Способ определения цитотоксической активности nk-клеток

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения цитотоксической активности NK-клеток в отношении клеток трофобласта. Способ включает выделение фракции мононуклеарных клеток, содержащих NK-клетки, из периферической крови. Проводят инкубацию в культуральной среде мононуклеаров в присутствии клеток-мишеней с последующей оценкой количества погибших клеток путем проточной цитофлуометрии. При этом мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубируют в культуральной среде DMEM в течение 4 часов в присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3. Часть клеток трофобласта инкубируют в культуральной среде DMEM без мононуклеаров в течение 4 часов. Затем определяют количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, и базовое количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без мононуклеаров периферической крови. Определяют цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта по формуле: ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1баз/Х2баз)×100, где ЦЭ - цитотоксическая активность NK-клеток, X1 - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, Х2 - количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, Х1баз. - базовое количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; Х2баз. - базовое количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров. Использование данного способа позволяет получить количественную оценку цитотоксической активности NK-клеток, что дает возможность проводить мониторинг течения беременности. 6 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки цитотоксической активности NK-клеток фракции мононуклеаров периферической крови.

Известен способ определения цитотоксической активности NK-клеток по интенсивности индукции гибели клеток-мишеней перевиваемой линии К562 (Муругин В.В. Комплекс методов исследования NK-клеток в норме и при патологии // Диссертация … канд. мед. наук. Москва, 2012, стр. 134). Для мечения клеток-мишеней линии К562 используют флуоресцентный краситель 5-,6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир (КФДЭ), который образует прочную ковалентную связь с внутриклеточными белками и в используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клеток (Ковальчук Л.В., Игнатьева Г.А., Ганковская Л.В. Иммунология. Практикум. Учебное пособие // 2010. - Р. 176). Учет флуоресценции проводится при помощи метода проточной цитофлуориметрии, позволяющего проанализировать большое количество клеток.

Недостаток способа: не учитываются особенности функциональных взаимодействий NK-клеток при различных физиологических процессах, например при беременности.

Данные литературы (Hunt J.S., Petroff M.G., McIntire R.H., Ober С. HLA-G and immune tolerance in pregnancy // FASEB J. - 2005. - Vol. 19, №7. P. 681-93) указывают на возможность образования NK-клеток децидуальной оболочки из NK-клеток периферической крови. Непосредственное взаимодействие клеток трофобласта и NK-клеток является неотъемлемым процессом, происходящим при физиологической беременности. В настоящее время малоизученным остается вопрос о характере взаимодействия клеток трофобласта и NK-клеток при беременности. При помощи существующих способов оценки цитотоксической активности NK-клеток не представляется возможным полноценно моделировать in vitro подобное взаимодействие клеток при беременности.

Техническим результатом изобретения является создание способа определения цитотоксической активности фракции NK-клеток мононуклеаров периферической крови в отношении клеток трофобласта, который может быть использован для проведения мониторинга цитотоксической активности NK-клеток пациенток с физиологической беременностью, а также для исследований функциональной активности NK-клеток пациенток с патологиями беременности.

Указанный технический результат достигается тем, что в заявленном способе определения цитотоксической активности NK-клеток, включающем выделение фракции мононуклеарных клеток, содержащих NK-клетки, из периферической крови, инкубацию в культуральной среде мононуклеаров в присутствии клеток-мишеней и последующую оценку количества погибших клеток путем проточной цитофлуометрии, согласно изобретению мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубируют в культуральной среде DMEM в течение 4 часов в присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3, часть клеток трофобласта инкубируют в культуральной среде DMEM без мононуклеаров в течение 4 часов, затем определяют количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, и базовое количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без мононуклеаров периферической крови, определяют цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта по формуле:

ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1баз/Х2баз)×100,

где ЦЭ - цитотоксическая активность NK-клеток,

X1 - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови,

Х2 - количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови,

X1баз. - базовое количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров,

Х2баз. - базовое количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров.

В исследование, на котором основано изобретение, было включено 89 пациентов, среди которых были 54 здоровые небеременные женщины без предшествующих беременностей в анамнезе (Группа 1), 14 здоровых мужчин (Группа 2) и 21 здоровая беременная женщина на сроке 6-7 недель.

Для каждого пациента проводили оценку цитотоксического эффекта NK-клеток в четырех повторах.

Полученные данные были статистически обработаны с помощью программы Statistica 10. Для сравнения полученных данных использовался U-критерий Манна-Уитни, являющийся непараметрическим аналогом t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми признавались различия при р<0,05.

В таблице 1 для каждой группы пациентов представлены значения медианы, в фигурных скобках приведены значения верхнего и нижнего квартиля.

Установлено, что группа 1 (здоровые небеременные женщины) статистически не отличается от группы 2 (здоровые мужчины). Группа 3 (здоровые беременные женщины на сроке 6-7 недель) отличается от группы 1 (здоровые небеременные женщины).

Вероятно, выявленный с помощью предлагаемого способа сниженный цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта в группе здоровых беременных женщин в сравнении с группой здоровых небеременных женщин определяется контактами NK-клеток данных пациенток с клетками трофобласта in vivo и подавлением их цитотоксической функции.

Способ иллюстрируется фиг. 1-6, где:

на фиг. 1 представлена двумерная гистограмма относительного количества клеток трофобласта линии Jeg-3 с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат SSC. Регион Cells содержит клетки трофобласта;

на фиг. 2 представлена двумерная гистограмма образца клеток трофобласта линии Jeg-3, неокрашенных красителем КФДЭ (отрицательный контроль), с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат FITC. Клетки спроецированы из региона Cells;

на фиг. 3 представлена двумерная гистограмма относительного количества клеток трофобласта линии Jeg-3 с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат FITC. Регион Jeg-3 содержит клетки трофобласта, окрашенные красителем КФДЭ. Клетки спроецированы из региона Cells;

на фиг. 4 представлена двумерная гистограмма относительного количества клеток трофобласта линии Jeg-3, неокрашенных красителем пропидия иодида (отрицательный контроль), с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат РЕ. Клетки спроецированы из региона Jeg-3;

на фиг. 5 представлена двумерная гистограмма относительного количества погибших клеток трофобласта линии Jeg-3, окрашенных красителем пропидия иодида, с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат РЕ. Регион Dead cells содержит клетки трофобласта, окрашенные красителем РЕ. Клетки спроецированы из региона Jeg-3;

на фиг. 6 представлена двумерная гистограмма относительного количества погибших клеток трофобласта линии Jeg-3, окрашенных красителем пропидия иодида, после инкубации в присутствии мононуклеаров периферической крови, с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат РЕ. Регион Dead cells содержит клетки трофобласта, окрашенные красителем РЕ. Клетки спроецированы из региона Jeg-3.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Для оценки цитотоксической активности NK-клеток фракции мононуклеаров периферической крови в отношении клеток трофобласта используют клетки трофобласта линии Jeg-3.

I. Порядок исследования.

1. Подготовка рабочих растворов.

1.1. Культуральная среда DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия (полная культуральная среда).

1.2. Раствор Версена стерильный.

1.3. Раствор Трипсина стерильный.

1.4. Раствор градиента плотности фиколл-верографин.

1.5. Раствор Хенкса стерильный.

2. Подготовка необходимых материалов.

2.1. Планшет 96-луночный, стерильный, с крышкой, прозрачный, круглодонный.

2.2. Флакон для культивирования прилипающих культур с вентилируемой синей крышкой 75 см2.

2.3. Камера Горяева.

2.4. Стерильные наконечники на 5 мл.

2.5. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 300 мкл, до 1000 мкл.

2.6. Конические стерильные пробирки объемом 13 мл, 15 мл, 50 мл.

2.9. Раствор пропидия иодида 1 мкг/мл, приготовленный на PBS.

3. Подготовка необходимого оборудования.

3.1. Вертикальный ламинарно-потоковый шкаф.

3.2. Набор механических дозаторов переменного объема.

3.3. Центрифуга.

3.4. Термостат.

3.5. Вортекс.

3.6. Холодильник 6+2°С.

3.7. СO2 инкубатор.

3.8. Проточный цитофлуориметр, оборудованный 488 нм лазером, датчиками прямого и непрямого светорассеяния, датчиками учета флуоресценции FITC (519 нм), РЕ (578 нм).

II. Культивирование клеток трофобласта линии Jeg-3.

Порядок работы

1. До начала процедуры прогреть стерильные контейнеры со средой для культивирования клеток трофобласта, стерильным раствором Трипсина и стерильным раствором Версена при температуре 37°С.

2. Все необходимые материалы, перечисленные в пункте 2 раздела I, внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.

3. Смешать стерильно раствор Трипсина с раствором Версена (ТВ), содержащий равные части раствора Трипсина и раствора Версена.

4. Аккуратно слить старую среду из флакона 75 см2 для культивирования с клетками трофобласта, добавить 5 мл стерильного раствора ТВ, чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить раствор ТВ. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора ТВ. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором. Похлопать флакон по бокам, чтобы снять клетки со стенок флакона.

5. Добавить 5 мл ранее приготовленной среды для клеток трофобласта во флакон 75 см2.

6. Тщательно ресуспендировать. Перенести 700 мкл среды с клетками в новый флакон 75 см2 и долить в него 10 мл среды для культивирования.

7. Культивировать клеточную культуру во влажной атмосфере с 7% СO2 при 37°С в течение 72 часов или до образования клетками 2/3 монослоя.

III. Выделение мононуклеаров из периферической крови.

1. Все необходимые материалы, перечисленные в пункте 2 раздела I, внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.

2. Подогреть Хенкс и раствор градиента плотности фиколл-верографин в термостате 37°С.

3. Подписать и внести в ламинар (из расчета на анализ 1 пациента): 1 пробирку на 50 мл, 3 пробирки на 13 мл, 1 пробирку на 15 мл.

4. Внести в пробирки на 13 мл по 4 мл раствора градиента. В пробирки на 50 мл внести по 12 мл Хенкса, в пробирки для отмывки мононуклеаров внести по 10 мл Хенкса.

5. Смешать 6 мл периферической крови с теплым раствором Хенкса в соотношении 1:2.

6. Пипеткой на 1 мл аккуратно наслоить разведенную периферическую кровь на раствор градиента из расчета на 4 мл градиента по 6 мл разведенной крови.

7. Центрифугировать 400g в течение 30 мин при 22°С.

8. Стерильно внести пробирки в ламинарно-потоковый шкаф. Отобрать 4-5 мл плазмы пипеткой на 1 мл и слить ее. Собрать кольцо мононуклеаров.

9. Перенести мононуклеары в пробирку с 10 мл раствора Хенкса.

10. Центрифугировать 200g в течение 10 мин при 22°С.

11. Аккуратно слить надосадочную жидкость, добавить к мононуклеарам 3 мл раствора Хенкса, ресуспендировать.

12. Посчитать концентрацию мононуклеаров в камере Горяева. Добавить 10 мл раствора Хенкса.

13. Центрифугировать 200g в течение 10 мин при 22°С.

14. Аккуратно слить надосадочную жидкость. Развести клетки в культуральной среде на основе DMEM до концентрации 3 млн/мл.

15. Перенести по 100 мкл клеток в лунки круглодонных планшетов.

16. Инкубировать в течение 96 часов при 37°С во влажной атмосфере и 5% СO2.

IV. Проведение эксперимента.

1. Подогреть культуральную среду DMEM, полную культуральную среду для клеток трофобласта линии JEG-3, раствор ТВ в термостате 37°С.

2. Все необходимые материалы, перечисленные в пункте 2 раздела I, внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.

3. Развести в 5 мл теплой культуральной среды DMEM 4 мкл КФДЭ (стоковый раствор: 4,48 ммоль/л) и ресуспендировать.

4. Аккуратно слить старую среду из флакона для культивирования с клетками трофобласта, добавить 5 мл стерильного раствора, внести раствор красителя КФДЭ.

5. Инкубировать в течение 10 мин при 37°С, 7% СО2.

6. Слить раствор красителя, внести 10 мл холодной культуральной среды для JEG-3 без ЭТС.

7. Повторить отмывку: слить раствор холодной культуральной среды и повторно внести 10 мл холодной культуральной среды для JEG-3.

8. Слить раствор культуральной среды.

9. Добавить во флакон для культивирования клеток трофобласта 5 мл стерильного раствора ТВ, чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить раствор ТВ. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора ТВ. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором. Похлопать флакон по бокам, чтобы снять клетки со стенок флакона.

10. Внести 2 мл теплой среды для клеток трофобласта.

11. Посчитать концентрацию клеток в камере Горяева. Развести клетки в среде для клеток JEG-3 до концентрации 0,6 млн/мл.

12. Перенести по 50 мкл клеток в планшет с предварительно засеянными мононуклеарами периферической крови, ресуспендировать. Внести в 5 лунок без мононуклеаров по 150 мкл клеток JEG-3.

13. Центрифугировать планшет при 100g в течение 3 мин при 22°С.

14. Инкубировать пробы в течение 4 часов при 37°С, 5% СО2.

15. Окрасить пробы красителем пропидия иодида. Конечная концентрация пропидия иодида должна составлять 2 мкг/мл. Оставить неокрашенной 1 пробу с клетками JEG-3.

16. Инкубировать пробы 20 минут при 4°С.

17. Добавить в пробы по 300 мкл стандартного фосфатно-солевого буфера.

V. Проведение анализа и учет результатов.

Анализ клеток проводят на проточном цитофлуориметре, оборудованном 488 нм лазером, по четырем параметрам: интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции по каналу FITC (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 519 нм), флуоресценции по каналу РЕ (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 578 нм). Анализируется 10000 событий. На двумерной гистограмме с координатами FSC-SSC выделяют регион Cells, содержащий клетки трофобласта (фиг. 1). Клетки из региона Cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-FITC (фиг. 2). Границу квадрантов на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, неокрашенной раствором КФДЭ (фиг. 2). При измерении опытной пробы, окрашенной раствором КФДЭ, клетки из региона Cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-FITC. Определяют количество событий в квадранте Jeg-3 (фиг. 3), данное количество соответствует количеству клеток трофобласта. Затем события из квадранта Jeg-3 проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-PE. Границу квадрантов на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, неокрашенной раствором пропидия иодида (фиг. 4). При измерении опытной пробы, окрашенной растворами КФДЭ и пропидия иодида, на двумерной гистограмме с координатами FSC-PE анализируют относительное количество погибших клеток трофобласта линии Jeg-3 (клетки из квадранта Jeg-3, окрашенные красителем пропидия иодида) (фиг. 5). Регион Dead cells содержит клетки трофобласта, окрашенные раствором пропидия иодида. Количество событий в квадранте Dead cells соответствует нежизнеспособным клеткам трофобласта (фиг. 5). Гибель клеток в контрольной лунке (после инкубации клеток трофобласта без мононуклеаров периферической крови) не должна превышать 30%.

Затем проводят учет количества событий в квадранте Dead cells после инкубации клеток трофобласта с мононуклеарами периферической крови (фиг. 6). По количеству событий в квадрантах Dead cells определяют процент нежизнеспособных клеток трофобласта.

Затем вычисляют цитотоксический эффект NK-клеток фракции мононуклеаров периферической крови по формуле:

ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1баз/Х2баз)×100.

Параметр X1 соответствует количеству событий в гейте Dead cells после измерения пробы клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови (фиг. 6). Параметр Х2 соответствует количеству событий в гейте Jeg-3 после измерения пробы клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови (фиг. 6). Параметр X1баз соответствует количеству событий в гейте Dead cells после измерения пробы клеток трофобласта, инкубированных без мононуклеаров периферической крови (фиг. 5). Параметр Х2баз соответствует количеству событий в гейте Jeg-3 после измерения пробы клеток трофобласта, инкубированных без мононуклеаров периферической крови (фиг. 5).

Пример 1. Пациентка А. Параметр X1=959 событие. Параметр Х2=2378 события. Параметр X1баз=624 события. Параметр Х2баз=3003 событий.

ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1баз/Х2баз)×100=(959/2378)×100-(624/3003)×100=19,5%.

Способ позволяет получить количественную оценку цитотоксической активности NK-клеток в отношении клеток трофобласта при их взаимодействии. Оценка цитотоксического эффекта NK-клеток в отношении клеток трофобласта может быть применена для мониторинга физиологического течения беременности, а также для исследований функциональной активности NK-клеток при патологии беременности.

Способ определения цитотоксической активности NK-клеток, включающий выделение фракции мононуклеарных клеток, содержащих NK-клетки, из периферической крови, инкубацию в культуральной среде мононуклеаров в присутствии клеток-мишеней и последующую оценку количества погибших клеток путем проточной цитофлуометрии, отличающийся тем, что мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубируют в культуральной среде DMEM в течение 4 часов в присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3, часть клеток трофобласта инкубируют в культуральной среде DMEM без мононуклеаров в течение 4 часов, затем определяют количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, и базовое количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без мононуклеаров периферической крови, определяют цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта по формуле:

ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1баз/Х2баз)×100,

где ЦЭ - цитотоксическая активность NK-клеток,

X1 - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови,

Х2 - количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови,

Х1баз - базовое количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;

Х2баз - базовое количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике гастроэнтерологии, может быть использовано для диагностики степени тяжести цирроза печени смешанной этиологии.Способ диагностики степени тяжести цирроза печени смешанной этиологии с помощью анализа крови заключается в том, что у пациентов в сыворотке крови определяют уровень интерлейкина-6, и при значении интерлейкина-6 менее или равном 12,7 пг/мл диагностируют легкую (компенсированную) степень цирроза печени, при концентрации интерлейкина-6 более 12,7 пг/мл и менее или равной 26,2 пг/мл диагностируют умеренную (субкомпенсированную) степень, при уровне интерлейкина-6 более 26,2 пг/мл - тяжелую (декомпенсированную) степень цирроза печени.Технический результат: повышение доступности и простоты выполнения при высокой чувствительности, специфичности и объективности способа.

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и микробиологии и касается штамма вируса Эбола Заир. Представленный штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 выделен из крови больного лихорадкой Эбола во время эпидемии в Гвинее 2014-2015 гг.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкоурологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития стеноза везикоуретрального анастомоза после радикальной простатэктомии.

Изобретение относится медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для определения субпопуляционного состава клеток кожи. Способ определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи включает забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°С, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°С.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, педиатрии и аллергологии, и может использоваться для прогнозирования степени тяжести атопического дерматита у детей.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и клинической иммунологии. У больных определяют клинико-анамнестические и лабораторно-инструментальные критерии диагностики псориатического артрита и присваивают им баллы.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики параимплантарного воспаления после эндопротезирования крупных суставов, характеризующийся тем, что производят забор крови, готовят образцы сыворотки крови, осуществляют исследование сыворотки крови с помощью иммуноферментного анализа, определяя количественные значения показателей: фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), и белка, стимулирующего макрофаги (MSP), а также интерлейкинов 1, 4, 8, 10 (IL1, IL4, IL8, IL10), рассчитывают коэффициент выраженности макрофагальной реакции и коэффициент выраженности гуморального ответа , определяют показатель развития параимплантарного воспаления К, равный (К1+К2)-2.7, и при его отрицательных значениях констатируют регресс патологического процесса, при положительных значениях - прогресс патологического процесса.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки влияния алюминия на иммунный статус. Для этого в пробе крови пациента определяют содержание алюминия, и в тех пробах крови пациентов, где содержание алюминия выше референтного значения, извлекают иммунокомпетентные клетки.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа диагностирования острого повреждения почек и применения in vitro набора, содержащего праймеры, необходимые для выполнения способа.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для диагностики периода инфекционного процесса, вызванного вирусом ветряной оспы.

Изобретение относится к медицине и предназначено для выделения и исследования иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), из сыворотки крови человека. Агрегируют из сыворотки крови человека множественно модифицированные ЛНП в условиях 9,1% ПВП-35000 при комнатной температуре, осаждают центрифугированием, тщательно декантируют. Полученный супернатант инкубируют при 4°С в течение 30 мин. Образовавшиеся агрегаты ИК-ммЛНП осаждают повторным центрифугированием, декантируют, растворяют преципитат в буфере без ПВП и определяют содержание холестерина, триацилглицеринов. Определяют содержание IgG в составе преципитата. Исследуют комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих ммЛНП. Способ может применяться для ранней диагностики субклинического атеросклероза. 1 ил., 5 табл., 3 пр.
Группа изобретений относится к медицине и касается диагностических реагентов для клинической лабораторной диагностики сифилитической инфекции. Заявлены стабилизированный кардиолипиновый антиген и способ его получения. Кардиолипиновый антиген получен способом, включающим приготовление буферного раствора с последовательным добавлением друг к другу ЭДТА динатриевой соли, натрия фосфорнокислого 2-замещенного, калия фосфорнокислого 1-замещенного, холин-хлорида, тимеросала (мертиолята), воды очищенной, далее получившийся раствор перемешивают и фильтруют, после чего приготавливают спиртовой раствор липидов, для этого смешивают кардиолипин, лецитин, холестерин и спирт этиловый абсолютированный, затем осуществляют смешение буферного раствора и спиртового раствора. Техническими результатами группы изобретений является:- законченный цикл получения готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена на производственном предприятии,- контроль качества и обеспечение длительной специфической активности приготовленного реагента в реакции микропреципитации при диагностике сифилиса с исключением этапа лабораторного приготовления рабочей эмульсии Аг Кл. 2 н.п. ф-лы, 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli, являющегося продуцентом антигена возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis. Представленный штамм получен на основе протективного антигена Bacillus anthracis путем введения в штамм E. coli BL21 (DE3) плазмиды pGEM-TTPPAG. Плазмида pGEM-TTPPAG содержит в своем составе промотор фага Т7, который контролирует экспрессию слитого гена, представляющего собой полноразмерный ген ТТP бактериофага DT57C (кодирует белок трубки хвоста pb6), слитый через 3’-конец с геном протективного антигена B. anthracis, и экспрессирующегося в форме вирусоподобных частиц. Изобретение обеспечивает выход целевого продукта в оптимальных условиях культивирования не ниже 1 г/л культуры, а также позволяет получить основной защитный антиген возбудителя сибирской язвы B. anthracis в форме вирусоподобных частиц (ВПЧ), имеющих размер 225,4 нм, что облегчает его очистку и потенциально повышает иммуногенность. Полученные ВПЧ, свободные от растворимого клеточного белка, могут использоваться в качестве антигена для иммунизации. 5 ил., 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli, являющегося продуцентом антигена возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis. Представленный штамм получен на основе протективного антигена Bacillus anthracis путем введения в штамм E. coli BL21 (DE3) плазмиды pTrPPA. Плазмида pTrPPA содержит в своем составе промотор фага Т7, который контролирует экспрессию слитого гена, представляющего собой продукт гена 142 Т5-подобного фага DT57C, известного как белок, терминирующий хвост (TrP), слитый через 3’-конец с доменом 1 протективного антигена B. anthracis, что позволяет при протеолитическом отщеплении в процессе транспорта токсина в цитоплазму клетки-мишени сохранять структурную стабильность антигена, и экспрессирующегося в форме вирусоподобных частиц. Изобретение обеспечивает выход целевого продукта не ниже 1 г/л культуры в оптимальных условиях культивирования, а также позволяет получать изолированный домен 1 основного защитного антигена возбудителя сибирской язвы B. anthracis в форме вирусоподобных частиц, что облегчает его очистку и потенциально повышает иммуногенность. 6 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано для диагностики аллергии. Для этого осуществляют подготовку пробы биологического материала (копрофильтрат) с последующей спектрофотометрией при 405 нм. При этом берут утреннюю пробу фекалий в количестве 1 г, растворяют ее в 9 мл фосфатно-солевого буфера с 0,05% Твином 20 (ФСБТ) рН=7,2. Затем перемешивают до однородной консистенции. После чего центрифугируют в течение 10-20 мин при 3500 об/мин. Отбирают надосадочную жидкость и проводят иммуноферментный анализ на наличие аллергенспецифических IgE-антител к пищевым аллергенам с последующей спектрофотометрией. При определении оптической плотности 0,15 ед. оптической плотности и более диагностируют аллергию к конкретному аллергену. А при определении оптической плотности менее 0,15 ед. диагностируют отсутствие аллергии к конкретному аллергену. Изобретение позволяет повысить точность диагностики пищевой аллергии на 10-12%. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, лабораторной диагностики и представляет собой способ диагностики бруксизма путем проведения клинического обследования и исследования крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови больного определяют содержание серотонина и при его концентрации ниже 180 нг/мл диагностируют бруксизм. Результатом осуществления изобретения является упрощение и ускорение процесса при высокой эффективности способа. 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, может быть использовано для прогнозирования развития жизнеопасных предсердных аритмий у больных с гипертонической болезнью. Для прогнозирования развития жизнеопасных предсердных аритмий у пациентов с гипертонической болезнью определяют содержание интерлейкина-6, интерлейкина-18 и интерлейкина-10 в сыворотке крови пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа. Далее рассчитывают коэффициент К по оригинальной формуле. При величине К более 3 прогнозируют развитие фибрилляции предсердий. Использование данного изобретения обеспечивает раннюю диагностику, объективизацию, конкретизацию прогностических критериев риска развития жизнеопасных предсердных аритмий у пациентов с гипертонической болезнью, что позволяет обеспечить адекватную лечебную тактику у данного контингента больных. 1 з.п. ф-лы, 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно, к способу определения угрозы прерывания беременности на 7-9 неделях гестации вследствие подавления активности мембранных рецепторов к прогестерону при обострении цитомегаловирусной инфекции. Способ включает определение титра антител IgG к ЦМВ на 7-9 неделе беременности и определение рецепторов к прогестерону в гомогенате хориона, и при определении на 7-9 неделе гестации титра антител IgG к ЦМВ 1:1600 и снижении в гомогенате хориона активных рецепторов к прогестерону до 14,00±0,85 нмоль/л, определяют угрозу прерывания беременности в виде самопроизвольного выкидыша. 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования развития распространенных форм инфильтративного эндометриоза. Для этого оценивают результат экспрессии иммуногистохимического маркера CD15 в биоптатах эндометрия. Проводят иммуногистохимическое исследование на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм. Экспрессию CD15 определяют в эпителиальных клетках эндометрия, результаты иммуногистохимической реакции оценивают полуколичественным методом в баллах. При этом отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (+) - 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов. При оценке экспрессии CD15 от 2 до 6 диагностируют распространенные формы инфильтративного эндометриоза. Изобретение позволяет прогнозировать развитие распространенных форм инфильтративного эндометриоза путем определения экспрессии маркера CD15 в образцах ткани эндометрия. 1 ил., 4 пр.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа идентификации В-клеточного клона, который специфически связывается с мишеневым антигеном, предусматривающего наличие множества В-клеток; взаимодействие В-клеток с мишеневым антигеном, где мишеневый антиген содержит первую сортируемую метку, и окрашивание множества В-клеток анти-IgG антителами, содержащими вторую сортируемую метку, и анти-IgM антителами, содержащими третью сортируемую метку; отделение от множества В-клеток одной или нескольких В-клеток, которые могут специфически связываться с мишеневым антигеном, используя клеточный сортер. Группа изобретений также касается способа идентификации В-клеточного клона, который специфически связывается с мишеневым антигеном, предусматривающего дополнительно иммунизирование животного мишеневым антигеном и выделение множества В-клеток из иммунизированного животного. Группа изобретений обеспечивает идентификацию В-клеточного клона, который специфически связывается с мишеневым антигеном. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 14 ил., 13 табл., 5 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения цитотоксической активности NK-клеток в отношении клеток трофобласта. Способ включает выделение фракции мононуклеарных клеток, содержащих NK-клетки, из периферической крови. Проводят инкубацию в культуральной среде мононуклеаров в присутствии клеток-мишеней с последующей оценкой количества погибших клеток путем проточной цитофлуометрии. При этом мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубируют в культуральной среде DMEM в течение 4 часов в присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3. Часть клеток трофобласта инкубируют в культуральной среде DMEM без мононуклеаров в течение 4 часов. Затем определяют количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, и базовое количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без мононуклеаров периферической крови. Определяют цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта по формуле: ЦЭ×100-×100, где ЦЭ - цитотоксическая активность NK-клеток, X1 - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, Х2 - количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, Х1баз. - базовое количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; Х2баз. - базовое количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров. Использование данного способа позволяет получить количественную оценку цитотоксической активности NK-клеток, что дает возможность проводить мониторинг течения беременности. 6 ил., 1 табл., 1 пр.

Наверх