогатого скота герефордской породы.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторным методам исследования, позволяющим осуществлять эффективный скрининг антиоксидантов. Способ экспресс-скрининга потенциальных антиоксидантов заключается в том, что выделяют липопротеиды низкой плотности (ЛНП) из плазмы венозной крови здоровых доноров, осуществляют окисление липопротеидов низкой плотности при температуре 37°С внесением 30 мМ сульфата меди (CuSO4), после чего через фиксированные интервалы времени измеряют накопление липогидропероксидов (конъюгированных диенов) при 233 нм (ΔD233) и по результатам исследования строят кинетическую кривую окисления ЛНП, из которой определяют продолжительность периода индукции (τ), затем в опытные пробы вносят исследуемые антиоксиданты (конечная концентрация 1 мкМ), растворенные либо в 96% этаноле - для жирорастворимых веществ или в среде инкубации - для водорастворимых веществ, и если продолжительность периода индукции исследуемого вещества выше 0,4 - вещество может рассматриваться в качестве эффективного антиоксиданта; если ниже 0,1 - исследованное вещество эффективным антиоксидантом не является.

Изобретение относится к медицине, и предназначено для ранней диагностики дисфункции сфинктера Одди III типа у пациентов, оперированных по поводу желчнокаменной болезни.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis. Способ заключается в том, что матриксы из тонких кишок спонтанно зараженных трихостронгилюсами при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии мелких жвачных предварительно обрабатывают в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия при t = 37°C.
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и сердечно-сосудистой хирургии, и может быть использовано для диагностики реактивности и дефицита кровотока в позвоночных артериях у пациентов с клиникой вертебрально-базилярной недостаточности.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, клинической лабораторной диагностике, молекулярной биологии, акушерству, гинекологии и неонатологии.
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для экспресс-диагностики скрытых воспалительных процессов молочной железы и репродуктивных органов коров.

Изобретение относится к области медицины, а именно - к неонатологии, к способам мониторинга состава конденсата выдыхаемого воздуха новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции, с целью мониторинга состояния пациента.

Группа изобретений относится к технической физике применительно к изучению образцов двухкомпонентных металлических сплавов, а именно исследованиям термозависимостей физических свойств расплавов образцов химически активных сплавов.

Изобретение относится к области обработки металлов давлением и может быть использовано для определения сопротивления деформации металлических материалов путем испытания образцов на сжатие, для построения кривой упрочения, для определения математической зависимости между сопротивлением деформации и степенью деформации при различных температурах.

Изобретение относится к области аналитической химии и может найти применение в области экологии и охраны окружающей среды при контроле загрязнения атмосферы. Производят отбор пробы при протягивании через фильтр атмосферного воздуха.

Группа изобретений относится к контролю загрязняющих атмосферу аэрозолей и газов, а именно к методам и устройствам отбора проб из атмосферного воздуха, обеспечивающих изокинетические условия отбора проб воздуха с борта самолета для определения аэрозольных примесей и/или газообразных примесей.

Изобретение относится к оперативному контролю скрытой и явной зараженности насекомыми зерновой насыпи и может быть использовано при исследовании качества партий продовольственного зерна, предназначенных для хранения в зерноперерабатывающей промышленности и семеноводстве.

Изобретение относится к технике океанографических и гидролого-геологических исследований прибрежных районов шельфа, предназначено для отбора проб минеральной взвеси с различных горизонтов придонного слоя моря в зоне больших скоростей турбулентного потока для получения репрезентативных данных о составе и концентрации взвеси и ее распределении по вертикали.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к области получения и подготовки образцов проб с водных поверхностей водоемов для проведения бактериологических исследований.

Изобретение относится к устройствам для взятия проб в жидком или текучем состоянии и может быть использовано в ядерных реакторах с жидкометаллическим теплоносителем для отбора проб расплавленного теплоносителя.

Изобретение относится к технике отбора образцов воздуха мотогондол двигателей летательных аппаратов для исследования достаточности содержания паров пожаротушащих агентов (хладоны, углекислый газ, элегаз и другие) в воздухе мотогондолы при срабатывании системы пожаротушения и повышения точности их определения.

Устройство для измерения размеров капель воды водовоздушных потоков содержит корпус, державку с кассетой со стеклами, блок управления, подвижной цилиндрический кожух, закрывающий кассету и приводимый в движение микроэлектродвигателем, установленным в корпусе. В кожухе выполнены два прямоугольных окна, положение которых относительно направления потока устанавливается за счет поворота кожуха микродвигателем на 90° с фиксацией времени экспозиции. Технический результат заключается в повышение точности измерения размеров капель и точности определения дисперсного состава. 2 ил.
Наверх