Способ диагностики врожденной немалиновой миопатии


 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2630982:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики немалиновой миопатии, при котором у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани, проводят иммуногистохимическое выявление фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1α), для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор для уменьшения фонового неспецифического окрашивания, затем срезы инкубируют с поликлональными антителами кролика к белку HIF-1α, после промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, покрывают фотозащитным реагентом и проводят люминесцентную микроскопию, а при выявлении локусов округлой и/или овальной формы красной окраски диаметром 3-5 мкм под оболочкой мышечного волокна диагностируют немалиновую миопатию. Техническим результатом изобретения является повышение надежности диагностики немалиновой миопатии. 2 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, патологической анатомии, а также к гистологии, цитологии и клеточной биологии, и может быть использовано для диагностики немалиновой миопатии.

Немалиновая миопатия - один из вариантов врожденной непрогрессирующей миопатии, ассоциированный с "палочковидными" ("немалиновыми") структурами в мышечных волокнах. Дифференциальный диагноз на наличие различных форм немалиновой миопатии следует проводить с другими болезнями и синдромами, при которых наблюдается симптомокомплекс "вялого ребенка", болезнью Краббе, хромосомными синдромами. Главной патоморфологической характеристикой немалиновой миопатии является наличие в мышечных волокнах скоплений т.н. "палочковидных телец" или "палочек" (rod bodies). "Палочки" имеют 0,5-3 мкм в ширину и до 7 мкм в длину и располагаются субсарколеммально (Dubowitz V., Sewry С.А., Oldfors А. Muscle biopsy. Saunders Elsevier, 2013, p. 371-377).

Изменения, типичные для данной болезни, не могут быть установлены при гематоксилин-эозиновой окраске фиксированного в формалине и залитого в парафин материала. Предпочтительнее фиксация в растворе Bouin или Zenker и последующая окраска фосфорно-вольфрамовой кислотой - эозином. При окраске по Гомори-Энгелу палочковидные структуры окрашиваются в более темный зеленый цвет по сравнению с нормальными мышечными волокнами.

Известен способ морфологического выявления немалиновых телец посредством трансмиссионной электронной микроскопии (Morris Е.Р., Nneji G., and Squire J.M. The Three-dimensional Structure of the Nemaline Rod Z-Band. The Journal of Cell Biology, 1990; 111: 6: 2: 2961-2978). Срезы толщиной около 80 нм из блоков мышечных биоптатов, залитых в аралдит, готовят на ультратоме как в поперечном, так и в продольном направлении. Анализ изображения проводят с помощью электронного микроскопа JEOL 1200ЕХ или аналогичного с гониометром и вращающимся держателем образцов. Признаком немалиновой миопатии служит обнаружение продольных и поперечных срезов немалиновых телец, а также немалиноподобных утолщений Z-полосок. Однако этот способ имеет недостатки: трудоемкость метода электронной микроскопии, повышенная частота как ложноотрицательных, так и ложноположительных ответов из-за малого поля зрения.

Известен другой способ морфологического выявления немалиновых телец, присутствующих в мышечных волокнах больных с врожденной немалиновой миопатией (Wallgren-Pettersson CI, Jasani В, Newman GR, Morris GE, Jones S, Singhrao S, Clarke A, Virtanen I, Holmberg C, Rapola J. Alpha-actinin in nemaline bodies in congenital nemaline myopathy: immunological confirmation by light and electron microscopy. Neuromuscul Disord. 1995 Mar; 5 (2): 93-104). Изучают биоптаты мышц с использованием моноклональных антител к альфа-актинину в сочетании с модифицированным трехцветным методом Гомори. Электронная и световая микроскопия используются для иммуногистохимического определения участков локализации альфа-актинина и десмина. При немалиновой миопатии световая микроскопия срезов при выявлении альфа-актинина показывает наличие поперечной исчерченности мышечных волокон, фокальное утолщение Z-полос и наличие немалиновых тел. Электронная микроскопия подтверждает наличие альфа-актинина в немалиновых телах и Z-полосах. Результаты дают прямые доказательства наличия альфа-актининовых немалиновых тел.

Таким образом, морфологическая диагностика, обладающая значительно большей чувствительностью, чем молекулярно-генетическое исследование, тем не менее, остается чрезвычайно трудоемким и капризным методом выявления признаков немалиновой миопатии. В связи с этим чрезвычайно актуально расширение спектра морфологических методов, способных выявлять маркеры немалиновой миопатии.

Наиболее близким аналогом к патентуемому (прототипом) является способ выявления немалиновых телец с помощью окраски свежезамороженных срезов мышечной ткани по Гомори-Энгелу (Engel W.K., Cunningham G.G. - Rapid examination of muscle tissue: An improved trichrome stain method for fresh frozen biopsy sections. / Neurology, 1963, v. 13, p. 919-926). Проводят морфологическое исследование мышечной ткани больных с врожденными миопатиями (в том числе немалиновой) - биоптаты мышц с использованием трехцветной окраски по Гомори, модифицированной для замороженных срезов мышечной ткани. Готовят краситель, содержащий хромотроп 2R (600 мг), прочный зеленый FSF (300 мг), фосфорно-вольфрамовую кислоту (600 мг), ледяную уксусную кислоту (1 мл), дестиллированную воду (100 мл). Замороженные срезы предварительно окрашивают одним из квасцовых гематоксилинов по стандартной методике, промывают водой и окрашивают вышеуказанным красителем 60 минут при комнатной температуре. Окрашенные срезы заключают под покровное стекло в глицерин-желатиновую смесь. При светомикроскопическом анализе немалиновые тельца видны в виде темно-зеленых палочковидных телец на светло-зеленом фоне саркоплазмы мышечных волокон.

Недостатком этого метода является необходимость использования только свежезамороженных срезов непосредственно после взятия мышечной биопсии, а также низкая чувствительность и высокая вероятность ложноотрицательных результатов.

Задачей изобретения является создание надежного и чувствительного морфологического метода диагностики врожденной немалиновой миопатии.

Техническим результатом является повышение надежности диагностики немалиновой миопатии за счет расширения технических возможностей исследования биоптатов скелетных поперечнополосатых мышц пациентов при использовании иммуногистохимического метода на парафиновых биопсийных препаратах.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для диагностики немалиновой миопатии у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани. Проводят иммуногистохимическое выявление фактора, индуцируемого гипоксией -1-альфа (HIF-1α). Для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор, обеспечивая уменьшение фонового неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубируют с поликлональными антителами кролика к белку HIF-1α. После промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, покрывают фотозащитным реагентом и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, а при выявлении локусов округлой и/или овальной формы красной окраски диаметром 3-5 мкм под оболочкой мышечного волокна диагностируют немалиновую миопатию.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного с признаками врожденной миопатии с целью дифференциальной диагностики проводят иммуногистохимическое выявление фактора, индуцируемого гипоксией -1-альфа (HIF-1α). Для этого после взятия мышечной биопсии проводят химическую фиксацию материала в 10% нейтральном (рН-7,4) забуференном формалине в течение 24 часов, после чего материал обезвоживают с использованием ксилола и заливают в парафин. С парафиновых блоков получают срезы толщиной 4 мкм, которые наносят на высокоадгезивные стекла, а затем высушивают в течение 24 часов при температуре 48°С.

Срезы депарафинируют поочередно в трех порциях ксилола по 5 минут в каждом, регидрируют трехкратно в 96% спиртовых растворах по 5 минут в каждом, промывают в дистиллированной воде 3 раза по 5 минут. Затем на 30 минут на образцы наносят усилитель флуоресцентного сигнала (Image-iT FX signal enhancer, Thermo Fisher Scientific), с последующей промывкой в фосфатном буфере (PBS).

На следующем этапе на срезы на 30 минут наносят белок-блокатор (Novocastra Protein Block, Leica), для уменьшения фонового неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубируют во влажной камере в течение 60 минут при комнатной температуре с поликлональными антителами кролика к белку HIF-la (Thermo Fisher Scientific, США; разведение 1:100). После чего срезы промывают в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут и на 60 минут на них наносят соответствующие вторичные флуоресцентные антитела (антитела к поликлональным антителам кролика) (Антитела козы к IgG кролика (Alexa Fluor 555) Thermo Fisher Scientific, США, Разведение 1:2000). Затем срезы промывают в фосфатном буферном растворе 3 раза по 5 минут и покрывают фотозащитным реагентом ProLong Gold (страна производитель США) и заключают под покровные стекла.

При последующем анализе с помощью люминесцентного микроскопа при немалиновой миопатии в различных участках мышечных волокон (чаще непосредственно под оболочкой волокна) определяются ярко красные локусы. Их форма приближена к округлой или овальной. Диаметр: 3-5 мкм. При других формах врожденных миопатий такие локусы не обнаруживаются.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Клинический пример 1.

Пациенту 2 лет с клиникой врожденной миопатии проведено исследование скелетной мышечной ткани по предлагаемому способу. Приводим описание микрофотографии (Фиг. 1). Скелетная мышечная ткань, увеличение ×600. Иммуногистохимическое распределение флуоресцентного маркера HIF-1α (красный). Определяются выраженные скопления маркера HIF-1α под оболочкой мышечного волокна (на периферии мышечных волокон) в виде четко очерченных кластеров. Диагностирована немалиновая миопатия. При исследовании биоптата скелетных мышц, окрашенного по методу Гомори, диагноз был верифицирован.

Клинический пример 2.

Пациенту 4 лет с клиникой врожденной миопатии проведено исследование скелетной мышечной ткани по предлагаемому способу. Приводим описание микрофотографии (Фиг. 2). Иммуногистохимическое распределение флуоресцентных маркеров наружной митохондриальной мембраны (зеленый) и HIF-1α (красный). Увеличение ×400. Определяются множественные локусы интенсивной флуоресценции маркера HIF-1α. Диагностирована немалиновая миопатия. При исследовании биоптата скелетных мышц, окрашенного по методу Гомори, диагноз был верифицирован.

Способ диагностики немалиновой миопатии, при котором у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани, проводят иммуногистохимическое выявление фактора, индуцируемого гипоксией -1-альфа (HIF-1α), для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор для уменьшения фонового неспецифического окрашивания, затем срезы инкубируют с поликлональными антителами кролика к белку HIF-1α, после промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, покрывают фотозащитным реагентом и проводят люминесцентную микроскопию, а при выявлении локусов округлой и/или овальной формы красной окраски диаметром 3-5 мкм под оболочкой мышечного волокна диагностируют немалиновую миопатию.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования необходимости проведения лазерной коагуляции при ретинопатии недоношенных.

Группа изобретений относится к способу калибровки составного анализа, включающему: добавление калибровочного реагента, включающего по меньшей мере две различные связывающие молекулы, где каждая молекула обладает способностью специфичного связывания с агентом захвата и способностью связываться с детектирующей молекулой и где по меньшей мере две из связывающих молекул имеют различные специфичности и присутствуют в различных концентрациях, добавление детектирующей молекулы, детектирование связанной детектирующей молекулы, создание калибровочной кривой, включающей ряд калибровочных точек/интервалов.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и касается способа стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro. Для этого CD4+-клетки костного мозга культивируют в СO2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано при обследовании больных для прогнозирования развития нефросклероза у детей с хроническим пиелонефритом.
Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для прогнозирования интраоперационных геморрагических осложнений при тяжелой форме пролиферативной диабетической ретинопатии.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам белка липокалина, а также к полученным на их основе специфично связывающимся терапевтическим или диагностическим белкам, направленным против гепсидина, и может быть использовано в медицине.
Изобретение относится к области медицины, а именно к судебно-медицинской экспертизе, криминалистике, и предназначено для определения биологического возраста трупа.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и касается способа выделения антилиганда, представляющего собой антитело или его антигенсвязывающий вариант, производное или фрагмент, каркасную молекулу со сконструированными вариабельными поверхностями; рецептор или фермент, к дифференциально-экспрессирующемуся целевому лиганду.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ для идентификации субъекта с депрессией или имеющего риск развития депрессии, который имел бы положительный эффект от или ответил на режим лечения, включающий фолат-содержащее соединение, где указанный субъект идентифицируется таким, как указанно выше при условии детекции в генотипах двух локусов наличия аллеля с тимином Т в положении 677 (в гене MTHFR) и аллеля с гуанином G в положении SNP2756 (в гене MTR).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточной инженерии, и может быть использовано для определения биологической активности IFN-γ. Получают линию клеток меланомы человека PiGAS с регистрационным номером ВКПМ Н-161 путем трансфекции родительской линии клеток меланомы человека MelP плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, кодирующей репортерную конструкцию 6xGAS-Luc, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 1, включающую 6 повторов сайта связывания транскрипционного фактора STAT-1, минимального промотора SV-40 и гена люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc), а также последовательности SEQ ID NO: 2, включающую ген устойчивости Neo к селективному антибиотику G418 под контролем своего конститутивного промотора PGK-1.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН).

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ профилактики африканской чумы свиней, включающий выявление животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и перинатологии, и может быть использовано для прогнозирования неврологических нарушений у новорожденных с задержкой внутриутробного развития плода (ЗВРП).

Изобретение относится к гигиене труда и медицине и может быть использовано для обоснования биомаркеров производственно обусловленных негативных эффектов (НЭ) работников промышленных производств при воздействии вредных производственных факторов (ВПФ).

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, включающий выделение внеклеточной ДНК (вкДНК) из образца крови, полученной у беременной женщины, выбор регионов генома для проведения амплификации, приготовление геномных библиотек, картирование полученных последовательностей на референсный геном или части генома человека с определением их координат, определение значения покрытия для каждого региона генома, характеризующегося открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%, и получение регионов генома с указанной открытостью хроматина, после чего делается вывод о наличии анеуплоидий плода.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и касается способа ранней диагностики наследственной тирозинемии 1 типа (HT1). Сущность способа заключается в том, что детям первых 3-х месяцев жизни, у которых имеет место сочетание симптомокомплекса, состоящего из лихорадки неясного генеза, отеков, желтухи и диспепсического синдрома, а у детей в возрасте 4 месяцев и старше - гепато- или гепатоспленомегалии и клинических проявлений острого рахита, проводят исследование крови с оценкой уровня гемоглобина и количества эритроцитов, количества тромбоцитов, уровня АЛТ, ACT, билирубина и его фракций, уровня щелочной фосфатазы, кальция, фосфора, АФП, коагулограммы.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для диагностики наличия мутации L576P гена c-KIT в тканях меланомы. Оценку наличия мутации проводят по соотношениям значений пороговых циклов Ct в трех реакциях ПЦР в реальном времени с аллель-специфичными праймерами.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в перинатологии и неонатологии при оценке готовности новорожденного ребенка к естественному молочному вскармливанию по сроку гестации.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями, включающий детекцию точковых мутаций в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа и наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, соответственно.

Изобретение относится к области медицины, в частности к эндокринологии, и предназначено для прогнозирования эффективности терапии сахарного диабета 2 типа. Осуществляют забор периферической венозной крови и выделение ДНК.

Изобретение относится к животноводству и ветеринарии и может быть использовано при оценке воспроизводительной способности коров мясных пород. Определяют воспроизводительные качества маток крупного рогатого скота мясного направления продуктивности по элементному составу шерсти. Проводят определение концентрации химических элементов меди, йода, селена и цинка и при концентрации меди на уровне 5,51-7,57 мкг/г, йода 0,332-0,575 мкг/г, селена 0,496-0,797 мкг/г, цинка 116,0-146,0 мкг/г воспроизводительные качества телок оценивают как высокие, животные хорошо приходят в охоту и осеменяются, при концентрации меди на уровне 3,54-5,50 мкг/г, йода 0,113-0,331 мкг/г, селена 0,348-0,495 мкг/г, цинка 90,0-115,0 мкг/г воспроизводительные качества оценивают как низкие, животные плохо приходят в охоту, не осеменяются, требуют коррекции рационов по данным элементам. Способ позволяет упростить оценку воспроизводительной способности коров. 2 табл.
Наверх