Порошок природного биокомпозита, получаемый из биомассы pichia pastoris, способ его получения и применения в качестве эксципиента

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности и раскрывает порошок природного биокомпозита. Биокомпозитный порошок содержит 20-95% (мас./мас.) комплекс хитин-глюкан (CGC) и до 50% полисахаридов, содержащих маннозу, экстрагируемых из биомассы дрожжей Pichia pastoris, где размер частиц биокомпозитного порошка находится в диапазоне от 5 до 1500 мкм, и где кажущаяся объемная плотность биокомпозитного порошка составляет от 0,05 до 1,0 г/см³. Также предложено применение указанного биокомпозитного порошка в качестве эксципиента в фармацевтической, косметической или пищевой промышленностях. Группа изобретений позволяет получить уникальную добавку, которую можно использовать в качестве многофункционального эксципиента в фармацевтической промышленности (в качестве связующего средства, дезинтегранта и/или смазочного средства). 7 н. и 45 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 7 пр.

 

На всем протяжении настоящего описания приведены ссылки на различные публикации, включая приведенные ссылки в скобках. Список полных ссылок на публикации, на которые приведены ссылки в скобках, можно найти в конце описания, непосредственно предшествующего формуле изобретения. Таким образом, описания всех публикаций, на которые приведены ссылки, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки для более полного описания существующего уровня техники, к которой относится настоящее изобретение.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к порошку природного биокомпозита, получаемому из биомассы дрожжей Pichia pastoris, содержащей комплекс хитин-глюкан (CGC) и полисахариды, содержащие маннозу, к способу получения порошка природного биокомпозита, способу получения биомассы Pichia pastoris с повышенным содержанием CGC и повышенным содержанием хитина и глюкана в CGC, и к использованию порошка природного биокомпозита в качестве эксципиента в фармацевтической, косметической или пищевой промышленностях. Согласно способу по изобретению получаемый порошок природного биокомпозита обеспечивает значительные преимущества в качестве уникальной добавки, которую можно использовать в качестве многофункционального эксципиента в фармацевтической промышленности (в качестве связывающего средства, дезинтегранта и/или смазочного средства).

Уровень техники, предшествующий изобретению

Стенка дрожжевой клетки представляет собой сложную сеть различных макромолекул, где полисахариды представляют основную фракцию, составляющую более 50% сухой массы клеток. Содержащие маннозу и глюкозу полисахариды являются основными компонентами стенки дрожжевой клетки с более низкими количествами хитина, который, как правило, содержится в форме комплекса хитин-глюкан. Комплекс хитин-глюкан (CGC) состоит из хитина (полимера из звеньев N-ацетилглюкозамина), ковалентно связанного с β-1,3-глюканами (полимером из звеньев глюкозы). Такой сополимер имеет важную структурную функцию в дрожжевой клетке и является нерастворимым в воде. Содержащие маннозу и глюкозу полисахариды включают маннаны (полимер из звеньев маннозы), глюканы (полимер из звеньев глюкозы), глюкоманнаны (полимер из звеньев маннозы и глюкозы) и/или галактоманнаны (полимер из звеньев маннозы и галактозы).

Благодаря их композиции стенка дрожжевой клетки представляет собой ценный источник различных типов полисахаридов, включая маннаны, глюкоманнаны, галактоманнаны, глюканы, хитин и комплекс хитин-глюкан. Полисахариды с аналогичной композицией также можно экстрагировать из водорослей, растений или животных, такие как, например, каррагенан, гуаровая камедь и хитин. Однако экстракция полисахаридов из таких высших организмов (водоросли, растения или животные) вызывает множество затруднений: они зависят от сезонной продукции с крайне изменчивым качеством и количеством, что приводи к тому, что способ получения становится, в частности, невоспроизводимым. В случае экстракции хитина из ракообразных получаемые продукты могут содержать токсины или аллергены, которые делают их непригодными для применения для человека. С другой стороны, экстракция из дрожжей, культивируемых в контролируемых условиях, является значительно более надежным, воспроизводимым и безопасным.

Недавно в патенте США 7556946 и патентной заявке US 2010/0221382, US 2010/0003292 и WO 2010/013174 описаны способы получения производные клеточной стенки из грибной или дрожжевой биомассы с получением хитиновых полимеров или хитин-глюкановых полимеров.

Однако способы направлены на получение в основном полимеров с высоким содержанием хитина и хитозана, не пользуясь преимуществом содержания других полисахаридов, таких как маннаны, глюкоманнаны и галактоманнаны.

С другой стороны, в других документах, таких как, например, патент США 6444448 и патентные заявки EP 2272876 и WO 2010/070207, описаны способы получения глюканов и маннанов из различных природных источников, включая бактерии, грибы, дрожжи и растения. Такие способы основаны на ферментативной (EP 2272876) или аутолитической (US 6444448) обработках, или на сочетании кислотных и щелочных обработок (2010/070207).

Эксципиенты представляют собой ингредиенты, используемые в фармацевтической промышленности для формулирования активных ингредиентов в конечные лекарственные формы. Состав активных фармацевтических ингредиентов (API) с эксципиентами является основным для обеспечения эффективной доставки лекарственного средства с желаемыми свойствами, наряду с надежным способом получения. В основном, эксципиенты используют для обеспечения матрицы, в которой можно обрабатывать лекарственное средство для контроля скорости дозирования, для облегчения обработки системы доставки лекарственного средства во время его производства и для способствования идентификации продукта, защите, поддержанию или повышению стабильности, биодоступности или переносимости пациентом, и для увеличения любой другой характеристики общей безопасности, эффективности или доставки лекарственного средства во время хранения или использования.

Основные категории эксципиентов представляют собой связывающие средства и наполнители, дезинтегранты, разбавители, смазочные средства и способствующие скольжению средства, консерванты и антиоксиданты. Содержащиеся в диапазоне от 15% до 99% от общей массы данного лекарственного средства, эксципиенты являются крайне важными для способа получения лекарственного средства, в отношении заготовки, логистики, контроля качества и способа продукции. Таким образом, эксципиенты должны быть способны обеспечивать преимущества высокой функциональности для разработчика, такие как увеличенный смазочные свойства, улучшенная текучесть, повышенная прессуемость и совместимость, улучшенные характеристики продукта и воспроизводимый способ получения.

В качестве примера, получение таблетированных лекарственных форм с приемлемыми физико-химическими свойствами включают использование наполнителей, связывающих средств, способствующих скольжению средств и смазочных средств, указанных выше. Для прессования в таблетки такие вещества должны обладать конкретными физическими свойствами, а именно, они должны быть свободнотекучими, когезивными и смазанными. Кроме того, для высвобождения активного фармацевтического ингредиента дезинтегрант добавляют для облегчения разрушения твердой лекарственной формы.

Хотя традиционные компоненты таблеток обладают общепризнанной эффективностью, некоторые из них имеют недостатки, которые связаны с их стоимостью, умеренной эффективностью и часто трудоемким получением эксципиентов. Таким образом, существует необходимость в новых составах эксципиентов, которые устраняют эти недостатки. Одним из больших преимуществ является возможность использования высоко функционального эксципиента, который объединяет в себе свойства различных традиционных компонентов эксципиентов, таким образом, делая способ получения проще и быстрее.

В настоящее время наиболее традиционные эксципиенты синтезируют или химически модифицируют с использованием природных молекул в качестве начальных точек. Производные целлюлозы или крахмала, синтетические полимеры и спирты представляют собой только несколько примеров, которые специалист в данной области легко идентифицирует. Использование полностью природных эксципиентов в фармацевтической промышленности остается ограниченным. Однако эти природные эксципиенты обладают преимуществом, которое заключается в том, что они являются безопасными, нетоксичными, биосовместимыми и биоразлагаемыми. Ввиду этого природные полисахариды можно использовать для разработки универсальных эксципиентов с улучшенными свойствами. Их можно экстрагировать из различных источников, таких как растения, животные или даже микроорганизмы.

Среди природных полисахаридов, появляющихся в настоящее время в качестве эксципиентов, специалисты в данной области идентифицируют полимеры, такие как гуаровая камедь или каррагенаны. Гуаровая камедь, используемая в качестве загустителя для лосьонов и кремов, в качестве связывающего средства таблеток или в качестве стабилизатора эмульсии, представляет собой галактоманнан (полимер из звеньев галактозы и маннозы), который существует в виде прочного полисахарида в эндосперме семян некоторых растений. Каррагенаны являются тривиальным названием семейства высокомолекулярных сульфатированных полисахаридов, получаемых из определенных видов красных морских водорослей, подходящих дл производства таблеток.

Общее описание изобретения

Настоящее изобретение относится к порошку природного биокомпозита, получаемому из клеточной стенки дрожжей Pichia pastoris, содержащей комплекс хитин-глюкан и содержащей полисахариды маннозы.

Настоящее изобретение также относится к применению такого порошка природного биокомпозита, получаемому из клеточной стенки дрожжей Pichia pastoris способом по изобретению, в качестве эксципиентов для фармацевтической промышленности.

Кроме того, изобретение относится к способу получения порошка природного биокомпозита по изобретению, который включает процедуру получения биомассы P. pastoris, экстракцию полисахаридов из биомассы P. pastoris, что приводит к получению порошка природного биокомпозита по настоящему изобретению, а также процедуры сушки и измельчения порошка природного биокомпозита с получением желаемого порошка.

В соответствии со способом по изобретению количество CGC и содержащих маннозу полисахаридов в порошке природного биокомпозита регулируют путем контроля условий процедур экстракции порошка природного биокомпозита из клеточной стенки P. pastoris. Физические свойства порошка природного биокомпозита, а именно объемная плотность, распределение размера частиц и влажность изменяют путем регуляции условий сушки и измельчения порошка природного биокомпозита.

Изобретение также относится к условиям культивирования для получения биомассы P. pastoris с конкретным содержанием CGC, а также конкретным отношением хитина к глюкану.

Аспекты настоящего изобретения относятся к биокомпозитному порошку, содержащему 20-95% (масс./масс.) комплекса хитин-глюкан (CGC), предпочтительно 40-90% (масс./масс.) и до 50% полисахаридов, содержащих маннозу, предпочтительно до 25% (масс./масс.), экстрагируемых из биомассы дрожжей Pichia pastoris, где размер частиц биокомпозитного порошка находится в диапазоне от 5 до 1500 мкм, предпочтительно от 30 до 400 мкм и где кажущаяся объемная плотность биокомпозитного порошка составляет от 0,05 до 1,0 г/см³, предпочтительно от 0,5 до 1,0 г/см³.

Аспекты настоящего изобретения относятся к способу получения биокомпозитного порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris по настоящему изобретению, характеризующемуся следующими ниже последовательными этапами:

a) приведения биомасса P. pastoris в контакт с щелочным водным раствором (NaOH, KOH, Ca(OH)₂, Na₂CO₃, K₂CO₃, CaCO₃, NaHCO₃ или KHCO₃, предпочтительно NaOH или NaHCO₃) в концентрации от 0,5 до 5,0 M, где биомасса находится в форме суспензии, предпочтительно в концентрация от 10 до 15% (масс./об.);

b) перемешивания щелочной суспензии биомассы при температуре в диапазоне 60-90°C в течение периода 1-5 часов с получением реакционной смеси;

c) охлаждения реакционной смеси до температуры от 30 до 45°C и после охлаждения отделения щелочной нерастворимой фракции в реакционной смеси от растворимой фракции центрифугированием или фильтрованием;

d) промывания щелочной нерастворимой фракции одним или несколькими из следующих смесей растворителей с получением взвеси:

i. воды,

ii. водного физиологического раствора, такого как, например, раствор фосфатно-солевого буфера (PBS) (20,45 г/л NaCl; 0,46 г/л KCL; 10,14 г/л Na₂HPO₄. 7H₂0; 0,54 г/л KH₂PO₄, pH 7,2),

iii. этанола (70%, об./об.) или

iv. водного раствора кислоты, такой как, например, соляная кислота (HCl);

e) сушки взвеси одним из следующих способов:

i. замораживанием жидким азотом с последующей лиофилизацией;

ii. сушкой в печи при температуре от 60 до 80°C в течение 12-18 часов;

iii. сушкой распылением при температуре от 120 до 200°C в течение периода времени от 1 до 10 секунд, предпочтительно при температуре от 130 до 150°C, или

iv. сушкой в псевдоожиженном слое при температуре входящего воздуха от 70°C до 90°C;

f) измельчения высушенного вещества с получением порошка посредством его пропускания один или несколько раз через измельчающую мельницу, конусную мельницу, шаровую мельницу, многовалковую мельницу или роликовый пресс, оснащенный ситами в диапазоне от 0,25 до 10 мм на выходе, работающий со скоростями ротора от 500 до 5000 об/мин, и

g) калибровки порошка посредством его пропускания один или несколько раз через вибрационную и вращающуюся решетчатую мельницу, оснащенную ситами в диапазоне от 0,05 до 1,5 мм.

Описание чертежей

Фигура 1 - Сканы DSC биокомпозитных порошков с высоким содержанием маннозы (сплошная линия) и с низким содержанием маннозы (пунктирная линия), получаемых из биомассы P. pastoris.

Подробное описание изобретения

Аспекты настоящего изобретения относятся к биокомпозитному порошку, содержащему 20-95% или приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% (масс./масс.) комплекса хитин-глюкан (CGC), предпочтительно 40-90% (масс./масс.) и приблизительно до 50% полисахаридов, содержащих маннозу, предпочтительно приблизительно до 25, 30, 35, 40 или 45% (масс./масс.), экстрагированного из биомассы дрожжей Pichia pastoris, где размер частиц биокомпозитного порошка находится в диапазоне от 5 до 1500 мкм, предпочтительно от 30 до 400 мкм или приблизительно 50, 100, 150, 200, 250, 300 или 350 мкм, и где кажущаяся объемная плотность биокомпозитного порошка составляет от 0,05 до 1,0 г/см³, предпочтительно от 0,5 до 1,0 г/см³ или приблизительно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 г/см³.

В некоторых вариантах осуществления гранулометрическое распределение биокомпозитного порошка является таким, что приблизительно 90% частиц имеют размер менее 355 мкм, приблизительно 50% имеют размер менее 250 мкм, и менее чем приблизительно 10% имеют размер менее 90 мкм.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет от 15 до 90 (моль.%), предпочтительно более 15 до 85 (моль.%), более предпочтительно более 50 до 50 (моль.%).

Аспекты настоящего изобретения относятся к способу получения биокомпозитного порошка, содержащему полисахариды, экстрагированные из биомассы дрожжей Pichia pastoris по настоящему изобретению, характеризующемуся следующими ниже последовательными этапами:

a) приведения биомассы P. pastoris в контакт с щелочным водным раствором в концентрации от 0,5 до 5,0 M или приблизительно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 или 5,0 M, где биомасса находится в форме суспензии предпочтительно в концентрации от 10 до 15% или приблизительно 11, 12, 13, 14 или 15 (масс./об.);

b) перемешивания щелочной суспензии биомассы при температуре приблизительно 60-90°C в течение периода приблизительно от 1-5 часов с получением реакционной смеси;

c) охлаждения реакционной смеси до температуры приблизительно от 30 и 45°C и после охлаждения отделения щелочной нерастворимой фракции в реакционной смеси от растворимой фракции центрифугированием или фильтрованием;

d) промывания щелочной нерастворимой фракции одним или несколькими из следующих смесей растворителей с получением взвеси:

i. воды,

ii. водного физиологического раствора,

iii. этанола (приблизительно 70%, об./об.) или

iv. водного раствора кислоты;

e) сушки взвеси одним из следующих ниже способов:

i. замораживанием жидким азотом с последующей лиофилизацией;

ii. сушкой в печи при температуре приблизительно от 60 и 80°C в течение приблизительно 12-18 часов;

iii. сушкой распылением при температуре приблизительно от 120 и 200°C или приблизительно 130, 140, 150, 160, 170, 180 или 190 °C в течение периода времени приблизительно от 1 и 10 секунд, или

iv. сушкой в псевдоожиженном слое при температуре входящего воздуха приблизительно от 70°C и 90°C;

f) измельчения высушенного вещества с получением порошка посредством его пропускания один или несколько раз через измельчающую мельницу, конусную мельницу, шаровую мельницу, многовалковую мельницу или роликовый пресс, оснащенный ситами в диапазоне приблизительно от 0,25 до 10 мм на выходе, работающий со скоростями ротора приблизительно от 500 и 5000 об/мин или приблизительно 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000 или 5000 об/мин, и

g) калибровки порошка посредством его пропускания один или несколько раз через вибрационную и вращающуюся решетчатую мельницу, оснащенную ситами в диапазоне от 0,05 до 1,5 мм.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC приблизительно до 15% (масс./масс.) культивированием в стандартной основной питательной среде (BSM) с добавлением глицерина, сорбита, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода в концентрации от 30 до 60 г/л, предпочтительно приблизительно от 40 и 50 г/л в периодическом, периодическом с подпиткой или непрерывном режиме при регулируемой температуре приблизительно при 28-32°C, регулируемом pH приблизительно при 4,5-5,5 и регулируемой концентрации растворенного кислорода (DO) более приблизительно 10, 20, 30, 40 или 50%, предпочтительно более приблизительно 30%, более предпочтительно более приблизительно 50%.

В некоторых вариантах осуществления биомассу Pichia pastoris получают с содержанием CGC более приблизительно 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением глицерина, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода в концентрациях приблизительно от 60 до 180 г/л, предпочтительно приблизительно от 80 до 120 г/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC выше приблизительно 15% (масс./масс.) культивированием без регуляции температуры.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC выше 15% (масс./масс.) культивированием при регулируемой температуре приблизительно при 28-32°C до тех пор пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая температуру приблизительно на 5-20°C, предпочтительно приблизительно на 10-15°C, в течение приблизительно 2-48 часов, предпочтительно в течение приблизительно 6-24 часов.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC выше приблизительно 15% (масс./масс.) культивированием без регуляции pH.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC выше приблизительно 15% (масс./масс.) культивированием при регулируемом pH приблизительно при 3,5-6,5 или приблизительно 3,5, 4,0, 5,0, 5,5, 6,0 или 6,5 до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая pH приблизительно на 1,0-3,0, предпочтительно приблизительно на 2,0-3,0 в течение периода или более приблизительно 2-48 часов или 6, 12, 18, 24, 36 или 48 часов, предпочтительно в течение периода или более 6-24 часов.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC выше приблизительно 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет приблизительно до 100 ммоль/л, предпочтительно приблизительно 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC выше приблизительно 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации приблизительно до 100 ммоль/л, предпочтительно приблизительно 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC выше приблизительно 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением поверхностно-активного вещества, такого как SDS, Triton X100 или PEG, в концентрации приблизительно до 1,0% (масс./об.), предпочтительно приблизительно от 0,01 до 0,1% (масс./об.).

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC выше приблизительно 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением кальция, кобальта, меди, железа, магния и/или марганца в форме хлоридных, сульфатных и/или фосфатных солей в концентрациях приблизительно от 1 до 200 ммоль/л или приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 ммоль/л, предпочтительно приблизительно от 5 до 50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более приблизительно от 15 до 85 (моль.%), предпочтительно более приблизительно от 50 до 50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения, в качестве источников углерода в концентрациях приблизительно от 40 и 180 г/л или приблизительно 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160 или 180 г/л, предпочтительно приблизительно от 60 и 120 г/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более приблизительно от 15 до 85 (моль.%), предпочтительно более приблизительно от 50 до 50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM приблизительно до 100 ммоль/л или приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 ммоль/л, предпочтительно 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более приблизительно от 15 до 85 (моль.%), предпочтительно более приблизительно от 50 до 50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации приблизительно до 100 ммоль/л или приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 ммоль/л, предпочтительно приблизительно 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более приблизительно от 15 до 85 (моль.%), предпочтительно более от 50 до 50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris с pH выше приблизительно 6,5.

В некоторых вариантах осуществления биомассу Pichia pastoris получают в качестве побочного продукта фармацевтической промышленности.

Аспекты настоящего изобретения относятся к биокомпозитному порошку, содержащему 20-95% (масс./масс.) комплекса хитин-глюкан (CGC) и до 50% полисахаридов, содержащих маннозу, экстрагируемому из биомассы дрожжей Pichia pastoris, где размер частиц биокомпозитного порошка находится в диапазоне от 5 до 1500 мкм, и где кажущаяся объемная плотность биокомпозитного порошка составляет от 0,05 до 1,0 г/см³.

В некоторых вариантах осуществления биокомпозитный порошок содержит до 25% (масс./масс.) полисахаридов, содержащих маннозу.

В некоторых вариантах осуществления размер частиц композитного порошка находится в диапазоне от 30 до 400 мкм.

В некоторых вариантах осуществления кажущаяся объемная плотность биокомпозитного порошка составляет от 0,5 до 1,0 г/см³.

В некоторых вариантах осуществления гранулометрическое распределение частиц биокомпозитного порошка является таким, что 90% частиц имеют размер менее 355 мкм, 50% имеют размер менее 250 мкм и менее 10% имеют размер менее 90 мкм.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет от 15 до 90 (моль.%).

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC является выше, чем от 15 до 85 (моль.%)

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC является выше, чем от 50 до 50 (моль.%).

Аспекты настоящего изобретения относятся к способу получения биокомпозитного порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris по настоящему изобретению, характеризующемуся следующими ниже последовательными этапами:

a) приведения биомассы P. pastoris в контакт с щелочным водным раствором в концентрации от 0,5 до 5,0 M, где биомасса находится в форме суспензии предпочтительно в концентрации от 10 до 15% (масс./об.);

b) перемешивания щелочной суспензии биомассы при температуре приблизительно 60-90°C в течение периода 1-5 часов с получением реакционной смеси;

c) охлаждения реакционной смеси до температуры от 30 до 45°C и после охлаждения отделения щелочной нерастворимой фракции в реакционной смеси от растворимой фракции центрифугированием или фильтрованием;

d) промывания щелочной нерастворимой фракции одним или несколькими из следующих смесей растворителей с получением взвеси:

i. воды,

ii. водного физиологического раствора,

iii. этанола (70%, об./об.) или

iv. водного раствора кислоты;

e) сушки взвеси одним из следующих ниже способов:

v. замораживанием жидким азотом с последующей лиофилизацией;

vi. сушкой в печи при температуре от 60 до 80°C в течение 12-18 часов;

vii. сушкой распылением при температуре от 120 до 200°C в течение периода времени от 1 до 10 секунд или

viii. сушкой в псевдоожиженном слое при температуре входящего воздуха от 70°C до 90°C;

f) измельчения высушенного вещества с получением порошка посредством его пропускания один или несколько раз через измельчающую мельницу, конусную мельницу, шаровую мельницу, многовалковую мельницу или роликовый пресс, оснащенный ситами в диапазоне от 0,25 до 10 мм на выходе, работающий со скоростями ротора от 500 до 5000 об/мин, и

g) калибровки порошка посредством его пропускания один или несколько раз через вибрационную и вращающуюся решетчатую мельницу, оснащенную ситами в диапазоне от 0,05 до 1,5 мм.

В некоторых вариантах осуществления водный щелочной раствор представляет собой NaOH, KOH, Ca(OH)₂, Na₂CO₃, K₂CO₃, CaCO₃, NaHCO₃ или KHCO₃.

В некоторых вариантах осуществления водный щелочной раствор представляет собой NaOH или NaHCO₃.

В некоторых вариантах осуществления водный раствор на этапе d) ii) представляет собой раствор фосфатно-солевого буфера (PBS) (20,45 г/л NaCl; 0,46 г/л KCl; 10,14 г/л Na₂HPO₄⋅7H₂O; 0,54 г/л KH₂PO₄, pH 7,2).

В некоторых вариантах осуществления водный раствор кислоты на этапе d) iv) представляет собой водный раствор соляной кислоты (HCl).

В некоторых вариантах осуществления сушку распылением проводят при температуре от 130 до 150°C.

В некоторых вариантах осуществления биомассу Pichia pastoris получают с содержанием CGC до 15% (масс./масс.) культивированием в стандартной основной питательной среде (BSM) с добавлением глицерина, сорбита, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрации от 30 до 60 г/л, в периодическом, периодическом с подпиткой или непрерывном режиме, где температуру регулируют, чтобы она составляла 28-32°C, pH регулируют, чтобы он составлял 4,5-5,5, и регулируют концентрацию растворенного кислорода (DO), чтобы она составляла более 10%.

В некоторых вариантах осуществления концентрацию растворенного кислорода (DO) регулируют, чтобы она составляла более 30%.

В некоторых вариантах осуществления концентрацию растворенного кислорода (DO) регулируют, чтобы она составляла более 50%.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC до 15% (масс./масс.) культивированием в стандартной основной питательной среде (BSM) с добавлением глицерина, сорбита, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрации от 40 до 50 г/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением глицерина, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 60 до 180 г/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением глицерина глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 80 до 120 г/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием без регуляции температуры.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием с регулируемой температурой при 28-32°C до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая температуру на 5-20°C в течение 2-48 часов.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием с регулируемой температурой при 28-32°C до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая температуру на 10-15°C в течение 2-48 часов.

В некоторых вариантах осуществления, после достижения фазы стационарного роста, температуру повышают в течение 6-24 часов.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием без регуляции pH.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием с регулируемым pH при 3,5-6,5 до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая pH на 1,0-3,0 в течение 2-48 часов.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием с регулируемым pH при 3,5-6,5 до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая pH на 2,0-3,0, в течение 2-48 часов.

В некоторых вариантах осуществления при достижении фазы стационарного роста pH повышают в течение 6-24 часов.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет до 100 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации до 100 ммоль/л., предпочтительно 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением поверхностно-активного вещества, такого как SDS, Triton X100 или PEG, в концентрации до 1,0% (масс./об.).

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением поверхностно-активного вещества, такого как SDS, Triton X100 или PEG, в концентрации от 0,01 до 0,1% (масс./об.).

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением кальция, кобальта, меди, железа, магния и/или марганца в форме хлоридных, сульфатных и/или фосфатных солей в концентрациях от 1 до 200 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием в BSM с добавлением кальция, кобальта, меди, железа, магния и/или марганца в форме хлоридных, сульфатных и/или фосфатных солей в концентрациях от 5 до 50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 40 до 180 г/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 60 до 120 г/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 40 до 180 г/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 60 до 120 г/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет до 100 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 5-50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет до 100 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации 10-50 ммоль/л.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris с pH более 6,5.

В некоторых вариантах осуществления отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (моль.%) в результате культивирования Pichia pastoris с pH более 6,5.

В некоторых вариантах осуществления биомассу Pichia pastoris получают в качестве побочного продукта фармацевтической промышленности.

Аспекты настоящего изобретения относятся к использованию биокомпозитного порошка, содержащего CGC и полисахариды, содержащие маннозу, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по настоящему изобретению в качестве фармацевтического эксципиента.

Аспекты настоящего изобретения относятся к использованию порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по настоящему изобретению в качестве косметического эксципиента.

Аспекты настоящего изобретения относятся к использованию порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по настоящему изобретению в фармацевтических составах.

Аспекты настоящего изобретения относятся к использованию порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по настоящему изобретению в косметических составах.

Аспекты настоящего изобретения относятся к использованию порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по вариантам осуществления настоящего изобретения в пищевых составах.

Каждый вариант осуществления в настоящем описании рассматривается как применимый к каждому из других раскрытых вариантов осуществления. Таким образом, в объем изобретения входят все сочетания различных элементов, описываемых в настоящем описании.

Следует понимать, что когда приводят диапазон параметров, также приводят все целые числа в диапазоне и их десятичные дроби по изобретению. Например, "0,2-5 мг/кг/сутки" представляет собой описание 0,2 мг/кг/сутки, 0,3 мг/кг/сутки, 0,4 мг/кг/сутки, 0,5 мг/кг/сутки, 0,6 мг/кг/сутки и т.д. до 5,0 мг/кг/сутки.

Как используют в настоящем описании, "приблизительно" в отношении числового значения или диапазона означает ±10% числового значения или диапазона, приведенного или заявленного, если из контекста не следует более ограниченный диапазон.

1. Характеризация порошка природного биокомпозита

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к порошку природного биокомпозита, получаемому из клеточной стенки дрожжей Pichia pastoris, содержащему 20-95% (масс./масс.) CGC, предпочтительно 40-90% (масс./масс.) и до 50% (масс./масс.) полисахаридов, содержащих маннозу, предпочтительно до 25% (масс./масс.), с размерами частиц в диапазоне от 5 до 1500 мкм, предпочтительно от 30 до 400 мкм, кажущейся объемной плотностью от 0,05 до 1,0 г/см³, предпочтительно от 0,5 до 1,0 г/см³, и коэффициентом сферичности в диапазоне от 0,20 до 0,95.

Гранулометрическое распределение биокомпозитного порошка предпочтительно является таким, что 90% частиц имеют размер менее 355 мкм, 50% имеют размер менее 250 мкм и менее 10% имеют размер менее 90 мкм.

Биокомпозитный порошок содержит CGC, где отношение хитина к глюкану составляет от 15 до 90 (моль.%), предпочтительно более 15-85 (моль.%), более предпочтительно более 50-50 (моль.%).

Физические и химические свойства порошка природного биокомпозита можно регулировать контролируемым образом посредством изменения рабочих параметров одной или нескольких процедур способа по изобретению, а именно процедур получения биомассы P. pastoris, экстракции биокомпозита из клеточной стенки P. pastoris и сушки и измельчения природного биокомпозита.

2. Способ получения порошка природного биокомпозита из биомассы Pichia pastoris

2.1. Процедура получения биомассы Pichia pastoris с содержанием CGC до 15% (масс./масс.)

Получают биомассу P. pastoris с содержанием CGC до 15% (масс./масс.) культивированием на стандартной основной солевой питательной среде (BSM) (Pichia Fermentation Process Guidelines, Invitrogen) с добавлением подходящего источника углерода в концентрации от 30 до 60 г/л, предпочтительно от 40 до 50 г/л. Подходящие источники углерода для получения больших концентраций биомассы P. pastoris включают глицерин, метанол и глюкозу, вещества с большим содержанием таких соединений (например, сырную сыворотку, мелассу тростникового сахара, лигноцеллюлозные гидролизаты, побочные продукты глицерина биодизельной промышленности и т.д.) или их смесей. Другие подходящие источники углерода для получения биомассы P. pastoris включают сорбит, фруктозу, галактозу, ксилозу, сахарозу и лактозу, а также вещества с высоким содержанием таких соединений или их смесей.

Культивирование P. pastoris проводят в периодическом, периодическом с подпиткой или непрерывном режиме при регулируемой температуре при 28-32°C, регулируемом pH при 4,5-5,5 и регулируемой концентрацией растворенного кислорода (DO) более 10%, предпочтительно более 30%, более предпочтительно более 50%. pH регулируют добавлением щелочного раствора, предпочтительно гидроксида аммония, который также служит в качестве источника азота для роста клеток. DO регулируют изменением скорости перемешивания от 200 до 2000 об/мин, предпочтительно от 300 до 1000 об/мин, изменением скорости потока воздуха от 0,5 до 3,0 об./об./мин (объем воздуха в объеме реактора в минуту), предпочтительно от 1,0 до 2,0 об./об./мин, насыщением чистым кислородом и/или изменением давления до 2,0 бар.

2.2. Процедуру получения биомассы Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.)

В одном из вариантов осуществления получают биомассу P. pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.) культивированием на BSM с добавлением глицерина, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источника углерода, в концентрации от 60 до 180 г/л, предпочтительно от 80 до 120 г/л.

По изобретению температуру культивирования используют для получения биомассы P. pastoris с содержанием CGC более 15% (масс./масс.). Высокие удельные скорости роста клеток (>0,15 час^-1) получают выращиванием P. pastoris при температуре, регулируемой при 28-32°C. Вне этого диапазона температур (15-28°C или 32-50°C) конкретная скорость роста клеток является ниже (<0,15 час^-1), и происходят изменения содержания CGC биомассы.

Альтернативно, P. pastoris культивируют при регулируемой температуре при 28-37°C до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышают температуру на 5-20°C, предпочтительно на 10-15°C, и поддерживают культуру при этой температуре в течение периода времени от 2 до 48 часов, предпочтительно от 6 до 24 часов. Таким образом, применяемый к культуре тепловой шок вызывает изменения содержания CGC биомассы P. pastoris.

Альтернативно, P. pastoris культивируют без регуляции температуры. Во время экспоненциального роста клеток температура постепенно повышается, таким образом, таким образом, подвергая культуру увеличивающимся значениям температуры, которые, таким образом, вызывают изменения содержания CGC биомассы P. pastoris.

Согласно изобретению pH во время культивирования P. pastoris также используют для регуляции содержания CGC биомассы P. pastoris. Высокие удельные скорости роста клеток (>0,15 час^-1) получают выращиванием P. pastoris при pH, регулируемом при 4,5-5,5. Вне этого диапазона pH (2,0-3,5 или 6,5-10,0) удельная скорость роста клеток является ниже (<0,15 час^-1), и индуцируются изменения содержания CGC биомассы.

Альтернативно, P. pastoris культивируют при регулируемом pH при 4,5-5,5 до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышают или понижают pH на 1,0-3,0, предпочтительно на 2,0-3,0, и поддерживают культуру при таком pH в течение периода времени от 2 до 48 часов, предпочтительно от 6 до 24 часов. Таким образом, применяемый к культуре щелочной или кислотный шок вызывает изменения содержания CGC биомассы P. pastoris.

Альтернативно, P. pastoris культивируют без регуляции pH. Во время экспоненциального роста клеток постепенно понижают pH, таким образом, подвергая культуру кислой среде, что, таким образом, вызывает изменения содержания CGC биомассы P. pastoris.

Регуляцию содержания CGC биомассы P. pastoris, культивируемой в BSM с подходящим источником углерода, дополнительно обеспечивают добавлением культуральной среды с глюкозамином в концентрации до 100 ммоль/л, предпочтительно 10-50 ммоль/л. Наличие глюкозамин стимулирует накопление хитина в клеточной стенке дрожжей, таким образом, обогащая биомассу CGC. Предпочтительно добавлять глюкозамин к культуральной среде во время фазы экспоненциального роста клеток.

Регуляцию содержания CGC биомассы P. pastoris, культивируемой в BSM с подходящим источником углерода, дополнительно обеспечивают добавлением культуральной среды с кофеином в концентрации до 100 ммоль/л, предпочтительно 10-50 ммоль/л. Наличие кофеина влияет на рост клеток P. pastoris и вызывает повреждения клеточной стенки. Таким образом, в качестве защитного механизма против содержания кофеина P. pastoris увеличивает количество хитина в клеточной стенке, таким образом, обогащая биомассу CGC. Кофеин можно добавлять к культуральной среде во время фазы экспоненциального роста клеток или во время фазы стационарного роста. Для обеспечения достаточной продуцируемой клеточной биомассы кофеин предпочтительно добавлять к культуральной среде, когда биомасса достигла концентрации более 20 г/л, предпочтительно более 50 г/л. Альтернативно, кофеин добавляют в конце фазы экспоненциального роста или во время фазы стационарного роста.

Альтернативно, изменения содержания CGC биомассы P. pastoris, культивируемой в BSM с подходящим источником углерода, получают добавлением культуральной среды с поверхностно-активным веществом, таким как, например, додецилсульфат натрия (SDS), Triton X100 или полиэтиленгликоль (PEG), в концентрации до 1,0% (масс./об.), предпочтительно от 0,01 до 0,1% (масс./об.). В присутствии поверхностно-активного вещества P. pastoris увеличивает количество CGC в клеточной стенке в результате защитного механизма против повреждения клеточной стенки, вызываемого наличием поверхностно-активного вещества, таким образом, обогащая биомассу CGC. Поверхностно-активные вещества можно добавлять в культуральную среду во время фазы экспоненциального роста клеток или во время фазы стационарного роста. Для обеспечения достаточной продуцируемой клеточной биомассы поверхностно-активное вещество предпочтительно добавлять в культуральную среду, когда биомасса достигла концентрации выше 20 г/л, предпочтительно выше 50 г/л.

На содержание CGC биомассы P. pastoris также влияет присутствие определенных солей в концентрациях выше их общепринятых значений в BSM. Таким образом, культивирование P. pastoris в BSM с добавлением кальция, кобальта, меди, железа, магния и/или марганца в форме хлоридных, сульфатных и/или фосфатных солей в концентрациях до 200 ммоль/л, предпочтительно от 5 до 50 ммоль/л, влияет на содержание CGC биомассы P. pastoris.

2.3. Процедура получения CGC с отношением хитина к глюкану более 15-85 (моль.%)

Согласно изобретению отношение хитина к глюкану в CGC модулируют посредством условий культивирования, используемых для получения биомассы P. pastoris. Как правило, CGC, продуцируемый P. pastoris, имеет отношение хитина к глюкану до 15 до 90 (моль.%). Согласно изобретению отношение хитина к глюкану в CGC преимущественно повышают до отношений более 15-85 (моль.%), предпочтительно более 50-50 (моль.%) посредством культивирования P. pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 40 до 180 г/л, предпочтительно от 60 до 120 г/л.

Отношение хитина к глюкану в CGC также повышают до отношений более 15-85 (моль.%), предпочтительно более 50-50 (моль.%) культивированием P. pastoris в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет до 100 ммоль/л, предпочтительно 10-50 ммоль/л. Присутствие кофеина влияет на рост клеток P. pastoris и вызывает повреждение клеточной стенки. Таким образом, в качестве защитного механизма против присутствия кофеина P. pastoris увеличивает количество хитина в клеточной стенке, таким образом, увеличивая отношение хитина к глюкану в CGC. Кофеин можно добавлять к культуральной среде во время фазы экспоненциального роста клеток или во время фазы стационарного роста. Для обеспечения достаточной продуцируемой клеточной биомассы кофеин предпочтительно добавлять в культуральную среду, когда биомасса достигла концентрации выше 20 г/л, предпочтительно выше 50 г/л.

Отношение хитина к глюкану в CGC также повышают до отношений более 15-85 (моль.%), предпочтительно более 50-50 (моль.%) культивированием P. pastoris в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации до 100 ммоль/л, предпочтительно 10-50 ммоль/л. Присутствие глюкозамина стимулирует накопление хитина в клеточной стенке P. pastoris, таким образом, повышая отношение хитина к глюкану в CGC. Глюкозамин предпочтительно добавляют к культуральной среде во время фазы экспоненциального роста клеток.

Отношение хитина к глюкану в CGC также повышают до отношений более 15-85 (моль.%), предпочтительно более 50-50 (моль.%) культивированием P. pastoris при pH выше 6,5. Применяемый таким образом щелочной шок к культуре вызывает изменения отношения хитина к глюкану CGC.

2.4. Экстракция природного биокомпозита из клеточной стенки Pichia pastoris

P. pastoris представляет собой метилтрофные дрожжи, широко используемые в фармацевтической промышленности в качестве хозяина для продукции различных рекомбинантных гетерологичных белков. Таким образом, после выделения продукта такими способами, биомасса P. pastoris получают в качестве побочного продукта, который является доступным в больших количествах и при низких затратах. Таким образом, P. pastoris, получаемую в качестве побочного продукта фармацевтических способов, можно преимущественно использовать способом по изобретению для получения природного биокомпозита, как описано выше.

Порошок природного биокомпозита, получаемый из клеточной стенки дрожжей P. pastoris, содержащих 20-95% (масс./масс.) CGC, предпочтительно 40-90% (масс./масс.) и до 50% (масс./масс.), предпочтительно до 35% (масс./масс.) полисахаридов, содержащих маннозу, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет до 15-90 (моль.%), предпочтительно более 15-85 (моль.%), более предпочтительно более 50-50 (моль.%), с размером частиц в диапазоне от 5 до 1500 мкм, предпочтительно от 30 до 400 мкм, кажущимися объемными плотностями от 0,05 до 1,0 г/см³, и коэффициентом сферичности в диапазоне от 0,20 до 0,95 получают следующим ниже способом:

a) Биомассу P. pastoris приводят в контакт с щелочным водным раствором (NaOH, KOH, Ca(OH)₂, Na₂CO₃, K₂CO₃, CaCO₃, NaHCO₃ или KHCO₃, предпочтительно NaOH или NaHCO₃) в концентрации от 0,5 до 2,0 M. Содержание биомассы в суспензии составляет от 10 до 15% (масс./об.).

b) Щелочную суспензию биомассы перемешивают при температуре 60-70°C в течение 1-5 часов, предпочтительно 2 часов с получением реакционной смеси.

c) После охлаждения реакционной смеси до температуры от 30 до 45°C щелочную нерастворимую фракцию в реакционной смеси отделяют от растворимой фракции центрифугированием или фильтрованием.

d) Щелочную нерастворимую фракцию отмывают одним или несколькими из следующих смесей растворителей:

i. воды, промывания повторяют до тех пор, пока pH и электропроводность смеси не составит от 5,0 до 8,0 и менее 50 мкСм/см, соответственно;

ii. водного физиологического раствора, такого как, например, раствор фосфатно-солевого буфера (PBS) (20,45 г/л NaCl; 0,46 г/л KCl; 10,14 г/л Na₂HPO₄ 7H₂O; 0,54 г/л KH₂PO₄, pH 7,2), промывания повторяют до тех пор, пока электропроводность смеси не составит от 50 до 200 мкСм/см;

iii. этанола (70%, об./об.);

iv. водного раствора кислоты, такого как, например, соляная кислота (HCl), промывания повторяют до тех пор, пока pH смеси не составит от 5,0 до 8,0.

Такие промывания предназначены для улучшения удаления растворимых компоненты клеточной стенки в экстракте, а именно белков (промыванием водой и/или раствором PBS и/или раствором HCl), липидов (промыванием этанолом и/или раствором HCl) и солей (промыванием водой и/или раствором HCl). Соответствующий выбор типа смеси(ей) растворителя, числа проводимых промываний и последовательность, с которой их проводят, используют для регуляции содержания белков, липидов и золы биокомпозита.

Количество CGC, полисахаридов, содержащих маннозу, белков, липидов и золы в природном биокомпозите регулируют посредством регуляции условий способа получения по изобретению.

2.5. Сушка природного биокомпозита, экстрагируемого из биомассы Pichia pastoris

Природный биокомпозит, получаемый из биомассы дрожжей P. pastoris по изобретению, сушат с использованием одной из следующих ниже процедур, известных специалисту в данной области но, не ограничиваясь ими. Различное промышленное оборудование для сушки, такое как лиофилизатор, сушилка с псевдоожиженным слоем, коническая сушилка, полочная сушилка, ленточная сушилка, вакуумная полочная сушилка, барабанная сушилка, распылительная сушилка, можно использовать для получения сухого биокомпозита.

В одном из вариантов осуществления изобретения влажный биокомпозит сушат замораживанием жидким азотом с последующей лиофилизацией в течение 48 часов. Время лиофилизации зависит в основном от содержания влаги исходного вещества и регулируется таким образом, чтобы содержание влаги составляло менее 10%, предпочтительно менее 5%.

В другом варианте осуществления изобретения влажный биокомпозит сушат в воздушной сушилке при температуре от 60 до 80°C в течение 12-18 часов.

Преимущественно биокомпозит сушат распылением при температурах в диапазоне от 120 до 200°C, предпочтительно от 130 до 150°C. Одно из преимуществ сушки распылением биокомпозита заключается в получении частиц с регулируемым и однородным размером от 15 до 50 мкм, предпочтительно от 25 до 35 мкм с объемной плотностью от 0,25 до 0,95 г/см³, предпочтительно от 0,45 до 0,75 г/см³ и обладающих по существу сферической формой, облегчающей переработка для выделения и очистки конечного продукта получаемого порошок/гранул.

В зависимости от используемого способа сушки сухой природный биокомпозит получают в формах в диапазоне от пены с низкой плотностью/большим объемом до высокоплотных/спрессованных осадков, которые используют для модуляции физических свойств.

Преимущество по настоящему изобретению заключается в получении сухого биокомпозита, который можно дополнительно обрабатывать и измельчать для нужд фармацевтической промышленности в целях высокой пригодности к обработке.

2.6. Способ измельчения для получения порошка природного биокомпозита

Порошок природного биокомпозита по настоящему изобретению получают любым известным на известном уровне техники способом получения порошков или гранул, таким как грануляция в псевдоожиженном слое, грануляция с большим напряжением сдвига, сушка распылением или влажная грануляция. Предпочтительно сухой биокомпозит измельчают и гранулируют посредством любого промышленного оборудования для фрагментации и дезинтеграции, используемого для получения гранулы и известного специалистам в данной области, такого как молот, валик, нож, лезвие или диски. Грануляторы, используемые в таком способе, могут представлять собой грануляторы с низким напряжением сдвига, такие как, например, гранулятор с псевдоожиженным слоем, со средним напряжением сдвига или с большим напряжением сдвига.

В одном из вариантов осуществления изобретения природный биокомпозит, подвергаемый сушке при температурах от 40 до 100°C, измельчают, пропуская через измельчающую мельницу, оснащенную ударным ротором ножевого типа и ситами в диапазоне от 0,25 мм до 10 мм на выходе, предпочтительно ситом в диапазоне от 0,25 до 1,0 мм на выходе. Получаемое вещество обрабатывают второй раз на том же оборудовании с ситом в диапазоне от 0,25 мм до 5 мм, предпочтительно ситом в диапазоне от 0,25 мм до 0,5 мм. Получаемый гранулят пропускают через вибрационную и вращающуюся решетчатую мельницу с ситом в диапазоне от 0,0125 до 2,5 мм.

Альтернативно, сухой природный биокомпозит можно измельчать, пропуская через конусную мельницу, оснащенную конусным или V-образным ротором и ситом в диапазоне от 0,25 мм до 10 мм на выходе, предпочтительно ситом в диапазоне от 0,25 до 1,0 мм на выходе. Используемые скорости ротора могут находиться в диапазоне от 500 об/мин до 5000 об/мин.

В другом альтернативном варианте природный биокомпозит можно измельчать, пропуская через шаровую мельницу. Используемые скорости роторов могут находиться в диапазоне от 500 об/мин до 1500 об/мин.

В другом альтернативном варианте природный биокомпозит можно измельчать, пропуская через многовалковую мельницу. Используемые скорости роторов могут находиться в диапазоне от 500 об/мин до 5000 об/мин.

Другая возможность заключается в том, что природный биокомпозит, подвергнутый сушке лиофилизацией или сушке распылением, или сушке в псевдоожиженном слое, или посредством конической сушилки пропускают через роликовый пресс, также известный как Chilsonator, например, такой как Chilsonator IR520, один раз или дважды, или столько раз, сколько считается достаточным для получения представляющего интерес порошка.

В настоящем изобретении биокомпозитный порошок получают таким образом, что он имеет размер частиц в диапазоне от 5 мкм до 1500 мкм, предпочтительно от 30 до 400 мкм.

Порошок, получаемый любыми описанными выше способами, калибруют любым способом калибровки, используемым специалистом в данной области, таким как просеиванием на последовательных ситах с последующими гравиметрическими измерениями. Например, частицы можно калибровать на вибрационной и вращающейся решетчатой мельнице, оснащенной ситом в диапазоне от 0,05 мм до 1,5 мм. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 85% частиц имело размер частиц от 0,5 мкм 1500 мкм, предпочтительно в диапазоне от 200 мкм и 500 pm. Также предпочтительно, чтобы мелкодисперсные частицы (т.е. частицы с размером менее 90 мкм) являлись остаточными для облечения последующего прессования порошка в таблетки, предпочтительно менее 1%. В предпочтительном варианте осуществления 90% частиц имеет размер менее 355 мкм, 50% имеет размер менее 250 мкм и менее 10% имеет размер менее 90 мкм.

Порошок природного биокомпозита по настоящему изобретению характеризуется частицами с минимально возможной пористостью, предпочтительно менее 2,5%, которую регулируют путем регуляции параметров способа сушки, таких как скорость, время и температура сушки. Форма частиц может быть сферической или цилиндрической, или даже пластинчатой в зависимости от сочетания процедур, проводимых ранее, но конечная форма предпочтительно является сферической.

Согласно European Pharmacopeia 2.9.15 (Apparent volume) кажущаяся объемная плотность получаемых частиц находится в диапазоне 0,05-1,0 г/см³, предпочтительно в диапазоне 0,2-1,0 г/см³, более предпочтительно в диапазоне 0,5-1,0 г/см³. Кажущаяся плотность получаемого биокомпозитного порошка находится в диапазоне от 0,4 до 1,7 г/см³, предпочтительно от 0,5 до 1,5 г/см³.

Для характеризации реологических свойства порошка специалисты в данной области используют параметры, такие как угол естественного откоса, индекс Карра, отношение Хауснера и время прохождения. Одно из преимуществ настоящего изобретения заключается в получении биокомпозитного порошка, обладающего углом естественного откоса от 20 до 40°, предпочтительно от 25 до 30°.

В другом варианте осуществления индекс Карра порошка составляет от 10% до 25%, предпочтительно от 15% до 20%. Другим преимуществом изобретения является получение порошка с отношением Хауснера менее 1 и временем прохождения менее 5 сек в соответствии с классификацией в European Pharmacopoeia 2.9.36 (Powder flow).

Было установлено, что фармацевтический эксципиент по настоящему изобретению обеспечивает свойства улучшенной текучести, высокой совместимости и прессуемости, а также быстрого распада. Под лучшей текучестью подразумевают, что порошок имеет время прохождение менее 5 сек, лучше, чем микрокристаллическая целлюлоза, один из наиболее широко используемых эксципиентов, доступных на рынке. Очевидно, что это является одним из преимуществ настоящего изобретения, т.к. скорости подачи вещества являются критическими для достижения конечной цели.

Под улучшенной прессуемостью подразумевают, что необходимо использовать меньшую силу прессования для получения таблеток с приемлемой жесткостью и временем распада. Например, сила прессования 15 кН является достаточной для получения удовлетворительных таблеток с жесткостью 7 кгс с описанным биокомпозитом по изобретению.

Все публикации и другие ссылки, указанные в настоящем описании, полностью включены посредством ссылки, как, если бы было конкретно и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или ссылка включена посредством ссылки. Публикации и ссылки, цитируемые в настоящем описании, не рассматривают как являющиеся известным уровнем техники.

Это изобретение будет лучше понятно посредством ссылки на подробное описание экспериментов, которое следует ниже, но специалисты в данной области легко поймут, что подробно описанные конкретные эксперименты являются только иллюстративными для изобретения, как определено в формуле изобретения, которая следует ниже.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение биомассы Pichia pastoris в биореакторе с добавлением субстрата при культивировании с экспоненциальной подпиткой

Штамм DSM 70877 P. pastoris культивировали в стандартной основной питательной среде (BSM) (Pichia Fermentation Process Guidelines, Invitrogen) со следующим составом (на литр): H₃PO₄ 85%, 26,7 мл; CaSO₄, 0,93 г; K₂SO₄, 18,2 г; MgSO₄⋅7H₂O 14,9 г; KOH 4,13 г; противопенистое средство A (Sigma) 0,75 мл и 4,35 мл раствора микроэлементов (PTM). Раствор PTM имел следующий состав (на литр): CuSO₄⋅5H₂O 6 г; NaI 0,08 г; MnSO₄⋅H₂O 3 г; Na₂MoO₄⋅2H₂O 0,2 г; H₃BO₃ 0,02 г; CoCl₂⋅6H₂O 0,5 г; ZnCl₂ 20 г; Fe₂SO₄⋅7H₂O 65 г; биотин 0,2 г и H₂SO₄ 5 мл. Раствор PTM отдельно стерилизовали посредством фильтрации и добавляли к среде BSM после ее стерилизации при 121°C в течение 30 мин. В BSM добавляли глицерин, стерилизованный при 121°C в течение 30 мин, до получения концентрации 40 г/л. Инокулят получали инкубацией культуры в среде BSM, содержащей глицерин (40 г/л), во встряхиваемых колбах в течение 2 суток при 30°C, в инкубаторе-качалке (250 об/мин). Такой пердинокулят использовали для инокуляции 250 мл встряхиваемой колбы при 10% (об./об.), который выращивали в течение 3 суток при 30°C и 250 об/мин.

Культивирование проводили в 2 л биореакторе (BioStat B-plus, Sartorius) с начальным рабочим объемом 1,4 л. Биореактор эксплуатировали при регулируемой температуре и pH 30°C±0,1 и 5,0±10,05, соответственно. pH регулировали добавлением 25% раствора гидроксида аммония, который также служил в качестве источника азота. Концентрацию DO регулировали выше 30% посредством автоматического изменения скорости перемешивания (от 300 до 1000 об/мин) и обогащения потока воздуха чистым кислородом. Начальную периодическую фазу проводили в течение 26 часов. Режим периодической подпитки начинали, когда наблюдали уменьшение скорости потребления кислорода, посредством подачи в биореактор глицерина с добавлением 24 мл раствора PTM микроэлементов на литр глицерина с использованием экспоненциальной скорости подпитки F=F₀×e^μt, где F скорость подпитки в г/ч, F₀ начальная скорость подпитки (5,6 г/ч), и μ желаемая удельная скорость роста, 0,16 час^-1. Во время начального периодического культивирования (26 часов) клетки P. pastoris росли с максимальной удельной скоростью роста 0,17 час^-1, и получали 22 г/л биомассы при начальной концентрации глицерина 40 г/л. Это соответствует выходу 0,55 г биомассы на г глицерина, аналогично опубликованным результатам роста P. pastoris на чистом глицерине (0,55 г/г, Oliveira et al., 2005) или неочищенном глицерине (0,57 г/г, Celik et al., 2008).

Через 26 часов, когда содержание глицерина снижалось, на что указывает уменьшение скорости перемешивания (соответствующее уменьшению скорости потребления кислорода), инициировали фаза с подпиткой с экспоненциальным добавлением субстрата, приводящую к непосредственному увеличению скорости потребления кислорода. Через 41 час культивирования концентрация биомассы достигала 104 г/л. Выход биомассы незначительно повышался до 0,63 г биомассы на г потребляемого глицерина во время фазы с подпиткой (близко к 0,7 г/г, выявленной Jahic et al., 2002). Конечная концентрация клеток находилась в диапазоне результатов, получаемых другими авторами с чистым глицерином (75-120 г/л) (Chauhan et al., 1999; Oliveira et al., 2005).

Пример 2: Получение биомассы Pichia pastoris при культивировании в биореакторе с подпиткой

Штамм DSM 70877 P. pastoris культивировали в BSM с композицией, описанной в примере 1. В BSM добавляли глицерин, подвергнутый стерилизации при 121°C в течение 30 мин, до получения концентрации 60 г/л.

Инокулят получали инкубированием культуры в среде BSM, как описано в примере 1, за исключением концентрации глицерина, которая составляла 60 г/л.

Культивирование проводили в 5 л биореакторе (BioStat B-plus, Sartorius) с начальным рабочим объемом 3,0 л. Биореактор эксплуатировали при регулируемой температуре и pH 30°C±0,1 и 5,0±0,05, соответственно. pH регулировали добавлением 25% раствора гидроксида аммония, который также служил в качестве источника азота. Концентрацию DO также регулировали выше 50% путем автоматического изменения скорости перемешивания (от 300 до 2000 об/мин) и обогащения воздушного потока чистым кислородом.

Цикл периодического культивирования занимал 32 часа до тех пор, пока культура не достигала фазы стационарного роста в результате снижения содержания источника углерода. Во время фазы экспоненциального роста клетки P. pastoris росли с удельной скоростью роста 0,18 час^-1. В конце цикла получали 42 г/л биомассы при начальной концентрации глицерина 54 г/л. Это соответствует выходу продукта 0,79 г биомассы на г глицерина, что являлось выше значения, получаемого в примере 1.

Пример 3: Экстракция природного биокомпозита из биомассы Pichia pastoris с использованием щелочной обработки 1M NaOH и промывания щелочной нерастворимой фракции раствором PBS

Культуральный бульон (200 мл) P. pastoris, получаемый как описано в примере 1, центрифугировали (10000g в течение 15 минут) и удаляли супернатант. Влажный клеточный осадок обрабатывали 1M NaOH (200 мл) при 65°C в течение 2 часов. Содержание биомассы в суспензии составляло 10,4% (масс./об.) в пересчете на сухое вещество.

Реакционную смесь центрифугировали (10000g в течение 15 минут) для отделения щелочной нерастворимой фракции от щелочной растворимой фракции, которую удаляли.

Щелочную нерастворимую фракцию дважды отмывали 200 мл деионизированной воды для удаления щелочных растворимых компонентов. Затем ее последовательно подвергали двум промываниям одинаковым объемом раствора фосфатно-солевого буфера (PBS) (20,45 г/л NaCl; 0,46 г/л KCl; 10,14 г/л Na₂HPO₄ 7H₂O; 0,54 г/л KH₂PO₄, pH 7,2), чтобы улучшить элиминацию остаточных белков, и одному промыванию этанолом (70%, масс./об.) для удаления липидов. Конечное промывание депонированной водой проводили для удаления этанола и остаточных солей. Получаемый природный биокомпозит подвергали лиофилизации (48 часов).

Для определения композиции сахаров природного биокомпозита проводили две процедуры кислотного гидролиза: трифторуксусную кислоту (TFA) использовали для гидролиза полисахаридов, содержащих маннозу, и молекулу глюкан CGC, тогда как более сильная кислота (HCl) являлась необходимой для количественного определения фракции хитина в CGC. Для гидролиза TFA лиофилизированные образцы биокомпозита (~5 мг) ресуспендировали в деионизированной воде (5 мл) и добавляли 0,1 мл TFA 99%. Гидролиз проводили при 120°C в течение 2 часов. Для гидролиза HCl лиофилизированные образцы биокомпозита (~5 мг) ресуспендировали в 12н. HCl (7,5 мл). Гидролиз проводили при 120°C в течение 5 часов. Оба гидролизата использовали для количественного определения входящих в состав моносахаридов посредством жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки CarboPac PA10 (Dionex), оснащенной амперометрическим детектором. Анализ проводили при 30°C с гидроксидом натрия (4 мМ NaOH) в качестве элюента при скорости потока 0,9 мл/мин. Глюкозу (Sigma), маннозу (Sigma) и глюкозамин (Sigma) использовали в качестве стандартов, которые подвергали аналогичным процедурам гидролиза как образцы полимера.

Для определения содержания белков в биокомпозите лиофилизированные образцы подвергали гидролизу 2M NaOH (7 мг:1 мл) в герметично закрытых флаконах при 120°C в течение 15 минут. Супернатант, получаемый центрифугированием (10000g, 10 минут), использовали для анализа белков модифицированным способом Лоури. К 1 мл супернатанта (разведенного при необходимости) добавляли 1 мл аликвоту реагента щелочного сульфата меди и оставляли отстаиваться в течение 10 минут при комнатной температуре. Добавляли 3 мл аликвоту разведенного реагента Фолина-Чокальтеу и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность регистрировали при 750 нм. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (BSA, Sigma).

Содержание золы биокомпозита определяли путем подвержения лиофилизированных образцов пиролизу при температуре 550°C в течение 48 часов.

Анализы дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) лиофилизированного биокомпозита проводили с использованием калориметра Setaram (модель DSC 131, France) в защитной атмосфере газообразного азота. Точную навеску сухого вещества помещали в алюминиевую чашу и герметично запечатывали. Измерения проводили от 25 до 450°C под азотом при скорости сканирования 10°C/мин.

Природный биокомпозит, получаемый из биомассы P. pastoris описанным способом, получали в виде желтоватого порошка с содержанием воды приблизительно 6% (масс./масс.). Он содержал 23,6% сухой массы клеток. Как определено композиционным анализом, проводимым с использованием гидролизатов TFA и HCl, биокомпозит состоял из 42% (масс./масс.) CGC и 28% (масс./масс.) полисахаридов, содержащих маннозу. Содержания глюкозы (35%, масс./масс.) и глюкозамина (7%, масс./масс.) CGC соответствуют отношению хитина к глюкану от 16 до 84 (моль.%). Кроме того, также общее содержание белка биокомпозита, получаемого способом, описанным в примере, составляло 9,5% масс., а также содержание золы составляло 15,0% масс.

Анализ тепловых свойств природного биокомпозита, получаемого из P. pastoris, демонстрировал, что он характеризуется широким эндотермическим пиком приблизительно при 50-100°C, который может быть связан с испарением воды, связанной с биокомпозитом (фигура 1). Значительный эндотермический пик позволяет предположить, что биокомпозит обладает высокой способностью удерживания воды. Для биокомпозита демонстрировали два экзотермических пика разложения при 205,18 и 288,38°C. Наличие двух экзотермических пиков разложения является показателем присутствия различных полимеров, вероятно, смеси CGC и полисахаридов, содержащих маннозу. Кроме того, очень низкое количество энтальпии пика биокомпозита свидетельствует о биовеществе с очень низкой степенью кристалличности.

Пример 4: Экстракция природного биокомпозита из биомассы Pichia pastoris с использованием обработки щелочью 5M NaOH и промывания щелочной нерастворимой фракции 1M раствором HCl

Культуральный бульон (200 мл) P. pastoris, получаемый как описано в примере 1, центрифугировали (10000g, в течение 15 минут) и удаляли супернатант. Влажный клеточный осадок обрабатывали 5M NaOH (200 мл) при 60°C в течение 2 часов. Содержание биомассы в суспензии составляло 10,4% (масс./об.) в пересчете на сухую массу.

Щелочную растворимую фракцию удаляли из щелочной нерастворимой фракции центрифугированием (10000g, в течение 15 минут).

Щелочную нерастворимую фракцию ресуспендировали в 200 мл деионизированной воды и доводили pH суспензии до 7,0 добавлением 12н. HCl. Затем ее повторно промывали деионизированной водой (8×200 мл). За pH и электропроводностью суспензии наблюдали во время процедуры промывания, которое заканчивали, когда pH и электропроводность составляли 6,3 и 15 мкСм, соответственно. Получаемый природный биокомпозит подвергали лиофилизации в течение 48 часов.

Композицию природного биокомпозита, получаемого этим способом, определяли, как описано в примере 3. Также проводили DSC, как описано в примере 3.

Природный биокомпозит, получаемый из биомассы P. pastoris описанным в примере способом, получали в виде светлого порошка с содержанием воды менее 5% (масс./масс.). Он содержал 12,4% сухой массы клеток. Как определено композиционным анализом, проводимым с использованием гидролизатов TFA и HCl, биокомпозит состоял из 89% (масс./масс.) CGC и только 1,7% (масс./масс.) полисахаридов, содержащих маннозу. Содержания глюкозы (71%, масс./масс.) и глюкозамина (18%, масс./масс.) CGC соответствовали отношению хитина к глюкану от 20 до 80 (моль.%). Кроме того, общее содержание белка в нем также составляло 3,0% масс., и в образце не детектировали золы.

Анализ тепловых свойств природного биокомпозита, получаемого из P. pastoris, демонстрировал, что он также характеризуется эндотермическим пиком приблизительно 50-100°C, который может быть связана с испарением воды, связанной с биокомпозитом (фигура 1). Более слабый эндотермический пик по сравнению с биокомпозитом, получаемым в примере 3 позволяет предположить, что он обладает более низкой способностью удерживания воды. Для биокомпозита демонстрировали один большой эндотермический пик разложения при 320°C, который свидетельствует о биовеществе с более высокой степенью кристалличности по сравнению с веществом, получаемым в примере 3.

Пример 5: Влияние условий культивирования Pichia pastoris на содержание CGC в биомассе и на отношение хитина к глюкану CGC

Штамм DSM 70877P. pastoris strain культивировали в BSM с композицией, описанной в примере 1. Анализы культивирования проводили во встряхиваемых колбах с периодической культурой в инкубаторе-качалке (250 об/мин) при 30°C в течение 96 часов, за исключением анализов, где исследовали влияние начального pH, который длился 48 часов. В каком-либо анализе не регулировали pH, но наблюдали за ним на всем протяжении циклов. Тестировали несколько условий культивирования, как представлено в таблице 1. В конце анализов природный биокомпозит экстрагировали из биомассы P. pastoris способом, описанным в примере 4.

В условиях периодической культуры этих анализов наблюдали, что на рост клеток оказывало благоприятное действие (CDW>8,00 г/л) культивирование с BSM с добавлением глицерина в концентрации от 40 до 60 г/л, где концентрация глицерина являлась сниженной 100 г/л. Сорбит также являлся хорошим источником углерода для роста. Добавка MnCl₂ или CaSO₄ также приводила к увеличенному росту клеток. С другой стороны, условия, которые значительно подавляли рост клеток (CDW<4,00 г/л) представляли собой использование галактозы (30 г/л), лактозы (40 г/л) или сахарозы (40 г/л) в качестве источников углерода, добавление кофеина, начальный pH ниже 3,0 или выше 8,5.

Наиболее высокие содержания CGC (>15%, масс./масс.) в биомассе P. pastoris получали для культивирования с BSM с добавлением глицерина в качестве источника углерода в концентрациях ≥60 г/л. Хотя использование лактозы и сахарозы в качестве источников углерода приводило к сниженному росту клеток, биомасса имела повышенное содержание CGC (21-23%, масс./масс.). Добавка в среду BSM кофеина и глюкозамина также приводила к высокому содержанию CGC (25 и 17% (масс./масс.) соответственно). Добавка в среду BSM MgSO₄, MnCl₂, CaSO₄ или CaCl₂ в концентрациях от 140 до 200 ммоль/л также приводила к высокому содержанию CGC (от 16 до 27%, масс./масс.). Начальный pH выше 7,0 также значительно увеличивал содержание CGC в биомассе P. pastoris (более 19%, масс./масс.).

Повышенные отношения хитина к глюкану (более 15-85,моль.%) получали для культивирования с использованием глюкозы, лактозы или сахарозы в качестве источников углерода с добавлением кофеина или глюкозамина и начальным pH от 6,0 до 10,0.

Пример 6: Сушка и измельчение природного биокомпозита

Природный биокомпозит, получаемый способом, описанным в примере 3, смешивали с деионизированной водой (31 г of лиофилизированного биокомпозита + 900 мл деионизированной воды) с получением густой гомогенной взвеси. Взвесь биокомпозита распределяли по планшетам с антиадгезивным покрытием (толщина слоев приблизительно 0,5 мм) и помещали в печь при 70°C в течение 16 часов.

Сухой природный биокомпозит (31,231 г) пропускали через измельчающую мельницу с ситом 1 мм, а затем через вибрационную и вращающуюся мельницу (опытное устройство Erweka) с ситом с отверстием 0,5 мм с получением гранул высокой плотности с уменьшенным размером частиц. Калибровку проводили пропусканием порошка через 0,75 мм сито в устройстве вибрационной и вращающейся мельницы, через сито 0,50 мм и в заключении через сито 0,35 мм в том же приборе. Гранулометрическое распределение порошка, получаемого таким образом, являлась таким, как указано ниже (таблица 2):

Таблица 2 Гранулометрическое распределение порошка, получаемого из биокомпозита, подвергнутого сушке при 70°C, затем измельчению и калибровке
Размер (мкм)	Отношение (%, масс./масс.)
>355	8,73
250-355	43,45
180-250	17,77
125-180	15,12
90-125	7,32
0-90	7,03

Средняя кажущаяся плотность составляла 0,64 г/см³, и плотность утряски составляла 0,71 г/см³.

Пример 7: Получение таблеток с использованием в качестве эксципиента порошка природного биокомпозита, получаемого из биомассы Pichia pastoris

Биокомпозитный порошок, получаемый как описано в примере 5, использовали в качестве связывающего средства/наполнителя в характерном существующем в настоящее время составе прямого прессования в диапазоне процентного содержания от 20 до 85%, как указано ниже (таблица 3):

Таблица 3 Существующей в настоящее время состав прямого прессования, используемый для получения таблеток с природным биокомпозитом, получаемым из биомассы P. pastoris
Вещество	%	мг/таблетка
Биокомпозит	50,000	50,00
Моногидрат лактозы	30,000	30,00
Коллоидный диоксид кремния	6,667	6,67
Крахмалгликолят натрия	8,333	8,33
Стеарат магния	5,000	5,00
Всего	100,000	100,00

Характеристику реологических свойств конечной смеси порошка сначала анализировали визуально. Затем определяли угол естественного откоса, и получаемое значение индекса Карра составляло 9,8, что указывает на порошок с очень хорошей текучестью (менее 12). Испытания по прессованию таблеток проводили на машине Piccola модель B-10, ротационном таблетировочном прессе Hi-Tech для научно-исследовательских испытаний от RIVA с использованием круглых вогнутых пуасонов диаметром 7 мм. Получаемые таблетки имели теоретическую массу 100 мг (95-105 мг), жесткость 7,5 кгс, ломкость менее 1% и время распада менее 5 минут в воде при 37°C.

Ссылки

Celik E, Ozbay N, Oktar N, Calik P (2008) Ind Engineer Chem Res 47(9), 2985-2990.

Oliveira R, Clemente JJ, Cunha AE, Carrondo MJT (2005) J Biotechnol 116(1), 35-50.

Jahic M, Rotticci-Mulder JC, Martinelle M, Hult K, Enfors SO (2002) Bioprocess Biosyst Eng 24, 385–393.

Chauhan AK, Arora D, Khanna N (1999) Process Biochemistry 34(2), 139-145.

1. Биокомпозитный порошок, содержащий 20-95% (мас./мас.) комплекс хитин-глюкан (CGC) и до 50% полисахаридов, содержащих маннозу, экстрагируемых из биомассы дрожжей Pichia pastoris, где размер частиц биокомпозитного порошка находится в диапазоне от 5 до 1500 мкм, и где кажущаяся объемная плотность биокомпозитного порошка составляет от 0,05 до 1,0 г/см³.

2. Биокомпозитный порошок по п. 1, содержащий 25% (мас./мас.) полисахаридов, содержащих маннозу.

3. Биокомпозитный порошок по п. 1, где размер частиц композитного порошка находится в диапазоне от 30 до 400 мкм.

4. Биокомпозитный порошок по п. 1, где кажущаяся объемная плотность биокомпозитного порошка составляет от 0,5 до 1,0 г/см³.

5. Биокомпозитный порошок по п. 1, где гранулометрическое распределение биокомпозитного порошка является таким, что 90% частиц имеют размер менее 355 мкм, 50% имеют размер менее 250 мкм, и менее 10% имеют размер менее 90 мкм.

6. Биокомпозитный порошок по п. 1, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет до 15-90 (мол.%).

7. Биокомпозитный порошок по п. 1, где отношение хитина к глюкану в CGC является более 15-85 (мол.%).

8. Биокомпозитный порошок по п. 1, где отношение хитина к глюкану в CGC является более 50-50 (мол.%).

9. Способ получения биокомпозитного порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по любому из пп. 1-8, отличающийся следующими ниже последовательными этапами:

a) приведения биомассы P. pastoris в контакт с щелочным водным раствором в концентрации от 0,5 до 5,0 М, где биомасса находится в суспензии предпочтительно в концентрации от 10 до 15% (мас./об.);

b) перемешивания щелочной суспензии биомассы при температуре приблизительно 60-90°С в течение периода 1-5 часов с получением реакционной смеси;

c) охлаждения реакционной смеси до температуры от 30 до 45°С и после охлаждения отделения щелочной нерастворимой фракции в реакционной смеси от растворимой фракции центрифугированием или фильтрованием;

d) промывания щелочной нерастворимой фракции одним или несколькими из следующих смесей растворителей с получением взвеси:

i. воды,

ii. водного физиологического раствора,

iii. этанола (70%, об./об.) или

iv. водного раствора кислоты;

e) сушки взвеси одним из следующих ниже способов:

ix. замораживанием жидким азотом с последующей лиофилизацией;

x. сушкой в печи при температуре от 60 до 80°С в течение 12-18 часов;

xi. сушкой распылением при температуре от 120 до 200°С в течение периода времени от 1 до 10 секунд или

xii. сушкой в псевдоожиженном слое при температуре входящего воздуха от 70°С до 90°С;

f) измельчения высушенного вещества с получением порошка посредством его пропускания один или несколько раз через измельчающую мельницу, конусную мельницу, шаровую мельницу, многовалковую мельницу или роликовый пресс, оснащенный ситами в диапазоне от 0,25 до 10 мм на выходе, работающий со скоростями ротора от 500 до 5000 об/мин; и

g) калибровки порошка посредством его пропускания один или несколько раз через вибрационную и вращающуюся решетчатую мельницу, оснащенную ситами в диапазоне от 0,05 до 1,5 мм.

10. Способ по п. 9, где водный щелочной раствор представляет собой NaOH, KOH, Ca(ОН)₂, Na₂CO₃, K₂CO₃, CaCO₃, NaHCO₃ или KHCO₃.

11. Способ по п. 9, где водный щелочной раствор представляет собой NaOH или NaHCO₃.

12. Способ по п. 9, где водный раствор на этапе d) ii) представляет собой раствор фосфатно-солевого буфера (PBS) (20,45 г/л NaCl; 0,46 г/л KCl; 10,14 г/л Na₂HPO₄⋅7H₂O; 0,54 г/л KH₂PO4, pH 7,2).

13. Способ по п. 9, где водный раствор кислоты на этапе d) iv) представляет собой водный раствор соляной кислоты (HCl).

14. Способ по п. 9, где сушку распылением проводят при температуре от 130 до 150°С.

15. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC до 15% (мас./мас.) культивированием в стандартной основной питательной среде (BSM) с добавлением глицерина, сорбита, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрации от 30 до 60 г/л в периодическом, периодическом с подпиткой или непрерывном режиме, где регулируют температуру, чтобы она составляла 28-32°С, регулируют pH, чтобы он составлял 4,5-5,5, и регулируют концентрацию растворенного кислорода (DO), чтобы она составляла боле 10%.

16. Способ по п. 9, где концентрацию растворенного кислорода (DO) регулируют, чтобы она составляла более 30%.

17. Способ по п. 9, где концентрацию растворенного кислорода (DO) регулируют, чтобы она составляла более 50%.

18. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC до 15% (мас./мас.) культивированием в стандартной основной питательной среде (BSM) с добавлением глицерина, сорбита, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрации от 40 до 50 г/л.

19. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением глицерина, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 60 до 180 г/л.

20. Способ по п. 19, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением глицерина, глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 80 до 120 г/л.

21. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием без регуляции температуры.

22. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием при регулируемой температуре при 28-32°С до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая температуру на 5-20°С в течение 2-48 часов.

23. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием при регулируемой температуре при 28-32°С до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая температуру на 10-15°С в течение 2-48 часов.

24. Способ по п. 22 или 23, где при достижении фазы стационарного роста температуру повышают в течение 6-24 часов.

25. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием без регуляции pH.

26. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием при регулируемом pH при 3,5-6,5 до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая pH на 1,0-3,0 в течение 2-48 часов.

27. Способ по п. 26, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием при регулируемом pH при 3,5-6,5 до тех пор, пока не получают фазу стационарного роста, а затем повышая pH на 2,0-3,0 в течение 2-48 часов.

28. Способ по п. 26 или 27, где при достижении фазы стационарного роста pH повышают в течение 6-24 часов.

29. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет до 100 ммоль/л.

30. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет 10-50 ммоль/л.

31. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации до 100 ммоль/л, предпочтительно 10-50 ммоль/л.

32. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации 10-50 ммоль/л.

33. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением поверхностно-активного вещества, такого как SDS, Triton Х100 или PEG, в концентрации до 1,0% (мас./об.).

34. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением поверхностно-активного вещества, такого как SDS, Triton Х100 или PEG, в концентрации от 0,01 до 0,1% (мас./об.).

35. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением кальция, кобальта, меди, железа, магния и/или марганца в форме хлоридных, сульфатных и/или фосфатных солей в концентрациях от 1 до 200 ммоль/л.

36. Способ по п. 9, где получают биомассу Pichia pastoris с содержанием CGC более 15% (мас./мас.) культивированием в BSM с добавлением кальция, кобальта, меди, железа, магния и/или марганца в форме хлоридных, сульфатных и/или фосфатных солей в концентрациях от 5 до 50 ммоль/л.

37. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 40 до 180 г/л.

38. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 60 до 120 г/л.

39. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 40 до 180 г/л.

40. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозы, сахарозы, лактозы, их смесей или веществ, содержащих такие соединения в качестве источников углерода, в концентрациях от 60 до 120 г/л.

41. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет до 100 ммоль/л.

42. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозамина в концентрации 10-50 ммоль/л.

43. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением кофеина или веществ, содержащих кофеин, где конечная концентрация кофеина в BSM составляет до 100 ммоль/л.

44. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris в BSM с добавлением глюкозамин в концентрации 10-50 ммоль/л.

45. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 15-85 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris при pH выше 6,5.

46. Способ по п. 9, где отношение хитина к глюкану в CGC составляет более 50-50 (мол.%) в результате культивирования Pichia pastoris при pH выше 6,5.

47. Способ по п. 9, где биомассу Pichia pastoris получают в качестве побочного продукта фармацевтической промышленности.

48. Применение биокомпозитного порошка, содержащего CGC и полисахариды, содержащие маннозу, экстрагируемых из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по пп. 18 в качестве фармацевтического эксципиента.

49. Применение биокомпозитного порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по пп. 1-8 в качестве косметического эксципиента.

50. Применение биокомпозитного порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по пп. 1-8 в фармацевтических составах.

51. Применение биокомпозитного порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по пп. 1-8 в косметических составах.

52. Применение биокомпозитного порошка, содержащего полисахариды, экстрагируемые из биомассы дрожжей Pichia pastoris, по пп. 1-8 в пищевых составах.