Способ выявления генных мутаций braf в опухолях человека



Способ выявления генных мутаций braf в опухолях человека
Способ выявления генных мутаций braf в опухолях человека
Способ выявления генных мутаций braf в опухолях человека
Способ выявления генных мутаций braf в опухолях человека

 


Владельцы патента RU 2631824:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике и онкологии, и касается способа выявления генных мутаций BRAF в опухолях человека. Осуществляют амплификацию исследуемого фрагмента гена BRAF посредством асимметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan: BRAF-15-sense – 5'-ROX-aggtgattttggtctagctacagtgaaatc-BHQ2 и BRAF-15-antisense – 5'-Су5-acccactccatcgagatttcactgta-BHQ2 и праймерами: прямой – 5'-gagatctactgttttcctttactt, обратный – 5'-ggccaaaaatttaatcagt. Этап отжига праймеров и зондов составляет 2 с, число циклов амплификации - 80-100, концентрация Taq-полимеразы - 0,63 ед., температура отжига праймеров и зондов - 57°С. Далее осуществляют плавление дуплекса зонд-однонитевая ДНК и построение пиков плавления. Идентифицируют мутации по асимметрии пиков плавления. Способ обладает высокой чувствительностью, от 10 до 15 раз превышающей чувствительность прототипа, прост в исполнении, реализуется в течение 2 ч в одной пробирке с однократной регистрацией результатов, снижает риск перекрестного загрязнения образцов. 4 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике, молекулярной диагностике и онкологии, и касается способа выявления генных мутаций в опухолях человека для использования таргетной терапии.

При многих онкологических заболеваниях, в частности при раке легких, толстой кишки, меланоме, обязательными объектами выявления генных мутаций являются гены KRAS, NRAS, BRAF. С этой целью используют секвенирование по Сэнгеру - «золотой стандарт» клинической генодиагностики.

Недостатки способа: невысокая чувствительность, трудоемкость, риск перекрестного загрязнения клинических образцов.

Известен способ выявления генных мутаций посредством плавления ДНК (DNA Melting Analysis, DMA), реализуемый иногда в режиме высокого разрешения (High Resolution Melting Analysis, HRMA) (Erali and Wittwer, High resolution melting analysis for gene scanning. Methods, 2010, 50, 250-261; Krypuy et al., High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer. BMC Cancer, 2006, 6, 295).

Недостатки способа: относительно невысокая чувствительность, необходимость дорогостоящего оборудования.

Известен способ выявления генных мутаций с применением в процессе ПЦР блокирующих агентов - пептидных нуклеиновых кислот, способных избирательно подавлять амплификацию аллелей дикого типа и тем самым повышать чувствительность определения мутаций (Guha et al., DISSECT Method Using PNA-LNA Clamp Improves Detection of T790m Mutation. PLoS ONE, 2013, 8, e67782).

Недостатки способа: необходимость независимой идентификации мутантного алле-ля, дорогостоящий химический синтез.

Прототипом заявляемого способа является способ выявления генных мутаций посредством DMA с использованием зондов TaqMan (Huang et al., Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS ONE, 2011, 6, e19206). Прототип включает следующие приемы: а) выделение ДНК из образца опухолевой ткани; б) амплификацию определенного фрагмента гена в асимметричной ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного зонда TaqMan; в) использование зонда TaqMan также на этапе плавления ДНК. Характерные изменения пиков плавления дуплексов зонда с однонитевой ДНК позволяют обнаружить в анализируемой последовательности мутацию.

Недостаток способа: невысокая чувствительность выявления генных мутаций в небольших опухолевых клонах, обусловливающих лекарственную резистентность опухоли.

Задачей заявляемого изобретения является создание нового, более чувствительного способа выявления генных мутаций BRAF в опухолях человека.

Технический результат: заявляемый способ обладает высокой чувствительностью выявления генных мутаций BRAF, превышающей в 10 и более раз чувствительность прототипа, при сохранении простоты исполнения, реализации 2-часового теста в одной пробирке без промежуточных или дополнительных процедур с однократной регистрацией результатов и без риска перекрестного загрязнения образцов ДНК операционного материала и опухолевой ткани, заключенной в парафиновые блоки.

Сущность заявляемого способа заключается в выявлении в ДНК опухоли мутаций BRAF, ассоциированных с чувствительностью опухоли к таргетной терапии, с использованием асимметричной ПЦР в реальном времени с двумя флуоресцентными зондами TaqMan, применяемыми в качестве агентов, блокирующих синтез аллелей дикого типа, и пост-амплификационным плавлением дуплексов зонд-однонитевая ДНК. Анализ результатов плавления осуществляют с помощью стандартного модуля плавления (DNA Melting Analysis) аппарата ПЦР (Bio-Rad CFX-96).

Расположенные по ходу движения Taq полимеразы гибридизованные с матрицей олигонуклеотиды, в частности зонды TaqMan, замедляют работу фермента (Montgomery et al., The Influence of Nucleotide Sequence and Temperature on the Activity of Thermostable DNA Polymerases. The Journal of Molecular Diagnostics, 2014, 16, 305-313). В специально подобранных условиях ПЦР зонды TaqMan подавляют амплификацию аллеля дикого типа сильнее, чем мутантного аллеля из-за неспаренного в последнем случае основания, существенно ослабляющего структуру дуплекса. За счет преимущественной амплификации мутантного аллеля существенно возрастает чувствительность способа.

Заявляемый способ включает следующие этапы: амплификацию исследуемого фрагмента гена BRAF посредством асимметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan (смысловым и антисмысловым); плавление дуплекса зонд-однонитевая ДНК; построение пиков плавления встроенной программой Bio-Rad CFX Manager. Способ осуществляют в одном приборе и одной пробирке без вмешательства оператора.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

а) Получение биологического материала - опухолевой ткани, замороженной в жидком азоте или фиксированной формальдегидом и заключенной в парафиновые блоки.

б) Выделение ДНК из опухолевой ткани депротеинизацией фенолом и хлороформом, а из парафиновых блоков - с использованием коммерческого набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen).

в) Амплификация фрагмента гена BRAF в двух реакциях ПЦР, в первой синтезируется преимущественно антисмысловая нить ампликона (соотношение прямого и обратного праймеров - 1:15), во второй - смысловая нить ампликона (соотношение прямого и обратного праймеров - 15:1), что позволяет выявлять мутации BRAF в обеих нитях ампликона. Реакцию проводили в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Инкубационная смесь (25 мкл) содержала 50 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 50 мМ KC1; 0,01% Tween-20; 3 мМ MgCl2; по 0,25 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов; 0,2 х EvaGreen (Biotium, USA); 0,1 мг/мл БСА; 1 мМ DTT; праймеры: прямой - 5'-gagatctactgttttcctttactt, обратный - 5'-ggccaaaaatttaatcagt (0,4 мкМ прямого праймера и 0,027 мкМ обратного праймера - для преимущественного синтеза смысловой нити ампликона; 0,4 мкМ обратного праймера и 0,027 мкМ прямого праймера - для преимущественного синтеза антисмысловой нити ампликона); по 0,25 мкМ двух зондов TaqMan (BRAF-15-sense - 5'-ROX-aggtgattttggtctagctacagtgaaatc-BHQ2 и BRAF-15-antisense 5'-Су5-acccactccatcgagatttcactgta-BHQ2), блокирующих синтез обеих нитей ампликона дикого типа; 0,63 ед. Hot-rescue Taq полимеразы; 5 мкл раствора ДНК в воде. Условия ПЦР: начальная денатурация - 5 мин при t = 95°C, после чего 80-100 циклов - 13 с при t = 95°C, 2 с при t = 57°C с регистрацией флуоресценции. Присутствующие в инкубационной среде оба зонда (смысловой и антисмысловой) функционируют в качестве блокирующих агентов, замедляющих синтез обеих нитей ампликона дикого типа.

г) Плавление дуплексов однонитевой ДНК с зондами TaqMan: продукты реакции денатурировали 1 мин при t = 95°С, прогревали 2 мин при t = 55°C, после чего повышали температуру до t = 85°C с шагом 0,4°С (выдержка 6 с); данные анализировали с помощью программы Bio-Rad CFX Manager (version 1.6). В процессе плавления ДНК участвует только один из двух присутствующих в инкубационной среде зондов TaqMan (комплементарный той нити ампликона, которая была преимущественно синтезирована в ПЦР). Обнаружение мутации в обеих нитях ампликона повышает надежность и чувствительность анализа.

Продолжительность ПЦР и плавления ДНК составляет 2 ч.

Способ иллюстрирован фиг. 1 (А, В, С), 2 (А, В, С), 3 (А и В), 4 (А и В).

На фиг. 1 (А, В, С) представлены этапы выявления генных мутаций BRAF методом асимметричной ПЦР в реальном времени с последующим плавлением ДНК с зондами TaqMan в приборе Bio-Rad CFX96: на фиг. 1(A) - асимметричная ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan (гидролиз зонда во время реакции сопровождается «разгоранием» флуоресценции, что позволяет в реальном времени судить о ходе реакции); на фиг. 1(B) - плавление ДНК приводит к фазовому переходу ДНК из двунитевой в однонитевую форму, что сопровождается падением флуоресценции; на фиг. 1(C) - пики плавления (отрицательные первые производные кривых плавления по температуре): симметричный пик, гомодуплекс (кривая 1) свидетельствует о присутствии только аллеля дикого типа, тогда как дополнительный пик слева, гетеродуплекс (кривая 2) свидетельствует о присутствии мутантного аллеля.

На фиг. 2 (А, В, С) представлена схема заявляемого способа преимущественной амплификации мутантных аллелей с использованием зондов TaqMan в качестве блокирующих агентов. Фермент Taq полимераза, удлиняющая праймер на матрице ДНК, наталкивается на сгибридизованный с матрицей зонд TaqMan и вынуждена устранить его со своего пути, используя 5'-3'-экзонуклеазную активность. На фиг. 2(A) представлена схема амплификации аллеля дикого типа, направление движения Taq полимеразы обозначено стрелкой; F - флуорофор на 5'-конце зонда, Q (quencher) - гаситель на 3'-конце зонда; зонд TaqMan полностью комплементарен последовательности ДНК дикого типа. На фиг. 2(В) - амплификация мутантного аллеля, при гибридизации зонда с мутантной ДНК возникает неспаренное основание, резко ослабляющее структуру комплекса и облегчающее движение Taq полимеразы. На фиг. 2(C) представлен сравнительный анализ образца ДНК рака легкого по способу прототипа (1) и по заявляемому способу (2). При применении заявляемого способа наблюдалось подавление амплификации аллеля дикого типа (wt) и возрастание доли мутантного аллеля (mut).

На фиг. 3 (А и В) представлено определение чувствительности (предела обнаружения мутантных аллелей BRAF) по способу прототипа и по заявляемому способу посредством серийного разведения ДНК клеток RKO (мутация V600E) в ДНК дикого типа. (А) - прототип; (В) - заявляемый способ. Дополнительные пики плавления, расположенные слева от основного (дикий тип, wt), обусловлены присутствием мутантных аллелей, так как температура плавления гетеродуплекса ниже температуры плавления гомодуплекса. Стрелки указывают процентное содержание мутантной ДНК в образце. Пределы обнаружения мутантного аллеля V600E по прототипу и заявляемому способу составляют 6,3% и 0,4%, соответственно. Показано, что чувствительность заявляемого способа в 15 раз превышает чувствительность способа прототипа.

На фиг. 4 (А и В) представлены сравнительные результаты выявления мутаций по прототипу и заявляемому способу образцов ДНК рака легкого (А) и меланомы (В). Пики плавления: 1 - прототип; 2 - заявляемый способ. Стрелками обозначен идентифицирующий мутацию признак - асимметрия пика плавления слева, выявляемый только заявляемым способом.

Способ выявления мутаций BRAF в опухолях человека, включающий амплификацию исследуемого фрагмента гена в подобранных условиях асимметричной ПЦР в реальном времени; плавление дуплекса зонд-однонитевая ДНК; построение пиков плавления; идентификацию мутаций по асимметрии пиков плавления, отличающийся тем, что в качестве блокирующих агентов используют два подобранных зонда TaqMan: BRAF-15-sense – 5'-ROX-aggtgattttggtctagctacagtgaaatc-BHQ2 и BRAF-15-antisense – 5'-Су5-acccactccatcgagatttcactgta-BHQ2 и праймеры: прямой – 5'-gagatctactgttttcctttactt, обратный – 5'-ggccaaaaatttaatcagt, этап отжига праймеров и зондов составляет 2 с, число циклов амплификации - 80-100, концентрация Taq-полимеразы - 0,63 ед., подобранная температура отжига праймеров и зондов составляет 57°С.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для стандартизации эффективности амплификации набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации перестроенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, полученном из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем каждый рецептор адаптивной иммунной системы содержит вариабельный участок и соединительный участок, причем композиция содержит: множество синтетических матричных олигонуклеотидов, причем каждый синтетический матричный олигонуклеотид имеет известную концентрацию до амплификации и олигонуклеотидную последовательность общей формулы: , причем: (а) V представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 20 и не более 1000 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей вариабельный (V) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый V содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка; (b) J представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 15 и не более 600 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей соединительный (J) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый J содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка; (с) U1 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) первой специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (d) U2 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) второй специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (e) присутствует по меньшей мере один из B1, В2, В3 и В4 и каждый из B1, В2, В3 и В4 содержит олигонуклеотид В, содержащий последовательность штрихкода из 3-25 последовательных нуклеотидов, которая уникальным образом идентифицирует в качестве спаренной комбинации, (i) уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка из (а) и (ii) уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка из (b); (f) R либо отсутствует, либо содержит сайт распознавания рестрикционного фермента, который содержит олигонуклеотидную последовательность, отсутствующую в (а)-(е); и причем: (g) множество синтетических матричных олигонуклеотидов содержит количество по меньшей мере а или по меньшей мере b уникальных олигонуклеотидных последовательностей в зависимости от того, какое значение больше, причем а представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, а b представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, и композиция содержит по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности V-участка и по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности J-участка.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках rs9652490 LINGO1 (A>G), rs11856808 LINGO1 (C>Т), rs10968280 LINGO2 (А>Т), rs7033345 LINGO2 (C>Т), rs1412229 LINGO2 (А>Т), rs10812774 LINGO2 (C>Т) и rs3794087 SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, композицию для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, набор для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, который включает в себя композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом и реакционную пробирку, набор для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ обратной транскрипции РНК-матрицы, способ амплификации нуклеиновой кислоты, композицию ПЦР с обратной транскрипцией для диагностики злокачественного новообразования.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности гена fad-3c в растении канолы. Также раскрыт набор для осуществления указанного способа.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метелирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР и способ идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу диагностики заболеваний, сопровождающихся повышенной гибелью клеток, и набору для его осуществления.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН).

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа диагностирования острого повреждения почек и применения in vitro набора, содержащего праймеры, необходимые для выполнения способа.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ профилактики африканской чумы свиней, включающий выявление животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью. В изобретении описан аптамерный ДНК олигонуклеотид, специфически связывающийся с тромбином и характеризующийся нуклеотидной последовательностью общей формулы GGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG, в котором по крайней мере один из нуклеотидов модифицирован для возможности связывания с молекулой полиэтиленгликоля и увеличения времени нахождения данного олигонуклеотида в кровотоке. В предпочтительных вариантах изобретения модификация произведена по тиминам в позициях 7, 9, 16, 23 и/или 25. Модифицированный аптамер обладает улучшенными фармакокинетическими параметрами, низкой токсичностью и высоким сродством к тромбину человека. Изобретение может быть использовано в качестве антикоагулянтного и антитромботического лекарственного средства для профилактики или лечения тромбозов различной природы. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Заявлен набор для оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР, включающий компоненты для выделения ДНК, видоспецифичные олигонуклеотидные пары праймеров для проведения одностадийной экспресс-идентификации нескольких однонуклеотидных замен в аллелях генов MTHFR, MTR, MTRR и компоненты для детекции результатов гель-электрофорезом. Изобретение позволяет с высокой точностью определять степень предрасположенности к заболеваниям, связанным с нарушениями репродуктивной, сердечно-сосудистой систем, канцерогенезу и др. патологиям по изучению полиморфизма в генах фолатного цикла.

Настоящее изобретение относится к биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путём амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S рРНК. Указанный набор содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям консервативных участков региона гена 28S рРНК микромицетов. Олигонуклеотидные праймеры имеет следующую структуру: 5'-CATATCAATAAGCGGAGG-3' (прямой праймер Fungi 28S-f) и 5'-CGACCAATATTTAGCTTTAG-3' (обратный праймер Fungi 28S-r). Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для амплификации и секвенирования фрагмента гена 28S рибосомальной РНК различных видов возбудителей микозов для анализа нуклеотидных последовательностей, установления видовой принадлежности чистых культур микромицетов, изучения их филогенетического родства на видовом уровне и идентификации медицински значимых микромицетов. 4 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы. Проводят молекулярно-генетическое исследование биопсийных образцов опухолевой ткани с последующим выделением РНК и определением уровня гена YKL-39 с помощью количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой уровень экспрессии YKL-39 составляет 1 УЕ. При уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют низкий риск развития лимфогенных метастазов. При уровне экспрессии YKL-39 менее 1 УЕ прогнозируют высокий риск лимфогенного метастазирования. Изобретение обеспечивает повышение точности способа за счет выявления новых маркеров и их числовых показателей, позволяющих прогнозировать течение заболевания и оценивать риск возникновения лимфогенного метастазирования у больных раком молочной железы. 1 табл., 2 пр.
Наверх