Очистка полипептидов с использованием двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ отделения представляющего интерес белка от раствора клеточной культуры с помощью двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Способ включает первую операцию с использованием устройства для ультрафильтрации в тангенциальном потоке и вторую операцию с использованием устройства для ультрафильтрации в тангенциальном потоке. При осуществлении первой операции фильтруют первый поток супернатанта клеточной культуры с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, при осуществлении второй операции фильтруют второй поток супернатанта клеточной культуры с использованием второй ультрафильтрационной мембраны. Причём при первой операции мембрана выбрана с такой границей отсечки, чтобы указанный белок собирался в ретентате, а при второй операции мембрана выбрана с такой границей отсечки, чтобы указанный белок собирался в пермеате. Изобретение обеспечивает снижение уровня загрязнителей и/или примесей в питающем потоке супернатанта клеточной культуры. 24 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам отделения представляющей интерес молекулы от содержащего указанную молекулу раствора с помощью двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке («TFF»). Способы, предлагаемые в изобретении, направлены, прежде всего, на обработку неочищенных питающих потоков, таких как кондиционированный супернатант клеточной культуры, с целью значительного снижения уровней загрязнителей и/или примесей перед осуществлением более поздних, т.е. последующих операций с использованием очистительных устройств. Способы, предлагаемые в изобретении, можно применять при обработке неочищенного питающего потока из биологических производственных систем, таких как система ферментации или другая система с использованием клеточных культур, и они позволяют также исключать необходимость в осуществлении требующих больших временных затрат процессов осаждения (например, регулируемого значением рН осаждения) примесей и/или фильтрации осадка перед осуществлением последующих процессов, чувствительных к высоким уровням примесей, таких как операции с использованием хроматографических устройств. Описанный двухстадийный процесс TFF объединяет по меньшей мере две операции с использованием устройства для TFF, которые можно осуществлять предпочтительно при значении рН, которое соответствует или близко к значению рН питающего потока, например, супернатанта клеточной культуры, как правило, при рН 7,5±1,0. Применение операций с использованием устройства для TFF для дополнения, усовершенствования или замены традиционных процессов очистки представляющих интерес белков для питающего потока может обеспечивать значительную экономию как прямых, так и косвенных затрат на обработку. Например, помимо косвенной экономии благодаря исключению процессов осаждения и фильтрации осадка снижение уровней примесей в результате операций с использованием устройства для двухстадийной TFF может приводить к косвенной экономии, обусловленной повышением характеристик используемых после этого колонок, например, улучшением хроматографического разделения, динамической связывающей способности, эксплуатационного срока службы и/или уменьшением требуемого размера колонок. В конкретных вариантах осуществления изобретения способы, предлагаемые в изобретении, применяют в процессах очистки молекул иммуноглобулина, например, антител, где указанные процессы не включают стадии аффинной очистки, например, аффинной хроматографической очистки с использованием белка А.

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к способам отделения и/или очистки представляющих интерес молекул, прежде всего биомолекул (например, белков), от/из неочищенных и/или производственных растворов, содержащих молекулы. В качестве направления биотехнологического развития все больший интерес приобретает экономически выгодная обработка в больших масштабах биомолекул из неочищенных производственных растворов. В частности, экономические вопросы производства и обработки могут играть определяющую роль в принятии решений, касающихся разработки и получения биомолекул и/или фармацевтических средств, включая ферменты, антитела и другие специализированные белки и пептиды. Для получения большинства из таких биомолекул (например, белков, полипептидов, антител) в качестве метода производства выбирают методы на основе рекомбинантной ДНК. С помощью таких методов можно осуществлять экспрессию требуемых биомолекул в больших количествах в разнообразных биологических системах. Такие системы включают клеточные системы (такие как культуры клеток бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающих (например, характеризующиеся эндогенной экспрессией представляющего интерес белка или культуры трансгенных клеток)), трансгенных животных и трансгенных растений. Биомолекулярные пути, присущие системам клеточных культур или системам in vivo также стали незаменимыми компонентами, применяемыми в системах производства in vitro. Однако при использовании указанных систем производства биофармацевтическая индустрия столкнулась одновременно с необходимостью разработки усовершенствованных или новых систем выделения требуемой биомолекулы (например, белка) из неочищенных производственных растворов или производственных материалов. Неочищенные производственные растворы включают кондиционированные среды для культивирования клеток, осветленные гомогенизированные/лизированные кондиционированные клеточные культуры, общую воду организма трансгенных животных (например, кровь, сыворотку, молоко и мочу) и производственные растворы, применяемые in vitro, которые содержат исходные материалы и компоненты помимо рассматриваемой биомолекулы. Методы выделения должны не только приводить к получению выделенного продукта, удовлетворяющего утвержденным правительством стандартам чистоты и безопасности, но они должны также быть экономически выгодными.

Процессы очистки, наиболее выгодные для выделения биомолекул из неочищенных производственных растворов, как правило, включают хроматографические процессы и/или операции с использованием устройств на основе аффинности. Хроматография на основе аффинности позволяет разделять биомолекулы на основе специфического взаимодействия представляющей интерес биомолекулы со связывающим фрагментом, иммобилизованным на твердом субстрате, таком как матрикс или гель. Таким образом, представляющая интерес биомолекула связывается с субстратом (как правило, находящимся в колонке), в то время как загрязнители и другие нежелательные компоненты питающего потока протекают через систему. Затем биомолекулу элюируют из связывающего фрагмента и/или колонки и собирают. Таким образом, колонки для аффинной хроматографии обладают очень большой специфичностью и позволяют получать продукты с очень высокой чистотой. При очистке антител, например, из сред для культивирования клеток, в качестве связывающего фрагмента для аффинной хроматографии наиболее часто применяют белок А. Аффинная хроматография на белке А характеризуется очень большой избирательностью в отношении антител и может обеспечивать чистоту продукта, получаемого из вводимого образца, такого как кондиционированные среды для клеточных культур, составляющую более 95%.

Хотя аффинная хроматография представляет собой эффективную стадию захвата и очистки, применение биоаффинных фрагментов (в данной области их называют также биоаффинными лигандами), которые связываются с требуемыми биомолекулами, также ассоциировано с высокими затратами на обработку. Например, стоимость биоаффинных лигандов (которые, как правило, сами представляют собой биомолекулы), например, белка А, в 7-15 раз выше, чем других хроматографических материалов (см. Gottschalk, Process Scale Purification of Antibodies, изд-во John Wiley & Sons, 1-е изд., 2009, глава 5.3.1). Кроме того, биоаффинные лиганды подлежат выщелачиванию из субстрата и колонки. Это не только приводит к укорачиванию срока службы колонки по сравнению с колонкой, в которой применяют, например, фильтрующие мембраны, выщелаченные лиганды обладают способностью к денатурации и могут индуцировать образование агрегатов представляющих интерес молекул. Кроме того, многие биоаффинные лиганды, такие как белок А, рассматривают/можно рассматривать как токсин, что требует осуществления непрерывного мониторинга потока продукта для выявления его присутствия. Таким образом, применение биоаффинных лигандов связано со значительными расходами, обусловленными не только прямыми затратами, например, на материалы для самой колонки, и более частым графиком замен, но также и косвенными затратами, ассоциированными с обслуживанием, мониторингом и возможными дополнительными операциями с использованием устройств (например, с необходимостью фильтрации осадка/агрегатов и/или повторного осуществления процесса). Таким образом, при любой схеме очистки биоаффинные колонки, их обслуживание и их мониторинг могут быть сопряжены с наиболее значительными затратами и их экономичная интеграция в промышленные операции может оказаться затруднительной.

Принимая во внимание высокие затраты, ассоциированные с применением биоаффинных лигандов, было изучено большое количество альтернатив для дополнения или усовершенствования методов аффинной хроматографии, включая использование синтетических аффинных лигандов и смол смешанного типа (см., Gottschalk 2009, глава 5.3.2). Кроме того, изучали также методы обработки/очистки, позволяющие полностью устранить операции с использованием устройств, функционирующих на основе аффинности. Такие методы включают фильтрацию, ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрацию и их комбинации. Например, систематическая оценка трехстадийного хроматографического процесса для очистки антитела без применения хроматографии с использованием белка А описана у Follmann и др., J. Chromatog. 1024, 2004, сс. 79-85.

Из числа процессов биомолекулярной очистки, наиболее интенсивно изученных с целью дополнения или замены процессов на основе аффинности, несколько процессов представляют собой процессы ионообменной хроматографии. В частности, было изучено применение катионообменной хроматографии («СЕХ») для целого ряда схем очистки белков, как в сочетании с операциями с использованием устройств на основе аффинности, так и в качестве их замены (см., например, Arunakumari и др., Adv. Process Chromatog. (приложение BioPharm Int.), 2007, сс. 36-40; Arunakumari и др., BioPharm. Int. Supp. 2 марта 2009 г.; Wang и др., BioPharm. Int. Supp. 2 марта 2008 г.; Gottschalk 2009, глава 5.3.3; Pharmaceutical Process Scale-Up, под ред. Cacciuttolo, изд-во CRC Press, 2-е изд. 2006, глава 5; Morrow, Gen. Eng. Biotech. News 28, 2008; публикация доступна только в режиме онлайн). Несмотря на связанные с ней надежды, ионообменная хроматография не заменила полностью аффинную хроматографию, однако она была адаптирована для того, чтобы она служила в качестве дополнительного процесса очистки в сочетании с аффинной хроматографией при осуществлении обычных промышленных процессов очистки. Однако, в случае хроматографических процессов состав загружаемого материала (например, потока продукта, вводимого в процесс/операцию с использованием устройства/колонку) имеет решающее значение для правильного функционирования колонки. Следовательно, в методах очистки, включающих хроматографические процессы/операции с использованием устройства, важной первой стадией является обработка загружаемого материала перед осуществлением хроматографического процесса. Например, до операции с использованием хроматографического устройства значение рН питающего потока (содержащего представляющую интерес молекулу), как правило, необходимо регулировать до достижения приемлемого значения, забуферивать и обеспечивать проводимость, зависящую от изоэлектрической точки конкретной представляющей интерес молекулы и от параметров конкретной колонки. Таким образом, не только конкретный хроматографический процесс, но также и состав питающего потока определяют, какие модификации необходимо осуществлять для питающего потока. Таким образом, различные варианты питающего потока могут требовать значительной модификации операций с использованием устройства и обработки питающего потока до осуществления процесса ионообменной хроматографии.

Обработку/регулировку параметров питающего потока часто осуществляют с помощью диафильтрации/фильтрации в тангенциальном потоке («TFF»). При осуществлении этой стадии обработки растворитель в питающем потоке постепенно заменяют посредством диафильтрации в процессе осуществления TFF на буфер, пригодный для конкретной хроматографической операции. Например, в случае очистки антител с помощью СЕХ в большинстве процессов регулируют питающий поток перед осуществлением СЕХ до достижения значения рН примерно от 5 до 7 при низкой проводимости, поскольку многие антитела характеризуются изоэлектрическими точками, превышающими 7. Однако, когда питающий поток представляет собой кондиционированные содержащие клетки среды (такие, например, как супернатант или гомогенизированная клеточная культура), то доведение значения рН питающего потока до уровня ниже нейтрального посредством обмена буфера часто приводит к осаждению загрязнителей, таких как ДНК клеток-хозяев («HCDNA») и белки клеток-хозяев («НСР») (см., например, у Gottschalk 2009, глава 5.3.3; Wang и др., 2008).

Явление осаждения имеет важное экономическое значение не только потому, что требует добавления по меньшей мере одной дополнительной операции с использованием устройства (для удаления осадков), но также и потому, что процессы осаждения могут оказывать негативное влияние на саму операцию с использованием устройства для обмена буфера (например, в процессе операции колонка для диафильтрации/TFF может закупориваться осадком). Таким образом, обработка белков из рекомбинантных клеточных культур с помощью хроматографических процессов, как правило, требует применения дорогостоящих операций с использованием устройств, таких как отстойники и/или фильтрующие устройства (см., например, Wang и др., 2009).

Таким образом, несмотря на надежды, связанные с ионообменной хроматографией, в промышленных условиях она оказалась недостаточно эффективной для того, чтобы полностью заменить операции с использованием устройств на основе аффинности, и в большинстве процессов, применяемых для коммерческого производства биофармацевтических средств, сохраняют стадию аффинной очистки, проводимую в сочетании с операцией с использованием ионообменных устройств. Однако, как более подробно отмечено выше, несколько таких операций с использованием устройств редко оказываются совместимыми, они часто требуют значительной модификации параметров буфера, что увеличивает стоимость и время при реализации схем очистки. Таким образом, существует необходимость в дальнейшей разработке процессов очистки для получаемых методами рекомбинации биомолекул, например, белков, которые позволили бы более эффективно реализовать в большей степени возможности очистки с помощью не основанных на аффинности процессов. В частности, существует необходимость в разработке стадий обработки, совместимых с широким разнообразием питающих потоков; позволяющих значительно снижать уровни загрязнителей, прежде всего загрязнителей, представляющих собой белки клеток-хозяев (НСР) и/или ДНК клеток-хозяев (HCDNA); и которые были бы совместимыми с другими операциями с использованием устройств, такими как аффинная хроматография, и с последующими процессами, такими как ионообменная хроматография.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам отделения представляющей интерес молекулы от содержащего молекулу раствора клеточной культуры с помощью двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке («TFF»). Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF существенно снижают уровни загрязнителей и/или примесей в питающем потоке продукта, и они наиболее пригодны в качестве предшествующих процессов, осуществляемых перед стандартными операциями с использованием устройств для очистки и выделения, которые можно применять для доведения потока продукта до конечного состава и/или чистоты, например, с помощью ионообменной хроматографии. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF наиболее пригодны в качестве дополнения к стандартным методам очистки, таким как операции с использованием хроматографических устройств на основе аффинности и ионообменной хроматографии, и, таким образом, они должны быть совместимы с ними. Однако под объем изобретения подпадают также способы, в которых описанные способы двухстадийной TFF заменяют операции с использованием хроматографических устройств на основе аффинности при получении и/или очистке представляющей интерес молекулы. Способы, предлагаемые в изобретении, можно применять при обработке неочищенного питающего потока (т.е. раствора клеточной культуры) из любых систем клеточных культур, включая системы ферментации или другие системы с использованием клеточной культуры, для существенного снижения уровней примесей или загрязнителей, таких как белки клеток-хозяев (НСР) и ДНК клеток-хозяев (HCDNA), где выходные потоки можно затем подвергать обработке с помощью стандартных методов очистки, либо с помощью операций с использованием хроматографических устройств на основе аффинности, либо без них. Существенное снижение уровней загрязнителей и/или примесей в питающем потоке (т.е. супернатанте клеточной культуры), обеспечиваемое предложенными способами двухстадийной TFF, устраняет необходимость в осуществлении стандартных операций с использованием устройств для очистки, таких, например, как регулируемое значением рН осаждение примесей и/или фильтрация осадка (что, как правило, требуется перед осуществлением ионообменной хроматографии вследствие необходимости изменений состава буфера), и/или может повышать эффективность дорогостоящих операций с использованием устройств на основе аффинности или даже исключать их. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF наиболее пригодны для применения в качестве предшествующих процессов перед операциями с использованием устройств, которые наиболее чувствительны к нагрузкам загрязнителями, такими как операции с использованием хроматографических устройств. Например, в случае применения последующих операций с использованием хроматографических устройств, например, колонок, существенное снижение нагрузки загрязнителями, обеспечиваемое с помощью способов, предлагаемых в изобретении, может приводить к улучшению хроматографического разделения, повышению динамической связывающей способности, эксплуатационного срока службы и/или уменьшению требуемого размера колонок, все это значительно снижает как прямые, так и косвенные затраты, ассоциированные с получением, обработкой и очисткой представляющей интерес молекулы.

В частности, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают выделение представляющей интерес молекулы от содержащего молекулу раствора клеточной культуры с использованием двухстадийной TFF, указанные способы существенно снижают уровни загрязнителей и/или примесей. При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что процесс двухстадийной TFF, объединяющий по меньшей мере две операции с использованием устройства для TFF (одну, заключающуюся в обработке представляющей интерес молекулы в ретентате, и одну, заключающуюся в обработке представляющей интерес молекулы в пермеате), позволяет снижать уровни загрязнителей и/или примесей в потоке продукта (т.е. в растворе, содержащем представляющую интерес молекулу, при его обработке) до такой степени, которая позволяет минимизировать или не осуществлять последующее удаление загрязнителей с использованием стандартной обработки (такой как осаждение (прежде всего осуществляемое посредством регулирования значения рН), фильтрация осадка и разделение на основе аффинности). Таким образом, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, наиболее пригодны для применения в процессах, включающих использование последующих хроматографических процессов, которые могут быть особенно чувствительными к составу потока продукта. В этом случае способы двухстадийной TFF, предлагаемые в настоящем изобретении, позволяют осуществлять не только существенное снижение уровней загрязнителей и/или примесей в потоке продукта, но их можно одновременно использовать также и для регулирования параметров потока продукта, например, значения рН и/или проводимости, таким образом, они являются совместимыми с последующими операциями с использованием устройств. Таким образом, способы, предлагаемые в изобретении, являются очень привлекательными в случае осуществления последующих хроматографических процессов, таких как катионообменная хроматография («СЕХ») и анионообменная хроматография («АЕХ»).

Способы двухстадийной TFF наиболее пригодны для обработки содержащих клеточные культуры растворов перед осуществлением последующих процессов, например, хроматографии, очистки и выделения, которые применяют для доведения потока продукта до конечного состава и/или конечной чистоты. Представленный в настоящем описании способ TFF можно успешно осуществлять при значении рН, которое соответствует или примерно равно значению рН типичного неочищенного потока продукта/содержащего клеточную культуру раствора, полученного в результате биологического процесса (например, кондиционированных сред для клеточных культур, лизатов клеточных культур, кондиционированных ферментационных сред и т.д.). Как правило, представленные в настоящем описании способы TFF осуществляют при значении рН, составляющем 7,5±1,0 или 7,5±0,5. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF можно объединять с последующими стандартными процессами очистки, известными в данной области, такими как аффинная очистка, или, в частности, с последующими процессами очистки, которые не основаны на аффинных методах выделения, например, с хроматографическими процессами. В частности, представленные в настоящем описании способы позволяют снижать уровни загрязнителей, в результате чего после этого можно модифицировать значение рН потока продукта, например, понижать его по меньшей мере примерно до 5, без осаждения любых оставшихся загрязнителей, таких как белки клеток-хозяев (НСР) и/или ДНК клеток-хозяев (HCDNA), которые могут присутствовать в потоке продукта.

Способы, предлагаемые в изобретении, можно применять для любых видов молекул, и они представлены в настоящем описании в предпочтительном варианте осуществления изобретения на примере выделения белка из содержащего белок раствора. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF представляют собой робастные и масштабируемые процессы, применимые в целом для белков в широком диапазоне размеров и молекулярных масс (например, полипептидов, пептидов, иммуноглобулинов, антител, ферментов). Представленные в настоящем описании способы в целом позволяют осуществлять отделение представляющего интерес белка от раствора на основе его размера. Иными словами, способы, предлагаемые в изобретении, не основаны на каком-либо специфическом аффинном или основанном на аффинности процессе очистки и, следовательно, они позволяют осуществлять экономичную и ускоренную обработку различных белков в разнообразных питающих потоках растворов клеточных культур. Таким образом, способы, предлагаемые в изобретении, могут приводить к экономии непосредственных затрат, ассоциированных с обработкой, получением и/или очисткой белков, например, экономии затрат, ассоциированных с анализом питающего потока или предварительной обработкой питающего потока для обеспечения совместимости с существующими системами.

Способы, предлагаемые в изобретении, наиболее пригодны для отделения представляющего интерес белка от питающего потока, представляющего собой раствор клеточной культуры. В контексте настоящего описания понятие раствор клеточной культуры и аналогичные понятия относятся к любому раствору, присутствующему в биологическом процессе или системе, который, как ожидается, содержит представляющий интерес белок. Следовательно, понятие «раствор клеточной культуры» может обозначать все содержимое резервуара, в котором осуществляли ферментацию клеточной культуры, т.е. получали гетерологичный или эндогенный белок. Раствор клеточной культуры, предлагаемый в изобретении, может содержать не только представляющий интерес белок, но также и другие белки или фрагменты белков (например, эндогенно или гетерологично продуцируемых клеточной культурой или присутствующих в среде по иной причине (например, в результате внесения)); клетки клеточной культуры; фрагменты клеток; и/или другие компоненты, внесенные вместе с питательной средой для поддержания клеточного роста и производства белка, или компоненты, продуцируемые клетками-хозяевами в процессе культивирования. Таким образом, растворы клеточной культуры, предлагаемые в изобретении, включают (но не ограничиваясь только ими) кондиционированные супернатанты клеточной культуры; осветленные кондиционированные супернатанты клеточной культуры (например, кондиционированные супернатанты клеточной культуры, из которых с помощью известных в данной области методов удалены представляющие собой частицы ингредиенты); и осветленные гомогенизированные/лизированные клеточные культуры. Во всех случаях подразумевается, что раствор клеточной культуры должен содержать представляющую интерес молекулу; это означает, что он должен представлять собой кондиционированный раствор клеточной культуры, например, кондиционированный супернатант клеточной культуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения питающий поток для двухстадийной TFF представляет собой супернатант клеточной культуры, полученной в результате реакции ферментации.

Как известно в данной области и представлено в настоящем описании, раствор клеточной культуры, как правило, в качестве первой стадии при любой схеме обработки осветляют или стерилизуют путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,2 мкм или 0,22 мкм. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF предусматривают фильтрацию раствора клеточной культуры через пригодный фильтр для стерилизации, например, имеющий размер пор от 0,1 мкм до 0,45 мкм, предпочтительно размер пор, составляющий 0,2 мкм или 0,22 мкм, до осуществления предлагаемого в изобретении способа двухстадийной TFF (т.е. до осуществления указанных по меньшей мере двух операций с использованием устройства для TFF). Применение фильтров других размеров, выходящих за указанные в настоящем описании рамки, вне зависимости от того, являются ли они предпочтительными или нет, для стерилизации раствора клеточной культуры, как это известно или подразумевается в данной области, также подпадает под объем настоящего изобретения. Под объем настоящего изобретения не подпадают молоко, фракционированный раствор, полученный из молока и/или молочный продукт, такой как выделенный из сыворотки белок. Таким образом, во всех вариантах осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, питающий поток и/или поток продукта, содержащий представляющие интерес молекулу, например, белок, не представляет собой молоко, фракционированный раствор, полученный из молока и/или молочный продукт, такой как выделенный из сыворотки белок.

В настоящем изобретении предложен способ отделения представляющего интерес белка от раствора клеточной культуры, содержащего указанный белок, с помощью двухстадийной TFF, в котором двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF, и в котором

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащий указанный белок, таким образом, чтобы указанный белок собирался в ретентате, полученном после первой операции с использованием устройства для TFF; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащий указанный белок, таким образом, чтобы указанный белок собирался в пермеате, полученном после второй операции с использованием устройства для TFF.

В контексте настоящего описания операции с использованием устройства для TFF, предлагаемые в изобретении, включают применение ультрафильтрационных мембран. Таким образом, следует понимать, что в настоящем описании сокращение «TFF», когда оно используется в контексте изобретения, обозначает ультрафильтрацию в тангенциальном потоке в том смысле, в каком указанную операцию с использованием устройства обычно понимают в данной области. Границы отсечки мембран при осуществлении по меньшей мере двух операций с использованием устройства для TFF (т.е. первой и второй операций с использованием устройства для TFF) выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула, например, белок, (I) не проходила через мембрану при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. собиралась в ретентате, полученном после первой операции с использованием устройства для TFF), и (II) проходила через мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF (т.е. собиралась в пермеате, полученном после второй операции с использованием устройства для TFF). Следовательно, изобретение можно охарактеризовать также как способ отделения представляющего интерес белка от раствора, содержащего белок, с помощью двухстадийной TFF, в котором двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF, и в котором

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащий белок, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей такую границу отсечки, чтобы представляющий интерес белок собирался в ретентате, полученном после первой операции с использованием устройства для TFF; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащий белок, через вторую ультрафильтрационную мембрану, имеющую такую границу отсечки, чтобы указанный белок собирался в пермеате, полученном после второй операции с использованием устройства для TFF.

Как указано в настоящем описании, ультрафильтрационную мембрану для первой операции с использованием устройства для TFF выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула не проходила через мембрану при осуществлении первой TFF-операции (т.е. так, чтобы белок собирался в ретентате, полученном после первой операции с использованием устройства для TFF), и ультрафильтрационную мембрану для второй операции с использованием устройства для TFF выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула проходила через мембрану при осуществлении второй TFF-операции (т.е. так, чтобы белок собирался в пермеате, полученном после второй операции с использованием устройства для TFF). Как правило, фильтрационные мембраны классифицируют по размеру пор или границам отсечки, которые определяют характеристики мембраны на основе максимального размера пор мембраны и/или максимальной молекулярной массы (в кДа) молекулы, свободно проникающей через нее; таким образом, молекулы с размером, превышающим границу отсечки, определяемую максимальным размером пор, и/или с массой, превышающей максимальную молекулярную массу, не должны проходить через мембрану. Однако, как известно в данной области, поскольку фильтрационные характеристики мембраны могут зависеть не только от точного размера молекулы, но также и от других факторов, таких, например, как заряд молекулы, то настоящее описание не накладывает ограничения на критерии, согласно которым можно выбирать мембрану, при условии, что представляющая интерес молекула, например, белок, не проходит через первую мембрану при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF и проходит через вторую мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF. Таким образом, границы отсечки мембран, которые применяют согласно способам двухстадийной TFF, представленным в настоящем описании, можно выбирать на основе характеристик мембраны, а не только на основе заявленных границ отсечки или размера пор (например, согласно спецификациям производителя). Способы определения характеристик мембраны и, более конкретно, определения проницаемости мембраны для представляющей интерес молекулы, например, белка, хорошо известны и широко применяются в данной области.

В контексте операций с использованием устройства для TFF, предлагаемых в изобретении, например, первой операции с использованием устройства для TFF, как она описана в контексте настоящего изобретения, выражения «не проходит через мембрану» и «находится в ретентате после операции с использованием устройства для TFF» являются эквивалентными, и они указывают на то, что мембрана, применяемая для операции с использованием устройства для TFF, практически непроницаема для представляющей интерес молекулы, например, белка. Кроме того, поскольку, как известно в данной области, характеристики мембраны могут варьироваться в зависимости от биологических растворов и молекул (например, белков), то следует иметь в виду, что фразы «не проходит через мембрану», «находится в ретентате после операции с использованием устройства для TFF» и/или «практически непроницаема», представляющие собой понятия и фразы, используемые в настоящем описании, не следует интерпретировать как выражения в их буквальном смысле. Скорее, как это следует из контекста настоящего описания и как это понимают в данной области, эти фразы используют с учетом того, что для первой фильтрационной мембраны может иметь место «прорыв» (т.е. представляющая интерес молекула в минимальном количестве может проникать через мембрану), но при этом по меньшей мере 90% от количества представляющей интерес молекулы, подвергнутой первой операции с использованием устройства для TFF, собирается или может собираться в ретентате.

Аналогично этому, в контексте операций с использованием устройства для TFF, предлагаемых в изобретении, например, второй операции с использованием устройства для TFF, как она описана в контексте настоящего изобретения, выражения «проходит через мембрану» и «находится в пермеате после операции с использованием устройства для TFF» являются эквивалентными, и они указывают на то, что мембрана, применяемая для операции с использованием устройства для TFF, практически полностью проницаема для представляющей интерес молекулы, например, белка. Кроме того, поскольку, как известно в данной области, характеристики мембраны могут варьироваться в зависимости от биологических растворов и молекул (например, белков), то следует иметь в виду, что фразы «проходит через мембрану», «находится в пермеате после операции с использованием устройства для TFF» и/или «практически полностью проницаема», представляющие собой понятия и фразы, используемые в настоящем описании, не следует интерпретировать как выражения в их буквальном смысле. Скорее, как это следует из контекста настоящего описания и как это понимают в данной области, эти фразы используют с учетом того, что фильтрационная мембрана может не являться полностью проницаемой для 100% представляющих интерес молекул, попадающих на/в фильтр и что мембрана может оказаться непроницаемой для определенного незначительного процента попавших на нее молекул, представляющих интерес. Таким образом, в контексте настоящего описания эти фразы указывают на то, что по меньшей мере 90% от количества представляющей интерес молекулы, подвергнутой второй операции с использованием устройства для TFF, собирается или может собираться в пермеате.

Таким образом, способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, как правило, включают применение по меньшей мере двух ультрафильтрационных мембран, каждая из которых обладает различными границами отсечки, размером пор и/или характеристиками проницаемости. Ультрафильтрационную мембрану для первой операции с использованием устройства для TFF выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула не проходила через мембрану при осуществлении операции и могла собираться в ретентате, полученном в результате операции. Как правило, этого достигают путем выбора первой ультрафильтрационной мембраны (т.е. мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF), имеющей границу отсечки, которая меньше молекулярной массы представляющей интерес молекулы. Однако, как известно в данной области, характеристики мембраны могут зависеть не только от размера молекулы, но и от других факторов; таким образом, мембраны с определенными границами отсечки могут, тем не менее, очень эффективно блокировать прохождение молекул с размером меньшим, чем установленная граница отсечки. Следовательно, мембраны с границами отсечки, большими, чем молекулярная масса представляющей интерес молекулы, можно применять для первой операции с использованием устройства для TFF при условии, что представляющая интерес молекула не проходит через мембрану при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF. Согласно изобретению на конкретную мембрану, как таковую, выбранную для применения в первой операции с использованием устройства для TFF, не накладывается никаких других ограничений, и ее можно выбирать исходя из простоты изготовления или коммерческой доступности при условии удовлетворения прочим указанным в настоящем описании критериям. В вариантах осуществления заявленного изобретения, не ограничивающих его объем, граница отсечки фильтрационной мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF может составлять 1,5, 1, ½, 1/3, 1/5, 1/10 или 1/15 молекулярной массы представляющей интерес молекулы, например, белка, при условии, что представляющая интерес молекула не проходит через мембрану при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF. В других вариантах осуществления изобретения граница отсечки фильтрационной мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF составляет менее 1/15 молекулярной массы представляющей интерес молекулы. В конкретных вариантах осуществления изобретения, граница отсечки фильтрационной мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании, составляет не более чем одну вторую от молекулярной массы представляющей интерес молекулы, например, белка. Иными словами, в указанных конкретных вариантах осуществления изобретения граница отсечки фильтрационной мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании, составляет 0,5 от молекулярной массы представляющей интерес молекулы или менее. Выбор конкретной мембраны может зависеть также от дополнительных параметров, таких как доступность (например, от коммерческой доступности или от того, можно ли ее изготовить своими средствами) или характеристик (например, от способности отделять представляющую интерес молекулу от конкретных известных загрязнителей/примесей).

В настоящем изобретении предложено также выбирать ультрафильтрационную мембрану для второй операции с использованием устройства для TFF таким образом, чтобы представляющая интерес молекула проходила через мембрану при осуществлении операции и могла собираться в пермеате, полученном в результате операции с использованием устройства. Как правило, это достигают путем выбора второй ультрафильтрационной мембраны (т.е. мембраны для второй операции с использованием устройства для TFF), имеющей границу отсечки, превышающую молекулярную массу представляющей интерес молекулы, но меньшую максимальной величины, составляющей 1000 кДа (которая представляет собой максимальный размер молекулы для «ультрафильтрации», как указано в настоящем описании). Следовательно, на конкретную мембрану, выбранную для применения во второй операции с использованием устройства для TFF, не накладывается никаких других ограничений, и ее можно выбирать исходя из простоты изготовления или коммерческой доступности при условии удовлетворения прочим указанным в настоящем описании критериям, а именно, так, чтобы представляющая интерес молекула проходила через мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF, при этом максимальная граница отсечки для второй мембраны составляет 1000 кДа. В вариантах осуществления заявленного изобретения, не ограничивающих его объем, граница отсечки фильтрационной мембраны для второй операции с использованием устройства для TFF может быть равна 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или 100 молекулярным массам представляющей интерес молекулы, например, белка, при условии, что представляющая интерес молекула проходит через фильтрационную мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF и при условии, что граница отсечки не превышает 1000 кДа.

Таким образом, в изобретении предложен также способ отделения представляющего интерес белка от раствора, содержащего белок, с помощью двухстадийной TFF, в котором двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF и в котором

(I) при первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащий белок, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей такую границу отсечки, при которой представляющий интерес белок собирается в ретентате, полученном в результате первой операции с использованием устройства для TFF, и/или где граница отсечки первой ультрафильтрационной мембраны составляет 0,5 от молекулярной массы белка; и

(II) при второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего белок, через вторую ультрафильтрационную мембрану, имеющую такую границу отсечки, при которой представляющий интерес белок собирается в пермеате, полученном в результате второй операции с использованием устройства для TFF, где граница отсечки второй ультрафильтрационной мембраны не превышает 1000 кДа.

Представленное в настоящем описании изобретение относится к способам ультрафильтрации, следовательно, максимальная граница отсечки мембраны, применяемой согласно изобретению (т.е. при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF), представляет собой верхнюю границу диапазона размеров для ультрафильтрации, как он определен в данной области, т.е. относится к фильтрации молекул с молекулярной массой, равной или ниже 1000 кДа. Следовательно, это ограничивает также размер и/или молекулярную массу представляющих интерес молекул, например, белков, для которых можно применять изобретение. Согласно изобретению представляющие интерес молекулы имеют размер, который равен или меньше верхней границы для ультрафильтрации, т.е. он равен или меньше 1000 кДа. В вариантах осуществления представленного в настоящем описании изобретения, не ограничивающих его объем, граница отсечки фильтрационной мембраны для второй операции с использованием устройства для TFF может составлять 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 молекулярных масс представляющей интерес молекулы, при том условии, что представляющая интерес молекула проходит через фильтрационную мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF и при том условии, что граница отсечки мембраны не превышает 1000 кДа. Согласно настоящему изобретению представляющая интерес молекула может представлять собой молекулу, имеющую молекулярную массу от примерно 10 до примерно 1000 кДа. В некоторых вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула представляет собой белок, имеющий молекулярную массу от примерно 25 до примерно 667 кДа. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула представляет собой белок, имеющий молекулярную массу от примерно 25 до примерно 300 кДа. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения представляющая интерес молекула представляет собой антитело, фрагмент антитела и/или белок, имеющий молекулярную массу 150±75 кДа.

В конкретных вариантах осуществления изобретения граница отсечки фильтрационной мембраны для второй операции с использованием устройства для TFF, как указано в настоящем описании, по меньшей мере в два раза больше молекулярной массы представляющей интерес молекулы, например, белка, но не превышает 1000 кДа. Иными словами, в этих вариантах осуществления изобретения граница отсечки фильтрационной мембраны для второй операции с использованием устройства для TFF, как указано в настоящем описании, в 2 раза или более превышает молекулярную массу представляющей интерес молекулы и не превышает 1000 кДа. Согласно этому варианту осуществления изобретения максимальная молекулярная масса представляющей интерес молекулы составляет примерно 500 кДа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в изобретении предложен способ отделения представляющего интерес белка от содержащего белок раствора клеточной культуры с помощью двухстадийной TFF, в котором двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют по меньшей мере

(I) первую операцию с использованием устройства для ультрафильтрации в тангенциальном потоке, при которой фильтруют первый поток продукта, содержащего указанный белок, через первую ультрафильтрационную мембрану, граница отсечки которой меньше молекулярной массы представляющего интерес белка; и

(II) вторую операцию с использованием устройства для ультрафильтрации в тангенциальном потоке, при которой фильтруют второй поток продукта, содержащего указанный белок, через вторую ультрафильтрационную мембрану, граница отсечки которой больше молекулярной массы представляющего интерес белка.

В других вариантах осуществления изобретения пункты (I) и (II) настоящего изобретения могут дополнительно отличаться тем, что белок собирают в ретентате, полученном в результате первой операции с использованием устройства для TFF, и собирают в пермеате, полученном в результате второй операции с использованием устройства для TFF.

В изобретении предложен также способ отделения представляющего интерес белка от содержащего белок раствора клеточной культуры с помощью двухстадийной TFF, в котором двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют по меньшей мере

(I) первую операцию с использованием устройства для ультрафильтрации в тангенциальном потоке, при которой фильтруют первый поток продукта, содержащего указанный белок, через первую ультрафильтрационную мембрану, граница отсечки которой составляет 0,5 от молекулярной массы представляющего интерес белка или менее; и

(II) вторую операцию с использованием устройства для ультрафильтрации в тангенциальном потоке, при которой фильтруют второй поток продукта, содержащего указанный белок, через вторую ультрафильтрационную мембрану, граница отсечки которой по меньшей мере в два раза больше молекулярной массы представляющего интерес белка, но меньше 1000 кДа.

В других вариантах осуществления изобретения пункты (I) и (II) настоящего изобретение могут дополнительно отличаться тем, что белок собирают в ретентате, полученном в результате первой операции с использованием устройства для TFF, и собирают в пермеате, полученном в результате второй операции с использованием устройства для TFF.

Как указано выше в настоящем описании, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения питающий поток для двухстадийной TFF представляет собой супернатант клеточной культуры. Супернатант клеточной культуры можно стерилизовать перед осуществлением способов/операций с использованием двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании, и/или с использованием любого метода, известного в данной области. Например, под объем настоящего изобретения подпадает фильтрация супернатанта клеточной культуры через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм перед осуществлением представленных в настоящем описании способов/операций с использованием двухстадийной TFF. Дополнительно или альтернативно настоящее изобретение включает способы и/или операции, в которых клеточный супернатант фильтруют через фильтр с размером пор, не превышающим 0,22 мкм, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,2 мкм или 0,22 мкм, перед осуществлением остальных операций с использованием двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании. Следовательно, супернатант клеточной культуры можно обрабатывать с помощью одной или нескольких дополнительных операций перед осуществлением представленных в настоящем описании операций с использованием двухстадийной TFF или его можно непосредственно подвергать одной из по меньшей мере двух предлагаемых в изобретении операций с использованием устройства для TFF. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения супернатант клеточной культуры (который необязательно был профильтрован через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,2 мкм или 0,22 мкм) представляет собой первый или второй поток продукта, который подвергают фильтрации с помощью представленной в настоящем описании первой или второй операции с использованием устройства для TFF соответственно. Следовательно, в указанных вариантах осуществления изобретения, за исключением необязательной стерилизации, например, путем представленной в настоящем описании фильтрации, первая или вторая операция с использованием устройства для TFF, представленная в настоящем описании, представляет собой первую операцию с использованием устройства по обработке неочищенного супернатанта клеточной культуры.

Таким образом, в изобретении предложен также способ отделения представляющего интерес белка от содержащего белок раствора с помощью двухстадийной TFF, в котором двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF, в котором

(I) при первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащий белок, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей такую границу отсечки, при которой представляющий интерес белок собирается в ретентате, полученном в результате первой операции с использованием устройства для TFF, и/или где граница отсечки первой ультрафильтрационной мембраны составляет 0,5 от молекулярной массы белка; и

(II) при второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего белок, через вторую ультрафильтрационную мембрану, имеющую такую границу отсечки, при которой представляющий интерес белок собирается в пермеате, полученном в результате второй операции с использованием устройства для TFF, где граница отсечки второй ультрафильтрационной мембраны не превышает 1000 кДа;

и в котором указанный раствор представляет собой супернатант клеточной культуры, профильтрованный через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм перед осуществлением указанной двухступенчатой TFF.

Способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, могут включать также одну или несколько стадий диафильтрации. В конкретных вариантах осуществления изобретения диафильтрацию можно объединять с первой операцией с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании (т.е. в этом случае ретентат, полученный в результате первой операции с использованием устройства для TFF, подвергают диафильтрации, например, для замены буфера и/или концентрирования представляющей интерес молекулы как это известно в данной области). Используемые в настоящем описании понятия «первый» и «второй» применительно к конкретным по меньшей мере двум операциям с использованием устройства для TFF, представленным в настоящем описании, следует понимать только как обозначения индивидуальных операций с использованием устройства для TFF и они не предназначены для обозначения какого-либо процесса или хронологического порядка в самом методе двухстадийной TFF. Более конкретно, первая операция с использованием устройства для TFF, представленная в настоящем описании, характеризуется тем, что применяют такую фильтрационную мембрану, что представляющая интерес молекула не проходит через мембрану, а вторая операция с использованием устройства для TFF, представленная в настоящем описании, характеризуется тем, что применяют такую фильтрационную мембрану, что представляющая интерес молекула проходит через мембрану. В конкретном варианте осуществления изобретения фильтрационная мембрана, применяемая при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании, характеризуется тем, что граница отсечки равна примерно одной второй от молекулярной массы представляющей интерес молекулы (т.е. 0,5 от молекулярной массы) или менее, а фильтрационная мембрана, применяемая при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании, характеризуется тем, что граница отсечки по меньшей мере в 2 раза превышает молекулярную массу представляющей интерес молекулы, но меньше 1000 кДа.

Поскольку идентификаторы первый и второй применительно к операции с использованием устройства для TFF не предназначены для обозначения какого-либо процесса или хронологического порядка, то под объем способов двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании, подпадают не только варианты осуществления изобретения, в которых первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют перед осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF, но также и варианты осуществления изобретения, в которых первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют после осуществления второй операции с использованием устройства для TFF. В том случае, когда первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют после осуществления второй операции с использованием устройства для TFF, питающий поток для первой операции с использованием устройства для TFF может представлять собой поток пермеата, полученный в результате второй операции с использованием устройства для TFF. В том случае, когда питающий поток для первой операции с использованием устройства для TFF представляет собой поток пермеата, полученный в результате второй операции с использованием устройства для TFF, первую и вторую операции с использованием устройства для TFF можно осуществлять параллельно (например, одновременно) для того, чтобы исключить необходимость в хранении пермеата, полученного в результате второй операции с использованием устройства для TFF.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют перед осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF. В этом варианте осуществления изобретения питающий поток для двухстадийной TFF может представлять собой супернатант клеточной культуры, который необязательно фильтруют через фильтр с размером пор, составляющим максимум 0,22 мкм, указанный питающий поток обрабатывают непосредственно путем осуществления первой операции с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании (т.е. формируют первый питающий поток без дополнительной обработки путем осуществления одной или нескольких дополнительных операций с использованием устройства). Согласно этому варианту осуществления изобретения первую операции с использованием устройства для TFF осуществляют перед осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF и поток ретентата, полученный в результате первой операции с использованием устройства для TFF, может непосредственно формировать питающий поток для второй операции с использованием устройства для TFF, но может и не формировать его (т.е. за первой операцией с использованием устройства для TFF может сразу следовать вторая операция с использованием устройства для TFF, или первая и вторая операции с использованием устройства для TFF могут быть разделены одной или несколькими дополнительными операциями с использованием устройства). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения за первой операцией с использованием устройства для TFF непосредственно следует вторая операция с использованием устройства для TFF.

Способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, могут включать одну или несколько дополнительных операций с использованием устройства для TFF, где одну или несколько дополнительных операций с использованием устройства для TFF можно осуществлять перед осуществлением первой операции с использованием устройства для TFF, перед осуществлением второй- операции с использованием устройства для TFF, перед осуществлением первой и второй операций с использованием устройства для TFF, после осуществления первой операции с использованием устройства для TFF, после осуществления второй операции с использованием устройства для TFF, после осуществления первой и второй операций с использованием устройства для TFF и/или в промежутке между осуществлением первой и второй операций с использованием устройства для TFF.

Одна или несколько дополнительных операций с использованием устройства для TFF в способе двухстадийной TFF может(гут) представлять собой третью операцию с использованием устройства для TFF. Ультрафильтрационную мембрану для третьей операции с использованием устройства для TFF выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула не проходила через мембрану в процессе третьей операции с использованием устройства для TFF. Следовательно, критерии для выбора фильтрационной мембраны для третьей операции с использованием устройства для TFF являются такими же, что и для выбора фильтрационной мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF. Фильтрационные мембраны для первой и третьей операции с использованием устройства для TFF могут быть одинаковыми или различными; граница отсечки или другой характеризующий проницаемость параметр (например, размер пор) мембран для первой и третьей операций с использованием устройства для TFF может быть одинаковым или различным.

Так же, как это было указано в настоящем описании для первой операции с использованием устройства для TFF, граница отсечки мембраны для третьей операции с использованием устройства для TFF, как правило, должна быть меньше молекулярной массы представляющей интерес молекулы. Однако, с учетом характеристик мембраны при осуществлении третьей операции с использованием устройства для TFF можно использовать мембраны с границей отсечки, превышающей молекулярную массу представляющей интерес молекулы, при условии, что представляющая интерес молекула не проходит через мембрану при осуществлении третьей операции с использованием устройства для TFF. Таким образом, на конкретную мембрану, выбранную для применения в третьей операции с использованием устройства для TFF, не накладывается никаких других ограничений, и ее можно выбирать исходя из простоты изготовления или коммерческой доступности при условии, что она удовлетворяет прочим указанным в настоящем описании критериям. В вариантах осуществления заявленного изобретения, не ограничивающих его объем, граница отсечки фильтрационной мембраны для третьей операции с использованием устройства для TFF может составлять 1,5, 1, ½, 1/3, 1/5, 1/10 или 1/15 молекулярной массы представляющей интерес молекулы, например, белка, при условии, что представляющая интерес молекула не проходит через мембрану при осуществлении третьей операции с использованием устройства для TFF. В других вариантах осуществления изобретения граница отсечки фильтрационной мембраны для третьей операции с использованием устройства для TFF составляет менее 1/15 молекулярной массы представляющей интерес молекулы. Как и в случае фильтрационной мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF, выбор мембраны для третьей операции с использованием устройства для TFF может зависеть также от дополнительных параметров, таких как доступность (например, от коммерческой доступности или от того, можно ли ее изготовить своими средствами) или характеристик (например, от способности отделять представляющую интерес молекулу от конкретных известных загрязнителей/примесей). В конкретных вариантах осуществления изобретения граница отсечки фильтрационной мембраны для третьей операции с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании, не превышает примерно половины молекулярной массы представляющей интерес молекулы, например, белка. Иными словами, в указанных вариантах осуществления изобретения граница отсечки фильтрационной мембраны для третьей операции с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании, составляет 0,5 от молекулярной массы представляющей интерес молекулы или менее.

Для третьей операции с использованием устройства для TFF можно применять ту же самую ультрафильтрационную мембрану, что и ультрафильтрационная мембрана для первой операции с использованием устройства для TFF, или отличную от нее. Следовательно, ультрафильтрационная мембрану для третьей операции с использованием устройства для TFF может иметь ту же самую границу отсечки, что и граница отсечки ультрафильтрационной мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF, или отличную от нее. Третью операцию с использованием устройства для TFF можно объединять с диафильтрацией как это указано в настоящем описании или в соответствии с любым известным в данной области методом. В конкретном варианте осуществления изобретения граница отсечки фильтрационной мембраны для третьей операции с использованием устройства является той же самой, что и граница отсечки для первой операции с использованием устройства для TFF.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ двухступенчатой TFF включает третью операции с использованием устройства для TFF, которую осуществляют после осуществления и первой и второй операции с использованием устройства для TFF, при этом первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют перед осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF. В этом варианте осуществления изобретения третью операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять непосредственно после или параллельно с осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF, т.е. таким образом, чтобы пермеат, полученный в результате второй операции с использованием устройства для TFF (содержащий представляющую интерес молекулу), формировал поток продукта для третьей операции с использованием устройства для TFF. Между третьей операцией с использованием устройства для TFF и второй операцией с использованием устройства для TFF можно также осуществлять одну или несколько дополнительных операций или процессов с использованием устройства. В конкретных вариантах осуществления изобретения для третьей операции с использованием устройства для TFF применяют фильтрационную мембрану с границей отсечки, составляющей 0,5 от молекулярной массы представляющей интерес молекулы или менее. В другом конкретном объекте изобретения для третьей операции с использованием устройства для TFF применяют фильтрационную мембрану с той же самой границей отсечки, что и граница отсечки фильтрационной мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF. Во всех вариантах осуществления изобретения, включающих третью операцию с использованием устройства для TFF, питающий поток для способа двухстадийной TFF может представлять собой супернатант клеточной культуры, который необязательно был профильтрован через фильтр с размером пор по меньшей мере 0,22 мкм, при этом питающий поток обрабатывают непосредственно путем осуществления первой операции с использованием устройства для TFF как представлено в настоящем описании (т.е. формируют первый питающий поток или поток продукта без дополнительной обработки путем осуществления одной или нескольких дополнительных операций с использованием устройства). Согласно этому варианту осуществления изобретения первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют перед осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF, и поток ретентата, полученный в результате первой операции с использованием устройства для TFF может непосредственно формировать, но может и не формировать поток продукта/питающий поток для второй операции с использованием устройства для TFF (т.е. непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF можно осуществлять вторую операцию с использованием устройства для TFF, или между осуществлением первой и второй операций с использованием устройства для TFF можно осуществлять одну или несколько дополнительных операций с использованием устройства).

В некоторых вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула представляет собой биомолекулу, которая является белком с молекулярной массой от примерно 10 до примерно 300 кДа, от примерно 25 до примерно 300 кДа, от примерно 50 до примерно 300 кДа, от примерно 75 до примерно 300 кДа, от примерно 100 до примерно 300 кДа, от примерно 120 до примерно 300 кДа, от примерно 135 до примерно 300 кДа, от примерно 10 до примерно 200 кДа, от примерно 25 до примерно 200 кДа, от примерно 50 до примерно 200 кДа, от примерно 75 до примерно 200 кДа, от примерно 100 до примерно 200 кДа, от примерно 120 до примерно 200 кДа, от примерно 135 до примерно 200 кДа, от примерно 10 до примерно 175 кДа, от примерно 25 до примерно 175 кДа, от примерно 50 до примерно 175 кДа, от примерно 75 до примерно 175 кДа, от примерно 120 до примерно 175 kD или от примерно 135 до примерно 175 kD.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула представляет собой биомолекулу, которая является белком с молекулярной массой 150±75 кДа. Таким образом, в вариантах осуществления изобретения, не ограничивающих его объем, представляющий интерес белок может иметь молекулярную массу, составляющую примерно 75 кДа, примерно 80 кДа, примерно 90 кДа, примерно 95 кДа, примерно 100 кДа, примерно 105 кДа, примерно ПО кДа, примерно 115 кДа, примерно 120 кДа, примерно 125 кДа, примерно 130 кДа, примерно 135 кДа, примерно 140 кДа, примерно 150 кДа, примерно 155 кДа, примерно 160 кДа, примерно 165 кДа, примерно 170 кДа, примерно 175 кДа, примерно 180 кДа, примерно 185 кДа, примерно 190 кДа, примерно 195 кДа, примерно 200 кДа, примерно 205 кДа, примерно 210 кДа, примерно 215 кДа, примерно 220 kD или примерно 215 кДа. Альтернативно или дополнительно представляющий интерес белок может характеризоваться тем, что он имеет молекулярную массу, составляющую 150±15 кДа, 150±30 кДа, 150±50 кДа. Примерами белков, имеющих молекулярную массу 150±75 кДа являются (но не ограничиваясь только ими) иммуноглобулины и антитела. Примерами способов двухстадийной TFF, которые можно применять для белков, имеющих молекулярную массу 150±75 кДа (например, 150±30 и/или 150±15 кДа), являются (но не ограничиваясь только ими) способы, в которых для первой операции с использованием устройства для TFF применяют фильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки 50 кДа или менее; для второй операции с использованием устройства для TFF применяют фильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки по меньшей мере 300 кДа, но не более чем 1000 кДа, и для необязательной третьей операции с использованием устройства для TFF применяют фильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки 50 кДа или менее. В конкретном примере способа двухстадийной TFF для таких белков применяют для первой операции с использованием устройства для TFF фильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки от 30 до 50 кДа (предпочтительно 50 кДа); для второй операции с использованием устройства для TFF - фильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки 300 кДа; и для необязательной третьей операции с использованием устройства для TFF - фильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки от 30 до 50 кДа (предпочтительно 50 кДа).

Как указано в настоящем описании под объем изобретения подпадают способы отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры (например, супернатанта культуры клеток гибридомы, экспрессирующих представляющее интерес антитело) с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и необязательно третью операции с использованием устройства для TFF, и в которых

(I) при осуществлении указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащий представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 30 до 50 кДа (предпочтительно 50 кДа);

(II) при осуществлении указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащий представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки по меньшей мере 300 кДа, но не более 1000 кДа (предпочтительно 300 кДа); и

(III) при осуществлении указанной необязательной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащий представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 30 до 50 кДа или менее (предпочтительно 50 кДа).

В предпочтительном объекте изобретения, связанном с описанным в этом параграфе вариантом осуществления изобретения, первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который необязательно был стерилизован. Необязательную стерилизацию можно осуществлять с помощью любого метода, известного в данной области и/или представленного в настоящем описании. Например, стерилизацию первого потока продукта перед осуществлением первой операции с использованием устройства для TFF можно осуществлять путем фильтрации через фильтр, имеющий размеры пор от 0,1 до 0,45 мкм, и ее предпочтительно осуществляют путем фильтрации через фильтр, имеющий размер пор 0,2 мкм или 0,22 мкм. В другом предпочтительном объекте изобретения, связанном с описанным в этом параграфе вариантом осуществления изобретения, вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после осуществления первой операции с использованием устройства для TFF; таким образом, согласно этому объекту между первой и второй операцией с использованием устройства для TFF не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства. Согласно другому предпочтительному объекту, связанному с описанным в этом параграфе вариантом осуществления изобретения, необязательную третью операцию с использованием устройства для TFF осуществляют, если она предусмотрена, непосредственно после осуществления или параллельно с осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF; таким образом, согласно этому объекту между второй и третьей (если она предусмотрена) операциями с использованием устройства для TFF не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства.

Предпочтительные объекты и/или варианты осуществления изобретения, представленные в описании, специально заявлены в виде отдельных объектов, которые можно применять индивидуально в способе двухстадийной TFF, и они заявлены также в виде комбинаторных объектов, которые можно объединять с одним или несколькими другими предпочтительными объектами. Так, например, под объем изобретения подпадает способ отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры (например, супернатанта культуры клеток гибридомы, экспрессирующих представляющее интерес антитело) с помощью двухстадийной TFF, где двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и необязательно третью операцию с использованием устройства для TFF, и в котором

(I) при осуществлении указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащий представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа;

(II) при осуществлении указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащий представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 300 кДа; и

(III) при осуществлении указанной необязательной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащий представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа;

в котором указанный первой поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который необязательно был стерилизован путем фильтрации через фильтрационную мембрану с размером пор не более 0,22 мкм; где указанную вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после осуществления указанной первой операции с использованием устройства для TFF; и в котором указанную необязательную третью операцию с использованием устройства для TFF осуществляют (если она предусмотрена) непосредственно после осуществления указанной второй операции с использованием устройства для TFF или параллельно с ней.

В конкретном варианте осуществления способа двухстадийной TFF, описанного в предыдущем параграфе, первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который лишь необязательно был профильтрован через фильтр с размерами пор 0,22 мкм, и первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно перед осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF, при этом вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно перед осуществлением необязательной третьей операции с использованием устройства для TFF (т.е. этот конкретный вариант осуществления способа двухстадийной TFF не включает применения других операций с использованием устройства между первой, второй и необязательной третьей операциями с использованием устройства для TFF). Кроме того, третью операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять параллельно с осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF или ее можно осуществлять после завершения второй операции с использованием устройства для TFF (т.е. каждую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют в периодическом режиме). В других родственных вариантах осуществления изобретения способ двухстадийной TFF включает применение одной или нескольких дополнительных операций с использованием устройства, которые осуществляют между осуществлением первой и второй и/или между осуществлением второй и необязательной третьей операций с использованием устройства для TFF.

В контексте настоящего описания выражения «осуществляют непосредственно перед», «осуществляют непосредственно после», «непосредственно перед», «непосредственно после» и аналогичные выражения не включают временной компонент; так, например, не требуется, чтобы осуществление обеих первой и второй операций с использованием устройства для TFF или второй и третьей операций с использованием устройства для TFF происходило или их осуществляли в какой-либо конкретный период времени. Фактически рассматриваемые выражения указывают на то, что поток продукта не обрабатывают путем осуществления каких-либо других операций с использованием устройств в промежутке между первой и второй или между второй и третьей операциями с использованием устройств; так, например, первую операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять, например, в периодическом режиме, поток продукта, т.е. поток ретентата, запасать, и/или транспортировать и запасать, и затем по истечении определенного периода времени поток продукта подвергать обработке путем осуществления второй операции с использованием устройства для TFF (при условии, что не осуществляли промежуточных операций с использованием устройства).

Некоторые объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF, и в которых

(I) при осуществлении указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при осуществлении указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при осуществлении указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при осуществлении указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа,

и в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF; это означает, что согласно данному объекту между первой и второй операциями с использованием устройств для TFF не осуществляют промежуточных операций с использованием устройств.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа,

и в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм).

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа,

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой и указанной второй операции с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм);

и в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF).

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм);

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой и указанной второй операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой и указанной второй операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм);

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой и указанной второй операций с использованием устройства для TFF.

Некоторые объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

и в которых

третью операции с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после или параллельно с осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между второй и третьей операциями с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

и в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм).

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, указанной второй и указанной третьей операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

третью операции с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после или параллельно с осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между второй и третьей операциями с использованием устройства для TFF.

и в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм).

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

третью операции с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после или параллельно с осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между второй и третьей операциями с использованием устройства для TFF.

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, указанной второй и указанной третьей операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитело) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF, в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, указанной второй и указанной третьей операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта; содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

третью операции с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после или параллельно с осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между второй и третьей операциями с использованием устройства для TFF.

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, указанной второй и указанной третьей операций с использованием устройства для TFF.

Способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, позволяют эффективно снижать уровни загрязнений и примесей в растворе, содержащем представляющую интерес молекулу. В частности, способы двухстадийной TFF, предлагаемые в изобретении, позволяют эффективно снижать уровни загрязнений и/или примесей в неочищенном питающем потоке раствора клеточной культуры (например, в супернатанте клеточной культуры, необязательно профильтрованном через мембрану с размером пор 0,22 мкм) перед осуществлением последующей обработки с помощью одной или нескольких операций с использованием устройств (например, хроматографических колонок). Применяемые в настоящем описании понятия «загрязнитель», «примесь» и аналогичные понятия имеют стандартное значение, известное в данной области, и обозначают нежелательные компоненты, которые присутствуют в растворе, содержащем представляющую интерес молекулу. Примерами таких нежелательных компонентов, которые могут присутствовать в неочищенном питающем потоке раствора клеточной культуры (например, в супернатанте клеточной культуры, необязательно профильтрованном через мембрану с размером пор 0,22 мкм) включают (но не ограничиваясь только ими) нежелательные белки, нежелательные малые молекулы, фрагменты представляющей интерес молекулы, агрегаты представляющей интерес молекулы, нежелательные компоненты среды для культивирования клеток, нежелательный компонент, продуцируемый клеткой (как эндогенный, так и гетерологичный). Как правило, такие загрязнители и/или примеси обозначают в литературе как белки клеток-хозяев («НСР») и ДНК клеток-хозяев («HCDNA»).

В примерах, не ограничивающих объем изобретения, раствор клеточной культуры (например, супернатант клеточной культуры), который формирует питающий поток для двухстадийной TFF, предлагаемой в настоящем изобретении, может иметь концентрацию HCDNA, составляющую по меньшей мере 500000 пг/мг представляющего интерес белка, по меньшей мере 750000 пг/мг представляющего интерес белка или по меньшей мере 1000000 пг/мг представляющего интерес белка до осуществления операции согласно способам двухстадийной TFF, представленным в настоящем описании. Альтернативно этому или дополнительно раствор клеточной культуры (например, супернатант клеточной культуры), который формирует питающий поток для двухстадийной TFF, предлагаемой в настоящем изобретении, может иметь концентрацию НСР, составляющую по меньшей мере 100000 нг/мг представляющего интерес белка, по меньшей мере 150000 нг/мг представляющего интерес белка или по меньшей мере 200000 нг/мг представляющего интерес белка до осуществления операции согласно способам двухстадийной TFF, представленным в настоящем описании.

Способы двухстадийной TFF, предлагаемые в изобретении, позволяют снижать уровень НСР в растворе клеточной культуры, содержащем представляющий интерес белок (например, в супернатанте клеточной культуры) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45% или по меньшей мере на 50%. Альтернативно этому или дополнительно способы двухстадийной TFF, предлагаемые в изобретении, позволяют снижать уровень HCDNA в растворе клеточной культуры, содержащем представляющий интерес белок (например, в супернатанте клеточной культуры) по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ двухстадийной TFF, представленный в настоящем описании, снижает уровень HCDNA в растворе, содержащем представляющий интерес белок, на 85-95%. Процент снижения можно определять согласно любому методу, представленному в настоящем описании и/или известному в данной области, который пригоден для определения концентрации НСР и/или HCDNA, и его рассчитывают путем сравнения уровня НСР и/или HCDNA в растворе, содержащем представляющий интерес белок, после применения двухстадийной TFF с уровнем в растворе, содержащем представляющий интерес белок, до применения двухстадийной TFF (например, в неочищенном питающем потоке). Поскольку двухстадийная TFF может включать одну или несколько стадий диафильтрации и/или замены буфера, как представлено в настоящем описании, то состав раствора, содержащего представляющий интерес белок, с точки зрения компонентов, отличных от НСР и HCDNA, может также претерпевать значительные измерения в процессе осуществления способа.

В конкретном варианте осуществления изобретения, в котором раствор, содержащий представляющий интерес белок, до осуществления способа двухстадийной TFF представляет собой супернатант клеточной культуры, способ двухстадийной TFF обеспечивает снижение концентрации HCDNA в растворе до 600000 пг/мг указанного белка или менее, до 500000 пг/мг указанного белка или менее, до 400000 пг/мг указанного белка или менее, до 300000 пг/мг указанного белка или менее или до 200000 пг/мг указанного белка или менее, и/или снижение концентрации НСР в растворе до 450000 нг/мг указанного белка или менее, до 400000 нг/мг указанного белка или менее или до 350000 нг/мг указанного белка или менее.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, предлагаемые в изобретении можно применять для очистки представляющего интерес белка из ферментационной реакционной среды, в которой в результате реакции ферментации продуцируется белок в высокой концентрации. Так, в некоторых вариантах осуществления изобретения способы, предлагаемые в изобретении, включают очистку представляющего интерес белка из раствора клеточной культуры, в котором концентрация белка составляет по меньшей мере 200 мг/л, 400 мг/л, 600 мг/л, 700 мг/1, 800 мг/л, 900 мг/л, 1 г/л, 1,5 г/л, 2 г/л, 2,5 г/л, 3 г/л, 3,5 г/л, 4 г/л, 4,5 г/л или 5 г/л раствора.

Некоторые объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

и в которых после осуществления первой и второй операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

и в которых после осуществления первой и второй операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм;

и в которых после осуществления первой и второй операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых после осуществления первой и второй операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой и указанной второй операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм);

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

и в которых после осуществления первой и второй операции с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм;

в которых после осуществления первой и второй операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой и указанной второй операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм;

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых после осуществления первой и второй операции с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой и указанной второй операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых после осуществления первой и второй операции с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, и указанной второй операций с использованием устройства для TFF.

Некоторые объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF, и третью операцию с использованием устройства для TFF,

и в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа; и

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

и в которых после осуществления первой, второй и третьей операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF, и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа; и

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

третью операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после второй операции с использованием устройства для TFF или параллельно с ней (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между второй и третьей операциями с использованием устройства для TFF);

и в которых после осуществления первой, второй и третьей операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF, и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа; и

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм);

и в которых после осуществления первой, второй и третьей операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF, и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа; и

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых после осуществления первой, второй и третьей операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, указанной второй и указанной третьей операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF, и третью операцию с использованием устройства для TFF,

и в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа; и

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

третью операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после второй операции с использованием устройства для TFF или параллельно с ней (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между второй и третьей операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм);

и в которых после осуществления первой, второй и третьей операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF, и третью операцию с использованием устройства для TFF,

и где

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа; и

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

третью операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после второй операции с использованием устройства для TFF или параллельно с ней (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между второй и третьей операциями с использованием устройства для TFF);

в которых после осуществления первой, второй и третьей операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, указанной второй и указанной третьей операции с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF, и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа; и

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм;

в которых после осуществления первой, второй и третьей операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, указанной второй и указанной третьей операций с использованием устройства для TFF.

Другие объекты изобретения относятся к способам отделения представляющего интерес иммуноглобулина (например, антитела) от супернатанта клеточной культуры, содержащего иммуноглобулин, с помощью двухстадийной TFF, в которых двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, вторую операцию с использованием устройства для TFF, и третью операцию с использованием устройства для TFF,

в которых

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки от 300 до 1000 кДа, предпочтительно 300 кДа; и

(III) при указанной третьей операции с использованием устройства для TFF фильтруют третий поток продукта, содержащего представляющий интерес иммуноглобулин, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа или менее, предпочтительно 50 кДа;

в которых

вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

третью операцию с использованием устройства для TFF осуществляют непосредственно после второй операции с использованием устройства для TFF или параллельно с ней (т.е. согласно данному объекту не осуществляют промежуточных операций с использованием устройства между второй и третьей операциями с использованием устройства для TFF);

в которых

первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, который был стерилизован путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм (предпочтительно 0,2 мкм или 0,22 мкм);

в которых после осуществления первой, второй и третьей операций с использованием устройства для TFF,

(а) снижают концентрацию НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 10% относительно концентрации НСР в супернатанте клеточной культуры; и/или

(б) концентрация НСР в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 400000 нг/мг иммуноглобулина или менее; и/или

(в) снижают концентрацию HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, по меньшей мере на 30% относительно концентрации HCDNA в супернатанте клеточной культуры; и/или

(г) концентрация HCDNA в растворе, содержащем иммуноглобулин, составляет 1500000 пг/мг иммуноглобулина или менее;

и в которых

указанные способы дополнительно заключаются в том, что осуществляют процесс хроматографии (например, процесс ионообменной хроматографии и/или процесс аффинной хроматографии) после указанной первой, указанной второй и указанной третьей операций с использованием устройства для TFF.

Любой из представленных в настоящем описании способов двухстадийной TFF, независимо от того, описан ли он в качестве объекта и/или варианта осуществления изобретения, и от того, описан ли он в качестве предпочтительного или нет, можно объединять с последующими стандартными процессами очистки, известными в данной области, такими как аффинная очистка, или, в частности, с последующими процессами очистки, не основанными на аффинном выделении, например, с процессами ионообменной хроматографии. В конкретном примере, любой из представленных в настоящем описании способов двухстадийной TFF можно осуществлять перед осуществлением процесса аффинной очистки, включающим, например, применение белка А (например, с помощью хроматографии с использованием белка А). В других примерах, не ограничивающих объем изобретения, любые из представленных в настоящем описании способов двухстадийной TFF можно осуществлять перед осуществлением процессов не основанной на аффинности очистки, включающими, например, операции с использованием хроматографических процессов/устройств, таких как СЕХ и/или АЕХ. В конкретных вариантах осуществления изобретения способы двухстадийной TFF можно осуществлять перед осуществлением процессов не основанной на аффинности очистки, включающими и СЕХ, и АЕХ, при этом АЕХ необязательно осуществляют перед осуществлением СЕХ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы двухстадийной TFF осуществляют перед осуществлением процесса/операции с использованием устройства для СЕХ, при этом регулируют значение рН раствора, содержащего представляющую интерес молекулу, до величины, составляющей 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 или 7,0, перед осуществлением процесса/операции с использованием устройства для СЕХ. Согласно конкретному объекту указанного варианта осуществления изобретения регулирование значения рН перед осуществлением СЕХ согласно способам, предлагаемым в изобретении, не ассоциировано с осаждением НСР и/или HCDNA в растворе. Согласно некоторым объектам указанного варианта осуществления изобретения способы двухстадийной TFF осуществляют перед осуществлением процесса/операции с использованием устройства для СЕХ, при этом не осуществляют осаждение или фильтрацию осадка перед осуществлением процесса/операции с использованием устройства для СЕХ.

Другие объекты и преимущества настоящего изобретения должны стать очевидными после ознакомления с представленным ниже описанием, в котором приведены с целью иллюстрации и в качестве примера определенные варианты осуществления настоящего изобретения.

Определения

В целом, приведенные ниже понятия и фразы при их употреблении в кратком изложении сущности изобретения, описании, примерах и формуле изобретения имеют указанные ниже значения.

В контексте настоящего описания понятие «примерно» применительно к числу означает ±5% от указанного численного значения. При его употреблении применительно к измерению, которое осуществляют с помощью прибора (например, к значению рН, которое определяют с помощью рН-метра) или осуществляют согласно стандартному методу, известному в данной области (например, к концентрации белка в растворе, которую определяют с помощью ЖХВР, УФ-абсорбции, ELISA, стандартных наборов (например, для колориметрического анализа)), оно указывает, что число находится в пределах стандартной ошибки, известной для такого прибора, или в пределах одного стандартного отклонения величины, определяемой таким методом.

Понятие «антитело» применяют в его наиболее широком смысле и оно конкретно включает, например, индивидуальные моноклональные антитела (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела; а также деиммунизированные, мышиные, химерные, гуманизированные и человеческие антитела), композиции антител, обладающие полиэпитопной специфичностью, одноцепочечные антитела, димерные антитела (диабоди), тримерные антитела (триабоди), иммуноконъюгаты, синтетические антитела, камелизованные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, сцепленные дисульфидом Fvs (sdFv), интрабоди и эпитопсвязывающие фрагменты любой из указанных выше субстанций. В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулина, т.е. молекулы, которые содержат антигенсвязывающий центр. Понятие «антитело» включает также молекулы иммуноглобулина любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂) или подкласса.

В контексте настоящего описания понятие «между» («от…до…») применительно к определению диапазона специально включает границы указанного диапазона. Так, если в настоящем описании указано, что параметр находится «между X и Y» («от X до Y»), то при этом специально подразумевается, что параметр может иметь величину, равную X или превышающую X, при условии, что самая большая его величина равна Y, т.е. не превышает Y. Иными словами, величины, определяемые выражением «между X и Y» и аналогичными конструкциями, специально включают величины X и Y. Например, подразумевается, что применяемая в настоящем описании фраза «где мембрана имеет границу отсечки от 300 кДа до 1000 кДа» специально включает варианты осуществления изобретения, в которых мембрана имеет границу отсечки, равную 300 кДа, а также варианты осуществления изобретения, в которых мембрана имеет границу отсечки, равную 1000 кДа.

В контексте настоящего описания выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. В частности, под объем изобретения подпадает отделение и/или очистка представляющих интерес молекул, например, белков, от продуктов клеток, клеточных линий и клеточных культур. Такие продукты, как правило, включают кондиционированные среды для клеток и/или лизированные и гомогенизированные клетки и клеточные культуры (например, гомогенизированные клетки и компоненты клеток, присутствующие в кондиционированных средах для клеток). Способы, предлагаемые в изобретении, наиболее пригодны для обработки продуктов трансгенных клеток, клеточных линий и клеточных культур, где трансгенные клетки, клеточные линии и клеточные культуры экспрессируют представляющую интерес молекулу. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения под объем изобретения подпадает применение осветленных кондиционированных сред для культивирования клеток.

Следует иметь в виду, что способы, предлагаемые в изобретении, относятся к отделению, очистке представляющей интерес молекулы, например, белка, от раствора, содержащего молекулу, и/или ее обработке. Таким образом, когда раствор, содержащий представляющую интерес молекулу, представляет собой среду для культивирования клеток или фракционированную или осветленную часть среды для культивирования клеток, то следует понимать, что такая среда представляет собой обязательно кондиционированную среду для культивирования клеток (т.е. она должна содержать представляющую интерес молекулу). Следовательно, в контексте настоящего описания, понятие «раствор клеточной культуры» и аналогичные понятия относятся к любому раствору, присутствующему в биологическом процессе или системе, который, как ожидается, содержит представляющую интерес молекулу, включая (но не ограничиваясь только ими), например, кондиционированный супернатант клеточной культуры; осветленный кондиционированный супернатант клеточной культуры; осветленные, гомогенизированные/лизированные клеточные культуры и т.д. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения питающий поток для двухстадийной TFF представляет собой супернатант клеточной культуры, как указано в настоящем описании.

Под объем способов двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании, подпадает также необязательная обработка сред для клеточных культур с целью осветления и/или стерилизации перед осуществлением первой операции с использованием устройства для TFF, т.е. перед осуществлением операций с использованием устройства для двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании. В контексте настоящего описания понятия «осветленный» и «осветление» относятся к удалению состоящего из частиц материала из раствора, включая стерилизацию фильтрацией. Следует понимать, что понятие «стерилизованный» в контексте настоящего описания используют применительно к раствору, содержащему белки, таким образом, следует понимать, что «стерилизацию» таких растворов осуществляют предпочтительно путем фильтрации, а не путем нагрева, для того, чтобы избежать денатурации белка и/или агрегации белка. «Очищенный»/«стерилизованный» раствор применительно к любым средам для культивирования клеток, подпадающим под объем способов, предлагаемых в изобретении, представляет собой раствор, профильтрованный через мембрану с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,2 мкм или 0,22 мкм.

В контексте настоящего описания понятие «двухстадийная ультрафильтрация в тангенциальном потоке», «двухстадийная TFF» и аналогичные понятия относятся к применению по меньшей мере двух TFF и/или операций с использованием устройства для диафильтрации/TFF в комбинации друг с другом. В конкретных вариантах осуществления изобретения понятие «двухстадийная TFF» относится к применению трех или более TFF и/или операций с использованием устройства для диафильтрации/TFF в комбинации друг с другом. Употребление понятия «в комбинации» не ограничивает порядок, в котором раствор, содержащий представляющую интерес молекулу (например, белок), подвергают двум или большему количеству TFF и/или операций с использованием устройства для диафильтрации/TFF в комбинации друг с другом. Понятие «в комбинации» не ограничивает также способ осуществлением по меньшей мере двух TFF и/или операций с использованием устройства для диафильтрации/TFF непосредственно друг за другом (т.е. осуществлением одной операции с использованием устройства непосредственно за другой); таким образом, двухстадийная фильтрация в тангенциальном потоке включает процессы, заключающиеся в осуществлении одной или нескольких операций с использованием устройства, не представляющих собой TFF и/или диафильтрацию/TFF, в промежутке между осуществлением по меньшей мере двух TFF и/или диафильтрации/операции с использованием устройства для TFF согласно способам, строго определенным в настоящем описании. Употребление понятия «в комбинации» не накладывает также ограничений на график осуществления каждой из двух или большего количества TFF и/или операций с использованием устройства для диафильтрации/TFF, представленных в настоящем описании, и две или большее количество индивидуальных операций с использованием устройства могут быть разделены промежутком времени, составляющим 1 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч или 72 ч. Кроме того, две или большее количество индивидуальных операций с использованием устройства можно выполнять одновременно друг с другом, например, осуществлять параллельно, как это известно в данной области. Понятие «двухстадийная TFF» может относиться также к применению по меньшей мере двух TFF и/или операций с использованием устройства для диафильтрации/TFF в комбинации со стандартными протоколами или процессами очистки, известными в данной области, например, с СЕХ и АЕХ.

В контексте способов, представленных в настоящем описании, выражение «неочищенный питающий поток», как правило, относится к сырому материалу или сырому раствору, полученному в результате производства, который подают для осуществления начальной операции с использованием устройства, где сырой материал содержит представляющую интерес молекулу (например, биомолекулу, белок, полипептид, антитело и т.д.) и может содержать также различные загрязнители (например, нежелательные белки, фрагменты клеток, вирусы, ДНК и т.д.). В отличие от этого, понятие «поток продукта», как правило, применяют в более широком контексте для обозначения раствора, содержащего представляющую интерес молекулу, который уже мог быть подвергнут определенной обработке (например, одной или нескольким операциям с использованием устройства, включая осветление, фильтрацию и т.д.), но мог и не подвергаться указанной обработке. Однако, с точки зрения способов, предлагаемых в изобретение, какие-либо различия между понятиями «питающий поток» и «поток продукта» являются несущественными, поскольку оба понятия относятся просто к растворам, содержащим представляющий интерес продукт (например, биомолекулу, белок, полипептид, антитело и т.д.), в целом, указанные растворы можно подвергать обработке с помощью способов, предлагаемых в изобретении, вне зависимости от того, производилась ли перед этим его обработка или нет. Если какое-то различие между понятиями «питающий поток» и «поток продукта» является необходимым для целей настоящего описания, то для специалиста в данной области это должно быть очевидно из контекста.

В контексте настоящего описания понятия «микрофильтрация» и «ультрафильтрация» характеризуют параметры фильтрации, общеизвестные в данной области. В частности, понятие «микрофильтрация», как правило, относится к применению фильтрационной мембраны с размерами пор от 0,1 до 10 мкм, а понятие «ультрафильтрация» относится к применению фильтрационной мембраны с размерами пор от 0,001 до 0,1 мкм. Микрофильтрацию, как правило, применяют для осветления, стерилизации, удаления микрочастиц и для сбора клеток; ультрафильтрацию, как правило, применяют для разделения и концентрирования растворенных молекул (например, белков, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов и других биомолекул), для обмена буферов и для фракционирования по размеру. Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, относятся к ультрафильтрации с использованием TFF и диафильтрации/операции с использованием устройства для TFF. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, могут включать также применение ультрафильтрационных мембран или мембран с даже более крупными размерами пор, например, в одном или нескольких устройствах для диафильтрации, для осуществления операций с использованием устройства, таких как стерилизация, до, т.е. перед осуществлением начальной/первой операции с использованием устройства для TFF, представленной в настоящем описании. Стерилизация загружаемых жидкостей, например, супернатантов клеточных культур, содержащих представляющие интерес белки, с помощью методов фильтрации хорошо известна в данной области и, как правило, заключается в фильтрации супернатанта через фильтрационные мембраны с размерами пор в пределах от примерно 0,1 мкм до примерно 0,45 мкм. Таким образом, под объем настоящего изобретения подпадают также способы двухстадийной TFF, включающие стерилизацию супернатанта клеточной культуры перед осуществлением начальной/первой операции с использованием устройства для TFF, в которых стерилизацию осуществляют путем фильтрации через пригодную фильтрационную мембрану с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,2 или 0,22 мкм.

В контексте настоящего описания выражение «представляющая интерес молекула» и аналогичные выражения относятся к молекуле, которую требуется отделить от раствора или суспензии. Представляющие интерес молекулы отделяют от других частиц или молекул в растворе или суспензии на основе размера представляющей интерес молекулы. В некоторых вариантах осуществления способов, представленных в настоящем описании, представляющие интерес молекулы отделяют также от исходного жидкого компонента раствора или суспензии с помощью процесса обмена буфера, например, посредством осуществления операции с использованием устройства для диафильтрации. Отделение представляющих интерес молекул от загрязнителей и/или других нежелательных компонентов раствора или суспензии можно обозначать также понятием «очистка». В предпочтительных вариантах осуществления изобретения представляющие интерес молекулы являются биомолекулами. Это означает, что представляющие интерес молекулы имеют биологическое или биохимическое происхождение и/или продуцируются культурами клеток млекопитающих или микроорганизмов (например, бактериями, грибами, дрожжами), при этом клеточные культуры могут быть трансгенными или могут не быть такими. Таким образом, представляющая интерес молекула, например, белок, может представлять собой молекулу, продуцируемую нативной клеточной культурой или может представлять собой рекомбинантный продукт. Представляющие интерес молекулы можно получать также in vivo с использованием животных моделей, например, трансгенных животных, или можно получать с помощью методов in vitro. Методы in vitro могут быть основаны на использовании биохимических путей, присущих клеткам млекопитающих и/или микроорганизмов. Примерами представляющих интерес молекул в контексте способов, предлагаемых в настоящем изобретении, являются (но не ограничиваясь только ими) белки, пептиды, полипептиды, антитела, ферменты и их фрагменты.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

На фиг 1 - схема способа двухстадийной TFF для отделения белка с молекулярной массой 150±30 кДа (например, антитела), включающего операцию с использованием устройства для TFF/концентрирования, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 50 кДа, и последующую операцию с использованием устройства для TFF/диафильтрации, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 300 кДа;

на фиг. 2 - схема способа двухстадийной TFF для отделения белка с молекулярной массой 150±30 кДа (например, антитела), включающего операцию с использованием устройства для TFF/диафильтрации, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 50 кДа, и последующую операцию с использованием устройства для TFF/диафильтрации, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 300 кДа;

на фиг. 3 - схема способа двухстадийной TFF для отделения белка с молекулярной массой 150±30 кДа (например, антитела), включающего операцию с использованием устройства для TFF/концентрирования/диафильтрации, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 50 кДа, последующую операцию с использованием устройства для TFF/диафильтрации, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 300 кДа, и последующую третью операцию с использованием устройства для TFF/концентрирования, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 50 кДа;

на фиг. 4 - схема способа двухстадийной TFF для отделения белка с молекулярной массой 150±30 кДа (например, антитела), включающего операцию с использованием устройства для TFF/концентрирования/диафильтрации, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 50 кДа, последующую операцию с использованием устройства для TFF/диафильтрации, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 300 кДа, которую осуществляют параллельно с третьей операцией с использованием устройства для TFF/концентрирования, содержащего ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки 50 кДа.

Подробное описание изобретения

При создании изобретения неожиданно было установлено, что применение двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке («двухстадийная TFF») для выделения представляющей интерес молекулы из раствора, содержащего молекулу, позволяет резко снижать уровень загрязнителей в растворе по сравнению со стандартными процессами очистки. Таким образом, заявленные способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, могут дополнять существующие схемы очистки и/или заменяь одну или несколько операций с использованием устройств в существующих схемах очистки. В частности, представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF позволяют снижать уровни загрязнителей до такой степени, что последующую обработку и/или очистку молекулы можно проводить без необходимости осуществления дополнительных процессов осаждения примесей и осветления/фильтрации осадка. Представленные в настоящем описании способы наиболее пригодны для процессов разделения и/или очистки биомолекул. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF можно применять в любом процессе отделения/очистки/выделения представляющей интерес молекулы от/из раствора. Существенное снижение уровней загрязнителей/примесей, обеспечиваемое с помощью представленных в настоящем описании способов двухстадийной TFF имеет значение также для любого процесса, в котором уровни загрязнителей/примесей оказывают негативное влияние на характеристики процесса и/или функцию операции с использованием устройства. Например, способ двухстадийной TFF можно применять перед осуществлением аффинной хроматографии, например, на колонке с белком А, или операций с использованием устройства для ионообменной хроматографии для защиты (посредством снижения уровня примесей), например, аффинной молекулы, например, белка А, или хроматографической смолы с целью удлинения их эффективного срока службы. В конкретных вариантах осуществления изобретения представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF могут заменять одну или несколько операций с использованием устройств в существующих схемах очистки, например, аффинной хроматографии, и, таким образом, их можно применять для не основанной на аффинности очистки/выделения/отделения биомолекулы, например, антитела, из/от раствора, содержащего биомолекулу. В других вариантах осуществления изобретения представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF можно применять также в процессах, которые включают аффинную хроматографию, например, хроматографию на белке А.

Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF позволяют снижать уровни загрязнителей/примесей, благодаря чему последующие процессы очистки можно осуществлять без применения промежуточного процесса осаждения и осветления, например, процесса осаждения и осветления, применяемого, например, перед осуществлением катионообменной хроматографии (СЕХ). В конкретных вариантах осуществления изобретения способами двухстадийной TFF можно заменять также одну или несколько операций с использованием устройства в традиционных процессах очистки, например, осуществляемых с помощью аффинной хроматографии. Таким образом, способы, предлагаемые в изобретении, могут приводить к существенной экономии как прямых затрат, так и косвенных затрат, ассоциированных с любым процессом производства, обработки и/или очистки потока. Касательно прямых затрат, способы двухстадийной TFF, предлагаемые в изобретении, могут, в некоторых вариантах осуществления изобретения, заменять методы хроматографии на основе аффинности. Поскольку стоимость фильтрационных мембран существенно меньше стоимости материалов для хроматографии на основе аффинности (например, касательно оснащения типичной промышленной колонки стоимость ниже по меньшей мере на ¼) и они имеют более продолжительные сроки службы, то применение основанных на использовании мембран способов двухстадийной TFF позволяет сокращать прямые материальные затраты на эту начальную стадию очистки. Кроме того, использование аффинной хроматографии ассоциировано также с множеством косвенных затрат, включая затраты на тщательную подготовку загружаемого материала для обеспечения его совместимости с аффинным материалом; мониторинг восстановления аффинного материала; и периоды остановки процесса для регенерации аффинного материала. Кроме того, поскольку параметры буферов для связывания и/или элюирования, применяемых для аффинной хроматографии, могут оказаться несовместимыми с последующими процессами, то для потока продукта может потребоваться осуществление дополнительных операций с использованием устройств, таких как замена буфера, перед осуществлением обычных дополнительных стадий очистки/доочистки, таких как ионообменная хроматография. Применение способов двухстадийной TFF, предлагаемых в изобретении, позволяет осуществлять косвенную экономию каждой из указанных дополнительных затрат. Способы двухстадийной TFF, предлагаемые в настоящее изобретении, основаны на размере, указанная характеристика мембраны не чувствительна к параметрам питающего потока и не требует мониторинга, поскольку выщелачивание не применяют. Кроме того, можно обрабатывать/очищать представляющую интерес молекулу в питающем потоке, одновременно регулируя параметры потока раствора так, чтобы выходной поток был полностью совместимым с последующими процессами, например, СЕХ, с минимальной дополнительной обработкой.

Методы отделения представляющей интерес молекулы от раствора, содержащего молекулу, на основе ее размера, например, молекулярной массы, являются известными. Из числа таких методов наиболее широко практикуемыми являются методы мембранной фильтрации. В настоящее время существует два основных метода мембранной фильтрации: однопроходная фильтрация или фильтрация прямого потока (DFF) и фильтрация в поперечном или тангенциальном потоке (TFF). Способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, относятся конкретно к TFF. TFF представляет собой ультрафильтрационную систему, которая отличается от DFF тем, что поток раствора, предназначенный для фильтрации, не подводят перпендикулярно к мембране, как при DFF, а направляют параллельно фильтрационной мембране. TFF была разработана для того, чтобы контролировать схему течения жидкости питающего потока таким образом, чтобы усиливать транспорт удержанного(ых) растворенного(ых) вещества от поверхности мембраны и возвращать его/их в основной объем питающего потока.

При осуществлении TFF поток, содержащий представляющую интерес молекулу, пропускают по поверхности мембраны с высокими скоростями с вектором, тангенциальным плоскости мембраны. В процессе TFF по длине мембраны прикладывают разность давлений для того, чтобы заставить жидкость и фильтруемые растворенные вещества протекать через фильтр. Это осуществляют для увеличения коэффициента переноса массы для обеспечения обратной диффузии. Жидкость, протекающая в направлении, параллельном фильтрационной мембране, также осуществляет непрерывную очистку поверхности фильтра и тем самым предупреждает его забивку. Можно осуществлять рециркуляцию оставшегося раствора (ретентата) и повторно пропускать его по поверхности мембраны, в то время как жидкость, прошедшую через фильтр (пермеат) непрерывно сливают в отдельное устройство. Согласно представленным в настоящем описании способам, предлагаемым в изобретении, в зависимости от границы отсечки, размера пор или другого параметра проницаемости фильтра представляющая интерес молекула может находиться в пермеате или в ретентате, получаемом при осуществлении индивидуальной операции с использованием устройства для TFF и, таким образом, либо пермеат, либо ретентат, получаемый при осуществлении любой операции с использованием устройства для TFF, можно собирать для последующей обработки согласно способам двухстадийной TFF, представленным в настоящем описании, или для последующей обработки после осуществления способов двухстадийной TFF. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что операция методом TFF редко бывает полностью эффективной. Это означает, что небольшой процент молекул, которые теоретически должны были бы оставаться в ретентате после операции с использованием устройства для TFF, могут, тем не менее, проходить через фильтрационную мембрану и присутствовать в пермеате; аналогично этому, небольшое количество молекул, которые теоретически должны были бы проходить через мембрану в пермеат при осуществлении операции с использованием устройства для TFF, могут, тем не менее, удерживаться мембраной и оставаться в ретентате. Таким образом, касательно осуществления операции с использованием устройства для TFF употребляемые понятия «не проходит через мембрану» и «присутствует в ретентате» не следует интерпретировать как абсолютные, но они указывают на то, что по меньшей мере 90% представляющей интерес молекулы, для которой применяют операцию с использованием устройства для TFF, собирается в ретентате. Аналогично этому, понятия «проходит через мембрану» и «присутствует в пермеате» также не следует интерпретировать как абсолютные, но они указывают на то, что по меньшей мере 90% представляющей интерес молекулы, для которой применяют операцию с использованием устройства для TFF, собирается в пермеате.

Применение и реализация операций с использованием устройства для TFF хорошо известны в данной области. Продемонстрировано применение методов TFF для фильтрации компонентов крови (см., например, U.S. 4888115), в производстве пищевых продуктов (например, пива, ЕР-А2 0208450), при очистке иммуноглобулинов из молока или молозива (см., например, U.S. 4644056) и при выделении противовирусных субстанций, таких как интерфероны, из продуцирующих их клеточных культур (см., например, U.S. 4420398). Таким образом, в любом методе, представленном в настоящем описании или известном в данной области, можно осуществлять индивидуальные операции с использованием устройства для TFF согласно способам, представленным в настоящем описании. Представленное в настоящем описании применение способов двухстадийной TFF, предлагаемых в изобретении, не включает обработку молока или фракционированных растворов молока, например, растворов/фракций молока с высоким содержанием казеина или с низким содержанием казеина, изолята сывороточного белка и т.д. Таким образом, питающие потоки или потоки продукта, подпадающие под объем способов, предлагаемых в изобретении, не представляют собой молоко или фракционированные растворы молока.

Способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, заключаются в том, что применяют по меньшей мере две операции с использованием устройства для TFF (т.е., первую и вторую операции с использованием устройства для TFF), посредством которых отделяют представляющую интерес молекулу на основе размера молекулы.

Первая операции с использованием устройства для TFF в способе двухстадийной TFF, представленном в настоящем описании, отличается тем, что фильтруют первый поток продукта, содержащий представляющую интерес молекулу, таким образом, чтобы молекула могла находиться или собираться в ретентате, образующемся при осуществлении операции с использованием устройства для TFF. Удерживание представляющей интерес молекулы в ретентате, образующемся при осуществлении операции с использованием устройства для TFF, осуществляют путем выбора такой ультрафильтрационной мембраны, которая является непроницаемой для представляющей интерес молекулы. Хотя выбор может быть основан на действительном или эффективном размере представляющей интерес молекулы, например, выбирают мембрану с границей отсечки или размером пор, меньшей/меньшим, чем действительный или эффективный размер, как известно в данной области, характеристики мембраны могут зависеть и от других факторов (например, от заряда мембраны). Следовательно, мембраны с известными границами отсечки или размерами пор, превышающими размер представляющей интерес молекулы, могут быть, тем не менее, функционально непроницаемыми для молекулы при осуществлении операции с использованием устройства для TFF. Таким образом, первая операция с использованием устройства для TFF отличается тем, что применяют ультрафильтрационная мембрану, имеющую границу отсечки, которая меньше чем молекулярная масса представляющей интерес молекулы, и/или отличается тем, что молекула не может проходить через мембрану в процессе первой операции с использованием устройства для TFF. В конкретных вариантах осуществления изобретения ультрафильтрационная мембрана для первой операции с использованием устройства для TFF имеет границу отсечки, которая составляет не более одной второй от молекулярной массы представляющей интерес молекулы; т.е. граница отсечки составляет 0,5 от молекулярной массы представляющей интерес молекулы или менее.

Вторая операции с использованием устройства для TFF в способе двухстадийной TFF, представленном в настоящем описании, отличается тем, что фильтруют второй поток продукта, содержащий представляющую интерес молекулу, таким образом, чтобы молекула могла находиться или собираться в пермеате, образующемся при осуществлении операции с использованием устройства для TFF. Сбор представляющей интерес молекулы в пермеате, образующемся при осуществлении операции с использованием устройства для TFF, осуществляют путем выбора такой ультрафильтрационной мембраны, которая является свободно проницаемой для представляющей интерес молекулы. Хотя выбор может быть основан на действительном или эффективном размере представляющей интерес молекулы, например, выбирают мембрану с границей отсечки или размером пор, большим/большей, чем действительный или эффективный размер, как известно в данной области, характеристики мембраны могут зависеть и от других факторов (например, от заряда мембраны). Таким образом, вторая операция с использованием устройства для TFF в способе двухстадийной TFF, представленном в настоящем описании, отличается тем, что применяют ультрафильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки, которая больше чем молекулярная масса представляющей интерес молекулы, и/или отличается тем, что представляющая интерес молекула может проходить через мембрану В некоторых вариантах осуществления изобретения ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки, которая по меньшей мере в два раза превышает молекулярную массу представляющей интерес молекулы; это означает, что граница отсечки равна 2 молекулярным массам представляющей интерес молекулы или более. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам, включающим ультрафильтрацию молекул; следовательно, граница отсечки при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF ограничена также верхней границей диапазона ультрафильтрации, известной и/или принятой в данной области, т.е. величиной 1000 кДа.

Как подробно описано в настоящей заявке, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения способы, предлагаемые в изобретении, направлены на отделение белка, например, иммуноглобулина, от раствора, содержащего белок, например, супернатанта клеточной культуры, который необязательно был осветлен и/или стерилизован, например, профильтрован через мембрану, имеющую размер пор от 0,1 до 0,45 мкм, предпочтительно профильтрован через мембрану, имеющую размер пор 0,2 мкм или 0,22 мкм. Согласно общим способам, предлагаемым в изобретении, границы отсечки для первой и второй операций с использованием устройства для TFF выбирают так, чтобы они были меньше и больше молекулярной массы представляющей интерес молекулы соответственно. Следует понимать, что это приводит, в частности, к тому, что при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF представляющая интерес молекула не проходит через фильтрационную мембрану, а при второй операции с использованием устройства для TFF представляющая интерес молекула проходит через фильтрационную мембрану. Однако, поскольку характеристики фильтрационной мембраны могут зависеть также от факторов, отличных от точного молекулярного размера (например, они могут зависеть от заряда молекулы), то настоящее описание не накладывает ограничений на критерии, с помощью которых можно выбирать мембраны (при условии, что представляющая интерес молекула не проходит через мембрану при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF и проходит через мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения границы отсечки мембран, применяемых согласно способам двухстадийной TFF, представленным в настоящем описании, выбирают на основе характеристик мембраны, а не строго на основе заявленной границы отсечки (например, согласно спецификациям производителя). Методы определения характеристик мембраны и конкретно проницаемости мембраны для представляющей интерес молекулы, например, белка, хорошо известны и широко применяются в данной области.

Следует подчеркнуть, что применение понятий «первый» и «второй» в качестве идентификаторов по меньшей мере для двух операций с использованием устройства для TFF в способах двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании, не указывает на их порядок. Иными словами, в представленных в настоящем описании способах не требуется, чтобы первую операцию с использованием устройства для TFF (отличающуюся тем, что представляющая интерес молекула находится в ретентате) осуществляли перед второй операцией с использованием устройства для TFF (отличающейся тем, что представляющая интерес молекула находится в пермеате). Скорее, понятия первый и второй в контексте настоящего описания представляют собой исключительно идентификаторы, позволяющие различать по меньшей мере две операции с использованием устройства для TFF в способе двухстадийной TFF, представленном в настоящем описании. Так, в некоторых вариантах осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, вторую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют перед осуществлением первой операции с использованием устройства. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют перед второй операцией с использованием устройства для TFF. В некоторых вариантах осуществления изобретения поток ретентата, образующийся при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF, формирует второй поток продукта для второй операции с использованием устройства для TFF, как это представлено в настоящем описании. В других вариантах осуществления изобретения одну или несколько дополнительных операций с использованием устройства можно осуществлять между первой и второй операциями с использованием устройства для TFF.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, могут содержать или включать также одну или несколько операций с использованием устройства для TFF в дополнение к первой и второй операциям с использованием устройства для TFF, представленным в настоящем описании. Одна или несколько дополнительных операций с использованием устройства для TFF могут включать применение ультрафильтрационной мембраны, идентичной той, которую применяют для первой операции с использованием устройства для TFF, или отличной от нее, или могут включать применение ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки, отличную от той, которую применяют для первой операции с использованием устройства для TFF, при условии, что граница отсечки меньше молекулярной массы представляющей интерес молекулы и/или она такова, что представляющая интерес молекула не может проходить через мембрану.

В конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение включает третью операцию с использованием устройства для TFF, отличающуюся тем, что фильтруют третий поток продукта, содержащий представляющую интерес молекулу, таким образом, чтобы молекула могла находиться или собираться в ретентате, образующемся при осуществлении операции с использованием устройства для TFF. Таким образом, критерии для осуществления третьей операции с использованием устройства для TFF согласно этому варианту осуществления изобретения являются такими же, что и для осуществления первой операции с использованием устройства для TFF. Следовательно, третья операция с использованием устройства для TFF согласно этому варианту осуществления изобретения отличается тем, что применяют ультрафильтрационную мембрану, имеющую граница отсечки, которая меньше молекулярной массы представляющей интерес молекулы, и/или отличается тем, что молекула не может проходить через мембрану при осуществлении третьей операции с использованием устройства для TFF. В конкретных вариантах осуществления изобретения ультрафильтрационная мембрана для третьей операции с использованием устройства для TFF имеет границу отсечки, которая составляет не более чем одну вторую от молекулярной массы представляющей интерес молекулы; это означает, что граница отсечки составляет 0,5 от молекулярной массы представляющей интерес молекулы или менее.

Как указано в настоящем описании, первую и вторую операции с использованием устройства для TFF можно объединять в любом порядке. Так, в способе двухстадийной TFF, предлагаемом в изобретении, первую операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять перед осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF, или вторую операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять перед осуществлением первой операции с использованием устройства для TFF. Кроме того, способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, включают также применение одной или нескольких операций с использованием устройства для TFF в дополнение к первой и второй операциям с использованием устройства для TFF, например, третьей операции с использованием устройства для TFF, где дополнительные операции с использованием устройства для TFF можно осуществлять перед, после или в промежутке между осуществлением первой и второй операций с использованием устройства для TFF. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, включающем третью операцию с использованием устройства для TFF, первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют перед осуществлением второй операции с использованием устройства для TFF, которую осуществляют перед осуществлением третьей операции с использованием устройства для TFF, где третья операция с использованием устройства для TFF отличается тем, что в ней применяют ультрафильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки, которая меньше молекулярной массы представляющей интерес молекулы, и/или отличается тем, что молекула не может проходить через мембрану при осуществлении третьей операции с использованием устройства для TFF. Согласно этому варианту осуществления изобретения первую, вторую и третью операции с использованием устройства для TFF можно осуществлять непосредственно одну за другой, или между ними можно осуществлять одну или несколько дополнительных операций с использованием устройства. В конкретных вариантах осуществления изобретения третью операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять параллельно со второй операцией с использованием устройства для TFF или можно осуществлять после завершения второй операции с использованием устройства для TFF.

Первую и вторую операции с использованием устройства и/или вторую и третью операции с использованием устройства можно осуществлять непосредственно одну за другой. В контексте настоящего описания выражения «осуществляют непосредственно перед», «осуществляют непосредственно после», «непосредственно перед», «непосредственно после» и аналогичные выражения не включают хронологический компонент; так, например, не требуется, чтобы осуществление первой и второй операций с использованием устройства для TFF или второй и третьей операций с использованием устройства для TFF имело место или происходило в течение какого-либо конкретного периода времени. Скорее, выражения указывают на то, что поток продукта не подвергают никаким другим операциям с использованием устройства между осуществлением первой и второй или между осуществлением второй и третьей операций с использованием устройства; так, например, первую операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять, например, в периодическом режиме, т.е. поток продукта запасают и/или транспортируют и запасают, а затем по истечении определенного периода времени поток продукта обрабатывают путем осуществления второй операции с использованием устройства для TFF (при условии, что не осуществляют никаких промежуточных операций с использованием устройства).

Хотя в конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается, что двухстадийные TFF способы, предлагаемые в изобретении, заменяют процессы хроматографии на основе аффинности в любой схеме очистки или обработки, в изобретении предусмотрены также способы очистки, включающие как способ двухстадийной TFF, предлагаемый в изобретении, так и очистку на основе аффинности. Таким образом, изобретение предусматривает комбинацию способов двухстадийной TFF и одной или нескольких дополнительных стадий очистки и/или операций с использованием устройства, включая хроматографию на основе аффинности, например, хроматографию с использованием белка А или белка G. Примерами других стадий очистки или операций с использованием устройств являются методы, специально представленные в настоящем описании, и/или методы, известные в данной области, такие, как аффинная хроматография с использованием белков микробного происхождения (например, упомянутая аффинная хроматография с использованием белка А или белка G), ионообменная хроматография (например, катионообменная (карбоксиметильные смолы), анионообменная (аминоэтильные смолы) и обменная хроматография смешанного типа), тиофильная адсорбция (например, с использованием бета-меркаптоэтанола и других SH лигандов), хроматография гидрофобного взаимодействия или ароматическая абсорбционная хроматография (например, с использованием фенил-сефарозы, аза-аренофильных смол или мета-аминофенилбороновой кислоты), металл-хелатная аффинная хроматография (например, с использованием обладающего аффинностью к Ni(II) и Cu(II) материала), гель-фильтрация и препаративные электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi М.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, сс. 93-102). Дополнительные примеры стадий очистки или операций с использованием устройства, хорошо известные в данной области, включают (но не ограничиваясь только ими) хроматографию на гидроксилапатите; диализ, аффинную хроматографию с использованием антитела для захвата белка, хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC), хроматографию гидрофобного взаимодействия с индуцированием заряда (HCIC), осаждение сульфатом аммония, анионо- или катионообменную хроматографию, осаждение этанолом; ЖХВР с обращенной фазой; хроматографию на диоксиде кремния, хроматофокусирование и гель-фильтрацию.

Комбинация по меньшей мере первой и второй операций с использованием устройства для TFF, осуществляемых согласно способам двухстадийной TFF, представленным в настоящем описании, позволяет не только отделять представляющую интерес молекулу от нежелательных компонентов раствора, содержащего представляющую интерес молекулу, но также и значительно снижать уровень загрязнений, которые в противном случае могут мешать осуществлению последующих процессов. Таким образом, способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, позволяют осуществлять обработку разнообразных входных потоков и получать выходной поток продукта, который можно подвергать дальнейшей обработке с помощью последующих методов очистки, известных в данной области, более быстрым, эффективным и экономичным образом. В частности, способы двухстадийной TFF позволяют значительно снижать уровни загрязнителей и примесей в потоке продукта без применения дорогостоящих операций с использованием устройств, таких как осаждение и фильтрация осадка. В данной области ранее уже было установлено, что процессы осаждения являются нежелательными и они приводят к снижению выходов, поскольку нельзя выделить раствор продукта из осажденных фракций. Помимо снижения выходов наличие осадка и операций с использованием устройства для фильтрации осадка приводят к увеличению прямых расходов, обусловленному такими факторами (но не ограничиваясь только ими) как увеличение времени обработки (например, требуемого для образования осадка и его фильтрации), увеличение энергетических затрат (например, на охлаждение в процессе осаждения) и увеличение затрат на оборудование (например, на большие отстойники для реакций осаждения). Следовательно, возможное исключение последующих операций с использованием устройств для осаждения при применении операций с использованием устройства для двухстадийной TFF, предлагаемых в настоящем изобретении, дает значительные экономические выгоды, включая увеличение выходов после обработки, уменьшение времени обработки и устранение фиксированных расходов (например, ассоциированных с операциями с использованием устройств для осаждения). Кроме того, значительное снижение уровней примесей/загрязнений может давать дополнительные экономические выгоды с точки зрения последующих процессов, таких как процессы хроматографии. Например, уменьшение загрязнения с помощью способов двухстадийной TFF может повышать производительность применяемой для последующей обработки колонки (например, благодаря более высокому динамическому связыванию, меньшему засорению), увеличивать время обработки (например, позволять применять более высокую скорость потока) и удлинять срок службы колонки. Кроме того, как продемонстрировано на примерах в настоящем описании, существенное снижение нагрузки загрязнениями для последующих процессов позволяет применять хроматографические колонки меньшего размера без угрозы перегрузки, что дает еще большие экономические преимущества. Таким образом, способы двухстадийной TFF, предлагаемые в изобретении, обеспечивают многочисленные экономические преимущества для процессов, в которых их применяют.

В конкретных вариантах осуществления изобретения представляющие интерес молекулы являются биомолекулами, продуцируемыми клетками млекопитающих, культурами микроорганизмов и/или животными (которые все могут быть трансгенными, но могут и не быть трансгенными), указанные биомолекулы выделяют из раствора культуры или общей воды организма животного. Альтернативно этому представляющие интерес молекулы могут представлять собой биомолекулы, продуцируемые в системе in vitro посредством биохимических реакций и путей, и их требуется отделять от компонентов системы in vitro, например, от ферментов и исходного материала, применяемого для создания биомолекулы. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула представляет собой белок, например, антитело, которое требуется отделять от раствора клеточной культуры (например, супернатанта клеточной культуры, необязательно профильтрованного через мембрану с размером пор 0,22 мкм).

Способы, представленные в настоящем описании, включают применение операций с использованием устройства для TFF, имеющих ультрафильтрационные мембраны. Как известно в данной области, при ультрафильтрации, как правило, применяют мембраны, имеющие размер пор от 0,001 до 0,1 мкм. Дополнительно или альтернативно этому ультрафильтрационные мембраны можно оценивать по границе отсечки, измеряемой в кДа, которая представляет собой максимальную приблизительную молекулярную массу, которая может свободно проходить через мембрану. Известно, что ультрафильтрационные мембраны применяют для разделения молекул, включая (но не ограничиваясь только ими) белки, полипептиды, коллоиды, иммуноглобулины, слитые белки, фрагменты иммуноглобулина, микоплазму, эндотоксины, вирусы, аминокислоты, ДНК, РНК и углеводы.

Способы, представленные в настоящем описании, не ограничены применением какой-либо конкретной ультрафильтрационной мембраны из числа тех различных типов мембран, которые можно приобретать на коммерческой основе и/или можно изготавливать с помощью методов, хорошо известных в данной области, таким образом, чтобы они имели требуемую границу отсечки молекулярной массы и не адсорбировали представляющую интерес молекулу (например, белок, антитело и т.д.). Примеры ультрафильтрационных мембран, которые можно применять в способах, предлагаемых в изобретении, включают (но не ограничиваясь только ими) мембраны, изготовленные из целлюлозы и производных целлюлозы типа ацетата целлюлозы (СА), полисульфона (PS), полиэфирсульфона (PES), поливинилиденфторида (PVDF), полиамида (РА) и/или полиакрилнитрила (PAN).

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна из по меньшей мере двух операций с использованием устройства для TFF в способах двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании, представляет собой высокопроизводительную фильтрацию в тангенциальном потоке (HPTFF). HPTFF представляет собой двумерную операцию с использованием устройства, которая разделяет растворенные белки на основе как размера, так и заряда, что позволяет осуществлять разделение видов белков, которые различаются по размеру менее чем в 10 раз. Основное различие между операциями с использованием устройств для TFF и HPTFF состоит в том, что в последнем случае применяют заряженные мембраны (прежде всего, мембраны, имеющие ту же самую полярность, что и виды, которые требуется собирать в ретентате, образующемся при осуществлении операции с использованием устройства). Как известно в данной области, высокой селективности HPTFF достигают путем тщательного регулирования значения рН буфера и ионной силы для того, чтобы максимизировать различия в эффективном объеме несущих различные заряды видов в потоке продукта/питающем потоке. Это обеспечивают путем тщательного контроля течения пермеата и замены/диафильтрации буфера в процессе осуществления операции. Эффективный объем заряженного белка (который определяют, например, с помощью гель-фильтрации) учитывает наличие диффузного двойного электрического слоя, окружающего белок. Увеличение заряда белка или уменьшение ионной силы раствора приводит к увеличению эффективного объема белка и тем самым снижает прохождение белка через мембрану. Таким образом, HPTFF осуществляет разделение на основе разницы, как в размере, так и в заряде, при этом величина этих вкладов определяется свойствами белка, мембраны и буферными средами. Оптимальное разделение, как правило, достигается при осуществлении операций (1) вблизи от изоэлектрической точки видов, которые проникают (проходят через фильтр) через мембрану, и (2) при относительно низкой концентрации солей для максимизации электростатических взаимодействий. Эффекты, обусловленные непосредственно зарядом, можно использовать также, если выбирать фильтрационные мембраны с профилями зарядов, являющихся предпочтительными для видов, которые требуется удерживать и/или фильтровать в условиях, в которых осуществляют операцию (см., например, Zydney и Kuriyel, Methods in Biotechnol. 9, 2000, сс. 35-46; Lebreton и др., Biotechnol. Bioeng. 2008(100), сс. 964-974; и U.S. 5256294).

Как представлено в настоящем описании, способ двухстадийной TFF требует применения по меньшей мере двух операций с использованием устройства для TFF, он включает (1) первую операцию с использованием устройства для TFF, при которой фильтруют первый поток продукта таким образом, что представляющую интерес молекулу, например, белок, собирают в ретентате, образующемся при осуществлении операции с использованием устройства для TFF; и (2) вторую операцию с использованием устройства для TFF, при которой фильтруют второй поток продукта таким образом, что представляющую интерес молекулу, например, белок, собирают в пермеате, образующемся при осуществлении операции с использованием устройства для TFF. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, могут отличаться тем, что (1) для первой операции с использованием устройства для TFF применяют ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки, которая меньше молекулярной массы представляющей интерес молекулы (в предпочтительных вариантах осуществления изобретении она составляет максимум одну вторую от молекулярной массы представляющей интерес молекулы (т.е. граница отсечки составляет 0,5 от молекулярной массы представляющей интерес молекулы или менее)) и/или ультрафильтрационную мембрану, которая отличается тем, что представляющая интерес молекула не проходит через мембрану при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF; и (2) для второй операции с использованием устройства для TFF применяют ультрафильтрационную мембрану с границей отсечки, которая превышает молекулярную массу представляющей интерес молекулы (в предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере в два раза превышает молекулярную массу представляющей интерес молекулы (т.е. граница отсечки составляет по меньшей мере 2 молекулярные массы представляющей интерес молекулы или более, но менее 1000 кДа)) и/или ультрафильтрационная мембрану, которая характеризуется тем, что представляющая интерес молекула проходит через мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF. На ультрафильтрационные мембраны, предназначенные для применения согласно способам, представленным в настоящем описании, не накладывается никаких других ограничений и они могут быть изготовлены из любого материала и иметь любую(ые) границу(ы) отсечки при условии, что они удовлетворяют указанным в настоящем описании широким критериям исключения (т.е., граница отсечки мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF должна быть такой, чтобы представляющая интерес молекула не проходила через мембрану при осуществлении операции с использованием устройства для TFF; и граница отсечки мембраны для второй операции с использованием устройства для TFF должна быть такой, чтобы представляющая интерес молекула проходила через мембрану при осуществлении операции с использованием устройства для TFF). Мембраны из различных материалов, с различными границами осечки, размерами пор и профилями проницаемости можно получать стандартными методами, известными в данной области (см., например, публикацию заявки на патент США 2010/0190965), и/или приобретать на коммерческой основе. Например, фирма Pall GmbH (Драйайх, Германия) предлагает ультрафильтрационные мембраны, имеющие границы отсечки 1, 5, 10, 30, 50, 70, 100 и 300 кДа; фирма Satorius AG (Гёттинген, Германия) предлагает ультрафильтрационные мембраны, имеющие 1, 2, 3, 5, 10, 30, 50, 100 и 300 кДа; фирма EMD Millipore (шт.Массачусетс, США) предлагает ультрафильтрационные мембраны, имеющие границы отсечки 1, 3, 5, 10, 30, 100, 300, 500 и 1000 кДа; и фирма Novasep (Помпей, Франция) предлагает ультрафильтрационные мембраны, имеющие границы отсечки 1, 3, 5, 10, 30, 50, 70, 100 и 300 кДа.

Способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, хорошо адаптированы для применения в промышленном масштабе. Способы можно осуществлять в режиме периодических или непрерывных операций, или в полунепрерывном режиме, например, на основе непрерывного потока раствора, содержащего требуемые виды, проводят по меньшей мере две операции с использованием устройства для TFF до тех пор, пока не будет профильтрована вся крупная партия (с применением одной или нескольких необязательных стадий отмывки в промежутке между стадиями фильтрации). Таким путем можно осуществлять непрерывный циклический процесс с получением больших выходов требуемого продукта в форме с приемлемой чистотой в течение относительно коротких периодов времени.

В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуальные операции с использованием устройства для TFF согласно способам, представленным в настоящем описании, можно объединять с диафильтрацией. Диафильтрация представляет собой процесс фракционирования, заключающийся в том, что вымывают молекулы меньшего размера через фильтрационную мембрану для TFF, оставляя более крупные молекулы в ретентате. Это представляет собой удобный и эффективный метод концентрирования представляющей интерес молекулы и/или удаления или замены солей, удаления детергентов, отделения несвязанных молекул, удаления низкомолекулярных материалов или быстрого изменения ионной силы или значения рН окружающей среды. Как правило, диафильтрацию применяют для обмена буфера, когда представляющая интерес молекула остается в ретентате. Диафильтрацию можно объединять и/или применять в любой операции с использованием устройства для TFF в способах двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании. Например, диафильтрацию можно применять в самой первой операции с использованием устройства для TFF в способе двухстадийной TFF, например, для замены компонентов питающего потока на пригодный для целей дальнейшей обработки буфер (см., например, фиг. 1). Альтернативно или дополнительно диафильтрацию можно применять при осуществлении более чем одной операции с использованием устройства для TFF в способе двухстадийной TFF, например, в процессе концентрирования и/или для осуществления обмена буфера в процессе обработки (см., например, фиг. 2). Процессы диафильтрации хорошо известны и широко применяются в данной области, и их можно осуществлять с помощью любого метода, известного в данной области и/или представленного в настоящем описании.

Способы, представленные в настоящем описании, наиболее пригодны для удаления загрязнений из питающих потоков, образующихся в процессах производства рекомбинантного белка. Более конкретно, представленные способы наиболее пригодны для обработки белка, присутствующего в растворе клеточной культуры, и позволяют снижать уровни обычных загрязнителей/примесей, таких как НСР и HCDNA, благодаря чему снижается или устраняется необходимость в осаждении НСР и HCDNA путем последующей обработки. В частности, способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, позволяют снижать уровни НСР- и HCDNA-нагрузки потока продукта (например, раствора клеточной культуры, такого как супернатант клеточной культуры) таким образом, что состав потока продукта может быть отрегулирован перед осуществлением последующего процесса, например, СЕХ, без осуществления осаждения НСР и/или HCDNA. В конкретных вариантах осуществления изобретения, касающихся обработки белка, присутствующего в растворе клеточной культуры, способы двухстадийнойя TFF, представленные в настоящем описании, позволяют снижать уровни нагрузки НСР и HCDNA потока продукта таким образом, что значение рН раствора может быть доведено примерно до рН 5 без осуществления осаждения НСР и/или HCDNA.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, касающихся отделения белка от раствора клеточной культуры (например, от супернатанта клеточной культуры, необязательно профильтрованного через мембрану, имеющую размер пор от 0,1 до 0,45 мкм), способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, позволяют снижать нагрузку HCDNA неочищенного содержащего питательные вещества потока (т.е., исходного раствора клеточной культуры перед осуществлением какой-либо операции с использованием устройства за исключением необязательной фильтрации через фильтр, имеющий размер пор от 0,1 до 0,45) по меньшей мере на 50%. Иными словами, концентрацию HCDNA в растворе, содержащем представляющий интерес белок, сформированном после и/или образовавшемся в результате осуществления способа двухстадийной TFF, представленного в настоящем описании, можно снижать по меньшей мере на 50% относительно концентрации HCDNA в неочищенном растворе клеточной культуры до операции с использованием способа двухстадийной TFF. Продемонстрировано также, что способы, предлагаемые в изобретении, обладают еще большей эффективностью в отношении снижения нагрузок HCDNA и в некоторых вариантах осуществления изобретения позволяют снижать концентрацию HCDNA в растворе, содержащем представляющую интерес молекулу, по меньшей мере на 90% или 95%. Таким образом, способы, представленные в настоящем описании, позволяют снижать концентрацию HCDNA в растворе, содержащем представляющую интерес молекулу, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, касающихся отделения белка от раствора клеточной культуры (например, от супернатанта клеточной культуры, необязательно профильтрованного через мембрану, имеющую размер пор от 0,1 до 0,45 мкм), способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, позволяют снижать нагрузку НСР неочищенного питающего потока (т.е., исходного раствора клеточной культуры перед осуществлением какой-либо операции с использованием устройства за исключением необязательной фильтрации через фильтр, имеющий размер пор от 0,1 до 0,45) по меньшей мере на 10%. Иными словами, концентрацию НСР в растворе, содержащем представляющий интерес белок, сформированном после и/или образовавшемся в результате осуществления способа двухстадийной TFF, представленного в настоящем описании, можно снижать по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45% или по меньшей мере на 50% относительно концентрации НСР в неочищенном растворе клеточной культуры до операции с использованием способа двухстадийной TFF.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых представляющая интерес молекула является белком (например, представляет собой антитело) и питающий поток представляет собой супернатант клеточной культуры, нагрузка НСР раствора, содержащего молекулу, который получен в результате и/или после осуществления способа двухстадийной TFF, представленного в настоящем описании, составляет 450000 нг/мг белка или менее, а нагрузка HCDNA в образовавшемся растворе составляет 600000 пг/мг белка или менее.

Согласно изобретению антитело предпочтительно получают методами рекомбинации. Общие методы получения антител путем рекомбинации хорошо известны в данной области и включают экспрессию белка в прокариотических или эукариотических клетках (см., например, следующие обзоры: Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, сс. 183-202; Geisse S., и др., Protein Expr. Purif. 8, 1996, cc. 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, cc. 151-160; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998, cc. 870-880). Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, в принципе пригодны для производства любого антитела. Водном из вариантов осуществления изобретения иммуноглобулины, получаемые с помощью способа, предлагаемого в изобретении, представляют собой рекомбинантные иммуноглобулины. В других вариантах осуществления изобретения иммуноглобулины представляют собой гуманизированные иммуноглобулины, химерные иммуноглобулины, человеческие иммуноглобулины, фрагменты иммуноглобулина или конъюгаты иммуноглобулинов. В другом объекте настоящего изобретения антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело. Антитела, получаемые с помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, могут представлять собой терапевтические или диагностические антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения антитела представляют собой терапевтические антител. Примеры терапевтических антител включают (но не ограничиваясь только ими) антитело к опухолевому антигену (например, к рецепторам фактора роста и факторам роста), такому как EGFR, HER3, HER4, Ер-САМ, СЕА, TRAIL, TRAIL-рецептор 1, TRAIL-рецептор 2, рецептор лимфотоксина-бета, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-IR, CTLA-4, фибробласт-активирующий белок (FAP), гепсин, меланома-ассоциированный хондроитинсульфат протеогликан (MCSP), простатоспецифический мембранный антиген (PSMA), рецептор VEGF 1, рецептор VEGF 2, IGF1-R, TSLP-R, PDGF-R, TIE-I, TIE-2, TNF-альфа, TNF-подобный слабый индуктор апоптоза (TWEAK), IL-IR, VEGF, EGF, PDGF, HGF и ангиопоэтин. Антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, может представлять собой также алемтузумаб, аполизумаб, цетуксимаб, эпратузумаб, галиксимаб, гемтузумаб, ипилимумаб, лабетузумаб, панитумумаб, ритуксимаб, нимотузумаб, мапатумумаб, матузумаб, пертузумаб или ING-I.

В некоторых вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула представляет собой белок, имеющий молекулярную массу 150±75 кДа (например, 150±30 кДа или 150±15 кДа), и двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF с ультрафильтрационной мембраной, имеющей границу отсечки 50 кДа; вторую операцию с использованием устройства для TFF с ультрафильтрационной мембраной, имеющей границу отсечки 300 кДа; и необязательно третью операцию с использованием устройства для TFF с ультрафильтрационной мембраной, имеющей границу отсечки 50 кДа. Применение ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа, позволяет исключать из ретентата (содержащего представляющий интерес белок) двухцепочечные нуклеиновые кислоты размером менее 240-475 пар оснований; применение ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 300 кДа, позволяет исключать двухцепочечную нуклеиновую кислоту размером более 1450-2900 пар оснований из пермеата (содержащего представляющий интерес белок; т.е. двухцепочечные нуклеиновые кислоты размером более 1450-2900 пар оснований удерживаются в образующемся при осуществлении TFF ретентате, в то время как представляющая интерес молекула проходит через мембрану и ее можно собирать из пермеата). Хотя необязательную третью операцию с использованием устройства для TFF осуществляют после первой и второй операций с использованием устройства для TFF, необязательную третью операцию с использованием устройства для TFF можно использовать для концентрирования белка из раствора пермеата, образующегося в результате осуществления второй операции с использованием устройства для TFF.

Для всех вариантов осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, необязательная третья операция с использованием устройства для TFF может включать применение ультрафильтрационной мембраны, которая идентична мембране, применяемой в первой операции с использованием устройства для TFF, или отлична от нее; это означает, что она отличается тем, что имеет границу отсечки, которая меньше молекулярной массы представляющего интерес белка, и/или отличается тем, что белок не проходит через мембрану и его можно собирать в ретентате, полученном в результате третьей операции с использованием устройства для TFF. В некоторых вариантах осуществления изобретения третья операция с использованием устройства для TFF отличается тем, что в ней применяют ультрафильтрационную мембрану, имеющую границу отсечки, составляющую не более 0,5 от молекулярной массы представляющего интерес белка, или отличается тем, что применяют ультрафильтрационную мембрану, которая не позволяет представляющему интерес белку проходить через нее при осуществлении операции. Как и случае понятий «первый» и «второй». употребляемых применительно к операции с использованием устройства для TFF, предлагаемой в настоящем изобретении, понятие «третий» при его употреблении применительно к операции с использованием устройства для TFF согласно способам двухстадийной TFF, предлагаемым в настоящем изобретении, не накладывает никакого ограничения на порядок осуществления индивидуальной операции с использованием устройства для TFF в описанном способе; это означает, что третья операция с использованием устройства для TFF не должна обязательно следовать за первой и второй операциями с использованием устройства для TFF, представленными в настоящем описании (т.е. осуществляться после них). Вместо этого третью операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять перед первой операцией с использованием устройства для TFF, перед второй операцией с использованием устройства для TFF или ее можно осуществлять перед и первой и второй операциями с использованием устройства для TFF. Альтернативно этому или дополнительно третью операцию с использованием устройства для TFF можно осуществлять после первой операции с использованием устройства для TFF, после второй операции с использованием устройства для TFF или ее можно осуществлять после и первой и второй операций с использованием устройства для TFF. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения способ двухстадийной TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF, после нее вторую операцию с использованием устройства для TFF и третью операцию с использованием устройства для TFF, которую осуществляют после и первой, и второй операций с использованием устройства, где при осуществлении третьей операции с использованием устройства для TFF применяют ультрафильтрационную мембрану, которая может быть идентичной мембране, применяемой для первой операции с использованием устройства для TFF или может быть отличной от нее, и/или которая имеет границу отсечки не более чем 0,5 молекулярной массы представляющего интерес белка.

В конкретных вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула представляет собой белок, имеющий молекулярную массу 150±75 кДа, и двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF с ультрафильтрационной мембраной, имеющей границу отсечки 50 кДа, после нее осуществляют вторую операции с использованием устройства для TFF с ультрафильтрационной мембраной, имеющей границу отсечки 300 кДа, и третью операцию с использованием устройства для TFF с ультрафильтрационной мембраной, имеющей границу отсечки 50 кДа, которую осуществляют после и первой, и второй операций с использованием устройства для TFF. Первую, вторую и/или третью операции с использованием устройства для TFF можно объединять с диафильтрацией. Первую, вторую и/или третью операции с использованием устройства для TFF можно осуществлять в периодическом режиме и непосредственно одну за другой или можно осуществлять последовательно в системе с непрерывным потоком. Способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, предусматривают также применение одной или нескольких операций с использованием устройства, которые осуществляют между первой, второй и/или третьей операциями с использованием устройства для TFF, предлагаемыми в изобретении. Одну или несколько из первой, второй и/или третьей операций с использованием устройства для TFF можно осуществлять параллельно с другими операциями с использованием устройства для TFF, предлагаемыми в изобретении, или можно осуществлять параллельно с одной или несколькими дополнительными операциями с использованием устройства.

Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF в сочетании с последующей СЕХ обладают выраженными преимуществами с точки зрения обработки белков по сравнению с соответствующими процессами, известными в данной области, прежде всего, обладают преимуществами с точки зрения последующей дальнейшей обработки/очистки белков. Более конкретно, по сравнению с процессами, в которых применяют одностадийную TFF, последующая обработка (например, с помощью СЕХ) питающих потоков и/или продукта, содержащих представляющий интерес белок, которые обрабатывали согласно способам, предлагаемым в изобретении, обладает выраженными преимуществами с точки зрения обработки и в экономическом плане. Например, неожиданно было установлено, что обработка супернатанта клеточной культуры с применением двухстадийной TFF согласно предлагаемым в настоящем изобретении способам устраняет необходимость в осуществлении каких-либо процессов осаждения и фильтрации осадка перед осуществлением СЕХ. В отличие от этого, процесс, в котором применяют метод одностадийной TFF, требует включения дополнительной стадии осаждения/фильтрации осадка для удаления загрязнителей, представляющих собой HCDNA и НСР, из потока продукта перед осуществлением СЕХ. Таким образом, представленные в настоящем описании способы, обладают преимуществами, заключающимися в экономии прямых и косвенных временных и денежных затрат при осуществлении последующего процесса очистки.

Необходимость осуществления осаждения/фильтрации осадка при применении известных из существующего уровня техники процессов, не основанных на аффинности, обусловлена тем, что обработка с помощью одностадийной TFF, осуществляемая согласно известным методам, не позволяет удалять в достаточной степени загрязнители (например, НСР и/или HCDNA) из потока, представляющего собой образец, перед осуществлением последующей хроматографической обработки. Например, при не основанной на аффинности обработке/очистке белка согласно методам, известным в данной области, как правило, применяют АЕХ и/или СЕХ для дополнительного/дополнительной рафинирования/очистки потока продукта. Однако, уровни загрязнения, остающиеся после осуществления одностадийной TFF, как правило, не позволяют применять сразу после нее ни АЕХ, ни СЕХ вследствие перегрузки, превышающей мощность колонки (см., например, приведенный в настоящем описании раздел Примеры). Кроме того, невозможность осуществить достаточную очистку от загрязнителей потока образца может приводить также к осаждению при регулировании значения рН/буфера, необходимом перед многими процессами хроматографической очистки, например, перед обработкой с помощью СЕХ. Таким образом, уровни загрязнений сами по себе и/или осаждение загрязнителей при осуществлении стандартных способов обработки могут оказывать негативное влияние на хроматографические процессы, применяемые вместо аффинной очистки. Однако необходимость удаления загрязнителей и, прежде всего, обусловленного ими осадка, значительно увеличивает затраты времени и средств на процесс очистки (например, затраты на охлаждение, поскольку осаждение в промышленном масштабе обычно производят в течение ночи при 4-8°С). Процессы осаждения имеют также недостаток, заключающийся в том, что выход продукта в зависимости от природы и объема осадка может оказаться небольшим. Например, как правило, нежелательно вносить и осадок и супернатант в пористый фильтр из-за индукции засорения фильтра; таким образом, растворимый продукт, присутствующий в осадке, как правило, теряется.

Неожиданно было установлено, что, в отличие от этого, способы, предлагаемые в изобретении, (т.е., включающие двухстадийную TFF, как представлено в настоящем описании) позволяют снижать загрязнения потока продукта до концентраций, оказывающих минимальное влияние или не оказывающих влияние на последующие процессы, например, позволяют исключить процессы осаждения/фильтрации осадка, которые обычно требуются при осуществлении регулирования значения рН. Например, путем обработки супернатанта клеточной культуры с помощью одностадийной TFF, известной в данной области, концентрацию HCDNA можно снижать лишь на 17-24%; в отличие от этого, способы двухстадийной TFF, предлагаемые в изобретении, позволяют снижать уровни HCDNA в супернатанте клеточной культуры по меньшей мере на 85-92% и возможно еще более. Аналогично этому, путем обработки с помощью одностадийной TFF, известной в данной области, концентрацию НСР в супернатанте клеточной культуры можно снижать лишь на 0-28%; в отличие от этого, способы двухстадийной TFF, предлагаемые в изобретении, позволяют снижать уровни НСР в супернатанте клеточной культуры по меньшей мере на 17-46% или более.

Касательно индивидуальных процессов, используемых в способах двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании, вторая операция с использованием устройства для TFF может обеспечивать очистку растворов, содержащих представляющую интерес молекулу, например, белок, от большей части загрязнителей, в частности, когда подлежащий обработке питающий поток представляет собой раствор культуры (т.е. супернатант клеточной культуры). Например, осуществление второй операции с использованием устройства для TFF, т.е. операции, отличающейся тем, что представляющая интерес молекула собирается в пермеате, для питающего потока, представляющего собой супернатант клеточной культуры, позволяет удалять по меньшей мере 86% HCDNA-нагрузки, по меньшей мере 22% НСР-нагрузки, из образовавшегося раствора, содержащего представляющий интерес белок. Вторая операция с использованием устройства для TFF позволяет также удалять по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80% по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% HCDNA-нагрузки, из раствора, содержащего представляющую интерес молекулу. Вторая операция с использованием устройства для TFF позволяет также удалять по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25% или по меньшей мере 30% НСР-нагрузки, из раствора, содержащего представляющую интерес молекулу.

Как указано в настоящем описании, значительное снижение уровней загрязнений, достигаемое с помощью способов двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании, имеет важное значение как для предшествующих, так и последующих процессов. Например, удаление загрязнителей в очень больших количествах, достигаемое при применении способов двухстадийной TFF, представленных в настоящем описании, обеспечивает их эффективность в широком диапазоне качества питающего потока, например, эффективность в широком диапазоне уровней/концентраций загрязнителей питающего потока. Таким образом, представленные в настоящем описании способы можно применять вне зависимости от качества питающего потока (например, качества кондиционированного осветленного супернатанта клеточной культуры) и тем самым устранять зависимость от предшествующей обработки, осуществляемой для удовлетворения минимальным требованиям к качеству. Аналогично этому, удаление загрязнителей в больших количествах позволяет также не рассматривать касающиеся последующей обработки вопросы, такие как мощность ионообменной колонки, позволяющие увеличивать поток и уменьшать время обработки. Обработка с помощью двухстадийной TFF занимает также меньше времени по сравнению с существующими методами, известными в данной области, например, включающими стадии осаждения и фильтрации осадка.

Индивидуальные операции с использованием устройства для TFF, из которых состоит способ двухстадийной TFF, представленный в настоящем описании (т.е. включающий первую и вторую операции с использованием устройства для TFF и необязательно, одну или несколько третьих операций с использованием устройства для TFF), можно объединять друг с другом для обеспечения процесса в режиме непрерывного потока или их можно осуществлять по отдельности в режиме отдельных периодических операций. Индивидуальные операции с использованием устройства для TFF в способах, представленных в настоящем описании, можно объединять также для осуществления параллельных операций, как это известно в данной области, например, таким образом, чтобы поток продукта от одной операции питал другую операцию, поток продукта от которой затем возвращался для осуществления исходной операции. Параллельное применение индивидуальных операций с использованием устройства может также снижать затраты, связанные с увеличением мощностей для хранения и времени для обработки.

Область применения представленных в настоящем описании способов двухстадийной TFF можно непосредственно расширять, как известно в данной области. Это позволяет применять их в любом процессе, где требуется осуществлять последующую обработку без осаждения. Например, двухстадийную TFF можно осуществлять перед любой хроматографической стадией для повышения срока службы колонки. Значительное снижение НСР- и HCDNA-нагрузки, может приводить к увеличению срока службы колонки как в результате непосредственного воздействия, так и опосредованно. Непосредственный эффект способов, предлагаемых в изобретении, заключается в уменьшении количества примесей, контактирующих с адсорбентом, что предупреждает забивку/засорение фильтра. Косвенный эффект заключается в том, что уменьшение загрязнения может позволить снижать жесткость условий «чистки на месте», необходимой для регенерации колонки. Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно предпочтительно применять для очистки антител для диагностических (не фармацевтических) целей.

Все патенты и публикации, упомянутые в настоящем описании, являются показателем уровня знаний специалистов в области, к которой относится изобретение. Следует понимать, что проиллюстрированы определенные варианты изобретения, они не накладывают ограничений на конкретные формы или порядок расположения элементов, представленных и проиллюстрированных в настоящем описании. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что могут быть сделаны различные изменения без отклонения от объема изобретения и не следует считать, что изобретение ограничено тем, что продемонстрировано и представлено в описании. Для более полного понимания представленного в настоящем описании изобретения ниже представлены примеры, не ограничивающие его объем.

Примеры

Пример 1:

Обработка белка в растворе с помощью одностадийной TFF

Настоящий пример относится к выделению и/или очистке антитела из содержащего антитело раствора с помощью методов неаффинной очистки, прежде всего, с помощью анионообменной хроматографии («АЕХ») и катионообменной хроматографии («СЕХ»). Исходный раствор, содержащий антитело, представлял собой питающий поток осветленной кондиционированной содержащей клеточную культуру среды. Питающий поток предварительно кондиционировали с помощью одностадийной фильтрации в тангенциальном потоке («TFF») с границей отсечки 50 кДа. Настоящий пример относится к общепринятой практике, которая в данной области является стандартной при не основанном на аффинности выделении антитела из типичных питающих потоков (см., например, Gottschalk 2009; Alahari и др., BioPharm Int., 2 марта 2009 г.(приложение); Wang и др., BioPharm. Int., 2 октября 2009 г.). Прежде всего, антитело сначала концентрировали (и частично очищали как представлено в настоящем описании) с помощью одностадийной TFF с использованием ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки меньше молекулярной массы антитела. После процесса TFF осуществляли обмен буфера/диафильтрацию перед осуществлением хроматографических процессов. Хотя это и не имело значения для конкретных методов, описанных и представленных в качестве примеров в настоящей заявке, в рассматриваемом примере применяли конкретное антитело, представлявшее собой антитело к рецептору колониестимулирующего фактора 1 (анти-CSFR1; см. WO 2011/131407).

Методы:

Одностадийная фильтрация в тангенциальном потоке и диафильтрация (продукт присутствует в ретентате)

Одностадийную фильтрацию в тангенциальном потоке осуществляли с использованием устройства Satorius Sartocon Slice с тандемным насосом модели 1082 (фирма Satorius Stedim Biotech S.A., Обань, Франция) и кассеты Sartocon Slice Cassette PESU 50 кДа (площадь фильтрации 200 см², продукт №3081465002 E-SG; фирма Satorius Stedim). При осуществлении одностадийной TFF, концентрировали 945 мл осветленного супернатанта клеточной культуры (т.е. питающий поток), содержащего представляющее интерес антитело в концентрации 2,9 мг/мл, до 136 мл.

После этого осуществляли обмен буфера путем диафильтрации в противотоке 10-кратного объема 25 мМ Трис/HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5. Условия для TFF/диафильтрации выбирали согласно стандартной в данной области практике. В частности, граница отсечки для одностадийной TFF, 50 кДа, является примером границы отсечки из диапазона от 10 до 50 кДа, который обычно выбирают для того, чтобы сконцентрировать продукт (т.е. иммуноглобулин), отфильтровывая низкомолекулярные белки клеток-хозяев, ДНК и фрагменты продукта из потока продукта.

Анионообменная хроматография

Поток продукта после стадии TFF/обмена буфера (т.е. ретентат) подвергали анионообменной хроматографии («АЕХ») согласно стандартным методам, известным в данной области. Хроматографию осуществляли в следующих условиях:

Обменный материал:	Q-Sepharose FF (фирма GE Healthcare, Фрейбург, Германия)
Колонка	внутренний диаметр 8 мм, длина 100 мм, объем 5,03 мл
Скорость потока:	150 см/ч (1,25 мл/мин)*
Уравновешивающий раствор:	25 мМ Трис/HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5
Загрузка:	80 г белка/1 л хроматографического материала
Промывочный раствор:	25 мМ Трис/HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5
Метод элюции:	изократический
(*) Скорость потока снижалась вследствие повышения противодавления, возникающего при загрузке образца и элюции.

Содержащий антитело образец (загружаемый продукт или поток продукта) загружали на хроматографическую колонку как указано выше. После загрузки колонку промывали промывочным раствором и выделяли антитело методом изократической элюции (проточный режим).

Регулирование значения рН до 5,0

Как указано выше, антитело, элюированное из АЕХ-колонки, находилось в буфере, имеющем значение рН 7,5. Для того чтобы осуществлять последующую СЕХ, значение рН содержащего антитело элюата доводили до рН 5,0 путем добавления 1М лимонной кислоты.

В научных статьях на данную тему неоднократно указывалось, что регулирование значения рН на этой стадии обработки приводит к осаждению загрязнений, присутствующих в питающем потоке, например, белков клеток-хозяев («НСР») и ДНК клеток-хозяев («HCDNA»; см., например, Gottschalk 2006; Anakumari и др., BioPharm Int., февраль 2007 г.(приложение); Arunakumari и др., BioPharm. Int., 2 марта 2009 г.(приложение); Arunakumari, Bioprocess Int., февраль 2009; Jue и др., BioPharm Int., 2 марта 2008 г.(приложение); Jue и др., BioPharm Int. 2 октября 2009 г.). Поэтому перед осуществлением СЕХ образец необходимо осветлять путем центрифугипрования и фильтрации.

Катионообменная хроматография: режим связывания-элюирования

После регулирования значения рН и фильтрации антитело выделяли из потока продукта с помощью СЕХ. Хроматографию осуществляли в следующих условиях:

Обменный материал:	Poros 50HS (фирма Life Technologies Co., Карлсбад, шт. Калифорния, США)
Колонка:	внутренний диаметр 8 мм, длина 100 мм, объем 5,03 мл
Скорость потока:	150 см/ч (=1,25 мл/мин)
Уравновешивающий раствор:	10 мМ цитрат натрия, рН 5,0
Загрузка:	40 г белка/1 л хроматографического материала
Промывочный раствор:	10 мМ цитрат натрия, рН 5,0
Раствор для элюирования:	10 мМ цитрат натрия, 750 мМ NaCl, рН 5,0
Метод элюции:	линейный градиент от 0% (об. %) до 100% (об. %) раствора для элюирования в 22,5 объемах колонки.

После загрузки колонки для СЕХ, как указано выше, колонку промывали промывочным раствором. Антитело в мономерной форме собирали методом элюции с использованием линейного градиента, при этом значение рН поддерживали на постоянном уровне и изменяли (повышали) проводимость путем добавления хлорида натрия.

Определение антитела и загрязнителей

Для исходного и конечного потоков продукта, а также на различных стадиях процесса очистки (как правило, после каждой операции с использованием устройства), определяли концентрации как антитела, так и загрязнителей, представляющих собой белки клеток-хозяев («НСР») и ДНК клеток-хозяев («HCDNA»). Концентрацию антитела в осветленном супернатанте клеточной культуры (исходный питающий поток) и во всех промежуточных потоках продукта определяли с помощью белок А-ЖХВР (жидкостная хроматография высокого разрешения на основе белка А; применяемая колонка: сенсорный картридж PA ImmunoDetection® для технологии Perfusion Immunoassay™ фирмы Applied Biosystems). Концентрацию антитела в объединенном элюате после СЕХ определяли по УФ-адсорбции при 280 нм.

Пропорцию мономерного антитела определяли с помощью ГФ-ЖХВР (гель-фильтрация-жидкостная хроматография высокого разрешения; применяемая колонка: TSK-GEL G3000SWXL; 7,8 мм (внутренний диаметр) × 30,0 см (длина), 5 мкм сорбент фирмы Tosoh Bioscience).

Оставшийся белок клеток-хозяев (НСР) определяли с помощью твердофазного иммуноферментного сэндвич-анализа (ELISA) с использованием поликлональных антител. В целом метод состоял в следующем: титрационные микропланшеты, предварительно сенсибилизированные стрептавидином, сенсибилизировали антителами к НСР клеток яичника китайского хомячка (СНО), меченными биотином, посредством взаимодействия биотин-стрептавидин, и инкубировали с раствором «содержащего антитело продукта». Связанный НСР обнаруживали с помощью антител к НСР СНО, конъюгированных с дигоксигенином, в комбинации с антителами к дигоксигенину, конъюгированными с пероксидазой из хрена. Связанный НСР СНО визуализировали путем добавления субстрата, представляющего собой 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоту) (ABTS). Параллельно для измерений для растворов «содержащего антитело продукта» строили стандартную кривую.

Для количественного определения ДНК СНО применяли анализ на основе q-ПЦР. Образцы (при необходимости разведенные буфером для анализа) лизировали в сильно денатурирующих условиях для того, чтобы гарантировать выделение интактной ДНК. Выделенную ДНК связывали с мембраной на основе силикагеля и отделяли от остального буфера и матрикса образца путем центрифугирования. ДНК элюировали в буфере для элюирования. После тепловой денатурации ДНК прямой и обратный праймеры избирательно связывались с последовательностью-мишенью. Находящийся между двумя праймерами специфический в отношении последовательности зонд для ДНК СНО гибридизовался с ДНК-мишенью.

Зонд метили с помощью флуоресцентного репортерного красителя на 5'-конце и красителя, представляющего собой гаситель флуоресценции, на 3'-конце. До тех пор, пока зонд оставался интактным, флуоресценция гасилась вследствие того, что краситель, представляющий собой гаситель, находился относительно близко к репортерному красителю. При амплификации Taq-полимераза гидролизовала зонд, связанный с последовательностью-мишенью, посредством своей 5'-->3'-экзонуклеазной активности. Репортерный краситель высвобождался, и интенсивность флуоресценции увеличивалась прямо пропорционально количеству ПЦР-продукта. Количество ДНК в образце оценивали с использованием стандартной кривой (внешний стандарт).

Для получения конечного результата измеренную концентрацию ДНК СНО умножали на фактор разведения образца, если оно имело место, и делили на концентрацию белка.

Результаты

В таблице 1 представлены концентрация антитела, относительное содержание мономера антитела и уровни загрязнения для исходного питающего потока, промежуточных потоков продукта и конечного элюата. Выход для стадии представлен в виде процента антитела, сохранившегося после указанной операции с использованием устройства.

Как указано выше, исходный питающий поток представлял собой 945 мл очищенного супернатанта клеточной культуры с концентрацией антитела 2,9 г/л. НСР-нагрузка составляла 245635 нг/мг, HCDNA-нагрузка составляла 6982759 пг/мг.

После одностадийной TFF с границей отсечки 50 кДа и обмена буфера/диафильтрации рассчитанный выход мономерного антитела для стадии составлял примерно 77% (т.е. после операции с использованием устройства было выделено 77% мономерного антитела, содержавшегося в загруженном питающем потоке). По данным ГФ-ЖХВР «мономерный пик» в ретентате составлял 69%. В результате одностадийной TFF НСР-нагрузка потока продукта снизилась на 28%, а HCDNA-нагрузка снизилась на 24%.

После TFF/диафильтрации осуществляли АЕХ в проточном режиме. Загрузка колонки составляла 80 г/л. При загрузке образца в АЕХ-колонку наблюдалось резкое повышение обратного давления в колонке. Однако процесс загрузки не прекращали, но продолжали при пониженном объеме потока. Можно предположить, что повышение противодавления было обусловлено высокой концентрацией HCDNA в питающем потоке продукта (5300722 пг/мг), что приводило к перегрузке мощности АЕХ-колонки. На основе полученных методом ELISA данных об уровне HCDNA было рассчитано, что в колонку поступало 0,42 мкг/мл HCDNA (5300722 пг/мг HCDNA × 80 мг/мл загрузки). Для предупреждения перегрузки, обусловленной аналогичными концентрациями HCDNA, может требоваться применять колонку значительно большего размера.

Рассчитанный выход для стадии АЕХ (мономерное антитело) составлял 90% (т.е. после указанной операции с использованием устройства было выделено 90% мономерного антитела, содержащегося в загруженном питающем растворе (после одностадийной TFF/диафильтрации)). По данным ГФ-ЖХВР обнаруженный «мономерный пик» составлял 73%, т.е. был немного больше, чем для образца питающего потока (69%). Обмен буфера/операция с использованием устройства для АЕХ снижала НСР-нагрузку в потоке продукта на 65%, в то время как HCDNA-нагрузка немного (на 5%) увеличивалась. Данные об уровне HCDNA свидетельствуют о том, что стадия АЕХ не внесла существенного вклада в процесс очистки с точки зрения уровня HCDNA, по меньшей мере в данном эксперименте. Недостаточная очистка от HCDNA, обнаруженная в этом эксперименте, по-видимому, обусловлена перегрузкой колонки, избежать которую потенциально можно путем применения колонки значительно большего размера.

Перед осуществлением стадии СЕХ значение рН потока продукта доводили до 5,0. На этой стадии наблюдалось осаждение в образце. Было высказано предположение о том, что осаждались только загрязнители, поскольку концентрация антитела в потоке продукта не изменялась по отношению к ее величине до регулирования значения рН. Осажденные продукты удаляли фильтрацией. Однако стадия регулирования значения рН/фильтрации ассоциировалась с низким выходом продукта, который составлял лишь 25%. Это было обусловлено потерями объема образца в процессе фильтрации в малом масштабе. Процессы интенсивного осаждения примесей, по всей вероятности, должны приводить к снижению извлечения продукта (как это имело место в рассматриваемом случае), обусловленного объемными потерями на соответствующей стадии осаждения и фильтрации. Однако можно ожидать, что соответствующие объемные потери при крупномасштабном процессе могут быть снижены по сравнению с представленными в настоящем описании данными, полученными для маломасштабного процесса.

После регулирования значения рН и фильтрации «мономерный пик» продукта, выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 73%, т.е. был идентичен пику, обнаруженному в образце питающего потока. Регулирование значения рН/фильтрация снижала НСР-нагрузку потока продукта на 60% и снижала HCDNA-нагрузку на 99,9%.

После этого поток продукта загружали в СЕХ-колонку, работавшую в режиме связывание-элюирование. Рассчитанный выход (мономерное антитело) после стадии составлял 73%. Для продукта «мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 86%, что было значительно выше, чем в образце питающего потока (73%). Осуществление СЕХ снижало НСР- и HCDNA-нагрузку в потоке продукта на 88% и 98% соответственно. Удаление агрегатов и фрагментов антитела, а также резкое уменьшение уровней НСР и HCDNA, свидетельствует о том, что с помощью СЕХ оставшиеся примеси эффективно удаляются при загрузке колонки 40 г/л.

Пример 2:

Обработка белка в растворе с использованием двухстадийной TFF

Настоящий пример относится к выделению и/или очистке антитела из раствора, содержащего антитело, с использованием метода неаффинной очистки, в частности, АЕХ и СЕХ. Исходный раствор представлял собой питающий поток очищенной кондиционированной среды для культивирования клеток. Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что питающий поток был предварительно кондиционирован с помощью двухстадийной фильтрации в тангенциальном потоке. В этом эксперименте первая операции с использованием устройства для TFF двухстадийной TFF была идентична одностадийной TFF из примера 1, т.е. ее проводили с использованием ультрафильтрационной мембраны, имеющей границу отсечки 50 кДа, и затем осуществляли обмен буфера/диафильтрацию. Однако, в отличии от примера 1, в рассматриваемом исследовании продемонстрировано добавление второй операции с использованием устройства для TFF, которую проводили на колонке с границей отсечки 300 кДа, это означает, что осуществляли двухстадийную TFF. С этой схемой можно ознакомиться на фиг. 1 или фиг. 2. Кроме того, в представленном в качестве примера исследовании после осуществления TFF с границей отсечки 300 кДа добавляли третью операцию с использованием устройства для TFF/концентрации, которую проводили с использованием колонки с границей отсечки 50 кДа. Схема двухстадийной TFF, применяемой в данном примере, представлена на фиг. 3. Вторую и третью операции с использованием устройства для TFF (необязательно объединенные с диафильтрацией) можно осуществлять параллельно, как показано на схеме, представленной на фиг. 4. После обработки с помощью двухстадийной TFF (TFF 50 кДа, TFF 300 кДа, TFF 50 кДа), проводили АЕХ и СЕХ таким же образом, как и в примере 1 (за исключением стадии центрифугирования/фильтрации, что будет пояснено ниже). Данное исследование проводили с применением антитела к CSFR1, которое использовали в примере 1.

Методы:

Первая стадия фильтрации в тангенциальном потоке и диафильтрации (продукт в ретентате)

Первую стадию TFF и диафильтрации осуществляли согласно процедуре, описанной для одностадийной TFF, которая представлена в примере 1. На первой стадии 945 мл осветленного супернатанта клеточной культуры, содержащего представляющее интерес антитело в концентрации 2,9 мг/мл, концентрировали до 136 мл.

Затем осуществляли обмен буфера путем диафильтрации в противотоке 10-кратного объема 25 мМ Трис/HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5.

Вторая стадия фильтрации в тангенциальном потоке (продукт в пермеате)

Вторую стадию TFF проводили аналогично первой стадии TFF, но с использованием устройства Sartocon Slice Cassette PESU 300 кДа (площадь фильтрации 200 см², продукт №3081467902E-SG; фирма Satorius Stedim). При осуществлении указанной второй стадии TFF продукт (антитело) проходил через фильтр и находился в пермеате (следовательно, пермеат после указанной второй стадии TFF формировал поток продукта). В процессе указанной второй стадии TFF 108 мл образца, содержащего антитело в концентрации 15,2 мг/мл (т.е. ретентат после первой стадии TFF), подвергали диафильтрации на второй колонке в противотоке 15-кратного объема буфера (25 мМ Трис/HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5).

Концентрирование

Вторая стадия TFF была разработана таким образом, чтобы продукт находился в пермеате, и ее осуществление приводило к значительному увеличению объема образца, содержащего продукт (т.е. к значительному увеличению объема потока продукта). Следовательно, третью TFF с использованием колонки с границей отсечки 50 кДа применяли для того, чтобы концентрировать продукт и уменьшить объем потока продукта. При осуществлении указанной третьей стадии TFF применяли колонку с границей отсечки 50 кДа, идентичную той, которую применяли на первой стадии TFF, которая описана выше и в примере 1. На этой третьей стадии 1627 мл потока продукта с концентрацией 1,1 мг/мл (т.е. пермеат после второй стадии TFF) концентрировали до объема 143 мл.

Анионообменная хроматография

Стадию обработки с помощью АЕХ после двухстадийной TFF проводили как описано в примере 1. Хроматографию осуществляли в следующих условиях:

Обменный материал:	Q-Sepharose FF (фирма GE Healthcare, Фрейбург, Германия)
Колонка:	внутренний диаметр 8 мм, длина 100 мм, объем 5,03 мл
Скорость потока:	150 см/ч (1,25 мл/мин)
Уравновешивающий раствор:	25 Трис/HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5
Загрузка:	86 г белка/1 л хроматографического материала
Промывочный раствор:	25 Трис/HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5
Метод элюции:	изократический.

Порцию продукта загружали в хроматографическую колонку как указано выше. После загрузки колонку промывали промывочным раствором и выделяли антитело методом изократической элюции (проточный режим). Следует отметить, что, в отличие от примера 1, не наблюдалось значительного увеличения противодавления в процессе АЕХ и не возникало необходимости в снижении скорости потока.

Регулирование значения рН до 5,0

Как и в примере 1, перед осуществлением СЕХ регулировали значение рН в образце, элюированном из АЕХ-колонки, путем добавления 1М лимонной кислоты до достижения рН 5,0. Однако, в отличие от примера 1, на этой стадии не происходило осаждение и, таким образом, не возникало необходимости в осуществлении центрифугирования/фильтрации потока продукта. Вместо этого поток продукта загружали непосредственно в СЕХ-колонку.

Катионообменная хроматография: режим связывания-элюирования

После регулирования значения рН антитело выделяли из потока продукта с помощью СЕХ согласно процедуре, описанной в примере 1. Хроматографию осуществляли в следующих условиях:

Обменный материал:	Poros 50HS (фирма Life Technologies Co., Карлсбад, шт. Калифорния, США)
Колонка:	внутренний диаметр 8 мм, длина 100 мм, объем 5,03 мл
Скорость потока:	150 см/ч (=1,25 мл/мин)
Уравновешивающий раствор:	10 мМ цитрат натрия, рН 5,0
Загрузка:	20 г белка/1 л хроматографического материала
Промывочный раствор:	10 мМ цитрат натрия, рН 5,0
Раствор для элюирования:	10 мМ цитрат натрия, 750 мМ NaCl, рН 5,0
Метод элюции:	линейный градиент от 0% (об. %) до 100% (об. %) раствора для элюирования в 22,5 объемах колонки.

После загрузки колонки для СЕХ, как указано выше, колонку промывали промывочным раствором. Антитело в мономерной форме выделяли методом элюции с использованием линейного градиента, при этом значение рН поддерживали на постоянном уровне и изменяли (повышали) проводимость путем добавления хлорида натрия.

Определение антитела и загрязнителей

Концентрацию антитела и концентрацию загрязнителей, т.е. белков клеток-хозяев («НСР») и ДНК клеток-хозяев («HCDNA»), определяли на различных стадиях эксперимента согласно методам, описанным в примере 1.

Результаты

В таблице 2 представлены концентрация антитела, относительное содержание мономера антитела и уровни загрязнения для исходного питающего потока, промежуточных потоков продукта и конечного элюата. Выход для стадии представлен в виде процента антитела, сохранившегося после указанной операции с использованием устройства.

Как указано выше, исходный питающий поток представлял собой 945 мл осветленного супернатанта клеточной культуры с концентрацией антитела 2,9 г/л. НСР-нагрузка составляла 245635 нг/мг, HCDNA-нагрузка составляла 6982759 пг/мг.

После осуществления первой стадии TFF с границей отсечки 50 кДа и обмена буфера/диафильтрации рассчитанный выход мономерного антитела для стадии составлял примерно 77%. «Мономерный пик» потока продукта (ретентат), выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 69%. Осуществление одностадийной TFF снижало НСР-нагрузку потока продукта на 28% и HCDNA-нагрузку на 24%. Эта операция с использованием устройства была идентичной одностадийной TFF, описанной в примере 1.

После второй стадии TFF с границей отсечки 300 кДа рассчитанный выход мономерного антитела для стадии составлял 112%. «Мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 72%, т.е. был немного выше, чем для внесенного образца (69%). Вторая стадия TFF снижала НСР-нагрузку и HCDNA-нагрузку потока продукта на 22% и 94% соответственно.

Для последующей стадии TFF/концентрации с использованием колонки с границей отсечки 50 кДа рассчитанный выход для стадии (мономерное антитело) составлял 93%. Для образца элюированного потока «мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 72%, т.е. был идентичен пику для внесенного образца питающего потока. Стадия TFF/концентрации снижала НСР-нагрузку в потоке продукта на 5%, в то время как HCDNA-нагрузка повышалась на 78% (что обусловлено вариацией анализа).

После предварительного кондиционирования с помощью двухстадийной TFF осуществляли АЕХ в проточном режиме. Загрузка колонки составляла 86 г/л. Рассчитанный выход после стадии АЕХ (мономерное антитело) составлял 92%. «Мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 75%, т.е. был немного выше, чем для внесенного образца (72%). Операция с использованием устройства для АЕХ снижала НСР-нагрузку потока продукта на 85%, а то время как HCDNA-нагрузка снижалась на 89%. В отличие от АЕХ, которую проводили с осуществлением предварительного кондиционирования с помощью одностадийной TFF, как описано в примере 1, результаты оценки НСР и HCDNA свидетельствуют о том, что АЕХ после предварительного кондиционирования с помощью двухстадийной TFF вносила существенный вклад в процесс очистки даже несмотря на то, что ее проводили в проточном режиме при сравнительно высокой загрузке колонки.

Перед стадией СЕХ значение рН потока продукта регулировали до достижения рН 5,0. В отличие от одностадийной TFF, описанной в примере 1, на этой стадии не наблюдалось осаждения в образце и образец/поток продукта загружали непосредственно в СЕХ-колонку.

Работу СЕХ-колонки осуществляли в режиме связывание-элюирование. Рассчитанный выход для стадии (мономерное антитело) составлял 90%. Для продукта «мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 96%, т.е. он намного превышал пик, выявленный во внесенном образце (72%). СЕХ снижала НСР- и HCDNA-нагрузку потока продукта на 73% и 99% соответственно. Удаление агрегатов и фрагментов антитела, а также значительное снижение уровней НСР и HCDNA, свидетельствует о том, что СЕХ эффективно удаляла оставшиеся примеси при загрузке колонки 20 г/л.

Пример 3:

Обработка белка в растворе с использованием одностадийной TFF

Процедуру, описанную в примере 1, повторяли с использованием питающего потока, содержащего другой представляющий интерес белок, в частности, антитела к ангиопоэтину 2 (Ang2)/VEGF (см., например, публикацию заявки на патент США 2010/0111967). Ниже описаны только отклонения от методов, которые применяли в примере 1.

Методы:

Одностадийная фильтрация в тангенциальном потоке и диафильтрация (продукт в ретентате)

При осуществлении одностадийной TFF 950 мл осветленного супернатанта клеточной культуры, содержащего антитело к Ang2/VEGF в концентрации 2,7 мг/мл, концентрировали до 134 мл. После этого осуществляли также замену буфера таким же образом, как и в примере 1.

Анионообменная хроматография

АЕХ осуществляли согласно процедуре, описанной в примере 1, за исключением того, что загрузка колонки составляла 19 г белка/1 л материала для колонки. В отличие от процесса АЕХ, описанного в примере 1, на этой стадии обработки антитела к Ang2/VEGF не наблюдалось повышения противодавления; на протяжении всей операции с использованием устройства скорость потока поддерживали на уровне 150 см/ч. Это было обусловлено, по-видимому, значительно более низкой концентрацией HCDNA в содержащем антитело к Ang2/VEGF питающем потоке по сравнению с исходным содержащим антитело к CSFR1 питающим потоком, который применяли в примере 1 (примерно на 80% меньшая концентрация; ср. таблицы 1 и 3). Это приводило к более низкой концентрации HCDNA при всех операциях с использованием устройства до осаждения и фильтрации.

Регулирование значения рН до 5,0

Несмотря на более низкую концентрацию HCDNA в течение рассматриваемого процесса по сравнению с концентрацией, имевшей место в примере 1, при регулировании значения рН до достижения рН 5,0 и в этом случае также происходило осаждение в содержащем антитело к Ang2/VEGF потоке продукта. И в этом случае также, по-видимому, происходило осаждение только загрязнителей, поскольку концентрация антитела в потоке продукта не изменялась. Как и в примере 1, образец осветляли путем центрифугирования и фильтрации перед осуществлением СЕХ.

Катионообменная хроматография: режим связывания-элюирования

СЕХ содержащего антитело к Ang2/VEGF образца осуществляли согласно процедуре, описанной в примере 1, за исключением того, что загрузку колонки снижали до 13 г белка/1 л хроматографического материала.

Определение концентраций антитела и загрязнителей

Концентрацию антитела и концентрацию загрязнителей, т.е. НСР и HCDNA, определяли в процессе эксперимента как описано в примере 1.

Результаты

В таблице 3 представлены концентрация антитела, относительное содержание мономера антитела и уровни загрязнителей в питающем потоке, промежуточных потоках продукта и конечном элюате.

Как указано выше, исходный питающий поток представлял собой 950 мл осветленного супернатанта клеточной культуры с концентрацией антитела 2,7 г/л. НСР-нагрузка составляла 420531 нг/мг, HCDNA-нагрузка составляла 1443609 пг/мг.

После одностадийной TFF с границей отсечки 50 кДа и обмена буфера/диафильтрации рассчитанный выход мономерного антитела для рассматриваемой стадии составлял примерно 86%. «Мономерный пик», выявленный в ретентате, по данным ГФ-ЖХВР составлял 65%. Одностадийная TFF увеличивала НСР-нагрузку потока продукта примерно на 6% и уменьшала HCDNA-нагрузку примерно на 17%.

После TFF/диафильтрации осуществляли АЕХ в проточном режиме. Загрузка колонки составляла 79 г/л. Рассчитанный выход для АЕХ (мономерное антитело) составлял 79%. «Мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 78%, т.е. был немного выше пика в образце питающего потока (65%). После обмена буфера/операции с использованием устройства для АЕХ НСР-нагрузка потока продукта снижалась на 62%, в то время как HCDNA-нагрузка немного возрастала (увеличение на 3%). Хотя в данном случае было достигнуто удаление некоторого количества НСР, полученные данные подтверждают результаты, представленные в примере 1, а именно, что осуществление стадии АЕХ после обработки с помощью одностадийной TFF не вносит существенного вклада в процесс очистки антитела. И в этом случае, как и в примере 1, по-видимому, обработка с помощью АЕХ не вносит существенный вклад в снижение концентрации HCDNA вследствие перегрузки колонки. Однако перегрузку можно предотвращать путем применения значительно более крупной и более дорогой колонки.

Перед осуществлением стадии СЕХ значение рН образца доводили до 5,0. И в этом случае также в рассматриваемом потоке продукта имело место осаждение, несмотря на то, что концентрации НСР и HCDNA в образце были значительно более низкими, чем в соответствующем образце из примера 1. И в этом случае также, по-видимому, осаждались только примеси, поскольку концентрация антитела в образце не изменялась по сравнению с ее величиной до регулирования значения рН. Осадки удаляли путем фильтрации. После регулирования значения рН/осаждения/фильтрации образца не проводили ни анализ мономера антитела, ни анализ загрязнителей.

После этого образец загружали в СЕХ-колонку, работавшую в режиме связывания-элюирования. Рассчитанный выход (мономерное антитело) для стадии составлял 99%. Для продукта «мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 94%. Поскольку промежуточный поток продукта не анализировали для определения концентрации загрязнителей как описано выше, то оценить вклад стадии СЕХ в снижение уровня загрязнителей не представлялось возможным. Однако было установлено, что конечная НСР-нагрузка составляла 16308 нг/мг, а конечная HCDNA-нагрузка составляла 65 пг/мл.

Пример 4:

Обработка белка в растворе с использованием двухстадийной TFF

Настоящий пример является повторением примера 2 с использованием питающего потока, представленного в примере 3, т.е. потока, содержащего антитело к Ang2/VEGF. В рассматриваемом случае не приведено повторно подробное изложение методов, применявшихся в примере 2, а дано описание только отклонений от указанных методов.

Методы:

Первая стадия фильтрации в тангенциальном потоке и диафильтрации (продукт в ретентате)

На первой стадии TFF 950 мл осветленного супернатанта клеточной культуры, содержащего представляющее интерес антитело в концентрации 2,7 мг/мл, концентрировали до 134 мл. Обмен буфера осуществляли согласно процедуре, описанной в примере 2.

Вторая стадия фильтрации в тангенциальном потоке (продукт в пермеате)

На второй стадии TFF 98 мл образца потока продукта, содержащего антитело в концентрации 11,9 мг/мл (т.е. ретентат после первой стадии TFF), подвергали диафильтрации в противотоке 18-кратного объема буфера.

Концентрирование

На третьей стадии TFF/концентрирования 1524 мл потока продукта, содержащего антитело в концентрации 1,0 мг/мл, концентрировали до объема 157 мл.

Анионообменная хроматография

АЕХ осуществляли согласно методам, описанным в примере 2, за исключением того, что загрузка составляла 80 г белка/1 л хроматографического материала.

Регулирование значения рН до 5,0

Регулировку значения рН осуществляли согласно процедуре, подробно описанной в примере 2.

Катионообменная хроматография: режим связывания-элюирования

СЕХ осуществляли согласно процедуре, подробно описанной в примере 2..

Определение концентраций антитела и загрязнителей

Концентрацию антитела и концентрацию загрязнителей, т.е. белков клеток-хозяев («НСР») и ДНК клеток-хозяев («HCDNA»), определяли в процессе эксперимента согласно методам, описанным в примере 1.

Результаты

В таблице 4 представлены концентрация антитела, относительное содержание мономера антитела и уровни загрязнителей в исходном питающем потоке, промежуточных потоках продукта и конечном элюате.

Как указано выше, исходный питающий поток представлял собой 950 мл осветленного супернатанта клеточной культуры с концентрацией антитела 2,7 г/л. НСР-нагрузка составляла 420531 нг/мг, HCDNA-нагрузка составляла 1443609 пг/мг.

После первой стадии TFF с границей отсечки 50 к Да и замены буфера/диафильтрации рассчитанный выход мономерного антитела для стадии составлял 86%. «Мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР в ретентате, составлял 65%. Одностадийная TFF немного (на 6%) увеличивала НСР-нагрузку потока продукта и уменьшала HCDNA-нагрузку на 17%. Эта операция с использованием устройства была идентичной одностадийной TFF, описанной в примере 3.

После второй стадии TFF с границей отсечки 300 кДа рассчитанный выход мономерного антитела для стадии составлял 100%. «Мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 75%, т.е. был значительно выше, чем в подводимом питающем потоке (65%). Вторая стадия TFF уменьшала НСР-нагрузку и HCDNA-нагрузку потока продукта на 29% и 86% соответственно.

Для последующей стадии TFF/концентрации с использованием колонки с границей отсечки 50 кДа рассчитанный выход (мономерное антитело) для стадии составлял 100%. Для элюированного образца «мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 76%, т.е. был немного выше, чем в образце подводимого питающего потока. Стадия TFF/концентрации приводила к увеличению НСР-нагрузки в потоке продукта на 10%, в то время как HCDNA-нагрузка уменьшалась на 3%.

АЕХ после предварительного кондиционирования с помощью двухстадийной TFF осуществляли в проточном режиме. Рассчитанный выход (мономерное антитело) для стадии АЕХ составлял 90%. «Мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 80%, т.е. был немного выше, чем в образце питающего потока (76%). Операция с использованием устройства для АЕХ снижала НСР-нагрузку потока продукта на 64%, в то время как HCDNA-нагрузка снижалась на 87%. В отличие от АЕХ, применявшейся в сочетании с обработкой с помощью одностадийной TFF, как описано в примере 3 (и примере 1), оценка НСР и HCDNA подтвердила результаты, полученные в примере 2, а именно, что осуществление АЕХ после обработки с помощью двухстадийной TFF вносит значительный вклад в процесс очистки, даже в том случае, когда ее осуществляют в проточном режиме при сравнительно высокой загрузке колонки.

Перед осуществлением стадии СЕХ значение рН потока продукта доводили до 5,0. И в этом случае также, в отличие от обработки с помощью одностадийной TFF, описанной в примерах 1 и 3, и в соответствии с результатами, полученными при обработке с помощью двухстадийной TFF, описанными в примере 2, на рассматриваемой стадии не было выявлено осаждения в потоке продукта, и образец загружали непосредственно в СЕХ-колонку.

Обработку с помощью СЕХ-колонки осуществляли в режиме связывание-элюирование. Рассчитанный выход (мономерное антитело) для стадии составлял 100%. Для продукта «мономерный пик», выявленный с помощью ГФ-ЖХВР, составлял 95%, т.е. был намного выше, чем для образца питающего потока (80%). СЕХ снижала НСР- и HCDNA-нагрузку образца питающего потока на 93% и 99,8% соответственно. Удаление агрегатов и фрагментов антитела, а также значительное уменьшение содержания НСР и HCDNA, свидетельствует о том, что СЕХ эффективно удаляла оставшиеся примеси при загрузке колонки, составляющей 20 г/л (что согласовалось с результатами, полученными в примере 2).

Общие выводы на основе результатов, полученных в примерах 1-4

Применение метода одностадийной TFF согласно подходам, известным в данной области, не позволяет добиться удовлетворительного снижения уровней загрязнителей (например, НСР и HCDNA), что приводит к перегрузке при осуществлении последующих хроматографических процессов, например, АЕХ. Однако, применение способа двухстадийной TFF, предлагаемого в настоящем изобретении, позволяет предотвращать перегрузку АЕХ-колонки для рассматриваемого размера колонки. Это свидетельствует о том, что способы двухстадийной TFF позволяют эффективно снижать уровни загрязнителей, например, удалять HCDNA и/или НСР для того же самого исходного питающего потока с использованием хроматографических колонок значительно меньшего размера по сравнению с применяемыми в настоящее время. Это является важным экономическим преимуществом, ассоциированным со способом двухстадийной TFF, представленным в настоящем описании.

Из существующего уровня техники известно, что имеется интерес к применению не основанных на аффинности методов очистки, например, АЕХ и СЕХ. Однако, указанные методы оказались неудовлетворительными и в настоящее время их не рассматривают в качестве имеющих значение средств замещения систем на основе аффинности. В частности, применение не основанных на аффинности хроматографических процессов часто ассоциировано с нежелательными воздействиями, такими как образование осадка в потоке продукта. Например, обработка потока продукта после осуществления одностадийной TFF с целью снижения значения рН от 7,5 до 5,0 перед осуществлением СЕХ приводит к осаждению примесей. Обработка потока продукта для удаления осадка занимает много времени и ассоциирована с другими значительными затратами, как подробно представлено в настоящем описании. Однако, применение способов двухстадийной TFF, предлагаемых в изобретении, устраняет образование осадка при осуществлении указанной стадии обработки и дает экономию затрат, ассоциированных с обработкой осадка.

Прямое сравнение одностадийной TFF и двухстадийной TFF, предлагаемой в изобретении, позволило установить, что последняя превосходит первую с точки зрения качества продукта, а именно, с точки зрения уровня мономерного продукта, уровня НСР и уровня HCDNA.

1. Способ отделения представляющего интерес белка от раствора клеточной культуры, содержащего указанный белок, с помощью двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке (TFF), в котором указанная двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF, в котором

при осуществлении указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащего указанный белок, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны с такой границей отсечки, чтобы указанный белок собирался в ретентате, полученном в результате первой операции с использованием устройства для TFF; и

при осуществлении указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащего указанный белок, с использованием второй ультрафильтрационной мембраны с такой границей отсечки, чтобы указанный белок собирался в пермеате, полученном в результате второй операции с использованием устройства для TFF;

и в котором указанный первый или указанный второй поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры.

2. Способ по п. 1, в котором указанный первый поток продукта представляет собой супернатант клеточной культуры, и указанную первую операцию с использованием устройства для TFF осуществляют перед указанной второй операцией с использованием устройства для TFF.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором указанная двухстадийная TFF дополнительно включает третью операцию с использованием устройства для TFF, при осуществлении которой фильтруют третий поток продукта, содержащий указанный белок, с использованием третьей ультрафильтрационной мембраны, имеющей такую границу отсечки, чтобы указанный белок собирался в ретентате, полученном в результате третьей операции с использованием устройства для TFF, и в котором указанную третью операцию с использованием устройства для TFF осуществляют после указанных первой и второй операций с использованием устройства для TFF.

4. Способ по п. 3, в котором граница отсечки третьей ультрафильтрационной мембраны является такой же, что и граница отсечки первой ультрафильтрационной мембраны.

5. Способ по п. 1 или 2, в котором указанный белок имеет молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа, но не более чем 500 кДа.

6. Способ по п. 3, в котором указанный белок имеет молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа, но не более чем 500 кДа.

7. Способ по п. 4, в котором указанный белок имеет молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа, но не более чем 500 кДа.

8. Способ по п. 5,

в котором указанная первая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки, равную одной второй от молекулярной массы, т.е. 0,5 от молекулярной массы, указанного белка или менее; и

в котором указанная вторая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки, по меньшей мере вдвое, т.е. в 2 раза, превышающую молекулярную массу указанного белка, но составляет не более чем 1000 кДа.

9. Способ по п. 6,

в котором указанная первая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки, равную одной второй от молекулярной массы, т.е. 0,5 от молекулярной массы, указанного белка или менее; и

в котором указанная вторая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки, по меньшей мере вдвое, т.е. в 2 раза, превышающую молекулярную массу указанного белка, но составляет не более чем 1000 кДа.

10. Способ по п. 7,

в котором указанная первая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки, равную одной второй от молекулярной массы, т.е. 0,5 от молекулярной массы, указанного белка или менее; и

в котором указанная вторая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки, по меньшей мере вдвое, т.е. в 2 раза, превышающую молекулярную массу указанного белка, но составляет не более чем 1000 кДа.

11. Способ по п. 5, в котором указанный белок имеет молекулярную массу 150±75 кДа.

12. Способ по п. 6, в котором указанный белок имеет молекулярную массу 150±75 кДа.

13. Способ по п. 8, в котором указанный белок имеет молекулярную массу 150±75 кДа.

14. Способ по п. 9, в котором указанный белок имеет молекулярную массу 150±75 кДа.

15. Способ по п. 1 или 2, в котором указанный белок представляет собой антитело.

16. Способ по п. 3, в котором указанный белок представляет собой антитело.

17. Способ по п. 5, в котором указанный белок представляет собой антитело.

18. Способ по п. 1 или 2, в котором указанная первая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки 50 кДа или менее и в котором указанная вторая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки от 300 до 1000 кДа.

19. Способ по п. 3, в котором указанная первая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки 50 кДа или менее и в котором указанная вторая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки от 300 до 1000 кДа.

20. Способ по п. 18, в котором указанная первая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки 50 кДа и в котором указанная вторая ультрафильтрационная мембрана имеет границу отсечки 300 кДа.

21. Способ по п. 1 или 2, в котором указанная двухстадийная TFF снижает концентрацию белка клеток-хозяев (НСР) в растворе, содержащем представляющий интерес белок, по меньшей мере на 10% относительно концентрации в указанном супернатанте клеточной культуры и/или снижает концентрацию ДНК клеток-хозяев (HCDNA) в растворе, содержащем представляющий интерес белок, по меньшей мере на 30% относительно концентрации в указанном супернатанте клеточной культуры.

22. Способ по п. 1 или 2, в котором указанная двухстадийная TFF снижает концентрацию НСР в растворе, содержащем представляющий интерес белок, до 400000 нг/мг указанного белка или менее и/или снижает концентрацию HCDNA в растворе, содержащем представляющий интерес белок, до 1500000 пг/мг указанного белка или менее.

23. Способ по п. 1 или 2, дополнительно заключающийся в том, что осуществляют процесс хроматографии на колонке после осуществления указанной двухстадийной TFF.

24. Способ по п. 23, в котором указанный процесс хроматографии на колонке представляет собой не основанный на аффинности процесс хроматографии на колонке.

25. Способ по п. 24, в котором указанный процесс хроматографии на колонке представляет собой операцию с использованием устройства для анионообменной хроматографии (АЕХ) или операцию с использованием устройства для катионообменной хроматографии (СЕХ).