Средство для ингибирования продукции стафилококками энтеротоксинов и удаления их из биологических субстратов

Изобретение относится к области медицины и предназначено для использования в клинической микробиологии. Для ингибирования продукции стафилококковых энтеротоксинов и удаления стафилококковых энтеротоксинов типов А и В из биологических субстратов применяют 18,2% раствора энтеросгеля - при содержании полиметилсилоксана полигидрата - 70 г, вода очищенная - 30 г на 100 г продукта. Использование изобретения обеспечивает эффективное ингибирование продукции стафилококковых энтеротоксинов и удаление стафилококковых энтеротоксинов типов А и В из биологических субстратов. 1 ил., 6 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и клинической микробиологии и может быть использовано для ингибирования продукции стафилококками энтеротоксинов, и удаления их из биологических субстратов.

Известно, что стафилококки продуцируют 23 иммунологически различных типа энтеротоксинов, имеющих большое значение, как факторы патогенности более 100 различных заболеваний, вызванных стафилококками. Стафилококковые энтеротоксины (СЭТ) обладают: рвотным действием; пирогенностью; способностью увеличивать токсичность эндотоксинов (липополисахаридов, продуктов грамотрицательных бактерий) в 100000 раз.

Энтеротоксины стафилококка являются суперантигенами: они способны вызвать активацию Т-лимфоцитов, обладающих определенным типом рецепторов, без предварительного формирования приобретенного иммунитета. Такая активация приводит к системному отравлению, которое в тяжелых случаях заканчивается смертью. Для этого необходимо, чтобы эти вещества проникли в кровь.

Все СЭТ являются суперантигенами и в концентрации от 1 пкг/мл до 1 мкг/мл могут вызывать активацию до 50% Т-лимфоцитов и выработку ряда интерлейкинов, которые вызывают интоксикацию и необратимое нарушение нормального функционирования разных систем организма, вплоть до летального исхода. В концентрации 100 нг СЭТ могут вызвать пищевое отравление.

Борьба со СЭТ затруднена из-за невозможности создания анатоксинов, способных индуцировать выработку антител к исходному токсину, поэтому вакцинная профилактика СЭТ не возможна или затруднена. В связи с этим основное внимание в этой области уделяется вопросам профилактики попадания энтеротоксигенных штаммов стафилококков и их энтеротоксинов в организм человека.

Известно, что СЭТ являются белками с молекулярной массой 25000-30000 дальтон, обладающими способностью выступать в качестве аллергенов и индуцировать продукцию специфических IgE. Такими свойствами обладают энтеротоксины А, В и С, эксфолиативный токсин и токсин синдрома токсического шока (ТСТШ-1) (см. Leung D.Y.M., Travers J.B., Norris D.A. The Role of Superantigen in Skin Dis-ease // J. Invest. Dermatol. 1995,105: 37-42).

Доказано, что СЭТ способны также приводить к выбросу макрофагами и клетками Лангерганса IL-1, IL-12 и TNFα, являющихся провоспалительными цитокинами, которые способны поддерживать аллергическое воспаление при АтД (Yokomizo Y., Mori Y Shimoji Y. et. al. Proliferative response and cytokine production of bovine peripheral blood mononuclear cells induced by the superantigens staphylococcal enterotoxins and toxic shock syndrome toxin-1.Vet. Med. Scientist. 1995,57 (2): 299-305).

Одним из важных аспектов борьбы с энтеротоксигенными штаммами стафилококков является поиск благоприятных физиологичных способов ингибирования роста стафилококков, ингибирование продукции стафилококковых энтеротоксинов и эффективного средства удаления СЭТ из организма больного.

Известно средство для подавления продукции энтеротоксинов у стафилококков - применение 2,0% раствора свекловичного пектина (см. патент РФ №2325168, опубл. 27.05.2008, авторы Меньшиков Д.Д., Флуер Ф.С., Прохоров В.Я., Лазарева Е.Б., Веснин A.В.). Данное средство позволяет подавлять продукцию стафилококковых энтеротоксинов, однако оно не обладает способностью удалять СЭТ из биологических субстратов.

Известен адсорбент, энтеросгель - полиметилсилоксана полигидрат (ПМСПГ) - представляющий собой полимерное гелевидное кремнийорганическое соединение (см. патент РФ №2293744, опубл. 20.02.2007, авторы Кадничанский Э.Г., Бадаев СВ., Храмов B.Г.), предназначенное для связывания в желудочно-кишечном тракте и выведения из организма токсических веществ различной природы, возбудителей заболеваний, метаболитов. Гель диспергирован в воде до частиц, размером не более 300 мкм. Препарат представляет собой суспензию и применяется внутрь. Пористая структура гелеобразующей матрицы определяет поглотительные способности по механизму молекулярной адсорбции и позволяет преимущественно поглощать среднемолекулярные токсические вещества и метаболиты (например, билирубин, продукты распада белков).

Благодаря гелевидной консистенции ПМСПГ по механизму соосаждения в геле поглощает высокомолекулярные токсические вещества (например, бактериальные токсины) и проявляет защитные свойства. При этом эластичные гелевидные частички препарата образуют слой на поверхности слизистых оболочек, что способствует регенерации слизистой оболочки ЖКТ. ПМСПГ может снижать токсическую нагрузку на естественные системы детоксикации организма и использоваться в лечении и профилактике эндотоксикоза, а также нормализует уровень эндотоксина грамотрицательных бактерий в крови. Препарат в составе комплексной терапии может применяться в лечении острых кишечных инфекций любого генеза, т.к. создает условия для восстановления микробиоценоза кишечника. При различных аллергических состояниях ПМСПГ снижает тяжесть клинических проявлений аллергии, а также применяется в качестве детоксикационного средства у взрослых и детей с раннего возраста при заболеваниях почек, осложненных и неосложненных хронической почечной недостаточностью (ХПН), заболеваниях печени, гнойно септических заболеваниях сопровождающихся выраженной интоксикацией. ПМСПГ применяют также в лечении острых и хронических интоксикаций различного происхождения, для профилактики хронических интоксикаций у работников вредных производств; отравления сильнодействующими и ядовитыми веществами, в т.ч. алкоголем, алкалоидами, солями тяжелых металлов и др.

Известные из уровня техники средства, подавляющие рост стафилококков и стафилококковых энтеротоксинов, не позволяют добиться значительных результатов в этой области.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств, для борьбы со стафилококковыми энтеротоксинами, путем создания средства, способного удалять СЭТ из биологических субстратов и подавлять рост стафилококков.

Решение указанной задачи обеспечивается тем, что в качестве средства для удаления СЭТ из биологических субстратов используют 18,2% раствор энтеросгеля.

Для изучения способности энтеросгеля ингибировать рост стафилококков, ингибировать продукцию СЭТ и удалять СЭТ типов А и В проводили исследование по его влиянию на рост стафилококков и ингибирования продукции СЭТ и способности удалять СЭТ из культуральной среды. Способность подавлять рост стафилококков и удалять СЭТ из культуральной среды исследовали с помощью модельной микробиологической системы, состоящей из штаммов стафилококков, обладающих способностью продуцировать СЭТ, питательной среды для культивирования стафилококков и энтеросгеля.

Культивирование стафилококков, продуцирующих СЭТ, проводили на специальной жидкой питательной среде с ферментативной казеиновой основой (Casman Е. Serological studies of staphilococcal Enterotoxins. Public Health Repts. 1958, 73:599- 609; Schlievert P.M., Case L.C., Strandberg K.L., et al. Superantigen profile of Staph-ylococcus aureus isolates from patients with steroid-resistant atopic dermati-tis. Clin. Infect. Dis. 2008, 46: 1562-1567).

Содержание аминного азота в среде 200 мг %. В среду добавляли 1,0% сердечно-мозговую вытяжку. Устанавливали pH среды 7,2. Затем среду разливали по 4,5 мл и стерилизовали 15 мин при 1 атмосфере и 120°C, после чего в пробирки с питательной средой вносили по 0,5 мл суточной культуры стафилококков, содержащей 10 колонеобразующих единиц (КОЕ/мл), и асептически вносили энтеросгель в конечных концентрациях в среде 1,82%, 9,09% и 18,2%. В работе использовали энтеросгель фирмы ООО «ТНК Силма».

Влияние различных концентраций геля (1,82%; 9,09%;18,2%) на рост стафилококков показано на фигуре 1, для культуры S. aureus FRI-722 и S. aureus S6 715 Н.

Выращивание проводили на шуттель-аппарате при непрерывном встряхивании 210 об/мин в течение 24 часов при 37°C. Сразу после окончания культивирования из каждой пробирки проводили разведение культуры, используя стерильный физиологический раствор с pH 7,0, и из разведений производили количественные высевы на чашки Петри с плотной питательной средой Baird-Рагкег с теллуритом калия количественным методом (Мейнелл Дж., Мейнелл Э. «Экспериментальная микробиология» Пер. с анг. - Мир, 1967. - 347 с.).

Рост микробных клеток определяли также нефелометрическим методом путем измерения оптической плотности культуры при Е_{560 нм} на спектрофотометре фирмы Unicum 1800. Контролем служили те же штаммы стафилококков, культивируемые в тех же условиях, что и опытные образцы, но без добавления энтеросгеля. Затем микробные клетки удаляли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 минут.

СЭТ в опытных и контрольных образцах определяли методом двойной диффузии в геле (Зильбер А. Реакция двойной диффузии в геле. Иммунохимический анализ. М.: Медицина, 1968: 99-117) с использованием моноспецифических антиэнтеротоксических сывороток типа А и В и иммуноферментным методом (ИФА) с использованием иммуноферментных тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В.

Авторами изобретения был проведен сравнительный анализ определения дифференцированного регуляторного воздействия энтеросгеля на способность подавления продукции СЭТ типов А и В.

В патентной и научно-технической литературе сведений о способности энтеросгеля ингибировать рост стафилококков, ингибировать продукцию СЭТ и удалять СЭТ из биологических субстратов не обнаружено.

Иммунологический способ определения СЭТ дает возможность точно установить количество продуцируемого энтеротоксина в зависимости от концентрации энтеросгеля в среде. Уникальная возможность этой модели заключается в том, что in vitro возможно тестировать специфические, индивидуальные способности энтеросгеля удалять СЭТ из культуральной среды у референс штаммов S. aureus FRI- 722 и S. aureus S6 715 Н, а также у других штаммов стафилококков, выделенных из различных источников.

Таким образом, в данном изобретении предлагается средство для ингибирования роста стафилококков, для ингибирования продукции СЭТА, СЭТВ и для удаления СЭТ типов А и В с использованием -18,2% концентрацией энтеросгеля, которая является физиологичной, и может быть использовано в медицине для борьбы со стафилококками (у ожоговых больных, у пациентов с диагнозом дисбактериоза кишечника и синдром раздраженного кишечника, при аллергических заболеваниях (атопическом дерматите и др.), заболеваниях стафилококковой этиологии при обнаружении у них энтеротоксигенных штаммов стафилококков, а также ветеринарии) и также при пищевых отравлениях стафилококковой этиологии для эффективного удаления энтеротоксинов из биологических субстратов.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример №1

Культуру S. aureus FRI- 722 (референс, продуцирующий СЭТА) и клинический изолят S. aureus выращивали в питательной среде, содержащей Энтеросгель в концентрации 1,82%, 9,09% и 18,2%. После культивирования определяли концентрацию микробных клеток в мл путем измерения оптической плотности при Е₅₆₀ нм на приборе Ultraviolet Spectrophotometer Unicam SP1800, Англия, а также определяли активность в опытных и контрольных пробах. Результаты представлены в таблице №1.

Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивании S. aureus 1,82% энтеросгеля не происходило ингибирования роста стафилококков и не происходило ингибирования продукции СЭТА и не происходило значительного удаления СЭТА из культурального фильтрата. Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивании S. aureus FRJ- 722 9,09% энтеросгеля происходило ингибирование продукции СЭТА и его удаление из культурального фильтрата. Следует отметить, что при добавлении в питательную среду при культивировании S. aureus FRI- 722 18,2% энтеросгеля происходило ингибирование роста стафилококков, ингибирование продукции энтеротоксина и удаление СЭТА из культурального фильтрата (таблица 1, фото фиг. 1 слева).

Пример №2

Исследование продукции СЭТА методом иммуноферментного анализа штаммом S. aureus FRI- 722 (референс, продуцирующий СЭТА) и клинический изолят S. aureus при выращивании их в питательной среде, содержащей различные концентрации энтеросгеля. В опытных образцах питательной среды вносили энтеросгель в концентрации 1,82%, 9,09% и 18,2%, выращивали и после культивирования определяли оптическую плотность при Е₅₆₀нм и содержание СЭТА в опытных и контрольных пробах. Результаты представлены в таблице №2.

Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивании S. aureus 18,2% энтеросгеля происходило ингибирование роста стафилококков, ингибирование продукции СЭТА и удаление СЭТА, из культурального фильтрата как референс-штамма, так и клинического штамма.

Пример №3

Исследование возможности энтеросгеля сорбировать СЭТА и удалять его из биологического материала.

При исследовании возможности энтеросгеля сорбировать и выводить СЭТА из культуральной жидкости показано, что энтеросгель обладает способностью выводить из культуральной жидкости до 50,0% СЭТ типа А. Результаты представлены в таблице №3.

Пример №4

Исследование влияния различных концентраций энтеросгеля на рост стафилококка и продукции СЭТ типа В.

Культуру S. aureus S6 715 Н, референс, продуцирующий СЭТВ выращивали в среде содержащей 1,82%, 9,09% 18,2% энтеросгеля и определяли количество КОЕ/мл и активность в опытных и контрольных пробах. Наличие в культуральной жидкости СЭТВ определяли методом двойной диффузии в геле.

Результаты представлены в таблице №4. Влияния различных концентраций геля в среде на рост стафилококков представлены на фото (фигура 1, справа). Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивании S. aureus S6 715H 1,82% энтеросгеля он не влиял на рост стафилококков, на продукцию СЭТВ и не удалял СЭТВ из культуральной среды. Показано, что при добавлении в питательную среду 18,2% концентрации энтеросгеля происходило подавление роста стафилококков, ингибирование продукции СЭТВ и сорбции энтеротоксина и, как следствие, установлено, что СЭТВ в культуральной жидкости не содержалось (результаты представлены в табл. №4).

Пример №5

Исследование влияния различных концентраций энтеросгеля на рост S. aureus штамм S6715H ингибирования продукции СЭТВ и удаление СЭТВ из культуральной среды методом иммуноферментного анализа. Показано, что при добавлении 18,2% концентрация энтеросгеля в питательную среду при культивировании S. aureus S6 715Н происходит ингибирование роста стафилококков, ингибирование продукции СЭТВ и удаление энтеротоксина типа В.

Штамм S. aureus S6715H при выращивании в питательной среде без добавления энтеросгеля образует энтеротоксин типа В, который выявляется иммуноферментным методом в разведении 1:3200 - 1:6400 (контроль), в то же время этот же штамм S. aureus S6715H, который выращивали в среде с содержанием 18,2 % энтеросгеля в культуральном фильтрате СЭТ типа В был обнаружен иммуноферментным методом всего лишь в разведении 1:10.

Таким образом, при выращивании энтеротоксигенного штамма стафилококка S. aureus S6 715H в питательной среде с содержанием 18,2% энтеросгеля происходило ингибирование роста стафилококков, ингибирование продукции СЭТВ и сорбция СЭТВ на энтеросгеле и в результате этого наличие СЭТВ в культуральном фильтрате оказалось в 320-640 раз меньше, чем в контроле.

Пример №6

Исследование сорбции СЭТ типа В из культуральных супернатантов с помощью энтеросгеля.

Нами исследована возможность энтеросгеля сорбировать и выводить из культуральных фильтратов СЭТВ. Результаты представлены на таблице №6.

Как видно из таблицы №6, энтеросгель обладает способностью сорбировать СЭТВ и удалять до 50,0% СЭТ типа В культуральной жидкости. Следует отметить, что вместе с энтеротоксином СЭТВ происходит удаление из культуральной жидкости компонентов питательной среды, а также других соединений.

Применение 18,2% раствора энтеросгеля (при содержании полиметилсилоксана полигидрата - 70 г, вода очищенная - 30 г на 100 г продукта) для ингибирования роста стафилококков, для ингибирования продукции стафилококковых энтеротоксинов и для удаления стафилококковых энтеротоксинов типов А и В из биологических субстратов.