Способ получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток с трансфекцией рнк опухолевых клеток рака молочной железы

Авторы патента:

Христин Александр Александрович (RU)

C12N5/10 - клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом

Владельцы патента RU 2631792:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток (ДК) трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы, и может быть использовано в медицине. Получают зрелые антиген-активированные ДК за счет сочетания магнитной трансфекции РНК опухолевых клеток рака молочной железы в соотношении 0,3 мкг РНК к 0,3 мкл взвеси магнитных частиц со стимулятором созревания в дозе 25 нг/мл в течение 24 часов. Изобретение позволяет эффективно стимулировать противоопухолевый цитотоксический иммунный ответ против клеток рака молочной железы. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток (ДК) с трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы и может быть использовано впоследствии для стимуляции противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа против клеток рака молочной железы.

Способы трансфекции антиген-активированных ДК сами по себе достаточно широко известны.

Известные способы введения векторов, содержащие необходимые нуклеиновые кислоты непосредственно в клетки хозяина, описаны в заявке на изобретение «Полипептиды, композиция, нуклеиновая кислота, клеточная линия, способ получения полипептида, способ лечения, клетка» (RU 94031472, C12Q 1/68, 1996). Как указано в данной заявке, нуклеиновые кислоты могут быть ДНК или РНК. Способы преобразования, которые различны в зависимости от типа клетки хозяина, включают электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорид рубидия, фосфат кальция, ДЭАЭ-декстрана или других веществ, бомбардировку микропулями; липофекцию; заражение (если вектор является инфицирующим агентом) и другие методы. При анализе других способов получения антиген-специфических цитотоксических клеток или иммунного ответа против опухолевых клеток больного анализировались и в данном изобретении описывались только способы получения антиген-активированных зрелых ДК.

Известен способ получения антиген-специфических цитотоксических клеток, при котором сначала получают зрелые ДК, а затем производят магнитную трансфекцию зрелых ДК экспрессионными плазмидами, содержащими ДНК-конструкции (RU 2013135146, C12N 1/00, 2013).

Известен также способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфицированных полиэпитопной ДНК-конструкцией (RU 2012135124, C07N 5/0784, 2012). Описанный способ включает, в том числе, трансфицирование уже зрелых ДК генетическими ДНК-конструкциями, несущими ЦТЛ- и Тх-эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов рака молочной железы.

В описанных способах применяется магнитная трансфекция ДНК-конструкций в уже зрелые ДК.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ получения антиген-активированных зрелых ДК, описанный как составная часть в заявке на изобретение «Способ индукции противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа с помощью дендритных клеток, трансфицированных РНК опухолевых клеток против клеток рака молочной железы» (RU 2013158429, C12N 5/0784, 2013). Способ по заявке включает совместное культивирование аутологичных мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови с дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, трансфицированными РНК опухолевых клеток рака молочной железы (РМЖ), а затем подвергнутых стимулированному созреванию, отличающийся тем, что совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и ДК, трансфицированных РНК аутологичных опухолевых клеток, проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18, а для получения зрелых ДК после двух суток культивирования прилипающей фракции МНК больных РМЖ полученные незрелые ДК, трансфицированные опухолевыми РНК по прошествии суток подвергают стимулированному созреванию еще в течение суток. Способ получения антиген-активированных зрелых ДК в описанном способе включает получение прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенной из периферической крови больного раком молочной железы, получение незрелых ДК, инкубирование ДК со стимуляторами созревания и трансфекцию РНК опухолевых клеток рака молочной железы.

Недостатком описанного способа получения антиген-активированных зрелых ДК является длительный срок их получения. Использованный способ оказывает непрямое токсичное действие на дендритные клетки и значительно снижает процент жизнеспособности (не более 21%) полученных зрелых дендритных клеток, что требует большого количества периферической крови для получения конечной фракции антиген-активированных дендритных клеток и необходимость проведения дополнительного этапа очистки от мертвых дендритных клеток с привлечением реактивов и специализированного оборудования, что также удлиняет процесс получения результата. Описанные недостатки вносят высокие риски и затраты в достижение требуемого результата - получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток.

Задача, решаемая изобретением, заключается в сокращении на 1 сутки срока получения антиген-активированных зрелых ДК и повышении жизнеспособности полученных антиген-активированных зрелых ДК.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток (ДК) с трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы (РМЖ), включающем получение прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больного, получение незрелых ДК, инкубирование ДК со стимуляторами созревания и трансфекцию РНК опухолевых клеток, причем получение зрелых антиген-активированных ДК производят в течение 24 часов сочетанием магнитной трансфекции РНК опухолевых клеток рака молочной железы в соотношении 0,3 мкг РНК к 0,3 мкл взвеси магнитных частиц со стимуляторами созревания, выбранными из ряда:

, ИЛ-1β, ЛПС или их любым сочетанием.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что антигенную активацию незрелых ДК проводят с помощью магнитной трансфекции РНК аутологичных опухолевых клеток рака молочной железы, а для досозревания ДК используют, например, рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО-α) или ИЛ-1β, ЛПС или их любым сочетанием.

Принципиальным отличием разработанного способа является применение протоколов активации и созревания ДК, включающих магнитную трансфекцию с РНК, полученных из аутологичных незрелых опухолевых клеток рака молочной железы, что активирует ДК против собственных опухолевых антигенов, тем самым увеличивая цитотоксический ответ, а также сокращает стадию получения зрелых антиген-активированных ДК до 3 суток.

Во всех известных способах трансфицируют РНК в зрелые ДК и отличными от заявляемого способа (магнитная трансфекция).

Например, при применении химической трансфекции незрелых дендритных клеток сам трансфицирующий агент (соли кальция, липосомы, липоконъюгаты) оказывает негативное влияние на дендритные клетки, взаимодействуя с мембраной клеток, нарушая ее целостность, что приводит к гибели клеток.

Например, при применении электропорации незрелых дендритных клеток сам трансфицирующий агент доставляется посредством разряда электрического импульса, что оказывает негативное влияние на дендритные клетки, приводя к критическим повреждениям мембран клеток.

Особенностью применения магнитной трансфекции на стадии незрелых ДК заключается в том, что на этой стадии дифференцировки (созревания) дендритные клетки активно сами способны захватывать антигенный материал посредством эндоцитоза, помимо трансфекции, и на этой стадии активно работают механизмы процессинга антигена. На стадии зрелых дендритных клеток сами клетки практически не способны захватывать антигенный материал, на первый план выходит функция дендритных клеток - презентация антигенов опухолевых клеток основным эффекторным клеткам иммунной защиты (CD4+ и CD8+лимфоциты).

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенная из периферической крови больных раком молочной железы прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируется в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2 -меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO₂ при 37°C с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования полученные незрелые ДК трансфицируют РНК аутологичных опухолевых клеток рака молочной железы методом магнитной трансфекции. Процедура магнитной трансфекции РНК в дендритные клетки составляет в среднем 45 минут и включает в себя смену питательной среды, приготовление реактива для трансфекции, содержащей РНК аутологичных опухолевых клеток рака молочной железы и магнитные частицы в соотношении 0,3 мкг РНК к 0,3 мкл взвеси магнитных частиц и инкубацию на универсальной магнитной плате. Далее для досозревания незрелых дендритных клеток вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл в культуру клеток и инкубируют в течение 24 часов в условиях CO₂-инкубатора. Чтобы оценить жизнеспособность полученных зрелых антиген-активированных дендритных клеток использовали краситель эритрозин. Жизнеспособность полученных зрелых антиген-активированных дендритных клеток составляла не менее 85%.

Для того, чтобы показать функциональную зрелость полученных антиген-активированных дендритных клеток, полученные ДК совместно культивировали с неприлипшей фракцией МНК. Далее оценивали влияние полученных зрелых антиген-активированных дендритных клеток на активацию лимфоцитов в культуре МНК, а именно пролиферативную активность CD4+ и CD8+лимфоцитов с помощью специфического красителя (CFSE) методом проточной цитофлуориметрии.

Показано достоверное повышение пролиферативной активности CD4+ и CD8+лимфоцитов, что служит показателем функциональной зрелости антиген-активированных дендритных клеток, полученных предложенным способом (см. таблицу).

Указанная проверка в объем защиты изобретения не входит. Предлагаемое изобретение позволяет в более короткие сроки получать зрелые антиген-активированные дендритные клетки, имеющие высокую жизнеспособность (не менее 85%), способные стимулировать пролиферативную активность CD4+ и CD8+ лимфоцитов в культуре мононуклеарных клеток.

Проведенные исследования показали, что разработанный способ получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток с трансфекцией РНК аутологичных опухолевых клеток является эффективным и перспективным для дальнейшего его использования для стимуляции противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа против клеток рака молочной железы.

Способ получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток с трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы, включающий получение прилипающей фракции мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови больного, получение незрелых дендритных клеток, инкубирование дендритных клеток со стимуляторами созревания и трансфекцию РНК опухолевых клеток, отличающийся тем, что получение зрелых антиген-активированных дендритных клеток производят в течение 24 часов сочетанием магнитной трансфекции РНК опухолевых клеток рака молочной железы в соотношении 0,3 мкг РНК к 0,3 мкл взвеси магнитных частиц со стимулятором созревания в дозе 25 нг/мл.

Похожие патенты:

Антитела против αβtcr // 2630656

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к гуманизированным моноклональным антителам, которые связываются с комплексом αβTCR/CD3, что может быть использовано в медицине.

Trail r2-специфические мультимерные скаффолды // 2628699

Настоящая группа объектов изобретения относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный мультимерный скаффолд на основе 3 домена FnIII тенасцина (Tn3), который специфически связывается с рецептором 2 TRAIL (TRAIL R2).

Объект сои 9582.814.19.1, придающий устойчивость к насекомым и устойчивость к гербицидам // 2628099

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с чешуекрылыми насекомыми. Также раскрыта выделенная нуклеиновая последовательность, которая является праймером.

Экзотоксин а pseudomonas с менее иммуногенными т-и/или в-клеточными эпитопами // 2627216

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен экзотоксин A Pseudomonas (РЕ), имеющий замену одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях L423, F443 и L477.

Антикластериновые антитела и антигенсвязывающие фрагменты и их использование для уменьшения объема новообразований // 2627163

Данное изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело, связывающее кластерин, и его антигенсвязывающий фрагмент.

Устойчивый к насекомым-вредителям и толерантный к гербицидам селекционный гибрид трансформанта сои pdab9582.814.19.1 и pdab4468.04.16.1 // 2627161

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с насекомыми-вредителями, такими как Pseudoplusia includens (соевая совка), Anticarsia gemmatalis (гусеница бархатных бобов), Spodoptera frugiperda (травяная совка).

Мутантные полимеразы вируса гепатита в // 2625021

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к мутантному полипептиду полимеразы ВГВ, содержащему мутантный домен полимеразы ВГВ с внутренней делецией, которая подавляет функциональную активность полимеразы, и мутантный домен РНКазы Н с внутренней делецией и мутациями, которые подавляют функциональную активность РНКазы Н.

Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы tnfr1-fc и способ получения рекомбинантного белка // 2625010

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного белка TNFR1-Fc в клетках HEK293.

Антитело против ксф-1r // 2621859

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложено выделенное рекомбинантное или очищенное антитело, которое специфически связывается с рецептором колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1R, CSF-1R), охарактеризованное аминокислотными последовательностями вариабельных доменов.

Способ улучшенной трансформации с использованием агробактерии // 2620975

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу трансформации растительной клетки, где способ включает контакт растительных клеток незрелых зародышей кукурузы с клетками Agrobacterium в жидкой среде, содержащей неионное трисилоксановое поверхностно-активное вещество.

Синтетические гены // 2632571

Изобретение относится к области биохимии, в частности к синтетической ДНК для экспрессии белковых токсинов Cry. Также раскрыты ДНК-конструкция для экспрессии белковых токсинов Cry и трансгенное растение, имеющее устойчивость к насекомым-вредителям, чувствительным к белковым токсинам Cry. Раскрыт способ борьбы с насекомыми-вредителями зерна или семян, чувствительными к белковым токсинам Cry. Изобретение позволяет бороться с насекомыми-вредителями . 4 н.п. ф-лы, 29 табл., 17 пр.

Слитый белок, ингибирующий ангиогенез или рост сосудов, и его применение // 2634406

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению ингибиторов ангиогенеза, и может быть использовано для лечения заболеваний, вызванных ангиогенезом, таких как опухоль или возрастная дегенерация макулы, диабетическая ретинопатия или хориоретинопатия. Получают слитый белок, состоящий из фрагмента KH02, KH03 или KH04 рецептора фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) человека и Fc-фрагмента иммуноглобулина человека, связанных вместе. Изобретение позволяет получить биологически активный слитый белок с высокой термостабильностью, значительно сниженной скоростью образования белковых агрегатов при процессе ферментации, и существенным повышением чистоты и выхода белка. 8 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл., 7 пр.

Фрагменты пищевых белков и способы их применения // 2634407

Представлены выделенный пищевой белок, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин и способ получения такого белка. Представленный пищевой белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2580, 2582, 2587, 2595, 2596, 2598, 2599 и 2603. Белок имеет растворимость в воде при рН 7 по меньшей мере 12,5 г/л, а также период его полупереваривания в искусственном желудочном соке составляет менее чем 10 мин. 5 н.п. ф-лы, 2 ил., 14 табл., 12 пр.

Антитела, подходящие для пассивной иммунизации против гриппа // 2635999

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны моноклональные антитела и их фрагменты, которые являются перекрестно реактивными с множеством кладов вируса гриппа, включая представителей как группы 1, так и группы 2. Эти антитела пригодны для контроля эпидемий и пандемий гриппа, а также для предоставления профилактической или терапевтической защиты от сезонного гриппа. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 8 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

Линии трансгенной сои, генетическое событие 8264.42.32.1, устойчивое к гербицидам с пакетированными генами на его основе, и их детектирование // 2636021

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению сои, имеющему устойчивость к гербициду на основе 2,4-D, гербициду на основе глюфосината и гербициду на основе глифосата, и включающему последовательность SEQ ID: 18. Также раскрыты семя указанного растения, экспрессионная кассета для придания устойчивости к указанным гербицидам, часть указанного растения, выделенная полинуклеотидная молекула и выделенный полинуклеотид для обнаружения указанной последовательности, стабильно трансформированное двудольное растение сои, имеющее устойчивость к указанным гербицидам, пищевой продукт, содержащий указанную последовательность, клетка растения сои, имеющая устойчивость к указанным гербицидам, набор для определения зиготности указанного растения сои, выделенный полинуклеотид для обеспечения устойчивости к указанным гербицидам, и продукт на основе масла, содержащий указанную последовательность. Раскрыты способы получения указанного растения сои, скрещивания указанного растения сои, способ борьбы с сорняками указанными гербицидами, способ определения зиготности указанного растения сои. Изобретение позволяет придать устойчивость растению сои к гербицидам на основе 2,4-D, глюфосината и глифосата. 17 н. и 13 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл., 9 пр.

Антитела к pd-l1 и их применение для усиления функции т-клеток // 2636023

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено выделенное антитело к PD-L1 и его антигенсвязывающий фрагмент, охарактеризованные аминокислотными последовательностями гипервариабельных участков (HVR) в составе вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи. Кроме того, описана выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело; экспрессионный вектор; клетка-хозяин и способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Также рассмотрена композиция, содержащая эффективное количество антитела к PD-L1 или антигенсвязывающего фрагмента; изделие производства, содержащее емкость с терапевтически эффективным количеством композиции; и способы лечения злокачественной опухоли и инфекции. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии. 11 н. и 49 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 11 пр.

Композиции для ингибирования masp-2-зависимой активации комплемента // 2636038

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено выделенное человеческое моноклональное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с MASP-2 человека. Кроме того, рассмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела и антигенсвязывающего фрагмента; экспрессионная кассета; клетка и способ продуцирования выделенного анти-MASP-2 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Также описана композиция для лечения состояния, ассоциированного с MASP-2-зависимой активацией комплемента; применение анти-MASP-2-антитела для получения лекарственного средства и промышленное изделие для лечения состояния, ассоциированного с MASP-2-зависимой активацией комплемента. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии комплемент-опосредованных заболеваний. 9 н. и 10 з.п. ф-лы, 24 ил., 30 табл., 12 пр.

Рекомбинантные клетки растений, способ их получения и способ получения белка-мишени с их использованием // 2636462

Данное изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, а именно к растительной клетке, которая экспрессирует рекомбинантный белок, способу ее получения и способу получения рекомбинантного белка. Эта растительная клетка имеет введенный в рекомбинантный вектор, содержащий ген, кодирующий рекомбинантный белок, а также представляет собой клетку камбиальной меристемы (CMC), которая является клеточной линией, содержащей по природе недифференцированные клетки, выделенные из растения, где клеточная линия выделена из камбиальной ткани растения, и имеет меристематическую преемственность без прохождения через дедифференцировку в каллюс. Система экспрессии рекомбинантного белка с использованием вышеуказанных растительных клеток в соответствии с данным изобретением показывает значимо высокую эффективность трансформации и, следовательно, может продуцировать большие количества рекомбинантных белков, в том числе биофармацевтических белков. Таким образом, она делает возможной коммерциализацию биофармацевтических лекарственных средств, включающих в себя белковые продукты растительного происхождения. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 19 ил., 15 табл., 7 пр.

Новый ген гликозилтрансферазы и его применение // 2636463

Изобретение относится к области биохимии, а именно представлен полинуклеотид, который кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона. Полинуклеотид выбран из группы, состоящей из: (а) полинуклеотида, состоящего из последовательности оснований SEQ ID NO:1; (b) полинуклеотида, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из последовательности оснований, коплементарной последовательности оснований SEQ ID NO:1, и кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона; (с) полинуклеотида, кодирующего белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. Изобретение позволяет эффективно получать полинуклеотид, который кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 23 ил., 10 пр.

Антитела, специфически связывающие рецептор 1 типа фактора роста фибробластов, применение антител для лечения онкологического заболевания, способ получения антител // 2638457

Группа изобретений относится к области биотехнологии, а именно биохимии и медицине, и касается антител для лечения онкологических заболеваний. Антитела по изобретению специфически связывают и блокируют рецептор 1 типа фактора роста фибробластов (FGFR1) и характеризуются аминокислотными последовательностями H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3. Предложены фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний, содержащая антитела по изобретению, и способ лечения онкологических заболеваний, включающий введение пациенту антител по изобретению. Также предложены способ получения антител, кодирующие их нуклеиновые кислоты и линии клеток для получения антител. Изобретения позволяют с высокой эффективностью и специфичностью подавлять пролиферацию опухолевых клеток и ингибировать опухолевый ангиогенез путем блокирования патологического пути FGF/FGFR1, что в свою очередь позволяет эффективно лечить онкологические заболевания. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.