Способ оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом пцр и набор для его осуществления


 


Владельцы патента RU 2631926:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный университет" (RU)

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Заявлен набор для оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР, включающий компоненты для выделения ДНК, видоспецифичные олигонуклеотидные пары праймеров для проведения одностадийной экспресс-идентификации нескольких однонуклеотидных замен в аллелях генов MTHFR, MTR, MTRR и компоненты для детекции результатов гель-электрофорезом. Изобретение позволяет с высокой точностью определять степень предрасположенности к заболеваниям, связанным с нарушениями репродуктивной, сердечно-сосудистой систем, канцерогенезу и др. патологиям по изучению полиморфизма в генах фолатного цикла.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности диагностики, молекулярной генетики и молекулярной биологии, и касается способа оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР с последующей детекцией результатов гель-электрофорезом и набора для его осуществления.

Фолатный цикл представляет собой сложный каскадный процесс, контролируемый ферментами, которые в качестве коферментов имеют производные фолиевой кислоты. Эта кислота является сложной молекулой, состоящей из птероидной кислоты и одного (моноглутаматы) или нескольких (полиглутаматы) остатков глутаминовой кислоты. Ключевым этапом в данном процессе является синтез метионина из гомоцистеина. Это достигается в процессе превращения фолатов: восстановления 5,10-метилентетрагидрофолата до 5-метилтетрагидрофолата, несущего метильную группу, которая необходима для превращения гомоцистеина в метионин. Восстановление фолатов происходит при участии фермента метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR). Метильная группа переносится на В12, который затем отдает ее гомоцистеину, образуя метионин с помощью фермента метионин-синтазы (MTR). Однако в некоторых случаях В12 может окисляться, что приводит к подавлению метионин-синтазы. Для поддержания активности фермента необходимо восстановительное метилирование с помощью фермента метионин-синтаза-редуктазы (MTRR).

В этом цикле происходит перенос метальных групп и осуществляется метаболизм гомоцистеина. Метаболизм фолатов (производных фолиевой кислоты) - важное звено первичного метаболизма клетки. Обмен фолатов является поставщиком одноуглеродных фрагментов для таких жизненно важных клеточных процессов, как регенерация метионина, биосинтез пуриновых нуклеотидов и превращение уридинмонофосфата в тимидилат, метилирование ДНК и РНК. Одноуглеродные остатки, поступающие в обмен фолатов, образуются при катаболизме некоторых аминокислот (серина, глицина, гистидина), а также при катаболизме холина.

Помимо процессов катаболизма, одноуглеродные остатки поступают в обмен фолатов при детоксикации формальдегида, а также при утилизации формиата - побочного продукта клеточного метаболизма.

Дефицит производных фолиевой кислоты, связанный с особенностями диеты, а также мутации в генах фолатного обмена, обусловливающие снижение активности ферментов, приводят к избыточному накоплению гомоцистеина в крови и, как следствие, нарушению процессов метилирования в клетках. Анализ мутаций в генах фолатного цикла - метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионин-синтазы-редуктазы (MTRR) и метионин-синтазы (MTR) позволяет определить предрасположенность к таким заболеваниям, как фетоплацентарная недостаточность, незаращение нервной трубки, нарушение расхождения хромосом в оогенезе (повышает риск рождения детей с синдромом Дауна) и другим патологиям плода, несовместимым с жизнью, атеросклероз, атеротромбоз, инфаркт и др. [2, 4].

Исследование полиморфизма гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) имеет прогностическое значение и позволяет определить риск развития онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний, а также дефектов внутриутробного развития во время беременности из-за нарушения обмена фолиевой и кислоты и гипергомоцистеинемии, оценить вероятность патологии у потомства, что дает возможность своевременного принятия мер посредством назначения корректирующей терапии.

В настоящее время известны следующие наборы и тест-системы для определения полиморфизма генов фолатного цикла: ДНК-технология «Генетика метаболизма фолатов». Метод для определения полиморфизма генов основан на технологии ПЦР с анализом кривых плавления дает возможность идентифицировать фрагменты ДНК путем детекции изменений в уровне флуоресценции комплекса фрагмент-проба (меченный флуорофором олигонуклеотидный зонд) на этапе его денатурации и последующего построения графика кривой плавления [3]. Недостатком набора является выделение ДНК только из крови, детекция результатов и программное обеспечение подходит только к определенному прибору - детектирующему амплификатору для ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (приборы серии ДТ производства ООО «НПО ДНК-Технология»). Набор для изучения полиморфизмов генов фолатного цикла SNP-экспресс (Литех, Москва) с последующей детекцией результатов гель-электрофорезом (его недостатком является выделение ДНК из крови) [1], которые являются близкими к предлагаемому изобретению. Однако идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Задачей настоящего изобретения является создание набора для оценки полиморфизмов генов фолатного цикла методом ПЦР с последующей детекцией результатов гель-электрофорезом.

Набор для регистрации 4 полиморфизмов в генах MTHFR, MTRR, MTR позволяет регистрировать в одной пробирке замены с.665С>Т, с.1286А>С в гене MTHFR, c.66A>G в гене MTRR и c.2756A>G в гене MTR методом специфической лигазной реакции.

Решение задачи настоящего изобретения - оценка полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР с последующей детекцией результатов гель-электрофорезом и набор для его осуществления. Для этого экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения мультиплексной цепной реакции, подобрано сочетание праймеров, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР, что является важным при проведении ПЦР анализа.

Заявляемая тест-система разделена на 3 комплекта:

- комплект 1 содержит компоненты для выделения ДНК, упакованные в шесть пластиковых флаконов, содержащих раствор 1 (6М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4М раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ-буфер), нуклеосорбент;

- комплект 2 содержит компоненты для проведения ПЦР и включает 2 пластиковые пробирки со смесью 1 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 2 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 3 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 4 (праймеры, дНТФ и вода), 1 пластиковую пробирку с 10-кратным буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую Taq-полимеразу, 1 пластиковую пробирку с ТЕ-буфером;

- комплект 3 содержит компоненты для учета результатов анализа и включает 1 пластиковый флакон, содержащий ТАЕ буфер, 2 флакона с агарозой для электрофореза и 1 флакон с буфером для нанесения проб.

Тест-система предназначена для определения методом мультилокусной полимеразной цепной реакции полиморфизма в генах фолатного цикла. Система рассчитана на проведение 50 определений, включая контрольные образцы.

Заявляемый способ идентификации включает следующие этапы.

а) Выделение ДНК (комплект 1).

б) Проведение ПЦР (комплект 2).

ПЦР проводят в один этап по следующей программе: предварительная денатурация 96°С - 2 мин, 25 циклов из 96°С - 10 с, 58,2°С - 10 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин.

в) Визуализация полученных результатов гель-электрофорезом (комплект 3).

Пример

Исследование проведено на девушках и женщинах добровольцах в возрасте от 18 до 33 лет русской и казахской национальностей, всего 91 человек. Все испытуемые были проинформированы о содержании работы, заполнили согласие на проведение исследования и анкету с вопросами о возрасте, национальности, регулярности менструального цикла, заболеваниях самих добровольцев и их матерей, образе жизни.

У них забиралась кров из вены, из которой затем проводили выделения ДНК и изучение мутаций генов MTHFR метилентетрагидрофолатредуктазы, MTRR метионин-синтаза-редуктазы и MTR метионин-синтазы методом ПЦР. После выделения ДНК из крови и постановки ПЦР, проводили анализ и статистическую обработку данных нуклеотидных замен гена MTHFR, MTRR и MTR., после чего мы распределяли полиморфные аллели в гомо- и гетерозиготном состоянии по группам в зависимости от национальности добровольцев. Кроме того, нами была определена корреляция полиморфных вариантов данного гена с заболеваниями испытуемых.

Изучаемые полиморфизмы генов:

MTHFR (метилентетрагидро-фолатредуктаза)

Полиморфизм: MTHFR:677 С>Т

Нейтральный аллель: С/С

Аллель риска: С/Т, Т/Т Частота - 30-40%

Полиморфизм: MTHFR:1298 А>С

Нейтральный аллель: А/А

Аллель риска: А/С, С/С Частота - 20-30%

Локализован на хромосоме 1р36.3

MTR (В12-зависимая метионин-синтаза)

Полиморфизм: MTR:2756 A>G

Нейтральный аллель: А/А

Аллель риска: A/G, G/G Частота - 20-30%

MTRR (метионин-синтаза редуктаза)

Полиморфизм: MTRR:66 A>G

Нейтральный аллель: А/А

Аллель риска: А/А, G/G Частота - 40-50%

Расположен на хромосоме 5р15.3-р15.2

ПЦР проводили в один этап по следующей программе: предварительная денатурация 96°С - 2 мин, 25 циклов из 96°С - 10 с, 58,2°С - 10 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин.

В гене MTR_2756 гомозиготная замена GG в 9 раз чаще встречалась у казахов (57,1%), в то время как у русских составила только 6,3%. Гомозиготы по норме и гетерозиготы в выборках встречались с одинаковой частотой.

Аналогичная динамика прослеживалась и для гена MTHFR_677: замена по двум аллелям ТТ у казахов достигла 19%, у русских - 2,1%. Однако в гетерозиготном состоянии этот полиморфный ген несколько чаще встречался у представителей русской национальности (41,6 к 23,8%).

Ген MTHFR_1298, в отличие от предыдущих, у русских испытуемых содержал замены значительно чаще: АС - 41,6%, СС - 12,5%, что в 1,5 и 3 раза больше, чем у казахов.

Одинаковая частота всех трех состояний в обеих популяциях выявлена для гена MTRR_66 с преобладанием гетерозигот AG над нормой АА и гомогозиготами GG.

Следует отметить высокие показатели замены обоих аллелей в выборке в целом. Кроме того, полученные результаты показывают, что этническая обусловленность замены нуклеотида в положении 677 гена MTHFR у испытуемых отличается от замены в положении 1298.

Согласно полученным результатам, из выборочной совокупности более подвержены возникновению гомозиготных нуклеотидных замен и соответствующим метаболическим эффектам представительницы казахской национальности.

Способ с использованием набора обеспечивает быстрое, простое, точное выявление полиморфизмов генов метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионин-синтазы-редуктазы (MTRR) и метионин-синтазы (MTR) фолатного цикла.

Источники информации

1. Вайнер А.С., Воронина Е.Н., Кострыкина Н.А., Филипенко М.Л. Полиморфные варианты генов фолатного цикла в популяции жителей Новосибирска. Вестник НГУ, 2008, Том 6, выпуск 2. - С. 13-19.

2. Добролюбов А.С., Липин М.А., Поляков А.В., Фетисова И.Н. Полиморфизм генов фолатного обмена и болезни человека // Вестник новых медицинских технологий, 2006. - Т. 13, №4 С. 71-73.

3. Иевлева К.Д., Баирова Т.А., Колесников С.И., Калюжная О.В. Распространенность полиморфизма 2756A>G гена метионинсинтазы в популяциях Восточной Сибири // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2014. - №6(100). - С. 108-110.

4. Ковалев В.В. Роль полиморфизма генов системы фолатного цикла в реализации программы Эко и ПЭ (литературный обзор) / Вестник УМАН, 2009. - №4.

Набор для оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР включает тест-систему, разделенную на 3 комплекта:

- комплект 1 содержит компоненты для выделения ДНК, упакованные в шесть пластиковых флаконов, содержащих раствор 1 (6М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4М раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ-буфер), нуклеосорбент;

- комплект 2 содержит компоненты для проведения ПЦР и включает 2 пластиковые пробирки со смесью 1 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 2 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 3 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 4 (праймеры, дНТФ и вода), 1 пластиковую пробирку с 10-кратным буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую Taq-полимеразу, 1 пластиковую пробирку с ТЕ-буфером;

- комплект 3 содержит компоненты для учета результатов анализа и включает 1 пластиковый флакон, содержащий ТАЕ буфер, 2 флакона с агарозой для электрофореза и 1 флакон с буфером для нанесения проб,

отличающийся тем, что тест-система предназначена для определения методом мультилокусной полимеразной цепной реакции полиморфизма с детекцией результатов гель-электрофорезом в генах фолатного цикла, позволяет выделять ДНК из любой биологической жидкости, рассчитана на проведение 50 определений, включая контрольные образцы, и содержит этапы:

а) выделение ДНК (комплект 1),

б) проведение ПЦР (комплект 2),

в) визуализация полученных результатов гель-электрофорезом (комплект 3).



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью.

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике и онкологии, и касается способа выявления генных мутаций BRAF в опухолях человека. Осуществляют амплификацию исследуемого фрагмента гена BRAF посредством асимметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan: BRAF-15-sense – 5'-ROX-aggtgattttggtctagctacagtgaaatc-BHQ2 и BRAF-15-antisense – 5'-Су5-acccactccatcgagatttcactgta-BHQ2 и праймерами: прямой – 5'-gagatctactgttttcctttactt, обратный – 5'-ggccaaaaatttaatcagt.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для стандартизации эффективности амплификации набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации перестроенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, полученном из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем каждый рецептор адаптивной иммунной системы содержит вариабельный участок и соединительный участок, причем композиция содержит: множество синтетических матричных олигонуклеотидов, причем каждый синтетический матричный олигонуклеотид имеет известную концентрацию до амплификации и олигонуклеотидную последовательность общей формулы: , причем: (а) V представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 20 и не более 1000 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей вариабельный (V) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый V содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка; (b) J представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 15 и не более 600 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей соединительный (J) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый J содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка; (с) U1 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) первой специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (d) U2 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) второй специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (e) присутствует по меньшей мере один из B1, В2, В3 и В4 и каждый из B1, В2, В3 и В4 содержит олигонуклеотид В, содержащий последовательность штрихкода из 3-25 последовательных нуклеотидов, которая уникальным образом идентифицирует в качестве спаренной комбинации, (i) уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка из (а) и (ii) уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка из (b); (f) R либо отсутствует, либо содержит сайт распознавания рестрикционного фермента, который содержит олигонуклеотидную последовательность, отсутствующую в (а)-(е); и причем: (g) множество синтетических матричных олигонуклеотидов содержит количество по меньшей мере а или по меньшей мере b уникальных олигонуклеотидных последовательностей в зависимости от того, какое значение больше, причем а представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, а b представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, и композиция содержит по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности V-участка и по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности J-участка.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках rs9652490 LINGO1 (A>G), rs11856808 LINGO1 (C>Т), rs10968280 LINGO2 (А>Т), rs7033345 LINGO2 (C>Т), rs1412229 LINGO2 (А>Т), rs10812774 LINGO2 (C>Т) и rs3794087 SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, композицию для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, набор для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, который включает в себя композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом и реакционную пробирку, набор для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ обратной транскрипции РНК-матрицы, способ амплификации нуклеиновой кислоты, композицию ПЦР с обратной транскрипцией для диагностики злокачественного новообразования.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности гена fad-3c в растении канолы. Также раскрыт набор для осуществления указанного способа.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метелирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР и способ идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу диагностики заболеваний, сопровождающихся повышенной гибелью клеток, и набору для его осуществления.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН).

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Настоящее изобретение относится к биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путём амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S рРНК. Указанный набор содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям консервативных участков региона гена 28S рРНК микромицетов. Олигонуклеотидные праймеры имеет следующую структуру: 5'-CATATCAATAAGCGGAGG-3' (прямой праймер Fungi 28S-f) и 5'-CGACCAATATTTAGCTTTAG-3' (обратный праймер Fungi 28S-r). Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для амплификации и секвенирования фрагмента гена 28S рибосомальной РНК различных видов возбудителей микозов для анализа нуклеотидных последовательностей, установления видовой принадлежности чистых культур микромицетов, изучения их филогенетического родства на видовом уровне и идентификации медицински значимых микромицетов. 4 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы. Проводят молекулярно-генетическое исследование биопсийных образцов опухолевой ткани с последующим выделением РНК и определением уровня гена YKL-39 с помощью количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой уровень экспрессии YKL-39 составляет 1 УЕ. При уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют низкий риск развития лимфогенных метастазов. При уровне экспрессии YKL-39 менее 1 УЕ прогнозируют высокий риск лимфогенного метастазирования. Изобретение обеспечивает повышение точности способа за счет выявления новых маркеров и их числовых показателей, позволяющих прогнозировать течение заболевания и оценивать риск возникновения лимфогенного метастазирования у больных раком молочной железы. 1 табл., 2 пр.
Наверх