Фиксатор проб для цитологических исследований
Владельцы патента RU 2630983:
Цуров Алаудин Бесланович (RU)
Занин Сергей Александрович (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России) (RU)
Туровая Алла Юрьевна (RU)
Трофименко Артем Иванович (RU)
Каде Азамат Халидович (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к цитологии, и может быть использовано при гистологических, онкологических, гематологических, патологоанатомических исследованиях. Фиксатор проб для цитологических исследований состоит из смеси, об.%: ХЧ изопропиловый спирт - 88, ЧДА диметилсульфоксид - 2, ЧДА глицерин - 10. Изобретение позволяет уменьшить время фиксации, расширить спектр исследований на фиксированных материалах, повысить безопасность при работе с реагентами и доступность компонентов входящих в состав фиксирующей жидкости, а также обеспечит высокую сохранность клеток. 2 ил., 1 табл.
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к цитологии, и может быть использовано при гистологических, онкологических, гематологических, патологоанатомических исследованиях.
В исследовательских и клинических медицинских лабораториях большинство цитологических и иммуноцитохимических исследований требует проведения фиксации биоматериала, для чего применяют фиксаторы, благодаря их использованию становится возможным изучение тонкого строения клеток и длительное хранение изучаемого материала.
Морфология любой клетки крови или костного мозга для цитологических и иммуноцитохимических исследований микропрепаратов зависит, прежде всего, от качества фиксации препарата. Для фиксации мазков крови, костного мозга, цитологических препаратов используют метанол, абсолютный этанол, жидкость Никифорова (смесь равных частей спирта и эфира), метаноловый раствор эозина-метиленового синего по Май-Грюнвальду, метаноловый раствор эозина-метиленового синего типа Лейшмана, фиксатор-краситель Райта (Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е.А. Кост, - 2-е изд. - М.: Медицина, 1975. - 393 с.; Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. Изд. Медицина, София, 1963. - 874 с., Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 2002. - 768 с.). Каждый из перечисленных фиксаторов имеет определенные недостатки: высокую специфичность фиксации, значительную токсичность, пожароопасность, высокую стоимость и низкую доступность. Ближайшим аналогом предлагаемого фиксатора является метанол.
Основными недостатками метанола являются: высокая токсичность, пожароопасность, оборот метанола строго контролируется государством, для его приобретения требуется лицензия, значительные расходы на его хранение, что повышает затраты и снижает потребительскую привлекательность метанола (Типовая отраслевая инструкция о порядке получения, перевозки, хранения, отпуска и применения метанола ИБТВ 2-001-82. Стр. 2-5).
Задачи: создание фиксирующей жидкости (фиксатора), не имеющей в своем составе метанола, этанола и других веществ, оборот которых контролируется государством, не являющейся высокотоксичной, недорогой, не требующей больших затрат на хранение и использование, при этом не уступающей в фиксирующих способностях метанолу.
Фиксатор проб для цитологических исследований, состоящий из смеси, об. %:
ХЧ изопропиловый спирт - 88
ЧДА диметилсульфоксид - 2
ЧДА глицерин – 10.
Техническим результатом изобретения является уменьшение времени фиксации, за счет того, что в состав фиксатора включен диметилсульфоксид - он облегчает поступление изопропанола в клетку и увеличивает скорость фиксации; расширение спектра исследований на фиксированных материалах, уменьшение затрат на покупку реагентов, повышение безопасности при работе с реагентами, повышение доступности компонентов входящих в состав фиксирующей жидкости, высокая сохранность клеток, т.к. у изопропанола имеется большое преимущество - он в сравнении с метанолом и этанолом, в меньшей степени повреждает антигены клетки. Данный эффект потенцируется глицерином, что позволяет расширить спектр проводимых иммуноцитохимических реакций при использовании предлагаемого фиксатора.
Основными компонентами фиксатора являются: изопропиловый спирт, диметилсульфоксид, глицерин.
Изопропиловый спирт обладает свойствами вторичных спиртов жирного ряда. Химическая формула (рациональная) изопропилового спирта: CH3СН(ОН)СН3. Это бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом, более резким по сравнению с этанолом (по этому признаку их можно отличить), t - плавления - 89,5°C, t - кипения +82,4°C, плотность 0,7851 г/см3 (при 20°C), t - вспышки 11,7°C.
Диметилсульфоксид (ДМСО) - вязкая бесцветная жидкость с характерным запахом. Химическая формула (рациональная) диметилсульфоксида: (CH3)2SО. ДМСО является важным биполярным апротонным растворителем. Благодаря своей сильной растворяющей и проникающей способности ДМСО часто используют как растворитель в химических и медико-биологических исследованиях.
Глицерин - бесцветная, вязкая, очень гигроскопичная жидкость. Химическая формула (рациональная) глицерина: CH3CH5(OH)3. Химические свойства глицерина типичны для многоатомных спиртов. Для приготовления фиксирующей жидкости необходимо развести реагенты: изопропанол, диметилсульфоксид и глицерин. Так как основным фиксирующим свойством обладает изопропанол, то его концентрация в растворе преобладает над другими реагентами и равна 88%. Концентрация диметилсульфоксида равна 2%, а глицерина составляет 10%. В необходимом количестве вначале смешивают изопропанол и диметилсульфоксид, последним добавляют глицерин. Жидкость хранят при комнатной температуре продолжительное время без существенной потери ее свойств.
Для фиксации клеток крови в качестве доказательства использовали кровь белых лабораторных крыс. Взятие крови проводили из кончика хвоста животного. После нанесения крови на предметные стекла создавали мазок крови. Проводили фиксацию подсушенных на воздухе мазков клеток в охлажденном до +4°C растворе фиксатора в течение 30 секунд, проводили отмывку от фиксатора в охлажденном до +4°C 0,9% растворе натрия хлорида в течение 1 минуты, далее 5 секунд в 0,9% растворе натрия хлорида при комнатной температуре и окунали в дистиллированную воду. Готовые мазки могут храниться довольно продолжительное время, от 1 до 3 лет, в зависимости от условий хранения.
После фиксации клеток, для подтверждения качества фиксации проводили окраску мазков крови методом Романовского-Гимзе. Полученные микропрепараты фотографировали с помощью окулярной камеры «Levenhuk 230» (США) на микроскопе Микромед-6 (Россия). Фотографии представлены ниже (см. Приложение).
Способ исследования мазков апробирован на 100 крысах в течение 3 лет. При этом задачи, поставленные в данном изобретении, решены с достоверностью p<0.05. На зафиксированных мазках предлагаемым фиксатором после окраски показано нормальное строение клеток крови крыс. Обнаруживались эритроциты и различные лейкоциты.
Апробация фиксатора проведена на мазках крови, полученных от 10 здоровых добровольцев в течение 1 года. При этом задачи, поставленные в данном изобретении, решены с достоверностью p<0.05.
Для приготовления 100 мл фиксатора взяли 88 мл ХЧ изопропилового спирта, 2 мл ЧДА диметилсульфоксида, 10 мл ЧДА глицерина. Разместили в емкость с притертой пробкой и путем взбалтывания получили готовую смесь - фиксатор для цитологических исследований.
У крысы, белой самки, массой 205 грамм, из кончика хвоста была взята капля крови. Далее шлифованным стеклом наносили небольшое количество крови на предметное стекло и получали, размазывая кровь по стеклу, мазок крови. Подсушивали мазок. Потом окунали в раствор фиксатора, охлажденного до +4°C на 30 секунд, затем проводили отмывку от фиксатора в охлажденном до +4°C 0,9% растворе натрия хлорида в течение 1 минуты, погружали на 5 секунд в 0,9% раствор натрия хлорида при комнатной температуре и споласкивали в дистиллированной воде.
Готовые мазки после подсыхания окрашивали методом Романовского-Гимзе и перед отправкой в архив заключали готовые препараты в полистирол.
Результат приведен на фиг. 1 и фиг. 2 (приложение) - мазки крови при увеличении в 100 раз. При микроскопическом исследовании мазка крови наблюдали эритроциты (1) и различные лейкоциты (2).
Фиксатор проб для цитологических исследований, состоящий из смеси, об. %:
ХЧ изопропиловый спирт - 88
ЧДА диметилсульфоксид - 2
ЧДА глицерин - 10.