Способ определения бактериальной контаминации биоматериалов

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен способ определения бактериальной контаминации культур клеток человека, а также лекарственных средств и биоматериалов на их основе при помощи ПЦР-амплификации последовательности ДНК гена бактериальной 16s РНК, универсальной для всех видов бактерий, который отличается наличием внутреннего контроля, отсутствием ложноположительных результатов и регулируемой чувствительностью, что достигается введением в реакционную смесь праймеров для амплификации последовательности гена человеческого бета-актина. Способ обеспечивает контроль выделения ДНК из образца и прохождения ПЦР, кроме того, контрольная реакция конкурирует с реакцией амплификации гена 16s РНК, в результате чего подавляется амплификация малых количеств бактериальной ДНК, имеющихся в компонентах реакционной смеси. Изменение температуры отжига-элонгации праймеров в указанном способе ведет к изменению эффективности контрольной реакции, что позволяет регулировать порог чувствительности предложенного способа. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, ветеринарии и фармацевтической промышленности, а именно к технологиям контроля качества клеточных препаратов, и может быть использовано для быстрого выявления бактериальной контаминации культур клеток человека, а также лекарственных средств и биоматериалов на их основе.

Уровень техники

Испытание на стерильность обязательно для лекарственных средств, которые в соответствии с нормативной документацией должны быть стерильными. Согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации испытание на стерильность проводят двумя методами: методом прямого посева или методом мембранной фильтрации [Государственная фармакопея Российской Федерации, XIII издание Москва 2015. Available from: http://femb.ru/feml]. Однако время, необходимое для идентификации бактерий посредством этих методов, составляет от 1 до 8 дней, что зачастую значительно превышает допустимое время хранения лекарственных средств и биоматериалов на основе культур клеток человека.

Из уровня техники известны технические решения, позволяющие выявлять контаминацию любыми бактериальными патогенами в различных биологических образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Впервые амплификация гена 16s РНК в качестве метода идентификации различных бактерий, в том числе встречающихся в образцах спинномозговой жидкости пациентов неврологических стационаров, была предложена Greisen и соавт. в 1994 г. [Greisen K, Loeffelholz М, Purohit A, Leong D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. Journal of clinical microbiology. 1994; 32(2): 335-51. PubMed PMID: 7512093; PubMed Central PMCID: PMC263034]. Использование универсальных для всех бактерий олигонуклеотидных праймеров к гену 16s РНК позволяет выявить бактериальное загрязнение в течение 3-4 часов с очень высокой чувствительностью (единичные колониеобразующие единицы (КОЕ)).

Однако высокая чувствительность ПЦР приводит к большому количеству ложноположительных результатов. Это может происходить из-за загрязнения реакционных смесей бактериальными клетками, находящимися на частицах пыли в лаборатории, но главная причина ложноположительных результатов - контаминация реактивов для ПЦР фрагментами ДНК бактерий, используемых при производстве, в частности, Taq-полимеразы [Corless СЕ, Guiver М, Borrow R, Edwards-Jones V, Kaczmarski ЕВ, Fox AJ. Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rRNA PCR. Journal of clinical microbiology. 2000; 38(5): 1747-52. PubMed PMID: 10790092; PubMed Central PMCID: PMC86577]. Из уровня техники известны различные способы борьбы с контаминацией исходных реагентов: обработка ДНКазой I [Heininger A, Binder М, Ellinger A, Botzenhart K, Unertl K, Doring G. DNase pretreatment of master mix reagents improves the validity of universal 16S rRNA gene PCR results. Journal of clinical microbiology. 2003; 41(4): 1763-5. PubMed PMID: 12682181; PubMed Central PMCID: PMC153871], обработка эндонуклеазами рестрикции [Mohammadi T, Reesink HW, Vandenbroucke-Grauls CM, Savelkoul PH. Optimization of real-time PCR assay for rapid and sensitive detection of eubacterial 16S ribosomal DNA in platelet concentrates. Journal of clinical microbiology. 2003; 41(10): 4796-8. PubMed PMID: 14532224; PubMed Central PMCID: PMC254335], ультрафильтрация [Yang S, Lin S, Kelen GD, Quinn TC, Dick JD, Gaydos CA, et al. Quantitative multiprobe PCR assay for simultaneous detection and identification to species level of bacterial pathogens. Journal of clinical microbiology. 2002; 40(9): 3449-54. PubMed PMID: 12202592; PubMed Central PMCID: PMC130696], обработка этидиум-моноазидом [Rueckert A, Morgan HW. Removal of contaminating DNA from polymerase chain reaction using ethidium monoazide. Journal of microbiological methods. 2007; 68(3): 596-600. doi: 10.1016/j.mimet.2006.11.006. PubMed PMID: 17187883], облучение ультрафиолетом в сочетании с обработкой 8-метоксипсораленом [Meier A, Persing DH, Finken М, Bottger ЕС.Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: implications for a general approach to detection of uncultured pathogens. Journal of clinical microbiology. 1993; 31(3): 646-52. PubMed PMID: 8458958; PubMed Central PMCID: PMC262835]. Также предлагается использование специальных Taq-полимераз высокой степени очистки [Muhl H, Kochem AJ, Disque C, Sakka SG. Activity and DNA contamination of commercial polymerase chain reaction reagents for the universal 16S rDNA real-time polymerase chain reaction detection of bacterial pathogens in blood. Diagnostic microbiology and infectious disease. 2010; 66(1): 41-9. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2008.07.011. PubMed PMID: 18722072]. Все эти способы, однако, не обеспечивают полной защиты от контаминации единичными бактериальными клетками в ходе сборки реакции и добавления ДНК, а также предусматривают дополнительные, иногда достаточно длительные, этапы и требуют работы в стерильных условиях, например в ламинарном боксе.

Из уровня техники известны технические решения, позволяющие исключить ложноположительные результаты за счет параллельной амплификации другой ДНК-мишени, в избытке присутствующей в образце. Эта мишень также может служить внутренним контролем, позволяющим отличить истинно отрицательный результат от ложноотрицательных результатов, возникающих из-за различных ошибок и сбоев при проведении ПЦР.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения бактериальной контаминации крови с использованием праймеров на общую для всех бактерий нуклеотидную последовательность в присутствии внутреннего стандарта конкурентного типа [Черкасов Е.Г., Круглов А.Н., Елов А.А., Федоров Н.А., Федоров Е.Н., Суханов Ю.С. Способ определения бактериальной контаминации крови patent RU 2208645. 2002] и его аналог, использующий ПЦР в реальном времени [Qinglin М, Yong L, Jingjing T, Shuangshi W, Hongmei W, Shengbao D, et al. Universal type fluorescent quantitative PCR method for detecting platelet bacterial pollution, patent CN 104372072. 2015]. В этих способах авторы вводят в реакционную смесь искусственно синтезированный стандарт, с которым связываются универсальные бактериальные праймеры, однако при этом используются специфичные флюоресцентные зонды или образуются ПЦР-продукты разной длины, что позволяет различать сигнал от стандарта и бактериальной ДНК. ПЦР-амплификация стандарта конкурирует с ПЦР-амплификацией бактериальной ДНК, и при небольшом количестве последней подавляет ложноположительный сигнал.

Однако в результате частичного подавления амплификации бактериальной ДНК происходит снижение чувствительности метода. Черкасов и соавт. заявляют о надежном обнаружении Treponema palludum при ее концентрации 200 КОЕ/мл, однако существуют исследования, показывающие, что для предотвращения 100% случаев осложнений, связанных с переливанием зараженных компонентов крови, необходимы методы, позволяющие обнаружить бактерии в концентрации менее 100 КОЕ/мл [Jacobs MR, Good СЕ, Lazarus НМ, Yomtovian RA. Relationship between bacterial load, species virulence, and transfusion reaction with transfusion of bacterially contaminated platelets. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 2008; 46(8): 1214-20. doi: 10.1086/529143. PubMed PMID: 18444858]. Для препаратов, получаемых на основе культур клеток человека, такие данные пока отсутствуют, порог чувствительности для них может быть как ниже, так и выше. Кроме того, в наиболее близких к настоящему изобретению способах используется искусственно синтезированный внутренний контроль, который вводится на этапе подготовки ПЦР-реакции и не позволяет контролировать этап выделения ДНК.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание способа, обеспечивающего в срок до 3 часов выявление бактериальной контаминации культур клеток человека, а также лекарственных средств и биоматериалов на их основе, обладающего высокой чувствительностью с возможностью ее регулировки и исключающего возникновение ошибочных результатов.

Техническим результатом изобретения является исключение влияния на результат анализа следовых загрязнений реагентов бактериальной ДНК за счет возможности регулировки чувствительности метода в зависимости от клинических и производственных задач, а также контроля качества не только на этапе прохождения ПЦР, но и на этапе выделения ДНК из образцов. Способ позволяет определить наличие бактериальной контаминации в биоматериале с чувствительностью от 1 до 1000 КОЕ/мл.

Поставленная задача решается тем, что способ определения бактериальной контаминации биоматериалов (культур клеток человека, а также лекарственных средств и других биоматериалов на их основе) включает следующие этапы:

- выделение тотальной ДНК из исследуемого биоматериала;

- проведение ПЦР-амплификации с использованием специфичных для всех видов бактерий универсальных праймеров к гену бактериальной 16s РНК и контрольных праймеров, специфичных к гену человеческого бета-актина, в соотношении 1:2 с допустимой величиной погрешности до 3%, при этом в процессе ПЦР-амплификации стадию отжига-элонгации проводят при температуре 54±0,5°C или 55±0,5°C в течение 40-50 сек;

- детекцию результатов при помощи разделения смеси продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле; при наличии продукта длиной 466 пар оснований при проведении стадии отжига-элонгации при температуре 54±0,5°C с обеспечением чувствительности способа от 10 до 1000 КОЕ/мл или температуре 55±0,5°C с обеспечением чувствительности от 1 до 10 КОЕ/мл делают вывод о присутствии бактерий в исследуемом биоматериале.

Предпочтительно в качестве праймеров, специфичных к гену бактериальной 16s РНК, использовать праймеры с последовательностями 5'-ТСС ТАС GGG AGG CAG CAG Т-3' и 5'-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3'.

Предпочтительно в качестве праймеров, специфичных к гену человеческого бета-актина, использовать праймеры с последовательностями 5'-GCG CCG TTC CGA AAG TT-3' и 5'-CGG CGG ATC GGC AAA-3'.

Для получения чувствительности метода на уровне 103 КОЕ/мл следует использовать температуру отжига-элонгации 54±0,5°C, а для увеличения чувствительности до 1-10 КОЕ/мл следует использовать температуру отжига-элонгации 55±0,5°C.

При указанных температурах отжига-элонгации работа праймеров к гену бета-актина приводит к появлению как специфического, так и ряда неспецифических продуктов, что позволяет эффективно подавлять амплификацию малых количеств бактериальной ДНК. Подавление имеет разную эффективность в зависимости от температуры: при использовании более низких температур понижается чувствительность метода и, следовательно, вероятность возникновения ложноотрицательных результатов. Наличие бактериальной контаминации определяют при наличии полосы, соответствующей продукту длиной 466 пар оснований (п.о.), о правильном выделении ДНК и прохождении ПЦР свидетельствует наличие полосы, соответствующей продукту длиной 136 п.о.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Электрофорез в агарозном геле ПЦР-продукта, полученного при температуре отжига-элонгации 54°C. Полоса 466 п.о. соответствует гену, кодирующему 16S рРНК; полоса 136 п.о. - гену бета-актина. Сверху обозначены количества бактерий в образцах, из которых была выделена ДНК, 0 - образец, не содержащий бактериальной ДНК, но содержащий ДНК мезенхимных стромальных клеток (МСК) жировой ткани человека, НК - отрицательный контроль. М - маркер длин ДНК (обозначены длины в п.н.). Каждый образец представлен в двух повторах. Также наблюдаются неспецифические полосы, возникающие из-за использования температур отжига-элонгации, не оптимальных для работы праймеров к гену бета-актина.

Фиг. 2. Электрофорез в агарозном геле ПЦР-продукта, полученного при температуре отжига-элонгации 55°C. Полоса 466 п.н. соответствует гену, кодирующему 16S рРНК; полоса 136 п.н. - гену бета-актина. Сверху обозначены количества бактерий в образцах, из которых была выделена ДНК, 0 - образец, не содержащий бактериальной ДНК, но содержащий ДНК МСК жировой ткани человека. НК - отрицательный контроль. М - маркер длин ДНК (обозначены длины в п.н.). Каждый образец представлен в двух повторах. Также наблюдаются неспецифические полосы, возникающие из-за использования температур отжига-элонгации, не оптимальных для работы праймеров к гену бета-актина.

Осуществление изобретения

Термин «биоматериалы» включает в себя культуры клеток человека (например, мезенхимных стромальных клеток жировой ткани), а также лекарственные средства и биоматериалы на их основе (например, клеточные пласты или кондиционированная среда мезенхимных стромальных клеток жировой ткани).

В общем виде способ определения бактериальной контаминации биоматериала, включает следующие этапы:

- осаждение ДНК-содержащего материала из исходного препарата (клеточной суспензии, кондиционированной среды или другого препарата) при помощи центрифугирования с ускорением 2000-3000 g в течение 20 минут;

- ресуспендирование осадка в небольшом количестве надосадочной жидкости и перенос его в пробирку меньшего объема для дальнейшего центрифугирования с ускорением 5000-6000 g в течение 10 минут;

- выделение ДНК из полученного осадка при помощи наборов QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen);

- сборку ПЦР-реакции с включением в ее состав известных из уровня техники универсальных праймеров к гену бактериальной 16s РНК (5'-TCC TAC GGG AGG CAG CAG T-3' и 5'-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3') [Nadkarni MA, Martin FE, Jacques NA, Hunter N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology. 2002; 148(Pt 1): 257-66. doi: 10.1099/00221287-148-1-257. PubMed PMID: 11782518], а также контрольных праймеров к гену человеческого бета-актина (5'-GCG CCG TTC CGA AAG TT-3' и 5'-CGG CGG ATC GGC AAA-3') [Chan КС, Ding C, Gerovassili A, Yeung SW, Chiu RW, Leung TN, et al. Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis. Clinical chemistry. 2006; 52(12): 2211-8. doi: 10.1373/clinchem.2006.074997. PubMed PMID: 17068167] в соотношении 1:2 с допустимой величиной отклонения до 3%;

- проведение ПЦР с использованием температуры отжига-элонгации в диапазоне 54-55°C в зависимости от требуемой чувствительности: при использовании более низких температур понижается чувствительность метода и вероятность возникновения ложноотрицательных результатов;

- детекцию продуктов реакции при помощи агарозного гель-электрофореза.

Материалы и методы

1. Выделение ДНК

Для исследования используется ДНК, выделенная из образцов, содержащих клетки человека, или из препаратов, полученных на основе клеток человека (включая клеточные пласты и кондиционированные среды). Клеточный материал получают любым известным из уровня техники способом. Все образцы обрабатывают в стерильных условиях. Клеточную суспензию, кондиционированную среду или иной препарат в объеме 10 мл помещают в пробирку объемом 15 мл и центрифугируют в течение 20 мин при ускорении 2500 g. Надосадочную жидкость отбирают, оставляя 1 мл. Осадок ресуспендируют и переносят в пробирку объемом 2 мл, после чего центрифугируют в течение 10 мин. при ускорении 5000 g. Полностью удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в 180 мкл буфера следующего состава: 20 мг/мл лизоцима, 20 мМ Трис HCl (pH 8,0), 2 мМ ЭДТА, 1,2% Тритона X100, после чего инкубируют в течение 30 мин при 37°C. Далее образцы помещают в автоматическую станцию QIACube (QIAGEN) и выделяют ДНК при помощи набора QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) с использованием запрограммированного в станции протокола. Возможно выделение ДНК при помощи набора QIAmp DNA Mini Kit согласно рекомендациям производителя. Концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически при помощи спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo) и хранят при температуре -20°C.

2. Проведение ПЦР-амплификации

Выявление бактериальной контаминации клеточных культур осуществляют с помощью ПЦР-амплификации образцов, содержащих выделенную ДНК. Используется двухстадийная ПЦР с объединением стадий отжига и элонгации для более эффективной амплификации гена бета-актина. Для проведения реакции были подобраны следующие концентрации реагентов: 5 мкл 5x окрашенной готовой реакционной смеси для ПЦР PCR ScreenMix (Евроген, Россия), в состав которой входят Taq-полимераза, смесь нуклеотидтрифосфатов, Mg2+, реакционный буфер, а также красители для нанесения на гель при проведении электрофоретического анализа; по 0,4 мкМ прямого (5'-TCC TAC GGG AGG CAG CAG T-3') и обратного (5'-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3') праймеров, комплементарных консервативной последовательности ДНК в составе гена, кодирующего бактериальную 16S рРНК; по 0,8 мкМ прямого (5'-GCG CCG TTC CGA AAG TT-3') и обратного (5'-CGG CGG ATC GGC AAA-3') праймеров, комплементарных последовательности гена человеческого бета-актина; 2 мкл образца, содержащего выделенную ДНК в концентрации 30-50 нг/мкл. Для увеличения точности одновременно исследуют по две пробы каждого образца. В отрицательный контроль вместо образца добавляют 2 мкл деионизованной воды, предварительно подвергшейся стерилизации УФ-излучением. Конечный объем реакционной смеси в каждой пробирке составил 25 мкл.

ПЦР проводят в термоциклере Applied Biosystems Veriti при следующих условиях: удерживание температуры 96°C в течение 5 минут, далее 50 двухшаговых циклов: первый шаг - плавление при температуре 96°C в течение 10 секунд, второй шаг - отжиг-элонгация при заданной температуре в течение времени, оптимального для амплификации продуктов необходимой длины (40-50 c). Так как температура отжига-элонгации является параметром, определяющим чувствительность метода, она отличается для разных экспериментов: для получения чувствительности на уровне 103 КОЕ/мл следует использовать 54°C, для увеличения чувствительности до 103 КОЕ/мл следует использовать 55°C.

3. Анализ полученных ПЦР-продуктов

Для анализа результатов проведенной ПЦР используют электрофорез в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл. Для приготовления геля в 180 мл трис-ацетатного буферного раствора (ТАЕ) растворяют 3,6 г агарозы с последующим ее расплавлением в микроволновой печи и охлаждением до 50-60°C, после чего добавляют 9 мкл раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл. Электрофорез проводят в камере, заполненной трис-ацетатным буферным раствором при напряженности поля 6 B/см в течение 40 минут. Для определения длины полученных ПЦР-продуктов используют маркер длин ДНК. Визуализацию и документирование результатов гель-электрофореза осуществляют с помощью системы гель-документации Vilber Lourmat Quantum ST5.

Примеры

Пример 1. Определение чувствительности метода при температуре отжига-элонгации 54°C.

Получение ДНК из клеточных препаратов, искусственно обсемененных бактериями

В качестве клеточного препарата используют мезенхимные стромальные клетки (МСК) человека. МСК выделяют из подкожного жирового отложения здоровых доноров обоих полов. Клетки выделяют из материала, полученного при проведении малого хирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций. Хирургический материал (15 г жировой ткани, взятой из околопупочной области или другой области локализации подкожного жира) помещают в одноразовую пробирку с буфером HBSS (HyClone), содержащим 5-ти кратную концентрацию антибиотика 500 ед./мл (HyClone).

В стерильных условиях культурального бокса биоптат фрагментируют до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергают его ферментативной обработке в растворе, содержащем среду AdvanceSTEM (HyClone), 500 ед/мл антибиотика (HyClone), 200 ед./мл коллагеназы I типа и диспазы (40 ед./мл) (Worthington Biochemical) (соотношение объема ферментов и жира должно быть 1:1:1), при 37°C в течение 30-45 минут при постоянном помешивании. По окончании инкубации к образцу добавляют равный объем среды с сывороткой и фильтруют через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD). Профильтрованную суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 200 g, после чего супернатант полностью удаляют. Осадок клеток подвергают обработке буфером для лизиса эритроцитов (BD) до покраснения раствора, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 200 g. Супернатант полностью удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в среде роста МСК. Для культивирования мезенхимных клеток используют среду AdvanceSTEM (HyClone) в сочетании с добавлением 10% раствора добавок AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone) и 100 ед/мл антибиотика (HyClone). Эта среда была разработана фирмой-производителем (HyClone) для культивирования недифференцированных МСК, в частности клеток, происходящих из жировой ткани, без добавления сыворотки (http://www.thermo.com).

Выделенные МСК высевают в концентрации 200 тыс. в мл в чашках Петри и культивируют в среде роста в инкубаторе при 37°C и при 5%-ной концентрации CO2. Для получения клеточной суспензии клетки снимают с поверхности культурального пластика. Перед снятием с поверхности культурального пластика клетки трехкратно промывают раствором Версена. Затем наносят в каждую чашку по 1 мл реагента для диссоциации клеток HyQTase (HyClone). При приобретении клетками округлой формы и откреплении их от подложки в каждую культуральную емкость вносят по 9 мл среды роста и интенсивно пипетируют клеточную суспензию.

Культуру бактерий Е. coli выращивают в жидкой среде LB в течение суток, после чего определяют концентрацию при помощи спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo). Объем доводят до концентрации бактерий 107 КОЕ/мл, полученный образец последовательно разводят в 10 раз до получения концентрации 102 КОЕ/мл. ДНК из семи образцов МСК выделяют, как описано в разделе «Материалы и методы», однако после переноса 1 мл образца в пробирку объемом 2 мл к нему добавляют 10 мкл бактериальных суспензий, полученных при осуществлении серийных разведений. Таким образом получают образцы объемом 1 мл, содержащие бактериальные клетки в количестве 105, 104, 103, 102, 10 и 1 КОЕ. В один из образцов, являющийся контрольным, бактерии не добавляют.

Проведение ПЦР-амплификации и анализ данных

Образцы ДНК, перечисленные выше, подвергают ПЦР-амплификации, как описано в разделе «Материалы и методы»: удерживание температуры 96°C в течение 5 минут, далее - 50 двухшаговых циклов: первый шаг - плавление при температуре 96°C в течение 10 секунд, второй шаг - отжиг-элонгация при температуре 54°C в течение 45 секунд. Кроме того, для оценки ложноположительных результатов одновременно проводят амплификацию отрицательного контроля - образца, не содержащего ДНК.

Анализ результатов ПЦР осуществляют с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл. Полоса 466 п.о. соответствует продукту амплификации гена, кодирующего 16S рРНК; полоса 136 п.о. - продукту амплификации гена бета-актина.

В результате проведенной реакции было выяснено, что чувствительность метода при данной температуре составляет 103 КОЕ/мл (фиг. 1). Полоса, соответствующая внутреннему контролю - продукту амплификации гена бета-актина, обнаруживается во всех исследуемых образцах, содержащих ДНК мезенхимальных стволовых клеток, но отсутствует в отрицательном контроле. При этом нужно заметить, что интенсивность свечения полосы, соответствующей продукту амплификации гена бета-актина, ниже в образцах с более высокими концентрациями бактериальной ДНК, что свидетельствует о взаимной конкуренции двух одновременно протекающих ПЦР-реакций. В образце, не содержащем ДНК, отчетливо наблюдается амплификация бактериальной ДНК, что свидетельствует о контаминации реагентов и возможности появления ложноположительных результатов в отсутствие амплификации гена бета-актина.

Пример 2. Определение чувствительности метода при температуре отжига-элонгации 55°C

ДНК из клеточных препаратов, искусственно обсемененных бактериями, получают так же, как описано в примере 1.

Образцы ДНК, перечисленные в примере 1, подверглись ПЦР-амплификации, как описано в разделе «Материалы и методы»: удерживание температуры 96°C в течение 5 минут, далее - 50 двухшаговых циклов: первый шаг - плавление при температуре 96°C в течение 10 секунд, второй шаг - отжиг и элонгация при температуре 55°C в течение 45 секунд. Для оценки ложноположительных результатов одновременно была проведена амплификация отрицательного контроля - образца, не содержащего ДНК.

Анализ результатов ПЦР был осуществлен с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл. Полоса 466 п.о. соответствует продукту амплификации гена, кодирующего 16S рРНК; полоса 136 п.о. - продукту амплификации гена бета-актина.

В результате проведенной реакции было выяснено, что чувствительность метода при данной температуре составляет 1-10 КОЕ/мл (фиг. 2). Аналогично предыдущему случаю полоса, соответствующая внутреннему контролю - продукту амплификации гена бета-актина, обнаруживается во всех исследуемых образцах, содержащих ДНК МСК, но отсутствует в отрицательном контроле. Так же, как и в примере 1, интенсивность свечения полосы, соответствующей продукту амплификации гена бета-актина, ниже в образцах с более высокими концентрациями бактериальной ДНК, что подтверждает наличие конкуренции двух одновременно протекающих ПЦР-реакций.

При проведении ПЦР чувствительность метода и количество побочных продуктов зависят от температуры отжига (гибридизации) праймеров. При сравнении результатов проведенных экспериментов, описанных в примерах 1 и 2, выяснилось, что повышение температуры увеличивает чувствительность метода, которая на два-три порядка выше при протекании гибридизации при температуре 55°C (1-10 КОЕ/мл), чем при 54°C (10-103 КОЕ/мл). Кроме того, повышение температуры снижает количество побочных (неспецифических) продуктов: интенсивность свечения их полос при температуре отжига-элонгации, равной 55°C, ниже, чем при 54°C.

При анализе результатов реакции с помощью гель-элетрофореза в отрицательном контроле обнаруживается полоса, соответствующая продукту амплификации гена, кодирующего 16S рРНК, хотя отсутствуют продукты амплификации внутреннего контроля. Данный результат объясняется контаминацией используемых при ПЦР реактивов, имеющих бактериальное происхождение, в частности рекомбинантной Taq-полимеразы. Одновременное протекание в реакционной смеси двух конкурирующих ПЦР-реакций (амплификация гена, кодирующего 16S рРНК, и амплификация внутреннего контроля - гена человеческого бета-актина) позволяет снизить уровень возможного «шумового» сигнала, связанного с контаминацией используемых при ПЦР реактивов, имеющих бактериальное происхождение, и избежать ложноположительных результатов. Поэтому в образце, в котором присутствует ДНК МСК, но нет бактериальной ДНК, отсутствует полоса, соответствующая продукту амплификации гена 16S рДНК, однако регистрируется сигнал от продуктов амплификации внутреннего контроля. Именно в таком случае результат исследования является отрицательным и можно говорить об отсутствии контаминации клеточной культуры. Положительным результат считается при выявлении сигнала от продуктов обеих ПЦР-реакций.

Интенсивность протекания конкурирующей реакции и, соответственно, чувствительность метода регулируются при помощи изменения температуры отжига-элонгации праймеров. Снижение чувствительности в приведенных примерах не влияет на информативность метода, поскольку по данным литературы чувствительности метода в 102 КОЕ/мл достаточно для детекции бактериальных патогенов в 100% случаев.

Пример 3. Определение возможностей метода при исследовании кондиционированной среды, содержащей продукты секреции клеток человека

Получение ДНК из препаратов кондиционированной среды, искусственно обсемененных бактериями

Для получения кондиционированной среды МСК жировой ткани наращивают до 2-5 пассажа. МСК жировой ткани человека добавляют в количестве 5-15⋅103/см2 в культуральные емкости для выращивания эукариотических клеток, после прикрепления промывают культуральные сосуды с клетками солевым раствором Хэнкса (Панэко, Россия) (в количестве 0,1-0,2 мл/см2 трижды по 10 минут) и заполняют их свежей средой роста для кондиционирования в количестве 0,1-0,2 мл/см2. В качестве последней используют универсальную среду роста для разных типов клеток DMEM with Low Glucose (HyClone, USA) или другую подходящую для кондиционирования среду роста. Затем клетки культивируют в условиях CO2 инкубатора при 37±1°C, 5%-ном содержании CO2 и относительной влажности ≥95% в течение 7 суток. Кондиционированную среду, содержащую все продукты секреции МСК жировой ткани человека, собирают в стерильные емкости для центрифугирования и центрифугируют при 2500 g и температуре (6±2)°C в течение 20 минут. Надосадочную жидкость отбирают, оставляя 1 мл. Осадок ресуспендируют и переносят в пробирку объемом 2 мл, после переноса к нему добавляют 10 мкл бактериальных суспензий, полученных при осуществлении серийных разведений, как описано в примере 1. Таким образом получают образцы объемом 1 мл, содержащие бактериальные клетки в количестве 105, 104, 103, 102, 10 и 1 КОЕ. В один из образцов, являющийся контрольным, бактерии не добавляют. Далее ДНК выделяют, как описано в разделе «Материалы и методы», начиная с этапа центрифугирования образца в течение 10 мин. при ускорении 5000 g.

Проведение ПЦР-амплификации и анализ данных

Образцы ДНК, перечисленные выше, подвергают ПЦР-амплификации, как описано в разделе «Материалы и методы»: удерживание температуры 96°C в течение 5 минут, далее - 50 двухшаговых циклов: первый шаг - плавление при температуре 96°C в течение 10 секунд, второй шаг - отжиг-элонгация при температуре в течение 45 секунд. Кроме того, для оценки ложноположительных результатов одновременно проводят амплификацию отрицательного контроля - образца, не содержащего ДНК. Проводят две серии экспериментов - с температурой отжига-элонгации 54°C и с температурой отжига-элонгации 55°C.

Анализ результатов ПЦР осуществляют с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл. Полоса 466 п.о. соответствует продукту амплификации гена, кодирующего 16S рРНК; полоса 136 п.о. - продукту амплификации гена бета-актина.

Данные электрофореза были аналогичны данным, полученным при исследовании клеточных препаратов в примерах 1 и 2, что свидетельствует о возможности использования метода для оценки бактериальной контаминации кондиционированных сред.

Таким образом, ПЦР-амплификация консервативных участков последовательности ДНК гена, кодирующего бактериальную 16S рРНК, является высокочувствительным методом, способным обнаружить бактериальную контаминацию клеточных культур, причем чувствительность метода напрямую зависит от температуры отжига-элонгации праймеров, что позволяет регулировать ее в зависимости от цели исследования. Кроме того, одновременное проведение конкурирующей ПЦР-реакции для обнаружения внутреннего контроля позволяет снизить уровень неспецифического «шумового» сигнала, не уменьшая диагностическую ценность метода.

1. Способ определения бактериальной контаминации биоматериалов, включающий: выделение тотальной ДНК из исследуемого биоматериала;

проведение ПЦР-амплификации с использованием праймеров, специфичных к гену бактериальной 16s РНК, и контрольных праймеров, специфичных к гену человеческого бета-актина, взятых в соотношении 1:2 с допустимой величиной отклонения до 3%, при этом в процессе ПЦР-амплификации стадию отжига-элонгации проводят при температуре 54±0,5°С или 55±0,5°С в течение 40-50 сек;

разделение смеси продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в агарозном геле; при выявлении на полученной электрофореграмме полосы, соответствующей продукту длиной 466 пар оснований, при использовании температуры отжига-элонгации 54±0,5°С с обеспечением чувствительности способа от 10 до 1000 КОЕ/мл или температуре 55±0,5°С с обеспечением чувствительности способа от 1 до 10 КОЕ/мл делают вывод о присутствии бактерий в исследуемом биоматериале.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве праймеров, специфичных к гену бактериальной 16s РНК, используют праймеры с последовательностями 5'-ТССТАСGGGAGGCAGCAGТ-3' и 5'-GGAСТАCCAGGGТАТСТААТСCTGТТ-3'.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве праймеров, специфичных к гену человеческого бета-актина, используют праймеры с последовательностями 5'-GCGCCGТТСCGAAAGТТ-3' и 5'-CGGCGGАТСGGCААА-3'.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клинической лабораторной диагностики вирусных инфекций, и может быть использовано для генотипирования вируса герпеса 6-го типа (ВГЧ-6).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ идентификации микроводорослей.

Изобретение относится к молекулярной генетике. Описан способ определения полиморфизма генов, ассоциированных с фертильностью крупного рогатого скота, а именно гена апоптотического протеаза-активирующего фактора 1 (APAF1), связанного с гаплотипом фертильности голштинского скота НН1.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан бактериофаг F510/08, имеющий геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:4.

Изобретение относится к пищевой промышленности и биотехнологии. Описан способ интенсификации массообменных процессов для растительного сырья.

Группа изобретений относится к области предсказания биомолекулярного связывания. Предложен способ и устройство предсказания взаимодействия между соединением и протеином, и энергонезависимый материальный считываемый компьютером носитель данных.

Изобретение относится к разделу общей и медицинской вирусологии и касается вируса гриппа А. Получены новые адаптированные варианты пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 к организмам различных лабораторных животных, представленные три адаптированных варианта пандемического вируса гриппа получены из штамма дикого типа A/Tomsk/273/2010(HlNlpdm09) путем многократного пассирования через легкие экспериментальных мышей.

Изобретение относится к биохимии. Описан липополисахарид, антагонист эндотоксинов, продуцируемый штаммом Rhodobacter capsulatus PG, депонированным в ВКМ ИБФМ РАН под номером В-2381 Д, в качестве средства для дифференцировки моноцитоподобных клеток.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в гастроэнтерологии. Предложен способ определения чувствительности Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицине. Диагностический штамм вируса гриппа RN9/13-human A(H6N9) получен путем скрещивания апатогенного вируса гриппа птиц А/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(H6N1) с холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/Ануи/2013/61(H7N9) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2).

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, гинекологии, неонатологии, микробиологии, молекулярной генетике, клинической лабораторной диагностике. Cпособ нацелен на выявление возбудителей оппортунистических инфекций и маркеров их патогенности у женщин репродуктивного возраста и новорожденных детей. Для исследования у женщин используют соскобы эпителиальных клеток из влагалища (заднебоковые своды) и цервикального канала, биоптат эндометрия, метроаспират, содержимое абсцесса, экссудат брюшной полости, кровь, мочу. Для исследования у новорожденного используют соскобы со слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта (кал, зев), отделяемое глаз, содержимое везикул, отделяемое пупочной ранки, кровь, мочу, содержимое венозного катетера. Выполняют ПЦР в режиме реального времени. В образцах биоматериала определяют общую бактериальную массу, количество геномов представителей условно-патогенной микрофлоры, относящихся к одиннадцати таксонам: семейство Enterobacteriaceae, роды: Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Candida, виды: Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, и наличие восемнадцати маркерных локусов, ассоциированных с патогенностью основных условно-патогенных микроорганизмов: G. vaginalis sialidase, G. vaginalis lacZ, G. vaginalis fucA, S. agalactiae sialidase, S. agalactiae ST-17, S. agalactiae ST-19/23, S. aureus tsst, S. aureus lukS, S. aureus lukF, S. aureus icaA, S. aureus icaD, E. faecalis cylA, E. faecalis cylB, E. coli cnf1, E. coli vat, E. colipapC, E. coli stx1, E. coli stx2. В зависимости от наличия/отсутствия возбудителя, его количества и маркерных генов патогенности проводят оценку уровня патогенности возбудителей инфекций и дают прогноз течения и развития осложнений заболевания. В соответствии с прогнозом осуществляют тактику ведения пациента. 7 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к стоматологии, и предназначено для оценки прогноза кариеса. Из венозной крови выделяют ДНК. Для определения точечных мутаций гена KLK4 используют метод ПЦР. В случае присутствия аллеля А в мутационных точках G2664153A и G2142A гена KLK4 прогнозируют развитие кариеса. Изобретение позволяет прогнозировать кариозный процесс при отсутствии клинических признаков заболевания. 3 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда. Указанный набор предназначен для идентификации ДНК возбудителя бластомикоза Blastomyces dermatitidis методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Настоящий набор содержит зонд BDags-2P, сконструированный по типу «молекулярного маяка», и олигонуклеотиды BDags-1F и BDags-2R, комплементарные фрагментам гена α-1,3-глюкансинтазы B. dermatitidis и обладающие активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации. Настоящее изобретение отличается тем, что указанные олигонуклеотиды обладают следующей структурой: 5’- GCG TTA TTGAAG CCG ATC CT - 3’ и 5’- AAC AGC CCG ATT GTC CAA AG - 3’, соответственно. Настоящий зонд обеспечивает флуоресцентную детекцию и имеет структуру 5’(FAM)-GGGATGCAGCGCAATTGCAATCCC-(BHQ1)3’, где FAM – флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин, BHQ1 – гаситель флуоресценции. Настоящее изобретение позволяет идентифицировать ДНК возбудителя бластомикоза B. dermatitidis с высокой чувствительностью и специфичностью. 1 табл., 1 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена тест-система, содержащая синтетические олигонуклеотидные праймеры, представляющие собой нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1-192 и определяющие 64 однонуклеотидных полиморфных маркера Х-хромосомы. Указанная совокупность маркеров обладает достаточной информативностью для проведения генетической экспертизы на территории Российской Федерации и состоит из двух групп маркеров, способных к мультиплексированию. Предложенная тест-система позволяет эффективно использовать ее в сложных случаях при экспертизе на родство в криминалистической и судебно-медицинской идентификационной практике.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности гена fad-2 растения канолы. Также раскрыт набор для осуществления указанного способа. Изобретение позволяет определить зиготность гена fad-2. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретения касаются способа диагностики болезни Альцгеймера или умеренного когнитивного нарушения (MCI) у субъекта и набора для осуществления указанной диагностики. Представленный способ включает определение уровня по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-15b, miR-191, miR-142-3р, Let-7g, Let-7d и их комбинаций, в образце крови, плазмы или сыворотки, взятом у субъекта. Отклонение уровня указанной по меньшей мере одной микроРНК от уровня у здорового субъекта, определенное по отношению к соответствующему контролю, указывает на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера или MCI. Набор для диагностики включает два или более агентов, селективно детектирующих присутствие по меньшей мере двух микроРНК, выбранных из группы, состоящей из miR-191, miR-15b, miR-142-3р, Let-7g, Let-7d, miR-301a и miR-545 в образце. Изобретения могут быть использованы для точной диагностики болезни Альцгеймера и MCI у субъекта. 2 н. и 33 з.п. ф-лы, 3 ил., 11 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены способы определения относительного и абсолютного количества нуклеиновой кислоты-мишени в образце. Также рассмотрен способ определения величины порогового числа циклов амплификации. Данное изобретение обеспечивает мультиплексные анализы нескольких нуклеиновых кислот-мишеней в образце в одно и то же время и может найти дальнейшее применение в молекулярной биологии, генетических исследованиях и диагностике. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению сои, обладающему устойчивостью к глифосату и изоксафлютолу. Также раскрыты трансгенное семя указанного растения, молекула нуклеиновой кислоты, геномная ДНК сои, продукт из сои, набор, пара праймеров и пара специфичных зондов для идентификации одновременного присутствия генов устойчивости к указанным гербицидам. Раскрыты способ получения продукта из сои, способы борьбы с сорняками на поле, где растение сои устойчиво к глифосату и изоксафлютолу, способ защиты указанных растений сои, способ получения указанного растения сои, способы идентификации одновременного присутствия генов устойчивости к указанным гербицидам, способ скрининга семени на одновременное присутствие генов устойчивости к указанным гербицидам, способ обнаружения присутствия одновременно генов устойчивости к указанным гербицидам. Изобретение позволяет придать устойчивость растению сои к глифосату и изоксафлютолу. 21 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 5 пр.

Изобретение относится к биохимии, в частности к способу скрининга противоопухолевых препаратов - ингибиторов PARP1. Для осуществления указанного способа проводят сборку нуклеосом из очищенных гистонов на ДНК-матрицах, затем лигирование с РНК-полимеразой и внесение в полученный комплекс молекулярной мишени - белка PARP1, с последующим внесением буфера транскрипции, а также тестируемых химических соединений. При этом указанный буфер транскрипции содержит дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ) и меченый α-32Ф-ГТФ. Далее проводят транскрипцию и оценку продуктов транскрипции путем их разделения с помощью электрофореза. Вывод о наличии у тестируемого соединения PARP1-ингибирующей активности делают при наличии на электрофореграмме полос в точках +15, +45 и в области run-off, показывающих паузирование транскрипции, как показано на фиг. 1, причем указанную оценку активности проводят с референсным значением PARP1 с НАД. Настоящее изобретение позволяет повысить специфичность и селективность системы отбора молекул на основе нуклеосом. 18 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза, содержащая изоформы фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы, и способ предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза, включающий введение млекопитающему указанной композиции. Предложенная группа изобретений обеспечивает предупреждение или лечение бокового амиотрофического склероза. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен способ определения бактериальной контаминации культур клеток человека, а также лекарственных средств и биоматериалов на их основе при помощи ПЦР-амплификации последовательности ДНК гена бактериальной 16s РНК, универсальной для всех видов бактерий, который отличается наличием внутреннего контроля, отсутствием ложноположительных результатов и регулируемой чувствительностью, что достигается введением в реакционную смесь праймеров для амплификации последовательности гена человеческого бета-актина. Способ обеспечивает контроль выделения ДНК из образца и прохождения ПЦР, кроме того, контрольная реакция конкурирует с реакцией амплификации гена 16s РНК, в результате чего подавляется амплификация малых количеств бактериальной ДНК, имеющихся в компонентах реакционной смеси. Изменение температуры отжига-элонгации праймеров в указанном способе ведет к изменению эффективности контрольной реакции, что позволяет регулировать порог чувствительности предложенного способа. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Наверх