Модифицированный биотин-связывающий белок, слитые белки на его основе и их применение

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению модифицированных биотин-связывающих белков, и может быть использовано в медицине для индуцирования иммунного ответа против антигенного белка или пептида. Получают слитый биотин-связывающий белок, который включает растворимый биотин-связывающий белок и антигенный белок или пептид, причем слитый белок не включает аминокислоты 1-44 белка Ризавидина дикого типа. Изобретение позволяет экспрессировать слитые биотин-связывающие белки в E. coli в растворимой форме и с высоким выходом, а также повысить эффективность образования комплексов биотин-связывающих белков и белковых антигенов. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 14 ил., 5 табл., 7 пр.

 

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной патентной заявке США 61/484934, поданной 11 мая 2011; 61/608168, поданной 8 марта 2012; и 61/609,974, поданной 13 марта 2012 в соответствии с §119(е) раздела 35 кодекса США, содержание каждой из которых приведено здесь во всей полноте для ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к биотин-связывающим белкам и слитым белкам/композициям, включающим данные биотин-связывающие белки. Также здесь описаны способы экспрессирования биотин-связывающих белков и/или слитых белков на их основе с высоким выходом и растворимых в бактериях.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Биотин-связывающий белок и его производные могут широко использоваться в различных областях. Тем не менее, продуцирование или очистка рекомбинантных биотин-связывающих белков может быть очень сложной. При экспрессии в Е. coli наибольшая часть биотин-связывающих белков скапливается в тельцах включений, при этом требуется денатурирование, рефолдинг и утомительный даунстрим-процессинг при получении активных белков. Экспрессия в Е. coli является предпочтительной в связи с низкой стоимостью производства и потенциальной возможностью дальнейшей обработки; таким образом, биотин-связывающие белки, которые могут быть эффективно продуцированы в Е. coli, являются очень востребованными. Также экспрессия в Е. coli предоставляет возможность создавать рекомбинантные слитые белки, содержащие биотин-связывающий белок для различных вариантов применения. Соответственно, в данной области существует потребность в биотин-связывающих белках и слитых белках, содержащих биотин-связывающие белки, которые могут быть экспрессированы в Е. coli в растворимой форме и с высокими уровнями выхода.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одной задачей настоящего изобретения является создание рекомбинантного биотин-связывающего белка, который может быть экспрессирован в Е. coli в растворимой форме с высокими уровнями выхода. Соответственно, настоящее изобретение относится к биотин-связывающим белкам и содержащим их композициям. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный биотин-связывающий белок включает сигнальную последовательность Е. coli в N-конце аминокислотной последовательности, включающей аминокислоты 45-179 (FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLT GRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD, SEQ ID NO:1) Ризавидина дикого типа (rhavi). В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность Е. coli представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID No:2). Эта сигнальная последовательность может быть слита с последовательностью, включающей аминокислоты 45-179 rhavi дикого типа, с помощью гибкого пептидного линкера.

Здесь также предусмотрен способ экспрессирования биотин-связывающего белка в растворимой форме в Е. coli с высоким выходом. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает экспрессию биотин-связывающего белка в Е. coli, при этом нативная сигнальная последовательность биотин-связывающего белка заменена на сигнальную последовательность Е. coli. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID No:2).

В другом аспекте изобретение относится к биотин-связывающему слитому белку, включающему биотин-связывающий домен и белок или пептид.

В другом аспекте здесь предусмотрен липидированный биотин-связывающий белок. В соответствии с использованным здесь значением термин "липидированный биотин-связывающий белок" означает биотин-связывающий белок, который ковалентно связан с липидом. Липидированные биотин-связывающие белки представляют собой лиганды или агонисты Toll-подобного рецептора 2. Соответственно здесь также предусмотрены способы индуцирования иммунного ответа у субъекта. Способ включает введение субъекту композиции, включающей липидированный биотин-связывающий белок.

Здесь также предусмотрен способ экспрессирования липидированного биотин-связывающего белка в Е. coli. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает экспрессию липидированного биотин-связывающего белка в Е. coli, при этом нативная сигнальная последовательность биотин-связывающего белка заменена на сигнальную последовательность Е. coli, содержащую мотив липидизации. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность представляет собой MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID No:3).

В другом аспекте здесь предусмотрено негемолитическое производное альфа-гемолизина (Hla) Staphylococcal aureus. Описанное здесь производное Hla может быть в форме слитого белка, при этом данный слитый белок включает домен производного Hla и биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах данного аспекта биотин-связывающий домен представляет собой описанный здесь биотин-связывающий белок. Подобно липидированным биотин-связывающим белкам, варианты Hla или их слитые белки с описанными здесь биотин-связывающими белками также представляют собой лиганды или агонисты Toll-подобных рецепторов или других рецепторов опознавания паттерна (PRR). Соответственно, здесь также предусмотрены способы индуцирования иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения данный способ включает введение субъекту композиции, включающей негемолитические Hla варианты или их слитые белки с описанным здесь биотин-связывающим белком.

В другом аспекте здесь предусмотрена иммуногенная или вакцинная композиция, включающая биотин-связывающий белок, липидированный биотин-связывающий белок, биотин-связывающий слитый белок, включающий биотин-связывающий домен и антигенный белок или пептид. В некоторых вариантах данного аспекта антигенный белок представляет собой негемолитическое производное описанного здесь Н1а.

Здесь также предусмотрен способ вакцинирования субъекта, например млекопитающего, например человека, иммуногенными композициями согласно тому, как описано здесь, при этом данный способ включает введение композиции описанной здесь вакцины субъекту.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой схему модифицированного биотин-связывающего белка в соответствии с описанным здесь вариантом осуществления изобретения.

Фиг.2 представляет собой SDS-PAGE описанного здесь очищенного рекомбинантного биотин-связывающего белка.

Фиг.3 представляет собой схему слитого белка, включающего биотин-связывающий белок и антиген X.

Фиг.4 является примерный SDS-PAGE очищенных Ризавидин-слитых белков.

Фиг.5 представляет собой схему липидированного биотин-связывающего белка в соответствии с описанным здесь вариантом осуществления изобретения.

Фиг.6 представляет собой SDS-PAGE описанного здесь липидированного биотин-связывающего белка.

Фиг.7 представляет собой гистограмму зависящей от дозировки TLR2 активности липидированного биотин-связывающего белка.

Фиг.8 представляет собой схему рекомбинантного альфа-гемолизина (Hia) S. aureus дикого типа или мутанта и его описанные здесь слитые белки Ризавидина. В негемолитическом Hla были осуществлены точечные мутации следующим образом: (i) остаток 205 W на A; (ii) остаток 213 W на А; или (iii) остатки 209-211 DRD на ААА.

Фиг.9 представляет собой SDS-PAGE очищенного Hla дикого типа или его негемолитических вариантов.

Фиг.10 представляет собой SDS-PAGE очищенных биотин-связывающих слитых белков Hla дикого типа или его негемолитических вариантов.

Фиг.11 представляет собой линейный график гемолитической активности Hla дикого типа или его негемолитических вариантов.

Фиг.12 представляет собой линейный график гемолитической активности Hla дикого типа, негемолитических вариантов Hla и биотин-связывающих белков Hla дикого типа и их негемолитических вариантов.

Фиг.13 представляет собой гистограмму, показывающую что стимулирование макрофагов биотин-связывающим слитым белком (rhavi-Hla209) индуцирует множественный воспалительный цитокинез.

Фиг.14 представляет собой гистограмму, показывающую что комплекс системы множественной презентации антигена (MAPS), содержащий липидированный Ризавидин или rhavi-Hla209, индуцирует более сильные ответы Т-клеток на антигены.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Должно являться понятным, что данное изобретение не ограничено конкретной описанной здесь композицией, методологией, протоколами, реагентами и так далее, и что они могут быть различными. Используемая здесь терминология предназначена исключительно для цели описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения охватываемой настоящим изобретением области, определенной исключительно пунктами формулы изобретения.

Без связи с какой-либо теорией, считается, что низкий уровень экспрессии биотин-связывающего белка в уровне техники может быть связан с плохим фолдингом, вызываемым дисульфидными связями в каждом мономере биотин связывающего белка, которая не образуется или образуется на крайне малых уровнях в цитоплазме Е. coli. Изобретатели обнаружили, что правильный фолдинг может быть достигнут путем транспортирования в периплазматическое пространство Е. coli. Таким образом, степень правильного фолдинга рекомбинантных биотин-связывающих белков может быть увеличена путем замены полной нативной сигнальной последовательности биотин-связывающего белка на сигнальную последовательность секреции Е. coli. Без связи с какой-либо теорией, считается, что это способствует транслокации рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток Е. coli. Транслокация рекомбинантного белка в периплазматическое пространство Е. coli может затем обеспечить функционально важную дисульфидную связь в биотин-связывающем белке (например, в Ризавидине) и белок может правильно фолдироваться в растворимой форме и с высокими уровнями выхода.

В одном аспекте здесь предусмотрен биотин-связывающий белок, который может быть экспрессирован в растворимой форме и с высоким выходом в Е. coli. В соответствии с использованным здесь значением "биотин-связывающий белок" означает белок, который нековалентно связывается с биотином или его аналогом или производным. Высокие уровни выхода означают, что данный белок может быть экспрессирован в растворимой форме в Е. coli в количестве около 10 мг/л, 11 мг/л, 12 мг/л, 13 мг/л, 14 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, 25 мг/л, 30 мг/л, 35 мг/л, 30 мг/л, 35 мг/л, 40 мг/л, 45 мг/л, 50 мг/л или более.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок может представлять собой рекомбинантный белок. Кодирующая последовательность для биотин-связывающего белка может быть оптимизирована с помощью кодонов экспрессии Е. coli чтобы избежать какого-либо затруднения при экспрессии в Е. coli, связанного с редкими кодонами, присутствующими в исходном гене.

В целом, биотин-связывающий белок включает биотин-связывающий домен. В соответствии с использованным здесь значением, "биотин-связывающий домен" означает последовательность полипептида, которая связывается с биотином. Хотя весь биотин-связывающий белок может быть использован в качестве биотин-связывающего домена, может быть использована и только биотин-связывающая часть данного белка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий домен получен из Ризавидина.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий домен состоит или по существу состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 45-179 Ризавидина дикого типа. Аминокислотная последовательность Ризавидина дикого типа представляет собой: MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALAFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:4).

Другими словами, биотин-связывающий домен не включает (то есть в нем отсутствуют) аминокислоты 1-44 (MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALA, SEQ ID NO:5) Ризавидина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий домен включает аминокислотную последовательность FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:1).

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий домен включает аминокислотную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и, более предпочтительно, по меньшей мере, на 99,3% относительно SEQ ID NO:1.

В то время как Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405) описывают удаление только первых 24 остатков полноразмерного Ризавидина, изобретатели обнаружили, что первые 44 остатков полноразмерного Ризавидина не являются необходимыми для базовой структуры и функционирования Ризавидина. Также, неожиданно было обнаружено, что аминокислоты 25-44 (MIRTNAVAALVFAVATSALA, SEQ ID NO:6) полноразмерного Ризавидина снижают растворимость и секрецию экспрессируемого в Е. coli Ризавидина, поскольку замена первых 44 остатков в полноразмерном Ризавидине на сигнальный пептид Е. coli вело к увеличению растворимости и секреции описанных здесь биотиновых белков в Е. coli.

В описанном здесь биотин-связывающем белке биотин-связывающий домен может быть удлинен на N- или С-конце одной или несколькими аминокислотами с условием, что N-конец биотин-связывающего домена не включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности 1-44 Ризавидина дикого типа. Изобретатели обнаружили, что усечение первых 44 аминокислот на N-конце Ризавидина дикого типа может серьезно увеличить экспрессию биотин-связывающего белка в растворимой форме в Е. coli. Таким образом, описанный здесь биотин-связывающий белок может включать последовательность X¹-X²-X³, где X² представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотам 45-179 Ризавидина дикого типа, а X¹ и X³ или независимо отсутствуют или независимо представляют собой пептид от 1 до коло 100 аминокислот с условием, что N-конец X¹ не включает аминокислотную последовательность, соответствующую N-концу аминокислот 1-44 Ризавидина дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающие белки могут включать сигнальный пептид, конъюгированный с N-концом биотин-связывающего белка, то есть X¹ может включать сигнальный пептид. Данный сигнальный пептид также называют лидерным пептидом на N-конце, который может или не может быть отщеплен после транслокации через мембрану. Секреторные/сигнальные пептиды описаны более подробно ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO:2), MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA (SEQ ID NO:7), MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID NO:3) или их производное или функциональную часть.

Сигнальный пептид может быть связан с N-концом биотин-связывающего домена либо напрямую (например, связью) или не напрямую (например, линкером). В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальный пептид может быть связан с N-концом биотин-связывающего домена пептидным линкером. Последовательность пептидного линкера может иметь любую длину. Например, последовательность пептидного линкера может быть длиной в одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер имеет длину четыре аминокислоты.

Последовательность пептидного линкера может включать любую аминокислотную последовательность. Например, пептидный линкер может включать аминокислотную последовательность, которая может быть расщеплена сигнальной пептидазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер включает аминокислотную последовательность AQDP (SEQ ID NO:8) или VSDP (SEQ ID NO:9). Биотин-связывающий домен в биотин-связывающем белке может быть конъюгирован на своем С-конце с пептидом из 1-100 аминокислот. Данные пептиды на С-конце могут применяться в качестве меток очистки, линкеров других доменов и им подобных.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок включает на своем N- или С-конце одну или несколько (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более) меток очистки. Примеры меток очистки включают (без ограничения) гистидиновую метку, с-ту метку. Halo метку. Flag метку и им подобные. В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок включает на его С-конце гистидиновую метку, например (His)₆ (SEQ ID NO.10).

Метка очистки может быть конъюгирована с биотин-связывающим белком пептидным линкером для увеличения вероятности того, что метка будет находиться снаружи. Длина линкера может составлять, по меньшей мере, одну (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать) аминокислот. Линкерный пептид может включать любую аминокислотную последовательность без ограничений. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкерный пептид включает аминокислотную последовательность VDKLAAALE (SEQ ID NO:11) или GGGGSSSVDKLAAALE (SEQ ID NO:12).

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок включает на своем С-конце аминокислотную последовательность VDKLAAALEHHHHH (SEQ ID NO:13) или GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:14).

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок включает аминокислотную последовательность: MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:15).

По сравнению с известными биотин-связывающими белками, которые образуют тетрамеры, описанный здесь биотин-связывающий белок образует димер. Без связи с какой-либо теорией, считается, что образование димера может дополнительно улучшать экспрессию описанного здесь биотин-связывающего белка в виде растворимого белка в Е. coli.

Несмотря на то, что биотин-связывающие белки известны из уровня техники, описанный здесь биотин-связывающий белок включает значительные различия по сравнению с авидином и авидин-подобными белками, известными из уровня техники в настоящее время. Во-первых, известные в настоящее время авидины крайне тяжело экспрессировать в виде растворимых белков в Е. coli. Тем не менее, как показано в данном изобретении, описанный здесь биотин-связывающий белок может быть экспрессирован в виде растворимого белка в Е. coli с высоким выходом.

Описанные здесь биотин-связывающие белки могут быть получены в растворимой форме с высокими уровнями выхода, например, более 30 мг на литр культуры, путем экспрессии в Е. coli. Таким образом, описанные здесь биотин-связывающие белки являются более растворимыми, чем белки, описанные в уровне техники, и также обладают другими отличиями. Без связи с какой-либо теорией, считается, что различная растворимость может быть связана с лежащими в основе физическими и/или химическими и/или структурными различиями между описанными здесь биотин-связывающими белками и другими биотин-связывающими белками, известными из уровня техники.

Второе, описанный здесь биотин-связывающий белок включает биотин-связывающий домен, который состоит из аминокислот 45-179 Ризавидина дикого типа. В то время как Ризавидин дикого типа и его частично усеченная часть известны из уровня техники, в уровне техники не существует теории или предложения, связанного с тем, что биотин-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность из аминокислот 45-179 Ризавидина дикого типа и сигнальную последовательность Е. coli ведет к образованию растворимого белка, который может быть получен из Е. coli с высоким выходом. Согласно Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405), аминокислоты 25-44 Ризавидина дикого типа включают предполагаемую сигнальную последовательность. Тем не менее, как описано здесь, изобретатели обнаружили и продемонстрировали, что замена предполагаемой сигнальной последовательности на сигнальную последовательность Е. coli ведет к увеличению экспрессии биотин-связывающего белка в растворимой форме в Е. coli.

Третье, описанный биотин-связывающий белок включает пептид аминокислотной последовательности GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:14). Данный пептид на С-конце обеспечивает гистидиновую метку для очистки и место для инсерции других доменов, например антигенных доменов, в биотиновый белок. Также, в то время как Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405) описывают экспрессию Ризавидина в Е. coli, у Helppolainen et al. не существует теории или предложения о конъюгировании дополнительного пептида на С-конец биотин-связывающего домена Ризавидина.

Четвертое, Ризавидин обладает более низкой гомологией последовательности относительно яичного авидина (22,4% идентичность последовательности и 35,0% аналогичность) по сравнению с другими авидин-подобными белками. Таким образом, описанный здесь биотин-связывающий белок представляет собой иной авидин и другие авидин-подобные белки.

Пятое, описанный здесь биотин-связывающий белок обладает более низкой изоэлектрической точкой (р1) по сравнению с авидином и другими авидин-подобными молекулами. Изоэлектрическая точка Ризавидина дикого типа составляет 4,0 (Helppolainen et al., Biochem J., 2007, 405: 397-405). Изоэлектрическая точка других известных биотин-связывающих белков в целом составляет более 6,1 (см. Helppolainen et al., Biochem J., 2007, 405: 397-405). С другой стороны, р1 описанного здесь биотин-связывающего белка составляет 5,4. Находящаяся в области кислых значений р1 описанного здесь биотин-связывающего белка ведет к снижению неспецифичного связывания. Связанной с применением известного в настоящее время авидина и авидин-подобных пептидов проблемой является их неспецифичное связывание. Известный в настоящее время авидин и авидин-подобные пептиды могут неспецифично связываться не только с клетками, но также с ДНК, белками и биологическими материалами, такими как мембраны. Например, при детектировании материала с применением связывания авидин-биотин, авидин неспецифично связывается с иными материалами, не являющимися подвергающимися детектированию материалами для увеличения фона. Одна из причин высокого уровня неспецифичного связывания авидина включает высокое значение его изоэлектрической точки. Авидин представляет собой высокоосновный белок с крайне высоким значением изоэлектрической точки, составляющим 10 или более, и являющийся в целом положительно заряженным. Соответственно, считается, что авидин легко связывается с биологическими материалами, во многих случаях являющимися отрицательно заряженными. Таким образом, низкое значение pI описанного здесь биотин-связывающего белка представляет собой преимущество по сравнению с известными в настоящее время авидином и авидин-подобными пептидами.

Шестое, размер описанного здесь биотин-связывающего белка относительно мал по сравнению с известными в настоящее время авидином и авидин-подобными белками. Этот биотин-связывающий белок менее 28 кДа (размер димера). Тем не менее, большая часть из известного в настоящее время авидина и авидин-подобных белков имеют размеры, соответствующие более 60 кДа (размер тетрамера). Считается, что Ризавидин дикого типа имеет размер около 29 кДа (размер димера). Малые размеры биотин-связывающего белка могут использоваться для увеличения степени конъюгирования между целевыми молекулами. Например, биотин-связывающий белок может применяться для конъюгирования первой целевой молекулы со второй целевой молекулой. Одна из данных молекул может быть связана с одним или несколькими молекулами биотина или биотин-подобными молекулами, а вторая молекула может быть связана, конъюгирована или слита с биотин-связывающим белком. С учетом небольших размеров описанного здесь биотин-белка, молекулы биотина или биотин-подобные молекулы могут быть расположены более близко друг к другу, что позволяет осуществлять более релятивное связывание в случае, если вторая молекула имеет большие размеры по сравнению с известным в настоящее время авидином или авидин-подобными молекулами.

Седьмое, описанный здесь биотин-связывающий белок представляет собой димер. Образование димера может дополнительно улучшать экспрессию описанного здесь биотин-связывающего белка в виде растворимого белка в Е. coli. Кроме того, в связи с тем, что биотин-связывающий белок образует димер, а не тетрамер, подобно всем другим известным авидин-подобным белкам 1) снижается сложность структуры слитых антигенов; 2) сложность экспрессии слитых белков рекомбинантного биотин-связывающего белка аналогично снижается; 3) стерический барьер, связанный с манипуляциями со слитыми биотин-связывающими белкам, минимизируется, что представляет собой преимущество в свете других манипуляций, например с (без ограничения) биотином, миметиками биотина или производными биотина; и 4) растворимость слитых биотин-связывающих белков значительно повышается. Таким образом, показаны основополагающие различия между описанными здесь биотин-связывающими белками и белками, известными из уровня техники.

Восьмое, описанный здесь биотин-связывающий белок снижает риск индуцирования содержащей его иммуногенной композицией аллергической реакции у субъекта в отношении яиц. Более того, антитело к описанному здесь биотин-связывающему домену не обладает заметной перекрестной реактивностью относительно яичного авидина (и наоборот).

Также, описанный здесь биотин-связывающий белок может обладать улучшенными качествами, такими как снижение степени неспецифичного связывания или дополнительное увеличение степени связывания биотина, в то же время сохраняя характеристики Ризавидина дикого типа. Применение описанного здесь биотин-связывающего белка для детектирования, например, в рамках иммунологического анализа или анализа гибридизации нуклеиновой кислоты, для измерения аналита с помощью связывания авидин-биотин может снижать фон, повышать чувствительность и поддерживать связывание с биотином при жестких условиях.

Данное исследование ясно показывает преимущества и различия описанных здесь биотин-связывающих белков по сравнению с авидином и другими авидин-подобными белками. Таким образом, описанные здесь биотин-связывающие белки обладают потенциалом в качестве мощного и универсального средства в рамках широкого спектра вариантов применения с использованием авидин-биотиновой технологии.

Биотин-связывающий белок может применяться в любой методологии, композиции или системе, требующей применения авидин-биотиновой системы, без каких-либо ограничений. Как хорошо известно специалисту в данной области, авидин-биотиновая система может применяться в широко используемых лабораторных процедурах, таких как биоконъюгирование; детектирование молекул-мишеней; выделение, очистка или обогащение из образца молекул-мишеней; детектирование белка; детектирование нуклеиновой кислоты; выделение, очистка или обогащение белка; выделение, очистка или обогащение нуклеиновой кислоты; ELISA; проточная цитометрия и им подобных.

Соответственно, примерные варианты применения описанных здесь рекомбинантных биотин-связывающих белков включают (без ограничения) биоконъюгирование; детектирование молекул-мишеней; выделение, очистку или обогащение из образца молекул-мишеней; детектирование белка; детектирование нуклеиновой кислоты; выделение, очистку или обогащение белка; выделение, очистку или обогащение нуклеиновой кислоты; ELISA; проточную цитометрию и им подобные.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанный здесь биотин-связывающий белок может применяться в качестве части аффинной пары в системе множественной презентации антигена (MAPS) как описано в предварительной патентной заявке США 61/484934, поданной 11 мая 2011; 61/608168, поданной 8 марта 2012; и 61/609,974, поданной 13 марта 2012 и РСТ заявке PCT/US12/37412, поданной 11 мая 2012, содержание каждой из которых приведено здесь во всей полноте для ссылки. MAPS также описана более подробно ниже. Без связи с какой-либо теорией, считается, что применение описанного здесь биотин-связывающего белка снижает риск индуцирования MAPS системой аллергической реакции, связанной с яйцами, у субъекта. Более того, антитело к рекомбинантному модифицированному Ризавидину не обладает заметной перекрестной реактивностью относительно яичного авидина (и наоборот).

Липидированный биотин-связывающий белок

В другом аспекте здесь предусмотрен липидированный биотин-связывающий белок. В соответствии с использованным здесь значением термин "липидированный биотин-связывающий белок" означает биотин-связывающий белок, который ковалентно конъюгирован с липидом. Липидными частями могут являться диацильный или триацильный липид.

Липидированный биотин-связывающий белок может быть получен с помощью липидационной последовательности. В соответствии с использованным здесь значением, термин "липидационная последовательность" означает аминокислотную последовательность, которая способствует липидированию несущего липидационную последовательность полипептида в бактериях, например в Е. coli. Липидационная последовательность может присутствовать на N-конце или С-конце белка. Липидационная последовательность может быть связана с рекомбинантным биотин-связывающим белком для образования слитого белка, находящегося в липидированной форме при экспрессии в Е. coli, осуществляемой в рамках стандартной рекомбинантной технологии. В некоторых вариантах осуществления изобретения липидационная последовательность расположена на N-конце биотин-связывающего белка.

Может применяться любая известная специалисту липидационная последовательность. В некоторых вариантах осуществления изобретения липидационная последовательность представляет собой MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID NO:3) или ее производное или функциональную часть. Другие примерные липидационные последовательности включают (без ограничения) MNSKKLCCICVLFSLLAGCAS (SEQ ID NO:16), MRYSKLTMLIPCALLLSAC (SEQ ID NO:17), MFVTSKKMTAAVLAITLAMSLSAC (SEQ ID NO:18), MIKRVLVVSMVGLSLVGC (SEQ ID NO:19) и их производные или функциональные части.

В некоторых вариантах осуществления изобретения липидационная последовательность может быть слита с биотин-связывающим белком через пептидный линкер, при этом пептидный линкер присоединяет липидационную последовательность к биотин-связывающему белку.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер включает аминокислотную последовательность VSDP (SEQ ID NO:9).

В одном варианте осуществления изобретения биотин-связывающий липидный белок включает аминокислотную последовательность MKKVAAFVALSLLMAGCVSDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:20).

Липидированные биотин-связывающие белки представляют собой лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR). Как таковые, описанные здесь липидированные биотин-связывающие белки могут применяться в качестве TLR лигандов. Например, липидированный биотин-связывающий белок может применяться в композициях для индуцирования TLR2 стимулирования. Это может быть полезно для индуцирования иммуногенности к другим антигенам/патогенам. Таким образом, биотин-связывающие липопротеины могут применяться в иммуногенных композициях в качестве костимулирующего фактора или адъюванта антигена.

В соответствии с использованным здесь значением термин "Toll-подобный рецептор" предназначен для обозначения в целом любого Toll-подобного рецептора организма любого вида. TLR может представлять собой рецептор любого вида млекопитающих. TLR были обнаружены у различных видов млекопитающих, включая (без ограничения), например, людей, гвинейских свиней и мышей. Специфичные TLR могут быть определены благодаря дополнительной ссылке на вид по происхождению (например, человек, грызуны и так далее), конкретный рецептор (например, TLR2, TLR3, TLR9 и так далее) или по им обоим. В некоторых вариантах осуществления изобретения липидированный биотин-связывающий белок представляет собой лиганд TLR2.

Toll-подобные рецепторы (TLR) представляют собой семейство трансмембранных белков линий зародышевых клеток, обеспечивающих распознавание патогенов и активацию врожденной иммунной системы. Toll-подобные рецепторы (TLR) представляют собой рецепторы опознавания паттерна (PRR) и экспрессируются клетками врожденной иммунной системы, включая макрофаги, дендритные клетки и NK-клетки. Примеры известных лигандов TLR включают грамположительные бактерии (TLR-2), бактериальный эндотоксин (TLR-4), белок флагеллин (TLR-5), бактериальную ДНК (TLR-9), двухспиральную РНК и поли I:C (TLR-3) и дрожжи (TLR-2). Другие лиганды, которые связывают эндоцитозный рецептор опознавания паттерна, фагоцитарный рецептор или связывающий маннозу рецептор также могут рассматриваться в рамках данного изобретения. TLR захватывают патогенные лиганды и далее активируют путь сигнальной трансдукции TLR/IL-1R для индуцирования различных эффекторных генов. Toll-подобные рецепторы (TLR) представляют собой важную группу PRR, которые могут распознавать молекулярные паттерны, связанные с патогенами или микробами. Они широко экспрессируются в крови, селезенке, легких, мышцах и кишечнике многими типами клеток, в частности дендритными клетками (DC), но также макрофагами, эпителиальными клетками и лимфоцитами.

Несмотря на то, что некоторые расположенные на клеточной поверхности TLR являются специфичными к микробным липидам и белкам, другие связанные с эндосомными компартментами внутри клеток являются специфичными к нуклеиновым кислотам. Лигирование TLR специфичными им лигандами приводит к конформационным изменениям в рецепторах, ведущим к входящей трансдукции, в основном затрагивающей MyD88- и TRIF-зависимые пути. За исключением TLR3, все другие TLR могут передавать сигналы через путь MyD88 для индуцирования воспалительного цитокинеза, включающего активацию внутриклеточных протеинкиназовых каскадов, включая IB киназу (IKK)-NF-B и внеклеточную сигнальную регулируемую протеинкиназу (ERK), c-Jun N-терминальную киназу (JNK) и митоген-активируемые протеинкиназы р38 (МАРК). Путь TRIF независимо от MyD88 используется TLR3 и TLR4 и опосредует индуцирование интерферонов I типа.

Описанные здесь рекомбинантные биотин-связывающие липопротеины обладают повышенной иммуногенностью. Без связи с какой-либо теорией, считается, что липидные части на N-концах липопротеинов или липопептидов вносят вклад в адъювантную активность. Соответственно, дополнительные варианты осуществления изобретения предусматривают иммуногенные композиции или композиции вакцин для индуцирования иммунологического ответа, включающие выделенный биотин-связывающий липопротеин или подходящий вектор для его экспрессии in vivo или оба из них, а также подходящий носитель и способы индуцирования иммунологического или протективного ответа, включающие введение субъекту выделенного рекомбинантного биотин-связывающего липопротеина, экспрессирующего рекомбинантный биотин-связывающий липопротеин вектора или композицию, содержащую рекомбинантный липопротеин или вектор в количестве, достаточном для индуцирования ответа.

Иммунологическая или иммуногенная композиция, включающая биотин-связывающий липопротеин, индуцирует иммунологический ответ - местный или системный. Данный ответ может необязательно являться протективным. Следует отметить, что в соответствии с использованным здесь значением термины "иммунологическая композиция" и "иммуногенная композиция" включают "композицию вакцины" (поскольку оба вышеуказанных термина могут означать протективные композиции). Без ограничений, описанный здесь липидированный биотин-связывающий белок может применяться в качестве антигена, адъюванта или костимулятора в иммунологической, иммуногенной или вакцинной композиции. Также, поскольку липидированный биотин-связывающий белок включает биотин-связывающий домен, липидированный белок может быть включен в полимерную основу MAPS. Соответственно, здесь также предусмотрены способы индуцирования иммунологического ответа в хозяине-млекопитающем. Данный способ включает введение субъекту иммуногенной, иммунологической или вакцинной композиции, включающей описанный здесь липидированный биотин-связанный белок и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения липидированный биотин-связывающий белок представляет собой слитый белок, включающий липидированный биотин-связывающий белок и белок или пептид.

Негемолитический Hla

Гемолизины представляют собой экзотоксины, продуцируемые бактериями, которые вызывают лизис красных кровяных клеток. Несмотря на высокую иммуногенность, их применение в вакцинах ограничено в связи с тем, что они вызывают лизис красных кровяных клеток. Соответственно, в другом аспекте здесь предусмотрены варианты альфа-гемолизина (Hla) staphylococcal aureus, его слитый с биотин-связывающим белком конструкт и варианты его применения. Данные варианты, обозначенные здесь как "mHla", практически негемолитические, то есть обладают низкой гемолитической активностью. В соответствии с использованным здесь значением, фраза "практически негемолитическая" означает неспособность лизировать красные кровяные клетки при эквивалентных уровнях титра Hla дикого типа. Термин "Hla дикого типа" соответствует обычному определению, связанному с данной фразой, то есть Hla, который вырабатывается естественным путем способным к этому бактериальным источником. Согласно определению, "Hla дикого типа" не включает, например, слитые продукты Hla, полученные с помощью способов рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения гемолитическая активность mHIa, по меньшей мере, на 5%, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 15%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% ниже эквивалентных уровней титра Hla дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения mHla не обладает детектируемой гемолитической активностью. Согласно изобретению, также обнаружено, что гемолитическая активность mHla может быть дополнительно снижена связыванием mHla с биотин-связывающим белком. Соответственно, настоящее описание также описывает слитые белки, включающие mHla белок и биотин-связывающий белок.

Как указано здесь, негемолитический Hla может быть создан, если остаток W205 или W213 заменен аланином (А) или если трипептид DRD209-211 заменен три-аланиновым пептидом (ААА) в Hla дикого типа. Мутировавший белок Hla может быть экспрессирован и очищен в системе экспрессии Е. coli. Данные мутанты могут быть получены с помощью точечной мутации с использованием мутагенеза согласно протоколу QuickChange. Например, нуклеотидная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующий Hla дикого типа, может быть изменена для замены целевой аминокислоты в Hla дикого типа на другую аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения mHla представляет собой слитый белок, включающий mHla и биотин-связывающий белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий mHla-слитый белок включает аминокислотную последовательность MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEE MTN(SEQIDNO:21).

Описанные здесь варианты Hla представляют собой лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR). Как таковые, описанные здесь варианты Hla могут применяться в качестве лигандов TLR. Например, варианты Hla могут применяться в композициях для индуцирования стимулирования TLR2. Это может быть полезно для индуцирования иммуногенности к другим антигенам/патогенам. Таким образом, описанные здесь варианты Hla могут применяться в иммуногенных композициях в качестве костимулирующего фактора или адъюванта антигена. Также, при слиянии mHla с биотин-связывающим белком слитый белок может быть конъюгирован с полимерной цепью MAPS.

В некоторых вариантах осуществления изобретения mHla может применяться в качестве костимулирующего фактора в иммуногенной или вакцинной композиции.

Также, поскольку mHla индуцирует иммунный ответ у субъекта, mHla может применяться в иммуногенной или вакцинной композиции для вакцинирования субъекта против S. aureus.

Описанный здесь mHla обладает повышенной иммуногенностью. Соответственно дополнительные варианты осуществления изобретения предусматривают иммуногенные композиции или композиции вакцин для индуцирования иммунологического ответа, включающие mHla или подходящий вектор для его экспрессии in vivo или оба из них, а также подходящий носитель и способы индуцирования иммунологического или протективного ответа, включающие введение субъекту-хозяину выделенного mHla, экспрессирующего mHla вектора или композиции, содержащей mHla или вектор в количестве, достаточном для индуцирования ответа.

Иммунологическая или иммуногенная композиция, включающая mHla, может индуцировать иммунологический ответ - местный или системный. Данный ответ может необязательно являться протективным. Соответственно, описанный здесь негемолитический мутант Hla может представлять собой антиген, адъювант или костимулятор в иммунологической, иммуногенной или вакцинной композиции.

Также здесь предлагаются способы индуцирования иммунологического ответа у млекопитающего-хозяина. Данный способ включает введение субъекту иммуногенной, иммунологической или вакцинной композиции, включающей описанный здесь негемолитический мутант Hla и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В другом аспекте изобретения здесь предусмотрены слитые белки, включающие описанный здесь биотин-связывающий белок, связанный с антигенным белком или пептидом. Данные слитые белки также называются здесь биотин-связывающими слитыми белками и антигенными слитыми белками. Биотин-связывающий белок и антигенный белок или пептид могут быть связаны в любой конфигурации, например биотин-связывающий белок может располагаться на N-конце, а антигенный пептид - на С-конце слитого белка или наоборот.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок и антигенный белок или пептид могут быть связаны друг с другом пептидным линкером.

Линкерный пептид может включать любую аминокислотную последовательность и может быть любой длины без ограничений. Например, последовательность пептидного линкера может включать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер, связывающий антигенный домен с биотин-связывающим доменом, включает восемь аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер, связывающий антигенный домен с биотин-связывающим доменом, имеет аминокислотную последовательность GGGGSSS (SEQ ID NO:22).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенный белок представляет собой описанный здесь негемолитический Hla.

В некоторых вариантах осуществления изобретения негемолитический белок Hla представляет собой слитый белок, включающий биотин-связывающий белок и описанный здесь негемолитический Hla.

В некоторых вариантах осуществления изобретения негемолитический белок Hla представляет собой слитый белок, включающий липидированный биотин-связывающий белок и описанный здесь негемолитический Hla.

Иммуногенные композиции

В другом аспекте изобретения предлагаются иммуногенные композиции, включающие антигенный слитый белок, липидированный биотин-связывающий или описанный здесь негемолитический вариант Hla. Кроме того, здесь предусмотрены также иммуногенные композиции и вакцинные композиции, представляющие собой иммуногенный комплекс, который включает, по меньшей мере, один антигенный слитый белок или несколько антигенных слитых белков, присоединенных к полимерному каркасу для применения с целью индуцирования иммунного ответа на каждый из присоединенных к полимеру антигенов и необязательно на сам полимер при введении субъекту. Без связи с какой-либо теорией, считается, что описанная здесь иммуногенная композиция стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ: она может продуцировать антитела и Th1/Th17 ответы на множественные белковые антигены с помощью одной иммуногенной конструкции MAPS. Комбинация В- и Т-клеточного иммунитета представляет собой оптимальную стратегию вакцинирования организма против многих заболеваний, включая связанную с пневмококковыми заболеваниями инвазивную инфекцию и носоглоточный перенос инфекции. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция представляет собой вакцину или включена в вакцину.

Соответственно, варианты осуществления изобретения предусматривают здесь иммуногенную композицию и способы, которые можно применять для повышения иммунного ответа у субъекта, которые могут применяться самостоятельно или совместно или дополнительно с, по существу, любыми существующими подходами к вакцинированию.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, 2 антигена, или, по меньшей мере, 3 антигена, или, по меньшей мере, 5 антигенов, или от 2 до 10 антигенов, или от 10 до 15 антигенов, или от 15 до 20 антигенов, или от 20 до 50 антигенов, или от 50 до 100 антигенов, или более 100 антигенов включительно. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых описанная здесь иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, 2 антигена, данные антигены могут представлять собой как одинаковые антигены, так и, по меньшей мере, 2 различных антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения данные антигены могут быть получены из одного или различных патогенов или могут представлять собой различные эпитопы или части одного антигенного белка или могут представлять собой один антиген, являющийся специфичным относительно различных серотипов или сезонных вариантов одного патогена (например, вирус гриппа А, В и С).

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция включает антиген из патогенного организма или ненормальной ткани. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может представлять собой, по меньшей мере, один антиген, выбранный из антигенов патогенов или паразитов, таких как антигены Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis или M. tetanus. Bacillus anthracis, ВИЧ, антигены сезонного или эпидемического гриппа (такого как H1N1 или H5N1), Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitides или N. gonorrhoeae, папилломавируса человека, Chlamydia trachomatis, вируса простого герпеса или других вирусов герпеса или Plasmodia sp.Данные антигены могут включать пептиды, белки, гликопротеины или полисахариды. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой анатоксин или часть токсина.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция включает антигенный полисахарид, например такой как Vi антиген (капсульный полисахарид Salmonella typhi), пневмококковые капсульные полисахариды, полисахарид клеточных стенок пневмококков, капсульный полисахарид Hib (Haemophilus influenzae типа В), менингококковые капсульные полисахариды и другие бактериальные капсульные полисахариды или полисахариды клеточных стенок или любые их комбинации. Полисахарид может иметь белковый компонент, например гликопротеин, такой как гликопротеин вирусов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один костимулирующий фактор, связанный с полимером или полисахаридом, при этом костимулирующий фактор может быть связан напрямую или не напрямую. Например в некотором варианте осуществления изобретения костимулирующий фактор может быть ковалентно связан с полимером. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор может быть ковалентно присоединен к первой аффинной молекуле, которая затем поперечно-сшивается с полимером. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор может быть присоединен к комплементарной аффинной молекуле, которая связывается с первой аффинной молекулой для связывания костимулирующего фактора с полимером. В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор представляет собой адъювант. В альтернативных вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор может представлять собой любой фактор, известный специалисту в данной области, и включает любые комбинации, например (без ограничения) агонисты Toll-подобных рецепторов (агонисты TLR2, 3, 4, 5 7, 8, 9 и так далее), агонисты NOD или агонисты инфламмасомы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор может представлять собой липидированный биотин-связывающий белок или негемолитический вариант альфа-гемолизина или слитый белок mHla с описанным здесь биотин-связывающим белком.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению описанной здесь иммуногенной композиции для введения субъекту для индуцирования иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ представляет собой антитело/В-клеточный ответ, CD4⁺ Т-клеточный ответ (включая Th1, Th2 и Th17 клетки) и/или CD4⁺ Т-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, один адъювант вводят совместно с иммуногенной композицией.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу индуцирования иммунного ответа у субъекта на, по меньшей мере, один антиген, включая введение субъекту описанной здесь иммуногенной композиции.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу вакцинирования животного, например птицы, млекопитающего, или человека против, по меньшей мере, одного антигена, включающему введение вакцинной композиции, включающей описанную здесь иммуногенную композицию.

Во всех описанных здесь аспектах термины "животное" или "субъект" может относится к человеку. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект может представлять собой сельскохозяйственное, или недомашнее животное, или домашнее животное. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцинная композиция, представляющая собой описанную здесь иммуногенную композицию, может быть введена подкожно, интраназально, орально, подъязычно, вагинально, ректально, внутрикожно, путем интраперитонеальной или внутримышечной инъекции.

Во всех описанных здесь аспектах иммунный ответ представляет собой антитело/В-клеточный ответ, CD4⁺ Т-клеточный ответ (включая Th1, Th2 и Th17 ответы) или CD8+ Т-клеточный ответ на белок/пептидный антиген(ы). В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ представляет собой антитело/В-клеточный ответ на полимер, например пневмококковый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, один адъювант вводят совместно с иммуногенной композицией.

Другой аспект настоящего изобретения связан с применением описанной здесь иммуногенной композиции для применения при диагностике чувствительности к патогенному или иммуногенному агенту.

Система множественной антигенной презентации

Также здесь предусмотрена иммуногенная система множественной антигенной презентации (MAPS), применяемая при производстве иммуногенных композиций, применяемых в вакцинах. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, представляющим собой иммуногенный комплекс, включающий, по меньшей мере, один тип полимера, например полисахарид, который может необязательно являться антигенным; по меньшей мере, один антигенный белок или пептид; и, по меньшей мере, одну пару комплементарных аффинных молекул, включающую (i) первую аффинную молекулу, которая связана с полимером, и (ii) комплементарную аффинную молекулу, которая связана с белком или пептидом; так что первая и вторая комплементарные аффинные молекулы служат в качестве непрямой связи между полимером и антигенным белком или пептидом. Соответственно, полимер может присоединять, по меньшей мере, 1, или, по меньшей мере, 2, или множество одинаковых или различных белковых или пептидных антигенов. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер является антигенным, например полимер представляет собой капсульный полисахарид пневмококков. В некоторых вариантах осуществления изобретения белковые или пептидные антигены представляют собой рекомбинантные белковые или пептидные антигены.

Описанные здесь иммуногенные композиции могут индуцировать гуморальный и клеточный ответы на один или множество антигенов одновременно. Данные иммуногенные композиции обеспечивают долговременный ответ, потенциально защищая субъекта от инфекций в будущем. Это делает возможным создание одной иммуногенной композиции, которая повышает высокий титр функционального антиполисахаридного антитела и является аналогичной или превосходящей уровень антител, индуцируемых существующими сопряженными вакцинами. Более того, не существует ограничения относительно конкретного несущего белка, при этом в конструкции MAPS могут применяться различные антигенные белки для продуцирования устойчивого антиполисахаридного антителогенеза.

Кроме того, сильный антителогенез и Th17/Th1 ответы являются специфичными относительно множественных белковых антигенов, презентируемых через MAPS композицию. Это представляет значительное преимущество в качестве средства для индуцирования двух форм иммунитета одной конструкцией. В добавление к более стандартному иммунному ответу на антигенный полисахарид, конъюгированный с белковым носителем, настоящее изобретение предусматривает Т-клеточный ответ и, более конкретно, Th17 и Th1 ответы на системно инъецируемые белки. Более того, предлагаемая иммуногенная композиция может включать лиганды в полимерную основу. Это обеспечивает возможность увеличить степень определенных В-клеточных или Т-клеточных ответов путем модификации отношения белок/полимер, размера комплекса или путем включения определенного костимулирующего фактора, такого как TLR2/4 лиганды и т.п., в композицию.

По сравнению с обычной технологией конъюгирования, которая включает грубую обработку белков, настоящие способы исключают риск денатурирования или иной модификации пептидного антигена. Это обеспечивает значительно преимущество, связанное с сохранением антигенности включенных белков и увеличением вероятности того, что сам белок будет служить в качестве антигена (а не просто носителя). Аналогично, предлагаемые в изобретении способы исключают необязательную модификацию/повреждение полисахаридной основы, поскольку тяжелое химическое сшивание: биотинилирование может точно контролироваться для взаимодействия определенными функциональными группами полисахарида, а уровень биотинилирования может быть легко изменен. Это представляет собой преимущество в плане исключения стандартного процесса конъюгирования, который приводит к повреждению функционально важных боковых цепей или эпитопов, что может вызывать сниженную степень иммуногенности и защиты.

Описываемая сборка конструкции на основе аффинности обеспечивает легкое и очень гибкое приготовление иммуногенной композиции. Она является высокоспецифичной и стабильной; может храниться в холоде в течение месяцев и сохранять свой потенциал. Процесс сборки достаточно прост для обеспечения высокой степени воспроизводимости; требуется лишь несколько этапов, которые снижают риск вариативности параметров, что представляет собой значительное промышленное преимущество. MASP сборка является высокоэффективной (более 95%) даже при низких концентрациях белка и полисахарида (таких как 0,1 мг/мл); это представляет собой значительной преимущество, поскольку неэффективность при продуцировании на основе конъюгации (типичный уровень эффективности находится в диапазоне <50%) представляет собой значительное препятствие и причину высокой стоимости вакцин. При разработке состава легко изменить композицию и физические свойства итогового продукта. Соотношение белок:полимер в комплексе является изменяемым; при среднем уровне биотинилирования полимера соотношение белок:полимер может составлять 10:1 (в/в) или более; с другой стороны, соотношение может составлять 1:10 или менее, если это требуется с учетом иммунологических целей. Кроме того, размер иммуногенной MAPS композиции может быть изменен путем выбора определенного размера полимера. Способы приготовления MAPS обеспечивают легкость комбинирования белков и полимеров при малой модификации. Возможная поливалентность итогового продукта за счет использования множества белковых антигенов от одного или различных патогенов (например, пневмококка или туберкулеза) в отдельной иммуногенной конструкции обеспечивает возможность создания композиции, которая может применяться для уменьшения количества вакцин, необходимых для иммунизации субъекта против более чем одного заболевания. Более того, MAPS композиция является высокостабильной; диссоциирует только при кипячении и сохраняет иммуногенность при 4°С даже спустя много месяцев. Иммуногенность MAPS комплекса может быть ограничена стабильностью антигенного белка или пептидного компонента, которая может быть увеличена путем включения в MAPS комплекс. Конкретные применяемые здесь антигены обладают стабильностью при комнатной температуре и после, по меньшей мере, одного цикла заморозки-оттаивания. Это обеспечивает важное преимущество по сравнению с существующими вакцинами, чья эффективность снижается, если "холодовая цепь" не соблюдается должным образом.

Соответственно один аспект настоящего изобретения относится к иммуногенной композиции, включающей полимер, по меньшей мере, один белковый или пептидный антиген и, по меньшей мере, одну пару комплементарных аффинных молекул, при этом данная пара комплементарных аффинных молекул включает первую молекулу, которая связывается с полимером, и комплементарную аффинную молекулу, которая связывается с белковым или пептидным агентом, так что когда первая аффинная молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой она ненапрямую связывает антиген с полимером.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первая аффинная молекула сшита с полимером сшивающим реагентом, например сшивающим реагентом, выбранным из CDAP (тетрафторборат 1-циан-4-диметиламинопиридиния), EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорид), цианборгидрид натрия; бромциана; или бикарбоната аммония/иодуксусной кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая аффинная молекула сшита с карбоксильными, гидроксильными, аминными, феноксильными, гемиацетальными и меркапто функциональными группами полимера. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая аффинная молекула ковалентно связана с полимером.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное, или молекулу с аналогичной биотину структурой или физическими свойствами, например амин-PEG3-биотин ((+)-биотинилирование-3-6,9-триксаундекандиамин) или его производное.

В некоторых вариантах осуществления изобретения белковый или пептидный антиген для иммуногенной композиции представляет собой слитый белок, включающий антигенный белок или пептид, слитый с комплементарной аффинной связывающей молекулой. Продукт слияния может представлять собой генетическую конструкцию, то есть рекомбинантный слитый пептид или белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может быть ковалентно присоединен в виде слитого белка к комплементарной аффинной молекуле. В альтернативных вариантах осуществления изобретения антиген нековалентно присоединен к комплементарной аффинной молекуле.

В некоторых вариантах осуществления изобретения комплементарная аффинная молекула представляет собой биотин-связывающий белок или его производное или его функциональную часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения комплементарная аффинная молекула представляет собой авидин-подобный белок или его производное или функциональную группу, например (без ограничения) Ризавидин или его производное. В некоторых вариантах осуществления изобретения комплементарная аффинная молекула представляет собой авидин или стрептавидин или их производное или функциональную часть.

В некоторых вариантах осуществления изобретения секреторный сигнальный пептид расположен на N-конце авидин-подобного белка. Может применяться любая сигнальная последовательность, известная специалистам в данной области; а в некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO:2) или ее производное или функциональную часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может быть слит с комплементарной аффинной молекулой через гибкий линкерный пептид, при этом гибкий линкерный пептид присоединяет антиген к комплементарной аффинной молекуле.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимерный компонент иммуногена включает полимер, полученный от живого организма, например полисахарид. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер может быть очищен и выделен из природного источника, или может быть синтезирован с помощью природной композиции/структура, или может представлять собой синтетический (например, в помощью искусственной композиции/структуры) полимер. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер получен от организма, выбранного из группы, состоящей из: бактерий, архей или эукариотных клеток, таких как клетки грибов, насекомых, растений или их химер. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой полисахарид, полученный от патогенной бактерии. В определенных вариантах осуществления изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид пневмококков, полисахарид клеточных стенок пневмококков или полисахарид Vi Salmonella typhi.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер описанной здесь иммуногенной композиции представляет собой полимер с разветвленной цепью, например разветвленный полисахарид или, альтернативно, может представлять собой полимер с прямой цепью, например одноцепочечный полимер, например полисахарид. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой полисахарид, например декстран или его производное. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер, например декстрановый полимер, может обладать средним молекулярной массой 425 кДа-500 кДа включительно, или, в других вариантах осуществления изобретения, - более 500 кДа. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер, например декстрановый полимер, может обладать средним молекулярной массой 60 кДа-90 кДа включительно, или, в других вариантах осуществления изобретения, - более 70 кДа. Декстрановый полимер может быть получен от бактерии, такой как Leuconostoc mesenteroides.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, 2 антигена, или, по меньшей мере, 3 антигена, или, по меньшей мере, 5 антигенов, или от 2 до 10 антигенов, или от 10 до 15 антигенов, или от 15 до 20 антигенов, или от 20 до 50 антигенов, или от 50 до 100 антигенов, или более 100 антигенов включительно. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых описанная здесь иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, 2 антигена, при этом данные антигены могут представлять собой одинаковые антигены, или, по меньшей мере, 2 различных антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения данные антигены могут быть получены из одного или различных патогенов или могут представлять собой различные эпитопы или части одного антигенного белка или могут представлять собой один антиген, являющийся специфичным относительно различных серотипов или сезонных вариантов одного патогена (например, вирус гриппа А, В и С).

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция включает антиген из патогенного организма или ненормальной ткани. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может представлять собой, по меньшей мере, один антиген, выбранный из антигенов патогенов или паразитов, таких как антигены Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis или M tetanus. Bacillus anthracis, ВИЧ, антигены сезонного или эпидемического гриппа (такого как H1N1 или H5N1), Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitides или N. gonorrhoeae, папилломавируса человека, Chlamydia trachomatis, вируса простого герпеса или других вирусов герпеса или Plasmodia sp. Данные антигены могут включать пептиды, белки, гликопротеины или полисахариды. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой анатоксин или часть токсина.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция включает антигенный полисахарид, например такой как Vi антиген (капсульный полисахарид Salmonella typhi), пневмококковые капсульные полисахариды, полисахарид клеточных стенок пневмококков, капсульный полисахарид Hib (Haemophilus influenzae типа В), менингококковые капсульные полисахариды, полисахарид Bacillus anthracis (возбудитель сибирской язвы) и другие бактериальные капсульные полисахариды или полисахариды клеточных стенок или любые их комбинации. Полисахарид может обладать белковым компонентом, например гликопротеином, таким как гликопротеин вирусов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один костимулирующий фактор, связанный с полимером или полисахаридом, при этом костимулирующий фактор может быть связан напрямую или не напрямую. Например в некотором варианте осуществления изобретения костимулирующий фактор может быть ковалентно связан с полимером. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор может быть ковалентно присоединен к первой аффинной молекуле, которая затем сшивается с полимером. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор может быть присоединен к комплементарной аффинной молекуле, которая связывается с первой аффинной молекулой для связывания костимулирующего фактора с полимером. В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор представляет собой адъювант. В альтернативных вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор может представлять любой фактор, известный специалисту в данной области, и включает любые комбинации, например (без ограничения) агонисты Toll-подобных рецепторов (агонисты TLR2, 3, 4, 5 7, 8, 9 и так далее), агонисты NOD или агонисты инфламмасомы.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению описанной здесь иммуногенной композиции для введения субъекту для индуцирования иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ представляет собой антитело/В-клеточный ответ, CD4⁺ Т-клеточный ответ (включая клетки Th1, Th2 и Th17) и/или CD8⁺ Т-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, один адъювант вводят совместно с иммуногенной композицией.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу индуцирования иммунного ответа у субъекта на, по меньшей мере, один антиген, включающему введение субъекту описанной здесь иммуногенной композиции.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу вакцинирования животного, например птицы, млекопитающего или человека против, по меньшей мере, одного антигена, включающему введение вакцинной композиции, представляющей собой описанную здесь иммуногенную композицию.

Во всех описанных здесь аспектах животное или субъект может представлять собой человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект может представлять собой сельскохозяйственное, или недомашнее животное, или домашнее животное. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцинная композиция, представляющая собой описанную здесь иммуногенную композицию, может быть введена подкожно, интраназально, орально, подъязычно, вагинально, ректально, внутрикожно, путем интраперитонеальной или внутримышечной инъекции или через пластырь для кожи для чрескожной иммунизации.

Во всех описанных здесь аспектах иммунный ответ представляет собой антитело/В-клеточный ответ, CD4⁺ Т-клеточный ответ (включая Th1, Th2 и Th17 ответы) или CD8⁺ Т-клеточный ответ на белок/пептидный антиген(ы). В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ представляет собой антитело/В-клеточный ответ на полимер, например пневмококковый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, один адъювант вводят совместно с иммуногенной композицией.

Другой аспект настоящего изобретения связан с применением описанной здесь иммуногенной композиции для диагностики чувствительности к патогенному или иммуногенному агенту.

Здесь также предусмотрен способ вакцинирования субъекта, например млекопитающего, например человека, иммуногенными композициями как описано здесь, при этом данный способ включает введение композиции субъекту вакцины, согласно описанному здесь.

В целом, иммуногенные композиции и композиции, представляющие собой иммуногенный комплекс, могут включать, по меньшей мере, один антиген или несколько антигенов, присоединенных к полимерному каркасу для применения с целью индуцирования иммунного ответа при введении субъекту на каждый из присоединенных к полимеру антигенов и необязательно на сам полимер. Данная система множественной презентации антигена (MAPS) стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ: она может продуцировать противополисахаридное антитело и В-клеточные/Th1/Th17 ответы на множественные белковые антигены путем применения одной MAPS иммуногенной конструкции. Комбинация В- и Т-клеточного иммунитета представляет собой оптимальную стратегию вакцинирования организма против многих заболеваний, включая связанную с пневмококковыми заболеваниями инвазивную инфекцию и носоглоточный перенос инфекции. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция представляет собой вакцину или включена в вакцину.

Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к иммуногенной композиции (системе множественной антигенной презентации или MAPS), включающей, по меньшей мере, один полимер, например один полисахарид, по меньшей мере, один белковый или пептидный антиген и, по меньшей мере, одну пару комплементарных аффинных молекул, включающую (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером, и (ii) комплементарную аффинную молекулу, связанную с антигеном, которая служит для непрямого присоединения антигена к полимеру (например, первая аффинная молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой для связывания антигена с полимером). Соответственно, полимер может применяться в качестве каркаса для присоединения, по меньшей мере, 1, или, по меньшей мере 2 или более (например, множества) одинаковых или различных антигенов. Описанные здесь иммуногенные композиции могут применяться для индуцирования гуморального и клеточного ответа на множество антигенов одновременно.

Соответственно, варианты осуществления изобретения предусматривают здесь иммуногенную композицию и способы, которые можно применять для повышения иммунного ответа у субъекта, которые могут применяться самостоятельно или совместно или дополнительно с, по существу, любыми существующими подходами к вакцинированию.

MAPS представляет собой гибкую и универсальную композицию, которая может быть составлена и изготовлена для индуцирования конкретного вида, широкого спектра или определенного набора антигенных мишеней. В Таблице 1 приведено простое примерное описание для понимания гибкости вариантов применения MAPS:

Таблица 1.

Область, охватываемая MAPS платформой

Полимеры

Один компонент MAPS состоит из "основы", обычно представляющей собой полимер. Данный полимер может быть антигенным или неантигенным. Он может быть получен из разных веществ, как описано здесь, с условием, что полимер служит в качестве средства презентации связанного антигена(ов) иммунной системе обеспечивая иммуногенность. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой синтетический полимер. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет встречающийся в природе полимер, например полисахарид, полученный или очищенный из клеток бактерий. В некоторых вариантах осуществления изобретения полисахарид получен или выделен из клеток эукариот, например клеток грибов, насекомых или растений. В других вариантах осуществления изобретения полимер получен из клеток млекопитающего, таких как инфицированные вирусом клетки или раковые клетки. В целом, данные полимеры хорошо известны из уровня техники и применяются в способах и композициях, согласно описанному здесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой полисахарид, выбранный из следующих веществ: декстран, Vi полисахарид Salmonella typhi, капсульный полисахарид пневмококков, полисахарид клеточных стенок пневмококков (CWPS), менингококковый полисахарид, полисахарид Haemophilus influenzae типа b или любой другой полисахарид вирусного, прокариотического или эукариотического происхождения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полисахарид состоит из или представляет собой антигенный сахарный остаток. Например, В некоторых вариантах осуществления изобретения полисахарид для применения в способах и иммуногенных композициях, как описано здесь, представляет собой Vi полисахарид Salmonella typhi. Vi капсульный полисахарид был разработан для применения против бактериальных кишечных инфекций, таких как брюшной тиф. Robbins et al., 150 J. Infect. Dis. 436 (1984); Levine et al., 7 Baillieres din. Gastroenterol. 501 (1993). Vi представляет собой полимер α-1→4-галактуроновой кислоты с N-ацетилом в положении С-2 и вариабельным O-ацетилированием в положении С-3. Вирулентность S. typhi коррелирует с уровнем экспрессии данной молекулы. Sharma et al., 101 PNAS 17492 (2004). Вакцина на основе Vi полисахарида S. typhi обладает несколькими преимуществами: побочные эффекты являются нечастыми и слабыми, одна доза обеспечивает устойчивую иммуногенность и эффективность. Vi полисахарид может быть надежно стандартизирован посредством физиохимических способов, чья эффективность относительно других полисахаридных вакцин является установленной, Vi стабилен при комнатной температуре и может вводиться одновременно с другими вакцинами без влияния на иммуногенность и толерабельность. Azze et al., 21 Vaccine 2758(2003).

Таким образом, Vi полисахарид S. typhi может быть сшит с первой аффинной молекулой, как описано здесь, для присоединения, по меньшей мере, одного антигена к полисахариду. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может быть от того же или иного организма, так что полученная иммуногенная композиция обеспечивает, по меньшей мере, некоторый уровень иммунитета против одного патогена или двух различных патогенов: если антиген обеспечивает защиту против пневмококков, иммуногенная композиция, где полимерный каркас представляет собой Vi полисахарид, может увеличивать иммунный ответ на S. typhi и пневмококки одновременно. Другие примеры включают соединения Сахаров из инкапсулированных бактерий (таких как менингококки, S. aureus, пневмококки, Hib и так далее) и туберкулезных антигенов для получения иммуногенной композиции, которая повышает иммунный ответ в отношении двух различных патогенов.

Другие полисахаридные (PS) остатки, которые могут применяться в настоящем изобретении в качестве альтернативы декстрану, полисахаридам клеточных стенок бактерий (CWPS) и так далее, включают углеводные антигены рака.

Далее относительно пневмококковых полисахаридов, полисахарид может быть получен от любого из более 93 идентифицированных в настоящее время серотипов пневмококков, например включая (без ограничения) серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F. Дополнительные серотипы могут быть идентифицированы и включены в настоящую иммуногенную композицию, как описано здесь. В описываемые иммуногенные композиции или вакцину, включающую настоящие MAPS композиции, могут быть включены более чем один пневмококковый полисахарид в качестве полимерной основы.

Полисахарид может быть также получен в рамках изобретения, при этом иммуногенная композиция включает капсульные полисахариды N. meningitidis из, по меньшей мере, одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W, W135 или Y.

Другой вариант осуществления изобретения включает Тип 5, Тип 8 или любой из полисахаридов или олигосахаридов Staphylococcus aureus.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой химерный полимер, представляющий собой более чем один тип полимера. Например, полимер иммуногенной композиции, как описано здесь, может включать часть полимера А и остальную часть полимера В. Не существует ограничения на количество различных типов полимеров, которые могут применяться в одном конкретном образце MAPS основы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, где полимер представляет собой разветвленный полимер, полимер цепи может представлять собой полимер А, а ответвления цепи могут представлять собой, по меньшей мере, 1 или, по меньшей мере, 2 или, по меньшей мере, 3 или более различных полимеров.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой разветвленный полимер. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой неразветвленный полимер в виде одной цепи.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой полисахарид, включающий, по меньшей мере, 10 повторяющихся углеводных звеньев, или, по меньшей мере, 20, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 75, или, по меньшей мере, 100, или, по меньшей мере, 150, или, по меньшей мере, 200, или, по меньшей мере, 250, или, по меньшей мере, 300, или, по меньшей мере, 350, или, по меньшей мере 400, или, по меньшей мере, 450, или, по меньшей мере, 500, или более чем 500 повторяющихся звеньев включительно.

В одном аспекте изобретения полисахарид (PS) может иметь молекулярную массу <500 кДа или >500 кДа. В другом аспекте изобретения PS имеет молекулярную массу <70 кДа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой полимер с высоким молекулярной массой, например полимер может иметь среднюю молекулярную массу в диапазоне около 425-500 кДа включительно, например, по меньшей мере, 300 кДа, или, по меньшей мере, 350 кДа, или, по меньшей мере, 400 кДа, или, по меньшей мере, 425 кДа, или, по меньшей мере, 450 кДа, или, по меньшей мере, 500 кДа, или более чем 500 кДа включительно, однако, как правило, менее 500 кДа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер может представлять собой полимер с малой молекулярной массой, например полимер может иметь среднюю молекулярную массу в диапазоне от около 60 кДа до около 90 кДа, например, по меньшей мере, 50 кДа, или, по меньшей мере, 60 кДа, или, по меньшей мере, 70 кДа, или, по меньшей мере, 80 кДа, или, по меньшей мере, 90 кДа, или, по меньшей мере, 100 кДа, или более 100 кДа включительно, но в целом менее чем около 120 кДа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер собирают и выделяют из природного источника, а в других вариантах осуществления изобретения полимер является синтетическим. Способ производства синтетических полимеров, включая синтетические полисахариды, известны специалистам в данной области и охватываются композициями и способами, описываемыми здесь.

В Таблице 2 приведены примеры только некоторых полисахаридных полимеров, которые могут служить в качестве основы для одного или нескольких антигенов или типов антигенов.

Таблица 2.
Примерная полисахаридная полимерная основа MAPS и связанные примерные антигены
Полисахарид	Белковые антигены
Количество антигенов	Происхождение антигена
Декстран	D90 (60-90 кДа)	два	пневмококки
	D150 (150 кДа)	three	пневмококки
	D270 (270 кДа)	three	пневмококки
D500 (425-575 кДа)	два; три; шесть	пневмококки
Капсульный пневмококковый полисахарид	Серотип 1	один, два, три, пять	пневмококки, туберкулез, стафилококки
	Серотип 3	пять	пневмококки, туберкулез
	Серотип 5	один, два, три, пять	пневмококки, туберкулез
	Серотип 6В	два	пневмококки
	Серотип 7	три	пневмококки
	Серотип 14	один, два, три, пять	пневмококки, туберкулез
Серотип 19	три	пневмококки
Полисахарид клеточных стенок пневмококков	пять	пневмококки
Vi полисахарид S. typhi	пять	пневмококки

Дополнительные полимеры, которые могут применяться в описанных здесь иммуногенных MAPS композициях, включают полимеры на основе полиэтиленгликоля, поли(ортоэфир)полимеры, полиакриловые носители, PLGA, полиэтиленимин (PEI), дендримеры полиамидоамина (РАМАМ), В-аминоэфирные полимеры, полифосфоэфир(РРЕ), липосомы, полимеросомы, нуклеиновые кислоты, фосфоротиоатные олигонуклеотиды, хитозан, шелк, полимерные мицеллы, белковые полимеры, вирусные частицы, вирусоподобные частицы (VLP) и другие микрочастицы. См., например, El-Sayed et al., Smart Polymer Carriers for Enhanced Intracellular Delivery of Therapeutic Molecules, 5 Exp. Op. Biol. Therapy, 23 (2005), Биосовместимые полимеры, разработанные для доставки нуклеиновой кислоты, могут быть адаптированы для применения здесь в качестве основы. См., например, biocompatible pol. nucl. acid. deliv. (Domb et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ, 2011).

Например, VLP имеют сходство с вирусами, однако они не являются инфекционными, поскольку не содержат какого-либо вирусного генетического материала. Экспрессия, включая рекомбинантную экспрессию структурных белков вирусов, таких как компоненты оболочки или капсида, может приводить к спонтанной сборке VLP. VLP продуцируются из компонентов широкого диапазона видов вирусов, включая Parvoviridae (например, адено-ассоциированный вирус), Retroviridae (например, ВИЧ) и Flaviviridae (например вирусы гепатита В или С). VLP могут быть получены из различных систем клеточных культур, включая линии клеток млекопитающих, линии клеток насекомых, дрожжи и клетки растений. Рекомбинантные VLP обеспечивают особенное преимущество, поскольку вирусный компонент может быть слит с рекомбинантными антигенами, как описано здесь.

Антигены

Слитые белки и иммуногенные композиции, как описано здесь, могут включать любой антиген, который индуцирует иммунный ответ у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, один или несколько антигенов связаны с полимером композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, 2, или, по меньшей мере, 3, или, по меньшей мере, 5, или, по меньшей мере, 10, или, по меньшей мере, 15, или, по меньшей мере, 20, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 100, или более 100 антигенов могут быть связаны с полимером, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых иммуногенная композиция включает более чем один антиген, антигены могут представлять собой одинаковые антигены или представлять собой множество различных антигенов, связанных с полимером. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых иммуногенная композиция включает более чем один антиген, антигены могут представлять собой антигены одного патогена или различных патогенов или, альтернативно, могут представлять собой различные антигены одного патогена или аналогичные антигены различных серотипов патогенов.

Антиген для применения в описанных здесь слитых белках и иммуногенных композициях и способах может представлять собой любой антиген, включая (без ограничения) патогенные пептиды, токсины, анатоксины, их субъединицы или комбинации (например, токсин холеры, анатоксин столбняка).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген, который может быть слит с комплементарной аффинной молекулой, может представлять собой любой антиген, связанный с инфекционным заболеванием или раком или иммунным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может представлять собой антиген, экспрессируемый любым инфекционным агентом, включая вирус, бактерию, гриб или паразит.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген выделен (например, получен) из патогенного организма. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой раковый или опухолевый антиген, например антиген, полученный из опухолевой или раковой клетки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген, полученный из патогенного организма, представляет собой антиген, связанный с инфекционным заболеванием; он может получен из любого инфекционного агента, включая вирус, бактерию, гриб или паразит.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-мишень представляет собой любой антиген, связанный с патологией, например инфекционным заболеванием или патогеном или раком или иммунным заболеванием, таким как аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может экспрессироваться любым инфекционным агентом, включая вирус, бактерию, гриб или паразит. Антиген-мишень для применения в способах и композициях, как описано здесь, может также включать, например, патогенные пептиды, токсины, анатоксины, их субъединицы или комбинации (например, токсин холеры, анатоксин столбняка).

Неограничивающие примеры инфекционных вирусов включают: Retroviridae; Picornaviridae (например, полиовирусы, вирус гепатита А; энтеровирусы, вирусы Коксаки человека, риновирусы, эховирусы); Calciviridae (такой как штаммы, которые вызывают гастроэнтерит); Togaviridae (например, вирусы энцефалита лошадей, вирусы краснухи); Flaviridae (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Coronaviridae (например, коронавирусы); Rhabdoviridae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Filoviridae (например, вирусы Эбола); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирус свинки, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bungaviridae (например, хантавирусы, бунгавирусы, флебовирусы и вирусы Наиро); Arena viridae (вирус геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (например, вирус гепатита В); Parvoviridae (парвовирусы); Papovaviridae (вирусы папилломы, вирусы полиомы); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae (вирус простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус опоясывающего лишая и ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), вирус болезни Марека, вирусы герпеса); Poxviridae (вирусы оспы, вирусы коровьей оспы, поксвирусы); Iridoviridae (такой как вирус африканской чумы свиней); неклассифицированные вирусы (например, этиологические агенты spongiform энцефалопатий, агент дельта-гепатита (считается дефектным сателлитом вируса гепатита В), антигены ни-А ни-В гепатита (класс 1=переносимый внутренне; класс 2=переносимый парентерально (то есть гепатит С); вирус Норуолк и связанные вирусы и астровирусы). Описанные здесь композиции и способы предназначены для применения при лечении инфекций с данными вирусными агентами.

Примеры грибковых инфекций, которые могут быть охвачены путем включения антигенов в настоящие варианты осуществления изобретения, включают аспергиллез; молочницу (вызываемую Candida albicans); криптококкоз (вызываемый Cryptococcus) и гистоплазмоз. Таким образом, примеры инфекционного грибка включают (без ограничения) Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Компоненты данных организмов могут быть включены в качестве антигенов в описанную здесь MAPS.

В одном аспекте изобретения антиген получен из инфекционного микроба, такого как Bordatella pertussis, Brucella, Enterococci sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheae, Moraxella, типируемая или нетипируемая Haemophilus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, E.coli, Helicobacter pylori, Clostridia, Bacteroides, Chlamydiaceae, Vibrio cholera, Mycoplasma, Treponemes, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (такой как M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae, M. leprae), Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes. Streptococcus pyogenes (стрептококк группы A), Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В), Streptococcus (группа viridans). Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis. Streptococcus (анаэробный), Streptococcus pneumoniae, патогенный Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae. Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Leptospira sps., Pastwella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue и Actinomyces israelli. Описанные здесь композиции и способы предназначены для применения при лечении или предотвращении инфекций против данных бактериальных агентов.

Дополнительные паразитические патогены, из которых могут быть получены антигены, включают, например: Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum, Leishmania sp., Toxoplasma gondii, Rickettsia и Helminths.

В другом аспекте изобретения антиген представляет собой расщепленный пневмококковый PsaA белок, токсоид пневмолизина пневмококковый серин/треонинпротеинкиназу (StkP), пневмококковый серин/повторяющееся звено треонинпротеинкиназы (StkPR), пневмококковый PcsB белок, альфа-гемолизин стафилококка, белок mtb ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, ядерный антиген клеточных стенок M. tuberculosis, СТ144, СТ242 или СТ812 полипептиды Chlamydia или их фрагменты, субъединицу В ДНК-гиразы Chlamydia, сульфитный синтез/бифосфат-фосфатазу Chlamydia, белок деления клеток FtsY Chlamydia, метионил-тРНК-синтетазу Chlamydia, ДНК-геликазу (uvrD) Chlamydia, субъединицу I АТФ-синтазы (atpl) Chlamydia или металлзависимую гидролазу Chlamydia.

Вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает иммуногенную композицию, предназначенную для патогена Mycobacterium tuberculosis (ТВ) -внутриклеточного бактериального паразита. Один пример ТВ антигена представляет собой TbH9 (также известный как Mtb 39A). Другие ТВ антигены включают (без ограничения) DPV (также известный как Mtb8.4), 381, Mtb41, Mtb40, Mtb32A, Mtb64, Mtb83, Mtb9.9A, Mtb9.8, Mtbl6, Mtb72f, Mtb59f, Mtb88f, Mtb71f, Mtb46f и Mtb31 f, где "f" означает, что он представляет собой продукт слияния двух или более белков.

Как указано выше, антиген может быть получен из видов Chlamydia для применения в иммуногенных композициях настоящего изобретения. Chlamydiaceae (состоящие из Chlamydiae и Chlamydophila) представляют собой обязательные грамотрицательные внутриклеточные бактерии. Вызываемые Chlamydia trachomatis инфекции представляют собой наиболее распространенные бактериальные инфекции, переносимые половым путем, и вызывают примерно 89 миллионов новых случаев заражения генитальной хламидийной инфекцией каждый год. Chlamydia настоящего изобретения включают, например, С. trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, С. muridarum, С. suis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila felis, Chlamydophila pecorum и С. pneumoniae. Модели хламидийной инфекции на животных позволили установить, что Т-клетки играют решающую роль при излечении инфекции и защите от повторного заражения подверженных носителей. Таким образом, иммуногенные композиции, как описано здесь, могут применяться для обеспечения ощутимой пользы за счет индуцирования клеточных иммунных ответов против хламидийной инфекции.

Более конкретно, хламидийные агенты, применяемые в настоящем изобретении, включают субъединицу В ДНК-гиразы, сульфитный синтез/бифосфат-фосфатазу, белок деления клеток FtsY, метионил-тРНК-синтетазу, ДНК-геликазу (uvrD); субъединицу I АТФ-синтазы (atpl) или металлзависимую гидролазу (опубликованная патентная заявка США 20090028891). Дополнительные агенты Chlamyidia trachomatis включают полипептид СТ144, пептид с аминокислотными остатками 67-86 СТ144, пептид с аминокислотными остатками 77-96 СТ144, белок СТ242, пептид с аминокислотами 109-117 СТ242, пептид с аминокислотами 112-120 полипептида СТ242, белок СТ812 (из гена pmpD), пептид с аминокислотными остатками 103-111 белка СТ812 и некоторые другие антигенные пептиды С.trachomatis: NVTQDLTSSTAKLECTQDLI (SEQ ID NO:29), AKLECTQDLIAQGKLIVTNP (SEQ ID NO:30), SNLKRMQKI (SEQ ID NO:31), AALYSTEDL (SEQ ID NO:32), FQEKDADTL (SEQ ID NO:33), QSVNELVYV (SEQ ID NO:34), LEFASCSSL (SEQ ID NO:35), SQAEGQYRL (SEQ ID NO:36), GQSVNELVY (SEQ ID NO:37) и QAVLLLDQI (SEQ ID NO:38). См. WO 2009/020553. Дополнительно, антигены Chlamydia pneumonia, включая гомологи вышеприведенных полипептидов (см. патент США 6919187), могут применяться в качестве антигенов в иммуногенных композициях и способах, описанных здесь.

Грибковые антигены могут быть получены из видов Candida и других дрожжей; или других грибков (aspergillus и других находящихся в природе грибков). Относительно других паразитов, малярия, а также черви и амебы могут представлять собой источник антигена для применения в иммуногенных композициях и способах, описанных здесь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых антиген предназначен для продуцирования противогриппозного иммуногена, подходящими антигенами в целом являются поверхностные гликопротеины гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA). Нуклеопротеидный (NP) полипептид и матричный (М) белок представляют собой внутренние вирусные белки и, таким образом, обычно не рассматриваются при разработке вакцин для иммунитета на основе антител. Противогриппозные вакцины обычно применяются для людей и включают вакцины на основе инактивированного цельного вируса гриппа, живого ослабленного вируса гриппа или очищенный и инактивированный материал из вирусных штаммов. Например, традиционная противогриппозная вакцина может быть изготовлена с применением трех потенциально вредоносных штаммов вируса гриппа. Данные штаммы обычно выращивают в оплодотворенных куриных яйцах, что требует тщательной степени обработки, включая инокуляцию и инкубацию яиц, сбор яиц, очистку и инактивацию вируса, обработку и объединение вируса или вирусных компонентов в составе итоговой вакцины, и асептическое расфасовывание в подходящие контейнеры. Как правило, данный производственный цикл на основе яиц занимает более 70 недель. В случае крупной эпидемии гриппа, доступность эффективной и безопасной вакцины вызывает беспокойство. Дополнительно, существуют риски, связанные с примесями в яйцах, таких как антибиотики и загрязнители, что негативно влияет на стерильность вакцины. Более того, полученные на основе яиц противогриппозные вакцины противопоказаны лицам с сильной аллергией на яичные белки и людям с синдромом Гийена-Барре. Настоящее изобретение обеспечивает альтернативу противогриппозным вакцинам на основе яиц не только благодаря предотвращению связанных с яйцами осложнений, но и обеспечению базы для применения множества антигенов гриппа в рамках высококонтролируемого процесса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген для применения в иммуногенных композициях, описанных здесь, может также включать антигены, применяемые в биологическом оружии, такие как рицин, которые могут индуцировать клеточный иммунитет.

Дополнительно, настоящее изобретение также предусматривает иммуногенные композиции, включающие антигены, которые повышают степень иммунного ответа против рака. В данных конъюгатах антиген представляет собой антиген, экспрессируемый раком или опухолью или полученный из опухоли. В некоторых вариантах осуществления изобретения данные антигены называются здесь "раковыми антигенами" и, как правило, представляют собой белок, в основном экспрессируемый на раковых клетках, так что конъюгат индуцирует обширный гуморальный и обширный клеточный иммунитет в отношении данного белка. Было идентифицировано большое количество связанных с раком антигенов, некоторые из которых применяются в настоящий момент для изготовления экспериментальных вакцин для лечения рака и, таким образом, являются подходящими для применения в настоящих вариантах осуществления изобретения. Антигены, связанные более чем с одним типом рака, включают карциноэмбриональный антиген (СЕА); раково-яичковые антигены, такие как as NY-ESO-1; муцин-1 (MUC1), такой как сиалил-Tn (STn); ганглиозиды, такие как GM3 и GD2; белок р53; и белок HER2/neu (также известный как ERBB2). Антигены, являющиеся уникальными относительно определенного типа рака, включают мутантную форму рецептора эпидермального фактора роста, называемого EGFRvIII; антигены дифференциации меланоцита/меланомы, такие как тирозиназу, MART1, gp100, связанную с линией дифференцировки раково-яичковую группу (MAGE) и связанные с тирозиназой антигены; простатспецифический антиген; связанные с лейкемией антигены (LAA), такие как слитый белок BCR-ABL, белок опухоли Вилмса и протеиназу 3; и идиотипные (Id) антитела. См., например, Mitchell, 3 Curr. Opin. Investig. Drugs 150 (2002); Dao & Scheinberg, 21 Best Pract. Res. din. Haematol. 391 (2008).

Другой подход к индуцированию иммунного ответа против рака включает применение антигенов из микробов, которые вызывают или вносят вклад в развитие рака. Данные вакцины применялись против видов рака, включающих гепатоцеллюлярную карциному (вирус гепатита В, вирус гепатита С, Opisthorchis viverrin), лимфому и назофарингеальную карциному (вирус Эпштейна-Барра), колоректальный рак, рак желудка (Helicobacter pylori), рак мочевого пузыря (Schisosoma hematobium), T-клеточную лейкемию (Т-клеточный лимфотропный вирус человека), цервикальный рак (папилломавирус человека) и других. В настоящее время были проведены клинические испытания вакцин против рака мочевого пузыря, опухолей головного мозга, рака груди, цервикального рака, рака почки, меланомы, множественной миеломы, лейкемии, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака простаты и твердых опухолей. См. Pardoll et al., ABELOFF'S CLIN. ONCOL. (4-е изд., Churchill Livingstone, Philadelphia 2008); Sioud, 360 Methods Mol. Bio. 277 (2007); Pazdur et al., 30 J. Infusion Nursing 30(3): 173 (2007); Parmiani et al., 178 J. Immunol. 1975 (2007); Lollini et al., 24 Trends Immunol. 62 (2003); Schlom et al., 13 Clin. Cancer Res. 3776 (2007); Banchereau et al., 392 Nature 245 (1998); Finn, 358 New Engl. J. Med. 2704 (2008); Curigliano et al., 7 Exp. Rev. Anticancer Ther. 1225 (2007). Вирус болезни Марека, вирус герпеса, который вызывает опухоли у домашней птицы, долгое время подавлялся вакциной. Таким образом, настоящие варианты осуществления изобретения охватывают превентивные и профилактические противораковые иммуногенные композиции и лечебные/терапевтические противораковые вакцины.

Охватываемые пролиферативные заболевания и виды рака включают связанные со СПИДом виды рака, невриному слухового нерва, острый лимфолейкоз, острый миелоидный лейкоз, аденокистозную карциному, рак коры надпочечников, идиопатическую миелоидную метаплазию, алопецию, альвеолярную мягкотканую саркому, рак анального канала, ангиосаркому, астроцитому, атаксию-телеангиэктазию, базальноклеточный рак (кожи), рак мочевого пузыря, рака кости, рак кишечника, опухоли мозга и ЦНС, рак молочной железы, карциноидные опухоли, рак шейки матки, опухоли мозга у детей, рак у детей, лейкемию у детей, саркому мягких тканей у детей, хондросаркому, хориокарциному, хронический лимфолейкоз, хронический миелолейкоз, колоректальные виды рака, кожную Т-клеточную лимфому, выбухающую дерматофибросаркому, десмопластическую мелкокруглоклеточную опухоль, протоковую карциному, эндокринные виды рака, рак эндометрия, эпендимому, рак пищевода, саркому Юинга, рак внепеченочных желчных протоков, рак глаза, включая, например, меланому глаза и ретинобластому, рак фаллопиевых труб, анемию Фанкони, фибросаркому, рак желчного пузыря, рак желудка, раки двенадцатиперстной кишки, желудочно-кишечные карциноидные опухоли, раки мочеполовой системы, опухоли зародышевых клеток, гестационную трофобластическую болезнь, глиому, гинекологические раки, гемобластозы, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, наследственный рак молочной железы, болезнь Ходжкина, связанный с папилломавирусом рак шейки матки человека, пузырный занос, рак гортаноглотки, рак островковых клеток, саркому Капоши, рак почки, рак гортани, леймиосаркому, лейкемию, синдром Ли-Фраумени, рак губы, липосаркому, рак легкого, лимфедему, лимфому, неходжкинскую лимфому, рак груди у мужчин, злокачественную палочковидную опухоль почки, медуллобластому, меланому, рак клеток Меркеля, мезотелиому, метастатический рак, рак рта, множественную эндокринную неоплазию, грибовидный микоз, миелодиспластические синдромы, миелому, миелопролиферативные заболевания, рак носа, рак носоглотки, нефробластому, нейробластому, нейрофиброматоз, синдром Ниймегена, немеланомный рак кожи, немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), рак ротовой полости, рак ротоглотки, остеосаркому, остомический рак яичника, рак поджелудочной железы, рак околоносовых пазух, рак околощитовидной железы, рак околоушной железы, рак полового члена, периферические нейроэктодермальные опухоли, рак гипофиза, истинную полицитемию, рак предстательной железы, почечно-клеточный рак, ретинобластому, рабдомиосаркому, синдром Ротмунда-Томсона, рак слюнных желез, саркому, шванному, синдром Сезари, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого (МРЛ), малый рак кишечника, саркому мягких тканей, опухоли спинного мозга, плоскоклеточный рак (кожи), рак желудка, синовиальнуб саркому, рак яичек, рак тимуса, рак щитовидной железы, переходноклеточный рак (мочевого пузыря), переходноклеточный рак (почечной лоханки|мочеточника), трофобластический рак, рак мочеточника, рак мочевыделительной системы, саркому матки, рак матки, рак влагалища, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема, и опухоль Вильмса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген для применения в иммуногенных композициях, описанных здесь, может включать антигены аутоиммунных заболеваний, например они могут представлять собой "аутоантигены". Рассматриваемые диагностируемые аутоиммунные заболевания в соответствии с описанными здесь анализами включают (без ограничения) очаговую алопецию, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром, болезнь Аддисона, апластическую анемию, рассеянный склероз, аутоиммунное заболевание надпочечников, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, целиакию-зрше-дерматит, синдром хронической усталости, синдром хронической воспалительной демиелинизации (СХВД), хроническую воспалительную полинейропатию, синдром Черджа-Штрауса, рубцующийся пемфигоид, crest-синдром, болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, герпетиформный дерматит, дискоидную красную волчанку, эссенциальную смешанную криоглобулинемию, фибромиалгию, гломерулонефрит.Базедову болезнь, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), IgA нефропатию, инсулинзависимый сахарный диабет (тип I), красный плоский лишай, волчанку, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, миастению, миокардит, пузырчатку обыкновенную, злокачественную анемию, нодозный полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз, псориаз, феномен Рейно, синдром Рейтера, острый ревматизм, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, синдром негнущегося человека, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, синдром Вегенера, васкулит и витилиго. В целом является важным анализ потенциального или актуального клеточного иммунитета у субъектов, страдающих или имеющих подозрение на наличие или подверженных аутоиммунному заболеванию.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген для применения в иммуногенных композициях, описанных здесь, может представлять собой антиген, который связан с воспалительным заболеванием или состоянием. Примеры связанных с воспалительными заболеваниями состояний, при которых могут применяться антигены, включают (без ограничения) акне, ангину, артрит, аспирационную пневмонию, эмпиему, гастроэнтерит, некротический энтероколит, воспаление тазовых органов, фарингит, плеврит, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию и хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может быть интактным (то есть полным или цельным) антигеном или функциональной частью антигена, которая включает более чем один эпитоп. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой пептидную функциональную часть антигена. "Интактный" в данном контексте означает, что антиген представляет собой полноразмерный антиген, в том виде, в котором данный антигенный полипептид встречается в природе. Это является прямой противоположностью доставке только малой части или пептида антигена. Доставка интактного антигена в клетку обеспечивает или включает индуцирование иммунного ответа на полный спектр эпитопов интактного антигена, а не только на отдельные или несколько выбранных пептидных эпитопов. Соответственно, описанные здесь способы и иммуногенные композиции охватывают интактные антигены, связанные с полимером, для большей чувствительности и специфичности иммунного ответа по сравнению с применением отдельного эпитопного антигена на основе пептида.

Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления изобретения интактный антиген может быть разделен на несколько частей в зависимости от размера исходного антигена. Как правило, если цельный антиген представляет собой мультимерный полипептид, цельный белок может быть разделен на субъединицы и/или домены, при этом каждая отдельная субъединица или домен антигена может быть связан с полимером в соответствии с описанными здесь способами. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления изобретения интактный антиген может быть разделен на функциональные фрагменты или части цельного антигена, например, по меньшей мере, на 2, или, по меньшей мере, на 3, или, по меньшей мере, на 4, или, по меньшей мере, на 5, или, по меньшей мере, на 6, или, по меньшей мере, на 7, или, по меньшей мере, на 8, или, по меньшей мере, на 9, или, по меньшей мере, на 10, или, по меньшей мере, на 11, или, по меньшей мере, на 12, или, по меньшей мере, на 13, или, по меньшей мере, на 15, или, по меньшей мере, на 20, или, по меньшей мере, на 25, или более чем на 25 частей (например, частей или фрагментов) включительно, при этом каждый отдельный функциональный фрагмент антигена может быть связан с полимером в соответствии со способами, как описано здесь.

Фрагментация, или разделение полноразмерного антигенного полипептида, может быть разделением полноразмерного антигенного полипептида на равные части или, альтернативно, в некоторых вариантах осуществления изобретения фрагментация является асимметричной или неравномерной. В качестве неограничивающего примера, в случае, если антиген разделен на два перехлестывающихся фрагмента, антиген может быть разделен на фрагменты приблизительно одинакового (равного) размера или, альтернативно, один фрагмент может быть равен около 45% цельного антигена, а другой фрагмент может быть равен около 65%. В качестве дальнейших неограничивающих примеров цельный антиген может быть разделен на ряд фрагментов различной длины, например, в случае, если антиген разделен на два фрагмента, фрагменты могут быть разделены на около 40% и около 70% или около 45% и около 65% или около 35% и около 75% или около 25% и около 85% цельного антигена включительно. Охватывается любая комбинация перехлестывающихся фрагментов полноразмерного цельного антигена для применения при получении панели перехлестывающихся полипептидов антигена. Исключительно в качестве иллюстрирующего примера, в случае, если антиген разделен на 5 частей, данные части могут быть разделены равным образом (то есть каждый перехлестывающийся фрагмент составляет от 21% до 25% целого полноразмерного антигена) или не равным образом (то есть антиген может быть разделен на следующие пять перехлестывающихся фрагментов; фрагмент 1 составляет около 25%, фрагмент 2 составляет около 5%, фрагмент 3 составляет 35%, фрагмент 4 составляет около 10%, а фрагмент 5 составляет около 25% размера полноразмерного антигена с условием, что каждый фрагмент перехлестывается с, по меньшей мере, одним другим фрагментом).

Как правило, панель частей антигена может в значительной степени покрыть полную длину цельного (или интактного) антигенного полипептида. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция включает полимер со многими различными и/или перехлестывающимися фрагментами того же интактного антигена. Перехлестывающиеся белковые фрагменты антигена могут быть получены намного быстрее и дешевле и с увеличенной стабильностью по сравнению с применением пептидных антигенов самостоятельно. Также, в некоторых вариантах осуществления изобретения предпочтительными являются антигены большего размера, чем простые пептиды, поскольку конформация важна для распознавания эпитопов, при этом антигенные полипептиды или фрагменты большего размера обеспечат преимущество по сравнению с пептидными фрагментами.

Специалист в данной области может разделить цельный антиген на перехлестывающиеся белки антигена для создания панели полипептидов антигена. Исключительно в качестве иллюстративного примера ТВ-специфичный антиген ТВ1 (циановый флуоресцентный белок, также известный как культуральный фильтрат-10 или CFP-10) может быть разделен на, например, по меньшей мере, семнадцать частей для получения панели семнадцати различных полипептидов, каждый из которых включает различный перехлестывающийся фрагмент ТВ-специфичного антигена ТВ1 (CFP). Белок культурального фильтрата (CFP-10) (Genbank AAC83445) представляет собой фрагмент белка М. tuberculosis весом 10 кДа со 100 аминокислотными остатками. Он также известен как гомологичный белок антигена L45 (LHP).

Антиген-мишень для применения в описанных здесь способах и композициях может быть экспрессирован рекомбинантно и может необязательно включать аффинную или эпитопную метку для обеспечения очистки, способы которой хорошо известны из уровня техники. Для получения антигена данного изобретения может быть применен химический синтез олигопептида, свободного или конъюгированного с белками-носителями. Олигопептиды рассматриваются как разновидности полипептида. Антиген может быть экспрессирован в виде продукта слияния с комплементарной аффинной молекулой, например (без ограничения) с Ризавидином или его производным, или функциональным фрагментом. Альтернативно, также возможно приготовить антиген-мишень и затем конъюгировать его с комплементарной аффинной молекулой, например (без ограничения) с Ризавидином или его производным, или функциональным фрагментом.

Полипептиды также могут быть синтезированы в виде разветвленных структур, как описано в патентах США 5229490 и 5390111. Антигенный полипептиды включают, например, синтетические или рекомбинантные В-клеточные и Т-клеточные эпитопы, универсальные Т-клеточные эпитопы и смешанные Т-клеточные эпитопы от одного организма или заболевания и В-клеточные эпитопы от другого.

Антиген может быть получен рекомбинантно или с помощью химического полипептидного синтеза, как и антиген, полученный из природных источников или экстрактов, может быть очищен на основе физических и химических характеристик антигена, например с помощью фракционирования или хроматографии. Данные способы хорошо известны из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может быть растворен в воде, в растворителе, таком как метанол, или буфере. Подходящие буферы включают (без ограничения) фосфатно-солевой буфер без Ca2⁺ и Mg2⁺ (PBS), нормальный солевой раствор (150 мМ NaCl в воде) и трис буфер. Антиген, являющийся нерастворимым в нейтральном буфере, может быть растворен в 10 мМ уксусной кислоте и затем разбавлен до желаемого объема нейтральным буфером, таким как PBS. В случае, если антиген растворим только при кислых значениях рН, в качестве растворителя может быть применен ацетат-PBS при кислых значениях рН после растворения в уксусной кислоте. Глицерин может представлять собой подходящий неводный растворитель для применения в описанных здесь композициях, способах и наборах.

Как правило, при разработке белковой вакцины против патогена, внеклеточный белок или белок, подверженный влиянию окружающей среды на вирусе, часто представляет собой идеального кандидата в качестве антигенного компонента в вакцине. Антитела, продуцируемые против внеклеточного белка, становятся первой линией защиты против патогена при инфицировании. Данные антитела связываются с белком патогена для обеспечения опсонизации антителами и маркировки патогена для расщепления и уничтожения фагоцитом, таким как макрофаг. Опсонизация антителами также может убивать патоген за счет антитело-зависимой клеточной цитотоксичности. Антитела индуцируют высвобождение продуктов лизиса из клеток, таких как моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и природные киллерные клетки.

В одном описанном здесь варианте осуществления изобретения все антигены, предназначенные для применения в композициях, как описано здесь, представляют собой белки дикого типа, поскольку аминокислотные остатки включают последовательности встречающихся в природе вирусов, не измененные селективными условиями роста или молекулярно-биологическими способами.

В одном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция, как описано здесь, может включать антигены, которые представляют собой гликозилированные белки. Другими словами, каждый целевой антиген может представлять собой гликозилированный белок. В одном варианте иммуногенных композиций, как описано здесь, антигены или антиген-слитые полипептиды гликозилированы по O-связи. В другом варианте иммуногенных композиций, как описано здесь, антигены или антиген-слитые полипептиды гликозилированы по N-связи. В другом варианте иммуногенных композиций, как описано здесь, антигены или антиген-слитые полипептиды одновременно гликозилированы по O-связи и гликозилированы по N-связи. В других вариантах осуществления изобретения возможны иные типы гликозилирования, например С-маннозилирование. Гликозилирование белков осуществляется в основном в эукариотных клетках. Гликозилирование по N-связи является важным для фолдинга некоторых эукариотных белков, обеспечивая механизм котрансляционной и посттрансляционной модификации белков, меняющий структуру и функцию мембранных и секретируемых белков. Гликозилирование представляет собой ферментативный процесс, который связывает сахариды для продуцирования гликанов и присоединяет их к белкам и липидам. При гликозилировании по N-связи гликаны присоединяются к амидному азоту аспарагиновой боковой цепи при трансляции белка. Тремя основными сахаридами, образующими гликаны, являются молекулы глюкозы, маннозы и N-ацетилглюкозамина. Консенсус гликозилирования по N-связи представляет собой Asn-Xaa-Ser/Thr, где Хаа может быть любой из известных аминокислот. Гликозилирование по O-связи происходит на более поздней стадии при процессинге белка, вероятно в аппарате Гольджи. При гликозилировании по O-связи N-ацетил-галактозамин, 0-фукоза, 0-глюкоза и/или N-ацетилглюкозамин добавляются к сериновым или треониновым остаткам. Специалист в данной области может использовать программное обеспечение, такое как NetNGlyc 1.0 и NetOGlyc Датского технического университета, для определения участков гликозилирования по N- и O-связи в полипептиде настоящего изобретения. Сервер NetNglyc предсказывает участки гликозилирования по N-связи в белках с применением искусственных нейронных сетей, которые рассматривают контекст последовательности Asn-Xaa-Ser/Thr секвонов. Программное обеспечение NetNGlyc 1.0 и NetOGlyc 3.1 доступно на вебсайте EXPASY. В одном варианте осуществления изобретения гликозилирование по N-связи осуществляется в антигенном полипептиде описанного здесь слитого полипептида.

Пары аффинных молекул

Как описано здесь, в некоторых вариантах осуществления изобретения антиген соединен с полимером через комплементарные аффинные пары. Данное соединение антигена с полимером опосредуется тем, что полимер соединен с первой аффинной молекулой, которая присоединяет вторую (например, комплементарную) аффинную молекулу, которая присоединяется к антигену. Примерная комплементарная аффинная пара представляет собой биотин/биотин-связывающий белок.

Примеры комплементарных аффинных пар включают (без ограничения) биотин-связывающие белки или авидин-подобные белки, которые связываются с биотином. Например, если первая аффинная связывающая молекула представляет собой биотин (который связывается с полимером), комплементарная аффинная молекула может представлять собой биотин-связывающий белок или авидин-подобные белок или его производное, например (без ограничения) авидин, Ризавидин или стрептавидин или их варианты, производные или функциональные части.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первая аффинная связывающая молекула представляет собой биотин, производное биотина или миметик биотина, например (без ограничения) амин-PEG3-биотин (((+)-биотинилирование-3-6,9-триксаундекандиамин) или его производное или функциональную группу. Определенные миметики биотина имеют специфичный пептидный мотив, содержащий последовательность DX_aAX_bPX_c (SEQ ID NO:39) или CDX_aAX_bPX_cCG (SEQ ID NO:40), где Х_а представляет собой R или L, X_b представляет собой S или Т, а Х_с представляет собой Y или W. Данные мотивы могут связывать авидин и нейтравидин, но не стрептавидин. См., например, Gaj et al., 56 Prot. Express. Purif. 54 (2006).

Связывание первой аффинной молекулы с полимером и комплементарной аффинной молекулы с антигеном может представлять собой нековалентное связывание или лежащий в основе химический механизм, например ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляцию, координатное связывание и комплексообразование. Ковалентное связывание обеспечивает очень стабильное связывание и особенно хорошо подходит для вариантов осуществления настоящего изобретения. Ковалентное связывание может быть достигнуто либо прямой конденсацией существующих боковых цепей или за счет включения внешних молекул-мостиков.

Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения антиген может быть нековалентно связан с одной из пар в комплементарной присоединяющей паре. В альтернативных вариантах осуществления изобретения антиген может быть ковалентно связан или слит с одной из пар в комплементарной присоединяющей паре. Способы получения слитых белков хорошо известны из уровня техники и описываются здесь.

В других вариантах осуществления изобретения первая аффинная связывающая молекула связана с полимером нековалентной связью или ковалентной связью. В некоторых вариантах осуществления изобретения применяется сшивающий агент для ковалентного связывания первой аффинной связывающей молекулы с полимером согласно описанному здесь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первая аффинная связывающая молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой нековалентной связью, как известно из уровня техники, включая (без ограничения) электростатическое взаимодействие, водородную связь, гидрофобное взаимодействие (то есть силы Ван-дер-Ваальса), гидрофильные взаимодействия и другие нековалентные взаимодействия. Сюда же относятся и другие взаимодействия с промежуточными группами более высокого порядка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения комплементарная аффинная молекула представляет собой родственный авидину полипептид. В определенных вариантах осуществления изобретения комплементарная аффинная молекула представляет собой Ризавидин, например рекомбинантный Ризавидин. В частности, рекомбинантный Ризавидин представляет собой модифицированный Ризавидин, который может быть экспрессирован в Е. coli с высоким выходом. Обычный выход составляет >30 мг на литр культуры Е. coli. Ризавидин обладает более низкой гомологией последовательности относительно яичного авидина (22,4% идентичность последовательности и 35,0% аналогичность) по сравнению с другими авидин-подобными белками. Применение модифицированного Ризавидина снижает риск индуцирования MAPS связанной с яйцами аллергической реакции у субъекта. Более того, антитело к рекомбинантному модифицированному Ризавидину не обладает заметной перекрестной реактивностью относительно яичного авидина (и наоборот).

Более конкретно, некоторые варианты осуществления изобретения включают модифицированный Ризавидин, подготовленный для рекомбинантной экспрессии в Е. coli. Кодирующая последовательность для гена Ризавидина была оптимизирована с помощью кодонов экспрессии Е. coli, чтобы избежать какого-либо затруднения при экспрессии в Е. coli, связанного с редкими кодонами, присутствующими в исходном гене. Для упрощения конструкта первые 44 остатка полноразмерного Ризавидина были удалены после проведения биоинформационного и структурного анализа, поскольку было установлено, что они являются необязательными для основной структуры и функционирования. Степень правильного фолдинга рекомбинантного белка была увеличена путем добавления сигнальной последовательности секреции Е. coli на N-конец укороченного Ризавидина (45-179) для обеспечения транслокации рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток Е. coli, где функционально важная дисульфидная связь в Ризавидине может формироваться правильным образом. В отличие от известных авидин-подобных белков, которые образуют тетрамеры, модифицированный рекомбинантный Ризавидин образует димер, что также увеличивает экспрессию слитого рекомбинантного Ризавидин-антигена в виде растворимого белка в Е. coli.

Более того, как описано здесь более подробно, для увеличения экспрессии и растворимости слитых антигенов в Е. coli, между Ризавидином и антигенным белком был добавлен участок с гибким линкером. Дополнительно, на основе биоинформационного и структурного анализа были клонированы и экспрессированы различные антигенные конструкты: полноразмерный антиген или важный функциональный домен или химерные белки включали два различных антигена.

Дополнительные аффинные пары, которые могут применяться в описанных здесь способах и композициях, включают антиген-антитело, металл/ион-металл/ион-связывающий белок, липид/липид-связывающий белок, сахарид/сахарид-связывающий белок, аминокислота/пептид/аминокислота- или пептид-связывающий белок, фермент-субстрат или фермент-ингибитор, лиганд-агонист/рецептор или миметик биотина. При применении альтернативных аффинных пар также могут применяться альтернативные средства присоединения соответствующего полимера и антигена, такие как in vitro ферментные реакции, а не только генное слияние. Более конкретно, аффинная пара антиген-антитело обеспечивает очень сильное и специфичное взаимодействие. Антиген может представлять собой любой эпитоп, включая белок, пептид, нуклеиновую кислоту, липид, поли/олигосахарид, ион и так далее. Антитело может представлять собой любой тип иммуноглобулина или АГ-связывающую часть иммуноглобулина, такую как Fab фрагмент. Относительно металл/ион-металл/ион-связывающего белка, примеры включают Ni NTA и меченный гистидином белок или Zn и Zn-связывающий белок. Относительно липид/липид-связывающего белка, примеры включают холестерин и холестерин-связывающий белок. Относительно сахарид/сахарид-связывающего белка, примеры включают мальтозу и связывающий мальтозу белок, манноза/глюкоза/олигосахарид и лектин. Фермент-субстрат/ингибиторы включают субстраты широкого диапазона веществ, включая белок, пептид, аминокислоту, липид, сахар или ионы. Ингибитор может представлять собой аналог настоящего субстрата, который в целом может связываться с энзимами более сильно и даже необратимо. Например, трипсин и соевый ингибитор трипсина. Ингибитор может быть природного происхождения или синтетической молекулой. Относительно других лиганд/агонист-рецепторов, лиганд может быть получен из широкого диапазона веществ, включая белок, пептид, аминокислоту, липид, сахар, ион, агонист и может представлять собой аналог реального лиганда. Примеры включают взаимодействие LPS и TLR4.

Сшивающие реагенты

Для связывания молекул белка с другими молекулами могут применяться многие двухвалентные или поливалентные сшивающие агенты. Например, соответствующие связующие агенты могут включать органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидные эфиры, диизоцианаты, глютаральдегиды, диазобензены и гексаметиленовые диамины. Этот список не является исчерпывающим различные классы связующих агентов, известных из уровня техники, но, скорее, содержит примеры наиболее известных связующих агентов. См. Killen & Lindstrom, 133 J. Immunol. 1335 (1984); Jansen et al., 62 Imm. Rev. 185 (1982); Vitetta et al.

В некоторых вариантах осуществления изобретения охвачены описанные в литературе сшивающие агенты для применения в способах, иммуногенных композициях и наборах как описано здесь. См., например, Ramakrishnan, et al., 44 Cancer Res. 201 (1984) (описано применение MBS (М-малеимидбензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир)); Umemoto et al., патент США 5030719 (описано применение галогенированного производного ацетилгидразида, связанного с антителом олигопептидным линкером). Конкретные линкеры включают: (а) EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорид); (b) SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)-толуол (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (с) SPDP (сукцинимидил-6[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (Pierce Chem. Co., Cat #216510); (d) Сульфо-LC-SPDP (сульфосукцинимидил 6 [3-(2-пиридилдитио)-пропианамид]гексаноат (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); и (f) сульфо-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид: Pierce Chem. Co., Cat. #24510), конъюгированный с EDC.

Описанные выше связи или связывающие агенты содержат компоненты, которые обладают различными атрибутами, что, таким образом, ведет к получению конъюгатов с различными физиохимическими свойствами. Например, сульфо-NHS эфиры алкилкарбоксилатов более стабильны, чем сульфо-NHS эфиры ароматических карбоксилатов. Линкеры, содержащие NHS-эфиры, менее растворимы, чем содержащие сульфо-NHS эфиры. Также, линкер SMPT содержит пространственно затрудненную дисульфидную связь и может образовывать конъюгаты с повышенной стабильностью. Дисульфидные связи в целом менее стабильны, чем другие связи, так как дисульфидная связь может быть расщеплена in vitro, что приводит к меньшей жизнеспособности конъюгата. Сульфо-NHS, в частности, может увеличивать стабильность карбодимидных компонентов. Компоненты связывания (такие как EDC) во время применения при конъюгации с сульфо-NHS образуют эфиры, которые более устойчивы к гидролизу, чем сам по себе карбодимид в реакции связывания.

Примеры сшивающих веществ для применения в описываемых способах и иммуногенных композициях включают (без ограничения) вещества, приведенные в Таблицах 3 и 4.

Таблица 3.
Примерные гомобифункциональные сшивающие линкеры*
Мишени сшивания	Сшивающие реактивные группы, свойства	Примеры продуктов
Амин-амин	NHS эфиры	DSG; DSS; BS3; TSAT (трифункциональный); пары реагентов набора для биоконъюгации
	NHS эфиры, PEG спейсер	BS(PEG)5; BS(PEG)9
	NHS эфиры, расщепляемые тиолом	DSP; DTSSP
	NHS эфиры, расщепляемые различными веществами	DST; BSOCOES; EGS; Сульфо-EGS
	имидоэфиры	DMA; DMP; DMS
	имидоэфиры, расщепляемые тиолом	DTBP
Другие	DFDNB; ТНРР (трифункциональный); набор с активированным альдегидом декстраном
Сульфгидрил-сульфгидрил	Малеимиды	ВМОЕ; ВМВ; ВМН; ТМЕА (трифункциональный)
	Малеимиды, PEG спейсер	BM(PEG)2; BM(PEG)3
	Малеимиды, расщепляемые	BMDB; DTME
	Пиридилдитиол (расщепляемый)	DPDPB
Другие	HBVS (винилсульфон)
Неизбирательно	Арилазиды	BASED (расщепляемый тиолом)
*сшивающие реагенты, которые обладают одним типом реактивной группы на каждом конце. Реагенты классифицированы на основе химических групп, которые они сшивают (левая колонка) и их химической композиции (средняя колонка). Продукты перечислены в порядке увеличения длины внутри каждой клетки.

Таблица 4.
Примерные гетеробифункциональные сшивающие линкеры*
Мишени сшивания	Сшивающие реактивные группы, свойства	Примеры продуктов
Амин-Сульфгидрил	NHS эфир/Малеимид	AMAS; BMPS; GMBS и Сульфо-GMBS; MBS и Сульфо-MBS; SMCC и Сульфо-SMCC; EMCS и Сульфо-EMCS; SMPB и Сульфо-SMPB; SMPH;
	LC-SMCC; Сульфо-KMUS
	NHS эфир/Малеимид, PEG спейсер	SM(PEG)2; SM(PEG)4; SM(PEG)6; SM(PEG)8; SM(PEG)12; SM(PEG)24
	NHS эфир/Пиридилдитиол, расщепляемый	SPDP; LC-SPDP и Сульфо-LC-SPDP; SMPT; Сульфо-LC-SMPT
NHS эфиры/Галоацетил	SIA; SBAP; SIAB; Сульфо-SIAB
Амин-Неизбирательно	NHS эфир/Арилазид	NHS-ASA ANB-NOS Сульфо-HSAB Сульфо-NHS-LC-ASA SANPAH и Сульфо-SANPAH
	NHS эфир/Арилазид, расщепляемый	Сульфо-SFAD; Сульфо-SAND; Сульфо-SAED
	NHS эфир/Диазирин	SDA и Сульфо-SDA; LC-SDA и Сульфо-LC-SDA
NHS эфир/Диазирин, расщепляемый	SDAD и Сульфо-SDAD
Амин-Карбоксил	Карбодиимид	DCC; EDC
Сульфгидрил-Неизбирательно	Пиридилдитиол/Арилазид	APDP
Сульфгидрил-Углевод	Малеимид/Гидразид	BMPH; EMCH; MPBH; KMUH
Пиридилдитиол/Гидразид	BMPH; EMCH; MPBH; KMUH
Углевод-Неизбирательно	Гидразид/Арилазид	ABH
Гидроксил-Сульфгидрил	Изоцианат/Малеимид	PMPI
Амин-ДНК	NHS эфир/Псорален	SPB
*сшивающие реагенты, которые обладают различными реактивными группами на каждом конце. Реагенты классифицированы на основе химических групп, которые они сшивают (левая колонка) и их химической композиции (средняя колонка). Продукты перечислены в порядке увеличения длины внутри каждой клетки.

Костимулирующий фактор

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция, описанная здесь, включает, по меньшей мере, одну костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор связан с полимером. В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор связан с полимерной комплементарной аффинной парой так же, как антиген связан с полимером. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых комплементарная аффинная пара, которая связывает костимулирующий фактор с полимером, представляет собой ту же или иную комплементарную аффинную пару, которая связывает антиген с полимером.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, 2 или, по меньшей мере, 3 или, по меньшей мере, 5 или, по меньшей мере, 10, или, по меньшей мере, 15, или, по меньшей мере, 20, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 100, или более 100 костимулирующих факторов включительно могут быть связаны с полимером, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения данные костимулирующие факторы могут представлять собой один костимулирующий фактор или ряд иных костимулирующих факторов, связанных с полимером.

В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор представляет собой лиганд/агонист Toll-подобных рецепторов, например (без ограничения) TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11 и так далее. В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор представляет собой NOD лиганд/агонист или активатор/агонист инфламмасомы. Без связи с какой-либо теорией, считается, что инфламмасома представляет собой мультибелковый олигомер, состоящий из каспазы 1, PYCARD, NALP и иногда каспазы 5 или каспазы 11 и обеспечивающий созревание воспалительных цитокинов интерлейкина 1-β и интерлейкина 18.

В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор представляет собой цитокин. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин выбран из группы, состоящей из: GM-CSF; IL-1α; IL-1β; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-23; IFN-α; IFN-β; IFN-β; IFN-γ; MIP-1α; MIP-1β; TGF-β; TNFα и TNFβ. В некоторых вариантах осуществления изобретения костимулирующий фактор представляет собой адъювант, который может быть связан с полимером, как было указано выше, или может быть добавлен к MAPS композиции до или одновременно с введением субъекту. Адъюванты описаны далее.

Получение рекомбинантных белков

Рекомбинантные белки могут быть легко экспрессированы и очищены специалистом в данной области или с помощью коммерчески доступных наборов, например системы очистки probond™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные антигены могут быть синтезированы и очищены способами очистки белков с использованием бактериальных систем экспрессии, дрожжевых систем экспрессии, систем экспрессии на основе бакуловирусов/клеток насекомых, систем экспрессии на основе клеток млекопитающих или систем на основе трансгенных растений или животных, как известно специалистам в данной области.

Все описанные здесь белки, полипептиды и слитые полипептиды могут быть синтезированы и очищены белковыми и молекулярными способами, которые хорошо известны специалистам в данной области. Применяют способы молекулярной биологии и системы экспрессии рекомбинантных гетерологичных белков. Например, рекомбинантный белок может быть экспрессирован в клетках бактерий, млекопитающих, насекомых, дрожжей или растений; или в трансгенных растениях или животных.

В одном варианте осуществления изобретения здесь предусмотрен выделенный полинуклеотид, кодирующий описанный здесь слитый полипептид или неслитый пептид. Для конструирования химерной или слитой кодирующей последовательности, кодирующей слитый полипептид, как описано здесь, могут применяться традиционные способы клонирования на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Кодирующая последовательность может быть клонирована в общецелевой кодирующий вектор, такой как pUC19, pBR322, векторы pBLUESCRIPT^® (Stratagene, Inc.) или pCR TOPO^® (Invitrogen). Полученный рекомбинантный вектор, несущий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, как описано здесь, может быть затем применен для дальнейших биологических манипуляций, таких как сайт-направленный мутагенез для создания вариантного слитого полипептида как описано здесь, или может быть субклонирован в векторы экспрессии белка или вирусные векторы для синтеза белка различных системах экспрессии белка с использованием клеток-хозяев, выбранных из группы, состоящей из линий клеток млекопитающих, линий клеток насекомых, клеток дрожжей, бактерий и растений.

Каждый ПЦР праймер должен обладать, по меньшей мере, 15 нуклеотидами, перехлестывающимися с соответствующими матрицами в подлежащем амплификации участке. Применяемая при ПЦР-амплификации полимераза должна обладать высокой точностью, такой как, например, у полимеразы PfuULTRA^® (Stratagene), для снижения ошибок в последовательности в процессе ПЦР-амплификации. Для простоты лигирования нескольких отдельных ПЦР-фрагментов вместе, например при конструировании слитого полипептида с последующей инсерцией в клонирующий вектор, ПЦР-праймеры должны также обладать четкими и уникальными участками расщепления рестриктазой на их примыкающих концах, которые не отжигаются на матрице ДНК при ПЦР-амплификации. Выбор участков расщепления рестриктазой для каждой пары определенных праймеров должен быть осуществлен таким образом, что слитый полипептид, кодирующий ДНК последовательность, находится в рамке и будет кодировать слитый полипептид от начала до конца без кодонов остановки. В то же время выбранные участки расщепления рестриктазой не должны присутствовать в кодирующей ДНК последовательности для слитого полипептида. Кодирующая ДНК последовательность для целевого полипептида может быть лигирована в клонирующий вектор pBR322 или в одно из его производных для амплификации, проверки точности и аутентичности химерной кодирующей последовательности, замен/или специфичного сайт-направленного мутагенеза на определенные аминокислотные мутации и замены в полипептиде.

Альтернативно, кодирующая ДНК последовательность для полипептида может быть ПЦР-клонирована в вектор с помощью, например, способа клонирования ТОРО®, включающего обработанные топоизомеразой (ТА) векторы, такие как pCR^®-TOPO, pCR^®-Blunt II-TOPO, pENTR/D-TOPO® и pENTR/SD/D-TOPO^® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). pENTR/D-TOPO^® и pENTR/SD/D-TOPO^® представляют собой направленные входные векторы ТОРО, которые позволяют осуществлять клонирование ДНК последовательности в направлении 5'→3' в вектор экспрессии GATEWAY®. Направленное клонирование в направлении 5'→3' обеспечивает ненаправленную инсерцию ДНК последовательности в вектор экспрессии белка, так что промотор находится выше стартового кодона 5' ATG слитого полипептида, кодирующего ДНК последовательность, обеспечивая возможность экспрессии белка за счет промотора. Рекомбинантный вектор, несущий кодирующую ДНК последовательность для слитого полипептида, может быть трансфицирован и размножен в обычной клонирующей Е. coli, такой как клетки XL1 Blue, SURE^® (STRATAGENE^®) и TOP-10 (Invitrogen).

Специалист в данной области будет способен клонировать и лигировать кодирующий участок целевого антигена с кодирующим участком комплементарной аффинной молекулы для конструирования химерной кодирующей последовательности для слитого полипептида, включающего антиген или его фрагмент и комплементарную аффинную молекулу или ее производное, с помощью специально подготовленных олигонуклеотидных зондов и способов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые хорошо известны из уровня техники. Специалист в данной области также будет способен клонировать и лигировать химерную кодирующую последовательность для слитого белка в выбранный вектор, например вектор бактериальной экспрессии, вектор экспрессии на основе насекомых или вектор бакуловирусной экспрессии. Кодирующие последовательности антигена и антигенного полипептида или их фрагменты должны быть лигированы в рамке, а химерная кодирующая последовательность должна быть лигирована ниже промотора и между промотором и терминатором транскрипции. Далее рекомбинантный вектор трансфицируется в обычную клонирующую Е. coli, такую как XL1 Blue. Рекомбинантная Е. coli с трансферной векторной ДНК затем отбирается на основе резистентности к антибиотикам для удаления любой Е. coli с нерекомбинантной плазмидной ДНК. Отобранные трансформантные Е. coli инкубиркуют, а ДНК рекомбинантного вектора может быть далее очищена для трансфекции в клетки S. frugiperda.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигены, как описано здесь, могут включать сигнальный пептид для транслокации в периплазматическое пространство бактерий. Данный сигнальный пептид также называют лидерным пептидом на N-конце, который может или не может быть отщеплен после транслокации через мембрану. Один пример сигнального пептида представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO:2) как описано здесь. Другая сигнальная последовательность представляет собой MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA (SEQ ID NO:7). Другие примеры сигнальных пептидов могут быть найдены в SPdb - базе данных сигнальных пептидов на сайте "proline.bic.nus.edu.sg/spdb/".

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых антиген слит с биотин-связывающим белком, сигнальная последовательность может быть расположена на N-конце биотин-связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность отщепляется от биотин-связывающего белка после транслокации в периплазматическое пространство Е. coli.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых антиген слит с комплементарным аффинным белком, сигнальная последовательность может быть расположена на N-конце комплементарного аффинного белка. Например, если антиген слит с авидин-подобным белком, сигнальная последовательность может быть расположена на N-конце комплементарного аффинного белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность отщепляется от комплементарного аффинного белка до того, как комплементарный аффинный белок связывается с первой аффинной молекулой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген и/или комплементарный аффинный белок, как описано здесь, не содержит сигнальную последовательность.

Описанные здесь полипептиды могут быть экспрессированы во множестве экспрессирующих клеток-хозяев, например в бактериях, дрожжах, клетках млекопитающих, клетках насекомых, клетках растений, клетках водорослей, таких как Chlamadomonas, или в бесклеточных системах экспрессии. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота может быть субклонирована из клонирующего вектора в рекомбинантный вектор экспрессии, являющийся подходящим для экспрессии слитого полипептида в клетках бактерий, млекопитающих, насекомых, дрожжей или растений или в бесклеточной системе экспрессии, такой как система экспрессии на основе ретикулоцита кроликов. Некоторые векторы предназначены для переноса кодирующей нуклеиновой кислоты для экспрессии в клетках млекопитающих, клетках насекомых и дрожжей в рамках одной рекомбинантной реакции. Например, некоторые из конечных векторов GATEWAY^® (Invitrogen) предназначены для конструирования бакуловируса, аденовируса, адено-ассоциированного вируса (AAV), ретровируса и лентивирусов, которые обеспечивают гетерологичную экспрессию слитых полипептидов в подходящих клетках-хозяевах при инфицировании соответствующих им клеток-хозяев. Перенос гена в вектор завершается всего за две стадии в соответствии с инструкциями производителя. Существуют векторы экспрессии GATEWAY^® для экспрессии белков в клетках насекомых, клетках млекопитающих и дрожжах. После трансформирования и отбора в Е. coli вектор экспрессии готов для применения для экспрессии в подходящем хозяине.

Примерами других векторов экспрессии и клеток-хозяев являются сильные цитомегаловирусные векторы pcDNA3.1 (Invitrogen) и pCINEO на основе промотора (Promega) для экспрессии в линиях клеток млекопитающих, таких как СНО, COS, HEK-293, Jurkat и MCF-7; неспособные к репликации аденовирусные векторы pADENO-X™, pAd5F35, pLP-ADENO™-X-CMV (CLONTECH^®), pAd/CMV/V5-DEST, вектор pAd-DEST (Invitrogen) для аденовирус-опосредованного переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих; ретровирусные векторы pLNCX2, pLXSN и pLAPSN для применения с системой RETRO-X™ компании Clontech для ретровирус-опосредованного переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ и pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) для лентивирус-опосредованного переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих; связанные с аденовирусами вирусные векторы экспрессии, такие как векторы pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP и pAAV-RC (Stratagene) для связанного с аденовирусами вирус-опосредованного переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих; бакуловирус BACpak6 (Clontech) и pFASTBAC™ HT (Invitrogen) для экспрессии в линиях клеток S. frugiperda 9 (Sf9), Sf11, Tn-368 и BTI-TN-5B4-1 насекомых; pMT/BiP/V5-His (Invitrogen) для экспрессии в клетках S2 Drosophila Schneider. векторы экспрессии Pichia pPICZa, pPICZ, pFLDα и pFLD (Invitrogen) для экспрессии в Р. pastoris и векторы рМЕТα и рМЕТ для экспрессии в Р. methanolica; векторы pYES2/GS и pYDl (Invitrogen) в дрожжах S. cerevisiae.

Описаны недавние достижения в области крупномасштабной экспрессии гетерологичных белков в Chlamydomonas reinhardtii. Griesbeck., 34 Mol. Biotechnol. 213 (2006); Fuhrmann, 94 Methods Mol Med. 191 (2006). Чужеродные гетерологичные кодирующие последовательности инсертируются в геном ядра, хлоропласта и митохондрий путем гомологичной рекомбинации. Вектор экспрессии хлоропласта рб4, несущий наиболее универсальный хлоропласт-селективный маркер аминогликозид аденилтрансферазы (aadA), который обуславливает устойчивость к спектиномицину или стрептомицину, может применяться для экспрессии чужеродного белка в хлоропласте. Для внесения вектора в водоросли может применяться генная пушка. При введении в хлоропласты чужеродная ДНК высвобождается из частиц генной пушки и встраивается в геном хлоропласта путем гомологичной рекомбинации.

Также в изобретение включены комплементарные аффинные молекулы, слитые с антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения слитая конструкция необязательно может включать метки очистки и/или сигнальные пептиды секреции. Данные слитые белки могут быть получены любым стандартным способом. Например, для получения стабильной линии клеток, экспрессирующих слитый белок на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы, ПЦР-амплифицированные антигенные нуклеиновые кислоты могут быть клонированы в рестриктазный участок производного вектора экспрессии млекопитающего. Например, KA, который представляет собой производное pcDNA3 (Invitrogen), содержит ДНК фрагмент, кодирующий гемагглютининовую метку (НА) вируса гриппа. Альтернативно, могут применяться производные векторов, кодирующие другие метки, такие как с-myc или полигистидиновые метки. Слитая экспрессирующая конструкция на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы может быть котрансфицирована маркерной плазмидой в подходящую линию клеток млекопитающего (например, клетки COS, НЕК293Т или NIH 3Т3) с помощью, например, LIPOFECTAMINE™ (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), в соответствии с инструкциями производителя или любыми другими подходящими способами трансфекции, известными из уровня техники. Подходящие маркеры трансфекции включают, например, β-галактозидазу или плазмиды экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) или любую плазмиду, которая не содержит тот же определяемый маркер в качестве слитого белка на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы. Экспрессирующие слитый белок клетки могут быть отсортированы и далее подвергнуты культивированию или помеченный слитый белок на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы может быть очищен. В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы амплифицируется сигнальным пептидом. В альтернативных вариантах осуществления изобретения кДНК, кодирующая слитый белок на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы, может быть амплифицирована без сигнального пептида и субклонирована в вектор (pSecTagHis) с сильным секреторным сигнальным пептидом. В другом примере слитый белок на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы может иметь метку на основе щелочной фосфатазы (АР) или гистидиновую (His) метку для очистки. Для применения в способах данного изобретения охватывается любой способ очистки белка антигена и/или слитого белка на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы, известный специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления изобретения любой из описанных здесь полипептидов получают путем экспрессии из рекомбинантного бакуловирусного вектора. В другом варианте осуществления изобретения любой из описанных здесь полипептидов экспрессируют в клетке насекомых. В другом варианте осуществления изобретения любой из описанных здесь полипептидов выделяют из клеток насекомых. Существует несколько преимуществ экспрессии белков с помощью бакуловируса в клетках насекомых, включая высокие уровни экспрессии, простоту масштабирования, продуцирование белков с посттрансляционными модификациями и упрощенное культивирование клеток. Клетки насекомых не требуют СОз для роста и могут быть быстро приспособлены для крупномасштабной экспрессии в виде суспензионной культуры высокой плотности. Многие пути посттрансляционной модификации в относящихся к млекопитающим системах также применяются в клетках насекомых, обеспечивая получение рекомбинантного белка, который аналогичен нативному белку млекопитающих в плане антигенности, иммуногенности и функциональности.

Бакуловирусы представляют собой ДНК вирусы вида Baculoviridae. Известно, что у данных вирусов узкий ряд хозяев, преимущественно ограниченный видами насекомых Lepidopteran (бабочки и мотыльки). Бакуловирус ядерного полиэдроза (AcNPV) Autographa californica, который стал прототипным бакуловирусом, эффективно реплицируется в подверженных ему инкубируемых клетках насекомых. AcNPV обладает геномом с двухспиральной замкнутой кольцевой ДНК с примерно 130000 спаренными основаниями и хорошо характеризуется в плане круга хозяев, молекулярной биологии и генетики. Векторная система экспрессии бакуловируса (BEVS) представляет собой безопасный и быстрый способ получения большого количества рекомбинантных белков в клетках насекомых и насеккомых. Бакуловирусные системы экспрессии представляют собой мощные и универсальные системы для экспрессии рекомбинантных белков на высоких уровнях в клетках насекомых. При применении бакуловирусной системы экспрессии сообщалось об уровнях экспрессии более 500 мг/л, что делает ее идеальной системой для экспрессии с высоким уровнем. Рекомбинантные бакуловирусы, которые экспрессируют чужеродные гены, конструируются путем гомологичной рекомбинации между бакуловирусной ДНК и химерными плазмидами, содержащими целевую последовательность генов. Рекомбинантные вирусы могут быть определены в силу отличительной морфологии их бляшек и очищены до гомогенности.

Описанные здесь рекомбинантные слитые белки могут быть получены в клетках насекомых, включая (без ограничения) клетки, полученные из видов Lepidopteran S. frugiperda. Другие клетки насекомых, которые могут быть инфицированы бакуловирусом, например видов Bombyx mori, Galleria mellanoma, Trichplusia ni или Lamanthria dispar, также могут применяться в качестве подходящего субстрата для получения описанных здесь рекомбинантных белков. Бакуловирусная экспрессия рекомбинантных белков хорошо известна из уровня техники. См. патенты США 4745051, 4879236, 5179007, 5516657, 5571709, 5759809. Специалистам в данной области будет понятно, что система экспрессии не ограничена бакуловирусной системой экспрессии. Важным является то, что система экспрессии направляет гликозилирование по N-связи экспрессируемых рекомбинантных белков. Описанные здесь рекомбинантные белки также могут быть экспрессированы в других системах экспрессии, таких как энтомопокс-вирусы (поксвирусы насекомых), вирусы цитоплазматического полиэдроза (CPV) и путем трансформации клеток насекомых с помощью рекомбинантного гена или генов, обеспечивающих экспрессию. Большое количество бакуловирусных трансферных векторов и соответствующих подходящим образом модифицированных клеток-хозяев коммерчески доступно, например pAcGP67, pAcSECG2TA, pVL1392, pVL1393, pAcGHLT и рАсАВ4 от BD Biosciences; pBAC-3, pBAC-6, pBACgus-6 и pBACsurf-1 от NOVAGEN^® и pPolh-FLAG и pPolh-MAT от SIGMA ALDRICH^®.

Участок между промотором и терминатором транскрипции может включать множество участков расщепления рестриктазой для осуществления клонирования чужеродной кодирующей последовательности, в этом случае - кодирующей ДНК последовательности для антигенного полипептида, и комплементарную аффинную молекулу. Могут быть включены дополнительные последовательности, например сигнальные пептиды и/или кодирующие метку последовательности, такую как His-метку, МАТ-метку, FLAG-метку, последовательность для распознавания энтерокиназы, сигнала секреции пчелиного мелиттина, бета-галактозидазы, глутатион-s-трансферазовой (GST) метки выше MCS для секреции, идентификации, корректной инсерции, правильного отбора рекомбинантного вируса и/или очистки рекомбинантного белка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок может включать N-терминальную сигнальную последовательность, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность присоединена к N-концу комплементарной аффинной молекулы, как описано здесь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок, как описано здесь, обладает спейсерным пептидом, например спейсером с 14 остатками (GSPGISGGGGGILE) (SEQ ID NO:41), отделяющим антиген от комплементарной аффинной молекулы. Кодирующая последовательность такого короткого спейсера может быть сконструирована путем отжига комплементарной пары праймеров. Специалист в данной области может подготовить и спроектировать олигонуклеотиды, которые будут кодировать выбранный спейсер. Спейсерные пептиды в целом должны иметь неполярные аминокислотные остатки, такие как глицин и пролин.

Могут применяться стандартные известные специалистам в данной области способы для включения мутаций (для создания аминокислотных замен в последовательности антигенного полипептида описанного здесь слитого полипептида, например в антигене в нуклеотидной последовательности, кодирующей описанный здесь слитый полипептид, включая, например, сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез). Предпочтительно, вариантный слитый белок имеет менее 50 аминокислотных замен, менее 40 аминокислотных замен, менее 30 аминокислотных замен, менее 25 аминокислотных замен, менее 20 аминокислотных замен, менее 15 аминокислотных замен, менее 10 аминокислотных замен, менее 5 аминокислотных замен, менее 4 аминокислотных замен, менее 3 аминокислотных замен, менее 2 аминокислотных замен включительно по сравнению с описанными здесь слитыми полипептидами.

Также могут быть реализованы определенные молчащие или нейтральные бессмысленные мутации в ДНК кодирующей последовательности, которые не изменяют кодирующую аминокислотную последовательность или способность обеспечивать трансмембранную доставку. Данные типы мутаций могут применяться для оптимизации использования кодонов или увеличения экспрессии и уровня рекомбинантного белка.

Для слитого полипептида в векторе может применяться определенный сайт-направленный мутагенез кодирующей последовательности для создания определенных мутаций и замен аминокислот. Сайт-направленный мутагенез может быть осуществлен с помощью, например, набора для сайт-направленного мутагенеза QUICKCHANGE^® компании Stratagene в соответствии с инструкциями производителя.

В одном варианте осуществления изобретения здесь описаны векторы экспрессии, включающие кодирующую ДНК последовательность для описанных здесь полипептидов для экспрессии и очистки рекомбинантного полипептида из системы экспрессии белка с помощью клеток-хозяев, выбранных из, например, клеток бактерий, млекопитающих, насекомых, дрожжей или растений. Вектор экспрессии должен обладать необходимыми находящимися на 5' выше и 3' ниже регуляторными элементами, такими как промоторные последовательности, последовательности распознавания рибосом и ТАТА-бокса и 3' UTR AAUAAA последовательностью остановки транскрипции для эффективной генной транскрипции и трансляции в соответствующую клетку-хозяина. Вектор экспрессии предпочтительно представляет собой вектор с промотором транскрипции, выбранным из группы, состоящей из CMV (цитомегаловирусного) промотора, RSV промотора (вирус саркомы Рауса), промотора β-актина, SV40 промотора (симийский вирус 40) и промотора мышечной креатинкиназы, а терминатор транскрипции выбран из группы, состоящей из SV40 поли(А) и ВОН терминатора; более предпочтительно вектор экспрессии с ранним промотором/энхансерной последовательностью цитомегаловируса и лидерной тройной аденовирусной/интронной последовательностью и содержащий последовательность точки начала репликации и поли(А) SV40. Вектор экспрессии может обладать дополнительными кодирующими участками, кодирующими, например, 6Х-гистидин, V5, тиоредоксин, глютатион-S-трансферазу, с-Myc, VSV-G, HSV, FLAG, связывающий мальтозу пептид, металл-связывающий пептид, НА и сигналы "секреции" (пчелиный милеттин, α-фактор, PHO, Bip), которые могут быть встроены в экспрессируемый слитый полипептид. Кроме того, после данных кодирующих участков могут быть встроены участки ферментативного расщепления для обеспечения их ферментативного удаления, если они не нужны. Данные дополнительные нуклеиновые кислоты могут применяться для определения экспрессии слитого полипептида, для очистки белков с помощью аффинной хроматографии, увеличенной растворимости рекомбинантного белка в цитоплазме и/или для секретирования экспрессированного слитого полипептида из культуральной среды или сферопласта клеток дрожжей. Экспрессия слитого пептида может осуществляться в клетках-хозяевах или может быть индуцирована, например, сульфатом меди, сахарами, такими как галактоза, метанолом, метиламином, тиамином, тетрациклином, инфицированием бакуловирусом и IPTG (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозидом) - стабильным синтетическим аналогом лактозы.

В другом варианте осуществления изобретения вектор экспрессии, включающий описанный здесь полинуклеотид, представляет собой вирусный вектор, такой как векторы адено-ассоциированного вируса (AAV), аденовирусные, ретровирусные и лентивирусные векторы, среди прочих. Рекомбинантные вирусы обеспечивают универсальную системы для исследования генной экспрессии и терапевтического применения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные здесь слитые полипептиды экспрессируются из вирусной инфекции клеток млекопитающих. Вирусные векторы могут быть, например, векторами аденовируса, адено-ассоциированного вируса (AAV), ретровируса и лентивируса. Упрощенная система для получения рекомбинантных аденовирусов представлена Не et al., 95 PNAS 2509 (1998). Целевой ген сначала клонируют в шаттл-вектор, например pAdTrack-CMV. Полученную плазмиду линеаризуют путем расщепления рестриктазой PmeI и затем котрансформируют в Е. coli клетки BJ5183 с аденовирусной плазмидой, например pADEASY-1 аденовирусной векторной системы Stratagene ADEASY™. Рекомбинантные аденовирусные векторы отбирают на основе устойчивости к канамицину и рекомбинантности, подтвержденной рестриктазными анализами. Наконец, линеаризованную рекомбинантную плазмиду трансфицируют в линии упаковывающих аденовирус клеток, например клетки НЕК 293 (E1-трансформированные эмбриональные клетки почки человека) или 911 (E1-трансформированные эмбриональные клетки сетчатки человека). Fallaux, et al. 7 Human Gene Ther. 215 (1996). Рекомбинантные аденовирусы получают в клетках HEK293.

Рекомбинантный лентивирус обладает преимуществом, связанным с доставкой и экспрессией слитый полипептидов в делящихся и неделящихся клетках млекопитающих. Лентивирус на основе ВИЧ-1 способен эффективно трансдуцировать более широкий круг хозяев, чем ретровирусные системы на основе вируса лейкемии Малони (MoMLV). Приготовление рекомбинантного лентивируса может быть осуществлено с применением, например, векторов pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ или pLenti наряду с лентивирусными системами экспрессии VIRAPOWER™ компании Invitrogen, Inc.

Рекомбинантные векторы на основе адено-ассоциированного вируса (rAAV) применимы к широкому кругу клеток-хозяев, включая многие различные линии клеток или ткани человека или не являющихся человеком субъектов. rAAV способны трансдуцировать широкий спектр типов клеток, при этом трансдукция не зависит от активного деления клеток-хозяев. Легко достижимы высокие титры на уровне >10⁸ вирусных частиц/мл в супернатанте и 10¹¹-10¹² вирусных частиц/мл при большей концентрации. Трансген встроен в геном-хозяин, поэтому экспрессия является долговременной и стабильной.

Приготовление AAV векторов в крупном масштабе осуществляется с помощью трехплазмидной со-трансфекции линии упаковывающих клеток: AAV вектора, несущего кодирующую нуклеиновую кислоту, AAV RC вектора, содержащего AAV гены rep и cap, и аденовирусной вспомогательной плазмиды pDF6 на 50×150 мм планшеты с субконфлюентными клетками 293. Клетки собирают спустя три дня после трансфекции, при этом вирусы высвобождают с помощью трех циклов заморозки и оттаивания или разрушения утльтразвуком.

AAV векторы могут быть очищены с помощью двух различных способов в зависимости от серотипа вектора. AAV2 вектор очищают с помощью одноэтапного способа очистки с применением колонки под воздействием гравитации на основе его аффинности к гепарину. Auricchio et. al,, 12 Human Gene Ther. 71 (2001); Summerford & Samulski, 72 J. Virol. 1438 (1998); Summerford & Samulski, 5 Nat. Med. 587 (1999). AAV2/1 и AAV2/5 векторы в настоящее время очищают с помощью трех последовательных CsCl градиентов.

Без связи с какой-либо теорией, считают, что в случае, если белки экспрессируются клеткой, включая бактериальную клетку, данные белки заданно таргетируются в определенную часть клетки или секретируются из клетки. Таким образом, внутриклеточное таргетирование белков или белковый сортинг представляет собой механизм, с помощью которого клетка транспортирует белки в подходящие позиции в клетке или вне ее. Мишенями сортинга могут быть внутренние пространства органеллы, любая из нескольких внутренних мембран, внешняя мембрана клетки или ее внешняя часть через секрецию. Данный процесс доставки осуществляется на основе информации, содержащейся в самом белке. Правильный сортинг критически важна для клетки; ошибки могут вести к заболеваниям.

За некоторым исключением бактерии не включают связанные с мембраной органеллы подобно эукариотам, однако они могут собирать белки в различные типы включений, таких как пузырьки газа и запасаемые гранулы. Кроме того, в зависимости от видов бактерий, бактерии могут обладать одной плазматической мембраной (грамположительные бактерии) или внутренней (плазматической) мембраной и внешней мембраной клеточной стенки с водным пространством между ними, называемым периплазмой (грамотрицательные бактерии). Белки могут быть секретированы в окружающую среду в зависимости от наличия внешней мембраны. Простой механизм в плазматической мембране аналогичен механизму в эукариотах. Кроме того, бактерии могут направлять белки внутрь или сквозь внешнюю мембрану. Системы для секреции белков сквозь внешнюю мембрану бактерии могут быть достаточно сложными; они играют ключевую роль в патогенезе. Данные системы могут быть описаны как секреция I типа, секреция II типа и так далее.

В большинстве грамположительных бактерий определенные белки направляются для экспорта сквозь плазматическую мембрану с последующим ковалентным присоединением к клеточной стенке бактерии. Специализированный энзим, сортаза, отщепляет белок в сайте распознавания характеристик рядом с С-концом белка, таком как мотив LPXTG (SEQ ID NO:42) (где X может представлять собой любую аминокислоту) и затем переносит белок в клеточную стенку. Предполагается, что системный аналог сортазы/LPXTG с мотивом PEP-CTERM (SEQ ID NO:43), называемый экзосортазой/PEP-CTERM, присутствует у большого числа грамотрицательных бактерий.

Белки с подходящими N-терминальными сигналами сортинга синтезируются в цитоплазме и затем участвуют в конкретной транспортировке белка. В течение или вскоре после их транслокации через цитоплазматическую мембрану белок обрабатывается и фолдируется в его активную форму. Затем перенесенный белок сохраняется на периплазматической стороне клетки или высвобождается в окружающую среду. Поскольку сигнальные пептиды, которые сортируют белки для попадания на мембрану, представляют собой ключевые детерминанты специфичности маршрута транспортировки, данные сигнальные пептиды классифицируют в соответствии с маршрутом транспортировки, в рамках которого они направляют белки. Классификация сигнальных пептидов основана на типе сигнальной пептидазы (SPase), которая отвечает за удаление сигнального пептида. Большинство экспортируемых белков экспортируются из цитоплазмы через общий "путь секреции (Sec)". Большинство хорошо известных вирулентных факторов (например, экзотоксины Staphylococcus aureus, защитный антиген Bacillus anthracis, листериолизин О Listeria monocytogenes), которые секретируются грамположительными патогенами, обладают типичным N-терминальным сигнальным пептидом, который приводит их к Sec пути. Белки, которые секретируются через данный путь переносятся через цитоплазматическую мембрану в нескрученном состоянии. Последующая обработка и фолдинг данных белков происходит в среде клеточной стенки на внешней стороне мембраны. Кроме Sec системы, некоторые грамположительные бактерии также содержат Tat-систему, которая способна транслоцировать скрученные белки сквозь мембрану. Патогенные бактерии могут содержать определенные специализированные системы экспорта, которые специфично участвуют в транспортировке лишь некоторых белков. Например, были обнаружены некоторые генные кластеры в микобактериях, которые кодируют белки, которые секретируются в окружающую среду через особые пути (ESAT-6) и являются важными для микобактериального патогенеза. Определенные АВС-транспортеры направляют экспорт и обработку малых антибактериальных пептидов, называемых бактериоцинами. Гены эндолизинов, которые отвечают за развитие бактериального лизиса, часто расположены рядом с генами, которые кодируют холин-подобные белки, что свидетельствует о том, что данные холины отвечают за экспорт эндолизина к стенке клетки. Wooldridge, bact. secreted prots: secretory mechs. & role in pathogen. (Caister Academic Press, 2009) В некоторых вариантах осуществления изобретения применяемая в настоящем изобретении сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность ОтрА, однако для применения в настоящем изобретении включена любая сигнальная последовательность, известная специалистам в данной области, обеспечивающая транспортировку и секрецию противомикробных агентов вне инфекированной бактериофагом клетки.

Сигнальные последовательности, которые направляют секрецию белков из клеток бактерий, хорошо известны из уровня техники, например как описано в международной заявке WO 2005/071088. Например, специалист может применить некоторые неограничивающие примеры сигнального пептида, показанные в Таблице 5, который может быть присоединен к аминному концу или карбоксильному концу противомикробного пептида (Amp) или антимикробного полипептида, экспрессируемого сконструированным противомикробным бактериофагом, например, АМР-сконструированным бактериофагом. Присоединение может быть осуществлено через слитую или химерную композицию с выбранным антигеном или слитым белком на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы, что приводит к секреции из бактерии, инфицированной сконструированным противомикробным бактериофагом, например АМР-сконструированным бактериофагом.

Таблица 5.
Примерные сигнальные пептиды для направления секреции белка или пептидного антигена или слитого белка на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы клетки бактерии
Маршрут секреции	Аминокислотная последовательность сигнального пептида (NH2-CO2)	Ген	Род/Вид
secA1	MKKIMLVITLILVSPIAQQTEAKD (SEQ ID NO:44)	Hly (LLO)	Listeria monocytogenes
	MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGV YADT (SEQ ID NO:45)	Usp45	Lactococcus lactis
MKKRKVLIPLMALSTILVSSTGNL EVIQAEV (SEQ ID NO:46)	Pag (защитный антиген)	Bacillus anthracis
secA2	MNMKKATIAATAGIAVTAFAAPT IASAST (SEQ ID NO:47)	Iap (связанный с инвазией белок р60)	Listeria monocytogenes
	MQKTRKERILEALQEEKKNKKSK KFKTGATIAGVTAIATSITVPGIEV IVSADE (SEQ ID NO:48)	NamA Imo2691 (аутолизин)	Listeria monocytogenes
	MKKLKMASCALVAGLMFSGLTP NAFAED (SEQ ID NO:49)	*ВА_0281 (группа NLP/P60)	Bacillus anthracis
MAKKFNYKLPSMVALTLVGSAV TAHQVQAAE (SEQ ID NO:50)	* atl (аутолизин)	Staphylococcus aureus
Tat	MTDKKSENQTEKTETKENKGMT RREMLKLSAVAGTGIAVGATGLG TILNVVDQVDKALT (SEQ ID NO:51)	Imo0367	Listeria monocytogenes
MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNN TFDRRKFIQGAGKIAGLGLGLTIA QSVGAFG (SEQ ID NO:52)	PhoD (щелочная фосфатаза)	Bacillus subtillis

Полипептиды, описанные здесь, например антигены или слитый белок на основе антиген-комплементарной аффинной молекулы, могут быть экспрессированы и очищены с помощью различных известных специалисту в данной области способов, например описанные здесь слитые полипептиды могут быть очищены из любой подходящей системы экспрессии. Слитые полипептиды могут быть очищены до значительной степени чистоты с помощью стандартных способов, включая селективное осаждение с такими веществами как сульфат аммония; колоночную хроматографию, способы на основе иммуноочистки и другие, которые хорошо известны из уровня техники. См., например, Scopes, protein purification: principles & practice (1982); патент США 4673641.

При очистке рекомбинантных белков может применяться ряд процедур. Например, белки с установленными свойствами молекулярной адгезии могут быть обратимо слиты с целевым белком. При наличии подходящего лиганда белок может быть селективно адсорбирован в колонке для очистки и затем высвобожден из колонке в относительно чистой форме. Слитый белок затем удаляют на основе ферментативной активности. Наконец, выбранный белок может быть очищен с помощью аффинных или иммуноаффинных колонок.

После экспрессии белка в клетках-хозяевах, данные клетки могут быть лизированы для высвобождения экспрессированного белка для очистки. Способы лизирования различных клеток-хозяев представлены в "Sample Preparation-Tools for Protein Research" EMD Bioscience и Current Protocols in Protein Sciences (CPPS). Примерный способ очистки представляет собой аффинную хроматографию, такую как металл-ионную аффинную хроматографию с использованием никелевых, кобальтных или цинковых аффинных смол для меченных гистидином слитых полипептидов. Способы очистки меченных гистидином рекомбинантных белков описаны компанией Clontech относительно применения кобальтной смолы TALON^® ее производства и компанией NOVAGEN^® в ее системном руководстве рЕТ, 10-е издание. Другая предпочтительная стратегия очистки представляет собой иммуноафффинную хроматографию, например для аффинной очистки меченных myc слитых полипептидов может применяться конъюгированная смола на основе анти-myc антител. При наличии подходящих последовательностей распознавания протеазы слитые полипептиды могут быть отщеплены от гистидиновой или myc метки, высвобождая слитый полипептид из аффинной смолы, при этом гистидиновые метки и myc метки остаются прикрепленными к аффинной смоле.

Стандартные способы выделения белков для очистки рекомбинантных и встречающихся в природе белков хорошо известны из уровня техники, например фракционирование за счет растворимости, размер-эксклюзионная гель-фильтрация и различные виды колоночной хроматографии.

Фракционирование за счет растворимости: Часто в качестве первого этапа, в частности в случае, если белковая смесь является сложной, первоначальное солевое фракционирование может обеспечить отделение многих нежелательых белков клеток-хозяев (или белков, полученных из культуральной среды клеток) от целевого белка. Предпочтительная соль представляет собой сульфат аммония. Сульфат аммония осаждает белки путем эффективного снижения количества воды в белковой смеси. Белки затем осаждаются на основе их растворимости. Чем больше гидрофобность белка, тем скорее он осядет при низких концентрациях сульфата аммония. Обычный подход включает добавление насыщенного сульфата аммония в белковый раствор, так что полученная концентрация сульфата аммония составляет 20-30%. Данная концентрация обеспечит осаждения наиболее гидрофобных белков. Осаждение затем прекращается (если целевой не является гидрофобным), при этом сульфат аммония добавляют в супернатант до достижения известной концентрации, при которой осуществляется осаждение целевого белка. Преципитат затем растворяют в буфере, при этом избыток соли удаляют путем диализа или диафильтрации, если это необходимо. Другие способы на основе растворимости белков, такие как осаждение в холодном этаноле, хорошо известны специалистам в данной области и могут применяться для фракционирования сложных белковых смесей.

Размер-эксклюзионная фильтрация: Молекулярная масса выбранного белка может быть использован для его выделения из белков большего или меньшего размера с применением ультрафильтрации через мембраны с порами различного размера (например, мембраны AMICON^® или MILLIPORE^®). В качестве первого этапа белковую смесь ультрафильтруют через мембрану размером пор, соответствующим меньшей максимальной молекулярной массе, чем молекулярная масса целевого белка. Ретентат ультрафильтрации затем ультрафильтруют с применением мембраны с размером пор, соответствующим большему максимальной молекулярной массе, чем молекулярная масса целевого белка. Рекомбинантный белок проходит через мембрану в фильтрат. Затем фильтрат может быть подвергнут хроматографии как описано ниже.

Колоночная хроматография: Выбранный белок также может быть отделен от других белков на основе его размера, результирующего поверхностного заряда, гидрофобности и аффинности к лигандам. Кроме того, антитела к рекомбинантным или встречающимся в природе белкам могут быть конъюгированы с колоночными матрицами, при этом белки подвергаются иммуноочистке. Все данные способы хорошо известны из уровня техники. Специалисту в данной области будет понятно, что способы на основе хроматографии могут быть осуществлены в любом масштабе и с применением оборудования многих различных производителей (например, Pharmacia Biotech). Например, антигенный полипептид может быть очищен с помощью аффинной колонки с гептамером РА63. Singh et al., 269, J. Biol. Chem. 29039 (1994).

В некоторых вариантах осуществления изобретения комбинация этапов очистки, включающая, например: (а) ионообменную хроматографию, (b) гидроксиапатитную хроматографию, (с) хроматографию гидрофобного взаимодействия и (d) размер-эксклюзионную хроматографию может применяться для очистки описанных здесь слитых полипептидов.

Описываемым изобретением также охватываются бесклеточные системы экспрессии. Бесклеточные системы экспрессии обеспечивают ряд преимуществ по сравнению с традиционными способами экспрессии на основе клеток, включая простоту модифицирования условий реакции для увеличения степени фолдинга белка, сниженную чувствительность к токсичности продуктов и адаптированность к стратегиям с высоким выходом, таким как быстрый скрининг экспрессии и получение белков в большом количестве благодаря сниженным объемам реакции и времени обработки. В бесклеточных системах экспрессии могут применяться плазмидная или линейная ДНК. Более того, улучшения в плане эффективности трансляции приводят к уровням выхода более одного миллиграмма белка на миллилитр реакционной смеси. Коммерчески доступные бесклеточные системы экспрессии включают ТНТ-сопряженные ретикулоцит-лизатные системы (Promega), в которой применяется in vitro система на основе ретикулоцитов кроликов.

Составление иммунной композиции и способы ее применения

Определенные варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают применение иммуногенных композиций, согласно описанному здесь, для индуцирования иммунного ответа у животного. Более конкретно, данные композиции индуцируют гуморальный и клеточный иммунитет, и во многих случаях мукозный иммунитет. Варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают, по меньшей мере, частичную защиту или частичное улучшение после инфицирования, в частности, пневмококками. Пневмококки вызывают ряд заболеваний, таких как менингит, пневмонию, бактериемию и отиты. Каждый год от пневмококковых заболеваний в мире умирает почти один миллион детей. S. pneumoniae интенсивно изучались, при этом, по меньшей мере, некоторые геномы были секвенированы. См., например, патент США 7141418. Несмотря на то, что антитела к капсульным полисахаридам, которые определяют известные серотипы, обеспечивают защиту на основе серотипа, были описаны иные защитные механизмы иммунитета. См. Malley et al., 88 J. Mol. Med, 135 (2010). Данные иные защитные механизмы включают (без ограничения) антитела к некапсульным антигенам и ответы Т-клеток на пневмококковые конституэнты. Применение вакцины PCV7 на основе конъюгата белок-полисахарид значительно снизило количество заболеваний. Black et al., 24(S2) Vaccine 79 (2006); Hansen et al., 25 Pediatr. Infect. Dis. J. 779 (2006)). В то же время исследования показали, что отсутствие других серотипов в PCV7 привел к увеличивающейся замене пневмококковых серотипов. Pichichero & Casey, 26(S10) Pediatr. Infect. Dis. J. S12 (2007).

Было установлено, что определенные пневмококковые антигены, присущие всем серотипам данного вида, обладают иммунозащитным потенциалом несмотря на инкапсулирование, например поверхностные белки PspA, PspC, PsaA и цитотоксин пневмолизин или мутант пневмолизина (Basset et al., 75 Infect. Immun. 5460 (2007); Briles et al., 18 Vaccine 1707 (2000)); применение геномных или мутационных библиотек позволило установить несколько дюжин дополнительных присущих данному виду белков (Hava & Camilli, 45 Mol. Microbiol. 1389 (2002); Wizemann et al., 60 Infect. Immun. 1593 (2001)). Иммунность индуцировали с помощью отдельных антигенов в моделях на животных (Alexander et al., 62 Infect. Immun. 5683 (1994); Balachandran et al., 70 Infect. Immun. 2526 (2002); Chung et al., 170 J. Immunol. 1958 (2003); Glover et al., 76 Infect. Immun. 2767 (2008); Wu et al., 175 J. Infect. Dis. 839 (1997)), однако к настоящему времени ни одна вакцина на основе общего антигена не была разрешена для применения на людях.

В одном варианте осуществления изобретения здесь предусмотрен способ вакцинирования млекопитающего, включающий введение иммуногенной композиции, включающей, по меньшей мере, один или несколько антигенов, присоединенных к, по меньшей мере, одному типу полимерного каркаса, например полисахариду или углеводному полимеру, для применения для индуцирования иммунного ответа на один или несколько антигенов, присоединенных к полимеру при введении субъекту. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ представляет собой гуморальный и/или клеточный иммунный ответ.

Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к способам индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающим введение субъекту иммуногенной композиции, включающей, по меньшей мере, один тип полимера, например полисахарид, по меньшей мере, один антиген и, по меньшей мере, одну пару комплементарных аффинных молекул, включающую (i) первую аффинную молекулу, которая связана с полимером, например полисахаридом, и (ii) комплементарную аффинную молекулу, которая связана с антигеном, для присоединения антигена к полимеру, например полисахариду (например, первая аффинная молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой для связывания антигена с полимером, например полисахаридом).

Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к способам индуцирования гуморального и/или клеточного иммунитета в отношении множества антигенов одновременно, например, если иммуногенная композиция, вводимая субъекту, включает полимер, включающий, по меньшей мере, 1 или, по меньшей мере, 2 или более, например, множества одинаковых или различных антигенов.

Один аспект настоящего изобретения относится к способу иммунизирования или вакцинирования субъекта, например птицы или млекопитающего, например человека, против патогена, включающему введение иммунной композиции как описано здесь, включающей, по меньшей мере, один антиген, полученный из одного или нескольких патогенов. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект может быть иммунизирован против, по меньшей мере, 1, или, по меньшей мере, 2, или, по меньшей мере, 3, или, по меньшей мере, 5, или, по меньшей мере, 10, или, по меньшей мере, 15, или, по меньшей мере, 20, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 100, или более 100 различных антигенов одновременно, при этом полимер иммуногенной композиции соответствует различным присоединенным антигенам.

В некоторых вариантах осуществления изобретения субъекту могут быть введены несколько различных иммуногенных композиций, как описано здесь, например субъекту может быть введена композиция, включающая полимер с антигеном или множеством антигенов, например антигены А, В, С и D и так далее, и также введена композиция, включающая полимер, включающий иной антиген или иной набор антигенов, например антигены W, X, Y и Z и так далее. Альтернативно, субъекту может быть введена композиция, включающая полимер А с антигеном или множеством антигенов, например с антигенами А, В, С и D и так далее, а также введена композиция, включающая полимер В, включающий те же антигены, например А, В, С и D и так далее или иной набор антигенов. Предполагается, что настоящее изобретение предусматривает способы иммунизирования субъектов настолько большим количеством антигенов, которое необходимо, например множеством различных иммуногенных комплексов, как описано здесь, для обеспечения иммунизирования 100 или более антигенами.

В одном варианте осуществления изобретения иммуногенные композиции, как описано здесь, включают фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения описанная здесь иммуногенная композиция составлена для введения птице, млекопитающему или человеку или в вакцину. Подходящие составы могут быть найдены, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (2006) или Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms (4-ое изд., Lea & Febiger, Philadelphia, 1985). В одном варианте осуществления изобретения иммуногенные композиции, как описано здесь, включают фармацевтически приемлемые носители, которые по своему существу являются нетоксичными и нетерапевтическими. Примеры данных носителей включают ионообменники, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как альбумин сыворотки человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, дизамещенный фосфат натрия, дизамещенный фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный кремнезем, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы и полиэтиленгликоль. Для всех типов введения применяются традиционные формы замедленного всасывания. Данные формы включают, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные формы, назальные спреи, подъязычные таблетки и препараты с замедленным высвобождением. См. примеры композиций с замедленным высвобождением в патентах США 3773919, 3887699, ЕР 58481 А, ЕР 158277А, патенте Канады 1176565; Sidman et al., 22 Biopolymers 547 (1983); Langer et al., 12 Chem. Tech. 98 (1982). Белки обычно присутствуют в концентрации от около 0,1 мг/мл до 100 мг/мл в расчете на одно применение у одного пациента.

В одном варианте осуществления изобретения в составы вакцины могут быть добавлены дополнительные ингредиенты, включая антиоксиданты, например аскорбиновая кислота; полипептиды с малым молекулярной массой (менее около десяти остатков), например полиаргинин или трипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелирующие агенты, такие как EDTA; и сахарные спирты, такие как маннитол или сорбитол.

В некоторых вариантах осуществления изобретения настоящие иммуногенные MAPS композиции вводят с, по меньшей мере, одним адъювантом. Адъюванты представляют собой гетерогенную группу веществ, которые усиливают иммунологический ответ на антиген, которые вводится одновременно. В некоторых случаях адъюванты усиливают иммунный ответ, так что необходимо меньшее количество вакцины. Адъюванты служат для приведения антигена - вещества, которое стимулирует определенный протективный иммунный ответ - в контакт с иммунной системой и влияют на тип индуцируемого иммунитета, а также на качество иммунного ответа (силу реакции или продолжительность). Адъюванты также могут снижать токсичность определенных антигенов и придавать растворимость некоторым компонентам вакцины. Практически все адъюванты, применяемые сегодня для усиления иммунного ответа на антигены, представляют собой частицы или образуют частицы с антигеном. В книге vaccine design - subunit & adjuvant approach (Powell & Newman, Eds., Plenum Press, 1995) описаны многие известные адъюванты в плане их иммунологической активности и химических характеристик. Адъюванты, которые не образуют частиц, представляют собой группу веществ, которые действуют в качестве иммунологических сигнальных веществ и при нормальных условиях состоят из веществ, которые образованы иммунной системой в качестве последствия иммунологической активации после введения систем на основе адъювантов в форме частиц.

Адъюванты для иммуногенных композиций и вакцин хорошо известны из уровня техники. Примеры включают (без ограничения) моноглицериды и жирные кислоты (например, смесь моноолеина, олеиновой кислоты и соевой кислоты), минеральные соли, например, гидроксид алюминия и фосфатные гели на основе алюминия или кальция; масляные эмульсии и составы на основе поверхностно-активных веществ, например MF59 (микрофлюидизированная детергентная стабилизированная эмульсия типа масло в воде), QS21 (очищенный сапонин), AS02 [SBAS2] (эмульсия типа масло в воде+MPL+QS-21), MPL-SE, монтанид ISA-51 and ISA-720 (стабилизированная эмульсия типа масло в воде); адъюванты из макрочастиц, такие как виросомы (неламеллярные липосомальные носители, включающие гемагглутинин инфлюэнцы), AS04 [SBAS4] (соль Al с MPL), ISCOMS (структурированный комплекс сапонинов и липидов), сополимер лактида с гликолидом (PLG), соединения микробиального происхождения (природные и синтетические), включая монофосфориллипид А (MPL), Detox (MPL+скелет клеточных стенок M. Phlei), AGP [RC-529] (синтетический ацилированный моносахарид), DC_Chol (липоидные иммуностимуляторы, способные самоорганизовываться в липосомы), ОМ-174 (производное липида A), CpG мотивы (синтетические олигонуклеотиды, содержащие иммуностимулирующие CpG мотивы) или иные ДНК структуры, модифицированные LT и СТ (генетически модифицированные бактериальные токсины для обеспечения нетоксичных адъювантных свойств), эндогенные иммуномодуляторы человека, например hGM-CSF или hIL-12 (цитокины, которые могут быть введены в виде кодированного белка или плазмиды), Иммудаптин (C3d тандемный биочип), MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, бета-алетин, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, квасцы и MF59 и инертные носители, такие как частицы золота. Дополнительные адъюванты известны из уровня техники, см., например, патент США 6890540, патентную публикацию США 2005/0244420; PCT/SE97/01003.

В некоторых вариантах осуществления изобретения адъювант представляет собой частицы и может обладать характеристикой, связанной с медленным разложением микроорганизмами. Следует убедиться, что адъювант не образует токсичных метаболитов. Предпочтительно, в некоторых вариантах осуществления изобретения данные адъюванты могут представлять собой матрицы с веществами, в основном полученными из организма. Они включают полимеры на основе молочной кислоты, полиаминовые кислоты (белки), углеводы, липиды и биосовместимые полимеры с низкой токсичностью. Также могут применяться комбинации данных групп веществ, полученных из организма, или комбинации частиц, полученных из организма, и биосовместимых полимеров. Липиды представляют собой предпочтительные вещества, поскольку они включают структуры, которые обеспечивают возможность их разложения микроорганизмами, а также представляют собой критически важный элемент во всех биологических мембранах.

В одном варианте осуществления изобретения иммуногенные композиции для введения, как описано здесь, должны быть стерильными для введения субъекту. Стерильность легко достигается с помощью фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны (например, мембраны 0,2 микрон) или с помощью гамма-облучения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные здесь иммуногенные композиции также включают фармацевтические вспомогательные вещества, включая (без ограничения) биосовместимые масла, физиологичные солевые растворы, консерванты, углеводы, белки, аминокислоты, контролирующие осмотическое давление агенты, несущие газы, контролирующие рН агенты, органические растворители, гидрофобные агенты, ферментные ингибиторы, адсорбирующие воду полимеры, поверхностно-активные вещества, промоторы адсорбции и противоокислительные агенты. Характерные примеры углеводов включают растворимые сахара, такие как гидропропилцеллюлозу, карбоксипропилцеллюлозу, натрийкарбоксилцеллюлозу, гиалуроновую кислоту, хитозан, альгинат, глюкозу, ксилозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, декстран, хондроитинсульфат и так далее. Характерные примеры белков включают альбумин, желатин и так далее. Характерные примеры аминокислот включают глицин, аланин, глутаминовую кислоту, аргинин, лизин и их соли. Данные фармацевтические вспомогательные вещества хорошо известны из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная MAPS композиция вводится в комбинации с другими терапевтическими ингредиентами, включая, например, γ-интерферон, цитокины, химиотерапевтические агенты или противовоспалительные или противовирусные агенты. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция, как описано здесь, может быть введена с одной или несколькими костимулирующими молекулами и/или адъювантами как описано здесь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция вводится в чистой или в значительной степени чистой форме, однако может быть введена в виде фармацевтической композиции, состава или препарата. Данный состав включает описанную здесь MAPS наряду с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно другими терапевтическими ингредиентами. Другие терапевтические ингредиенты включают соединения, которые увеличивают презентацию антигенов, например γ-интерферон, цитокины, химиотерапевтические агенты или противовоспалительные агенты. Составы могут находиться в форме единичной дозы и могут быть приготовлены способами, хорошо известными в области фармацевтики. Например Plotkin and Mortimer, in vaccines (2-е изд, W.B. Saunders Co., 1994) описывают вакцинирование животных или людей для индуцирования иммунного ответа, специфичного к определенным патогенам, а также способы приготовления антигена, определения подходящей дозы антигена и анализ индуцирования иммунного ответа.

Составы, подходящие для внутривенного, внутримышечного, интраназального, орального, подъязычного, вагинального, ректального, подкожного или интраперитонеального введения обычно включают стерильные водные растворы активного ингредиента с растворами, являющимися предпочтительно изотоническими относительно крови реципиента. Данные растворы могут быть приготовлены удобным образом путем растворения твердого активного ингредиента в воде, содержащей физиологически совместимые вещества, такие как хлорид натрия (например, 0,1 М-2,0 М), глицин и им подобные, с отрегулированным рН, совместимым с физиологическими условиями для получения водного раствора при сохранении стерильности раствора. Данные вещества могут находиться в одноразовых или содержащих множество доз контейнерах, например запечатанных ампулах или флаконах.

В качестве фармацевтически приемлемых носителей также могут применяться липосомальные суспензии. Они могут быть приготовлены в соответствии с известными для специалиста в данной области способами, например как описано в патенте США 4522811.

Составы интраназального введения описаны патентах США 5427782, 5843451, 6398774. Составы иммуногенных композиций могут включать стабилизатор. Примерные стабилизаторы представляют собой полиэтиленгликоль, белки, сахарид, аминокислоты, неорганические кислоты и органические кислоты, которые могут применяться самостоятельно или в составе смесей. Два или более стабилизатора могут применяться в водных растворах при подходящей концентрации и/или рН. Определенное осмотическое давление в данном водном растворе в целом находится в диапазоне 0,1-3,0 осмосов, предпочтительно в диапазоне 0,80-1,2. рН водного раствора поддерживается в диапазоне 5,0-9,0, предпочтительно в диапазоне 6-8.

Если требуется получить оральные препараты, иммуногенные композиции могут быть соединены с обычными носителями, такими как лактоза, сахароза, крахмал, тальк, стеарат магния, кристаллическая целлюлоза, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, глицерин, альгинат натрия или гуммиарабик, среди прочих. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенные композиции, описанные здесь, могут быть введены внутривенно, интраназально, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально, подкожно, вагинально, ректально или орально. В некоторых вариантах осуществления изобретения тип введения является оральным, интраназальным, подкожным или внутримышечным. В некоторых вариантах осуществления изобретения маршрут введения представляет собой интраназальное введение.

Вакцинирование может быть осуществлено с помощью традиционных способов. Например, иммуногенные композиции могут применяться в подходящем растворителе, таком как солевой раствор или вода или полные или неполные адъюванты. Имунногенная композиция может быть введена любым путем, подходящим для индуцирования иммунного ответа. Иммуногенная композиция может быть введена однократно или с периодическими интервалами вплоть до индуцирования иммунного ответа. Иммунные ответы могут быть обнаружены с помощью различных известных специалистам в данной области способов, включая (без ограничения) продуцирование антител, анализ цитотоксичности, анализ пролиферации и анализ высвобождения цитокинов. Например, от иммунизованного млекопитающего могут быть получены образцы крови и проанализированы на присутствие антител к антигенам иммуногенной композиции с помощью ELISA (см. de Boer et. al., 115 Arch Virol. 147 (1990)), а титр данных антител может быть определен способами, известными из уровня техники.

Точная дозировка для применения в составе также будет зависеть от типа введения и должна быть установлена в соответствии с решением лечащего врача и обстоятельствами каждого пациента. Например, ежемесячно может вводиться 25 μg-900 μg белка в течение трех месяцев.

В конечном итоге, лечащий врач установит количество иммуногенной композиции или вакцинной композиции для введения конкретным субъектам. Как и в случае всех иммуногенных композиций или вакцин, иммунологически эффективные количества иммуногенов должны быть определены эмпирически. Рассматриваемые факторы должны включать иммуногенность вне зависимости от образования комплекса или ковалентного присоединения иммуногена к адъюванту или несущему белку или другому носителю, маршрута введения и количества иммунизирующих доз для введения. Данные факторы известны в области вакцин и полностью находятся в сфере компетенции иммунологов, принимающих данные решения без чрезмерного экспериментирования.

В одном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция или вакцинная композиция, как описано здесь, при введении мышам может индуцировать иммунный ответ, который купирует симптом заболевания у, по меньшей мере, 20% животных, которым введены 5 LD₅₀ иммуногенной композиции, включающей антигены заболевания, симптом которого купирован. Специалисту в данной области известны способы вакцинирования и анализа на иммунизированных животных. Например, 10 μg, аликвота иммуногенной композиции или вакцинной композиции, как описано здесь, может быть приготовлена в 100 мкл PBS и/или с добавлением неполного адъюванта Фрейнда и инъецирована внутримышечно одной мыши в рамках одной вакцинации. Альтернативно, могут применяться парентеральные, интраперитонеальные инъекции и инъекции в подушечки лап. Объемы инъекций в подушечки лап снижены до 50 мкл. Мыши могут быть иммунизированы иммуногенной композицией или вакцинной композицией, как описано здесь, три отдельных раза через несколько дней, например с интервалом 14 дней.

Эффективность вакцинирования может быть проанализирована путем испытания с применением патогена. Спустя семь дней после последнего введения иммуногенной композиции иммунизированные мыши подвергаются интраназальному воздействию патогенного организма, от которого был получен антиген. Подвергнутые анестезии простым эфиром мыши (весом от 10 г до 12 г) могут быть инфицированы интраназально 50 мкл разбавленной PBS аллантоидной жидкостью, содержащей 5 LD₅₀ патогенного организма. Степень защиты может быть измерена путем мониторинга выживаемости животных и веса тела, анализируемых в 21-дневный период оценки. Тяжело пораженные мыши умерщвляются. Одна единица LD₅₀ A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 равна 100-1000 50% инфекционной дозе в тканевой культуре (ТКИД50).

В других вариантах осуществления изобретения иммунизированные мыши могут быть подвергнуты воздействию ряда различных патогенных организмов, например различных патогенных организмов, из которых получен каждый из присоединенных к полимеру антигенов. Например, иммуногенная композиция включает пять различных антигенов, присоединенных к полимеру, например, полисахариду, при этом каждый антиген получен из пяти различных патогенных организмов, иммунизированные мыши могут быть подвергнуты воздействию каждого из пяти различных патогенных организмов, либо последовательно (в любом порядке) или одновременно. Специалист в данной области будет способен определить LD₅₀ для каждого патогенного организма, применяемого для испытания иммунизированных мышей, известными из уровня техники способами. См., например, LaBarre & Lowy, 96 J. Virol. Meths. 107 (2001); Golub, 59 J. Immunol. 7 (1948).

Наборы

Настоящее изобретение также предусматривает наборы для получения иммуногенной композиции, как описано здесь, для исследования адаптации иммуногенной композиции с предпочтительными антигенами, например, в научных целях - для анализа эффективности антигена или комбинации антигенов, вызывающих иммунный ответ. Данные наборы могут быть составлены из легкодоступных материалов и реагентов. Например, такие наборы могут включать любой один или несколько из следующих материалов: контейнер, содержащий полимер, например полисахарид, сшитый со множеством первых аффинных молекул, и контейнер, включающий комплементарную аффинную молекулу, которая связывается с первой аффинной молекулой, при этом комплементарная аффинная молекула связывается с антигеном.

В другом варианте осуществления изобретения набор может включать контейнер, включающий полимер, например полисахарид; контейнер, включающий множество первых аффинных молекул, и контейнер, включающий сшивающий реагент для сшивания первых аффинных молекул с полимером.

В некоторых вариантах осуществления изобретения набор также включает средства для присоединения комплементарной аффинной молекулы к антигену, при этом эти средства могут быть сшивающим реагентом или неким промежуточным слитым белком. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор может включать, по меньшей мере, один костимулирующий фактор, который может быть добавлен к полимеру. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает сшивающий реагент, например (без ограничения) CDAP(тетрафторборат 1-циан-4-диметиламинопиридиния), ЕОС(1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорид), цианборгидрид натрия; бромциан; бикарбонат аммония/иодуксусную кислоту для связывания кофактора с полимером.

Может быть подготовлен широкий спектр наборов и компонентов для применения в описанных здесь способах в зависимости от целевого применения набора, конкретного антигена и потребностей пользователя.

Изобретение может быть также описано любым из вариантов осуществления в следующих пронумерованных пунктах.

1. Растворимый биотин-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:1) и любые его функциональные производные.

2. Биотин-связывающие белок по пункту 1, причем биотин-связывающий белок получают в растворимой форме на уровне, по меньшей мере, 10 мг/л культуральной среды в Е. coli.

3. Биотин-связывающий белок по любому из пунктов 1-2, причем биотин-связывающий белок представляет собой димер.

4. Биотин-связывающий белок по любому из пунктов 1-3, в котором биотин-связывающий белок включает бактериальную сигнальную последовательность на N-конце.

5. Биотин-связывающий белок по пункту 4, в котором бактериальная сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID No:2).

6. Биотин-связывающий белок по любому из пунктов 4 или 5, в котором сигнальная последовательность связана с биотин-связывающим белком пептидным линкером.

7. Биотин-связывающий белок по пункту 6, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность AQDP (SEQ ID NO:8) или VSDP (SEQ ID NO:9).

8. Биотин-связывающий белок по любому из пунктов 1-7, причем биотин-связывающий белок включает метку очистки на С-конце.

9. Биотин-связывающий белок по пункту 8, в котором метка очистки выбрана из группы, состоящей из гистидиновой метки, с-my метки, Halo метки, Flag метки и любой их комбинации.

10. Биотин-связывающий белок по пункту 9, в котором гистидиновая метка включает аминокислотную последовательность НННННН (SEQ ID NO:10).

11. Биотин-связывающий белок по любому из пунктов 8-10, в котором метка очистки связана с биотин-связывающим белком через пептидный линкер,

12. Биотин-связывающий белок по пункту 11, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность VDKLAAALE (SEQ ID NO:11) или GGGGSSSVDKLAAALE (SEQ ID NO:12).

13. Биотин-связывающий белок по любому из пунктов 1-12, причем биотин-связывающий белок включает аминокислотную последовательность MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:15).

14. Композиция, включающая биотин-связывающий белок по любому из пунктов 1-13.

15. Слитый белок, включающий биотин-связывающий белок и белок или пептид.

16. Слитый белок по пункту 15, в котором белок или пептид слит с биотин-связывающим белком с помощью пептидного линкера.

17. Слитый белок по пункту 15, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность GGGGSSS (SEQ ID NO:22).

18. Слитый белок по любому из пунктов 15-17, в котором белок или пептид представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из: пневмококковых антигенов, туберкулезных антигенов, антигенов сибирской язвы, антигенов ВИЧ, антигенов сезонного или эпидемического гриппа, антигенов инфлюэнцы, антигенов коклюша, антигенов Staphylococcus aureus, менингококковых антигенов, Haemophilus антигенов, антигенов папилломавируса человека или их комбинаций.

19. Слитый белок по любому из пунктов 15-18, причем антиген представляет собой негемолитический вариант альфа-гемолизина S. aureus.

20. Слитый белок по пункту 19, в котором негемолитический вариант альфа-гемолизина S. aureus содержит мутацию в аминокислотном остатке 205, 213 или 209-211 альфа-гемолизина S. aureus дикого типа.

21. Слитый белок по пункту 19, в котором негемолитический вариант альфа-гемолизина S. aureus содержит одну из следующих мутаций в альфа-гемолизине S. aureus дикого типа: (i) остаток 205 W на A; (ii) остаток 213 W на А; или (iii) остатки 209-211DRD на ААА.

22. Слитый белок по пункту 19, в котором негемолитический вариант альфа-гемолизина S. aureus включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) W205A

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNAGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO:23);

(ii) W213A

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSANPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO:24);

(iii) DRD209-211AAA

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO:25); и

его функциональных вариантов, частей и производных.

23. Слитый белок по любому из пунктов 15-22, причем слитый белок включает бактериальную сигнальную последовательность на N-конце.

24. Слитый белок по пункту 23, в котором бактериальная сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID No:2).

25. Слитый белок по любому из пунктов 23 или 24, в котором сигнальная последовательность связана с биотин-связывающим белком пептидным линкером.

26. Слитый белок по пункту 25, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность AQDP (SEQ ID NO:8) или VSDP (SEQ ID NO:9).

27. Слитый белок по любому из пунктов 15-26, причем что слитый белок включает метку очистки на С-конце.

28. Слитый белок по пункту 27, в котором метка очистки выбрана из группы, состоящей из гистидиновой метки, с-ту метки. Halo метки. Flag метки и любой их комбинации.

29. Слитый белок по пункту 27, в котором гистидиновая метка включает аминокислотную последовательность НННННН (SEQ ID NO:10).

30. Слитый белок по любому из пунктов 27-29, в котором метка очистки связана с биотин-связывающим белком через пептидный линкер.

31. Слитый белок по пункту 30, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность VDKLAAALE (SEQ ID NO:11).

32. Слитый белок по любому из пунктов 15-31, в котором биотин-связывающий белок представляет собой биотин-связывающий белок по любому из пунктов 1-13.

33. Слитый белок по любому из пунктов 15-32, причем слитый белок включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) W205A

MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNAGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:26);

(ii) W213A

MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSANPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:27);

(iii) DRD209-211AA

MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:28).

34. Композиция, включающая слитый белок по любому из пунктов 15-33.

35. Белок мутантного альфа-гемолизина (mHla), включающий мутацию в аминокислотном остатке 205, 213 или 209-211 альфа-гемолизина S. aureus дикого типа, причем мутантный альфа-гемолизин имеет сниженную гемолитическу активность по сравнению с эквивалентным титром альфа-гемолизина (Hla) дикого типа.

36. Мутантный альфа-гемолизин по пункту 35, причем гемолитическая активность мутантного альфа-гемолизина, по меньшей мере, на 25% ниже, чем эквивалентный титр Hla дикого типа.

37. Мутантный альфа-гемолизин по пунктам 35 или 36, причем мутантный альфа-гемолизин включает одну из следующих мутаций в альфа-гемолизине S. aureus дикого типа: (i) остаток 205 W на A; (ii) остаток 213 W на А; или (iii) остатки 209-211 DRD на ААА.

38. Мутантный альфа-гемолизин по любому из пунктов 13-15, причем мутантный альфа-гемолизин включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) W205A

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNAGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO:23);

(ii) W213A

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSANPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO:24);

(iii) DRD209-211AAA

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO:25); и

его функциональных вариантов, частей и производных.

39. Композиция, включающая мутантный альфа-гемолизин по любому из пунктов 35-38.

40. Слитый белок, включающий альфа-гемолизин и биотин-связывающий домен, в котором слитый белок обладает сниженной гемолитической активностью по сравнению с эквивалентным титром альфа-гемолизина (Hla) дикого типа.

41. Слитый белок по пункту 18, в котором альфа-гемолизин представляет собой мутантный гемолизин по любому из пунктов 35-38 или альфа-гемолизин состоит из аминокислотной последовательности аминокислот 27-319 альфа-гемолизина S. aureus дикого типа.

42. Слитый белок по пункту 19, в котором биотин-связывающий домен состоит из аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:1).

43. Слитый белок по любому из пунктов 40-42, в котором биотин-связывающий домен и мутантный альфа-гемолизин связаны через пептидный линкер.

44. Слитый белок по пункту 43, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность GGGGSSS (SEQ ID NO:22).

45. Слитый белок по любому из пунктов 40-44, причем слитый белок включает бактериальную сигнальную последовательность на N-конце.

46. Слитый белок по пункту 45, причем бактериальная сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID No:2).

47. Слитый белок по любому из пунктов 45 или 46, в котором сигнальная последовательность связана с биотин-связывающим белком пептидным линкером.

48. Слитый белок по пункту 47, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность AQDP (SEQ ID NO:8) или VSDP (SEQ ID NO:9).

49. Слитый белок по любому из пунктов 40-48, причем слитый белок включает метку очистки на С-конце.

50. Слитый белок по пункту 49, в котором метка очистки выбрана из группы, состоящей из гистидиновой метки, с-ту метки, Halo метки, Flag метки и любой их комбинации.

51. Слитый белок по пункту 50, в котором гистидиновая метка включает аминокислотную последовательность НННННН (SEQ ID NO:10).

52. Слитый белок по любому из пунктов 49-51, в котором метка очистки связана с биотин-связывающим белком через пептидный линкер.

53. Слитый белок по пункту 52, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность VDKLAAALE (SEQ ID NO:11).

54. Слитый белок по любому из пунктов 40-53, в котором биотин-связывающий домен представляет собой биотин-связывающий белок по любому из пунктов 1-13.

55. Слитый белок по любому из пунктов 40-54, причем слитый белок включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (SEQ ID NO:26), (SEQ ID NO:27) и (SEQ ID NO:28).

56. Слитый белок по любому из пунктов 40-55, причем гемолитическая активность слитого белка, по меньшей мере, на 25% ниже эквивалентного титра Hla дикого типа.

57. Композиция, включающая слитый белок по любому из пунктов 40-56.

58. Способ индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту композиции по пунктам 14, 34, 39 или 57.

59. Способ вакцинирования млекопитающего против, по меньшей мере, одного антиген-несущего патогена, причем способ включает введение композиции по пунктам 14, 34, 39 или 57.

60. Способ по любому из пунктов 58 или 59, в котором субъект представляет собой человека.

61. Способ по любому из пунктов 58 или 59, в котором субъект представляет собой сельскохозяйственное или недомашнее животное.

62. Способ по любому из пунктов 58 или 59, в котором субъект представляет собой домашнее животное.

63. Способ по любому из пунктов 58 или 59, в котором введение представляет собой подкожную, интраназальную, внутрикожную или внутримышечную инъекцию.

64. Способ по пункту 58, в котором иммунный ответ представляет собой антитело/В-клеточный ответ.

65. Способ по пункту 58, причем иммунный ответ представляет собой CD4+ Т-клеточный ответ, включая Th1, Th2 или Th17 ответ.

66. Способ по пункту 58, причем иммунный ответ представляет собой CD8+ Т-клеточный ответ.

67. Композиция по любому из пунктов 14, 34, 39 или 57 для применения при диагностировании подверженности заболеванию, вызванному патогеном, или иммунному заболеванию.

68. Липидированный биотин-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность

FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:1) и любые его функциональные производные.

69. Липидированный биотин-связывающий белок по пункту 68, причем биотин-связывающий белок получен в растворимой форме на уровне, по меньшей мере, 10 мг/л культуральной среды в Е. coli.

70. Липидированный биотин-связывающий белок по любому из пунктов 68-69, причем биотин-связывающий белок представляет собой димер.

71. Липидированный биотин-связывающий белок по любому из пунктов 68-70, причем биотин-связывающий белок включает липидационную последовательность на N-конце.

72. Липидированный биотин-связывающий белок по пункту 71, в котором липидационная последовательность представляет собой MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID No:3).

73. Липидированный биотин-связывающий белок по любому из пунктов 71 или 72, в котором липидационная последовательность связана с биотин-связывающим белком пептидным линкером.

74. Липидированный биотин-связывающий белок по пункту 73, причем пептидный линкер включает аминокислотную последовательность AQDP (SEQ ID NO:8) или VSDP (SEQ ID NO:9).

75. Липидированный биотин-связывающий белок по любому из пунктов 68-74, причем биотин-связывающий белок включает метку очистки на С-конце.

76. Липидированный биотин-связывающий белок по пункту 75, в котором метка очистки выбрана из группы, состоящей из гистидиновой метки, с-ту метки, Halo метки, Flag метки и любой их комбинации.

77. Липидированный биотин-связывающий белок по пункту 76, в котором гистидиновая метка включает аминокислотную последовательность НННННН (SEQ ID NO:10).

78. Липидированный биотин-связывающий белок по любому из пунктов 75-77, в котором метка очистки связана с биотин-связывающим белком через пептидный линкер.

79. Липидированный биотин-связывающий белок по пункту 78, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность VDKLAAALE (SEQ ID NO:11) или GGGGSSSVDKLAAALE (SEQ ID NO:12).

80. Липидированный биотин-связывающий белок по любому из пунктов 68-79, причем биотин-связывающий белок включает аминокислотную последовательность MKKVAAFVALSLLMAGCVSDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:20).

81. Композиция, включающая Липидированный биотин-связывающий белок по любому из пунктов 68-80.

82. Слитый белок, включающий Липидированный биотин-связывающий белок и белок или пептид.

83. Слитый белок по пункту 82, причем белок или пептид слит с липидированным биотин-связывающим белком пептидным линкером.

84. Слитый белок по пункту 83, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность GGGGSSS (SEQ ID NO:22).

85. Слитый белок по любому из пунктов 82-84, в котором белок или пептид представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из: пневмококковых антигенов, туберкулезных антигенов, антигенов сибирской язвы, антигенов ВИЧ, антигенов сезонного или эпидемического гриппа, антигенов инфлюэнцы, антигенов коклюша, антигенов Staphylococcus aureus, менингококковых антигенов, Haemophilus антигенов, антигенов папилломавируса человека или их комбинаций.

86. Слитый белок по пункту 85, в котором антиген представляет собой негемолитический вариант альфа-гемолизина S. aureus.

87. Слитый белок по пункту 86, в котором негемолитический вариант альфа-гемолизина S. aureus содержит мутацию в аминокислотном остатке 205, 213 или 209-211 альфа-гемолизина S. aureus дикого типа.

88. Слитый белок по пункту 86, в котором негемолитический вариант альфа-гемолизина S. aureus содержит одну из следующих мутаций в альфа-гемолизине S. aureus дикого типа: (i) остаток 205 W на А; (ii) остаток 213 W на А; или (iii) остатки 209-211DRD на ААА.

89. Слитый белок по пункту 86, в котором негемолитический вариант альфа-гемолизина S. aureus включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(iv) W205A

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNAGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO:23);

(v) W213A

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSANPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO:24);

(vi) DRD209-211AAA

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKI DWEKEEMTN (SEQ ID NO:25); и

его функциональных вариантов, частей или производных.

90. Слитый белок по любому из пунктов 82-89, причем слитый белок включает липидационную последовательность на N-конце.

91. Слитый белок по пункту 90, в котором липидационная последовательность представляет собой MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID No:3).

92. Слитый белок по любому из пунктов 90 или 91, в котором сигнальная последовательность связана с биотин-связывающим белком пептидным линкером.

93. Слитый белок по пункту 92, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность AQDP (SEQ ID NO:8) или VSDP (SEQ ID NO:9).

94. Слитый белок по любому из пунктов 82-93, причем слитый белок включает метку очистки на С-конце.

95. Слитый белок по пункту 94, в котором метка очистки выбрана из группы, состоящей из гистидиновой метки, с-ту метки. Halo метки. Flag метки и любой их комбинации.

96. Слитый белок по пункту 95, в котором гистидиновая метка включает аминокислотную последовательность НННННН (SEQ ID NO:10).

97. Слитый белок по любому из пунктов 93-96, в котором метка очистки связана с биотин-связывающим белком через пептидный линкер.

98. Слитый белок по пункту 97, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность VDKLAAALE (SEQ ID NO:11).

99. Слитый белок по любому из пунктов 82-98, причем липидированный биотин-связывающий белок представляет собой биотин-связывающий белок по любому из пунктов 68-80.

100. Слитый белок по любому из пунктов 82-99, причем слитый белок включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) SEQ ID NO:53

MKKVAAFVALSLLMAGCVSPDFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNAGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH;

(ii) SEQ ID NO:54

MKKVAAFVALSLLMAGCVSPDFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSANPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH; и

(iii) SEQ ID NO:55

MKKVAAFVALSLLMAGCVSPDFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:55).

101. Композиция, включающая липидированный биотин-связывающий белок по любому из пунктов 82-100.

102. Способ индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту композиции по пунктам 81 или 101.

103. Способ вакцинирования млекопитающего против, по меньшей мере, одного антиген-несущего патогена, причем способ включает введение композиции по пунктам 81 или 101.

104. Способ по любому из пунктов 102 или 103, причем субъект представляет собой человека.

105. Способ по любому из пунктов 102 или 103, причем субъект представляет собой сельскохозяйственное или недомашнее животное.

106. Способ по любому из пунктов 102 или 103, причем субъект представляет собой домашнее животное.

107. Способ по любому из пунктов 102 или 103, причем введение представляет собой подкожную, интраназальную, внутрикожную или внутримышечную инъекцию.

108. Способ по пункту 102, причем иммунный ответ представляет собой антитело/В-клеточный ответ.

109. Способ по пункту 102, причем иммунный ответ представляет собой CD4+ Т-клеточный ответ, включая Th1, Th2 или Th17 ответ.

110. Способ по пункту 102, причем иммунный ответ представляет собой CD8+ Т-клеточный ответ.

111. Композиция по любому из пунктов 81 или 101 для применения при диагностировании подверженности заболеванию, вызванному патогеном, или иммунному заболеванию.

Некоторые отдельные определения

Для удобства здесь собраны отдельные термины, применяемые во всей заявке (включая описание, примеры и пункты формулы изобретения). Если иное явно не указано, все используемые здесь технические и научные термины обладают тем же значением, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится данное изобретение.

В соответствии с использованным здесь и в пунктах формулы изобретения значениями, все формы единственного числа включают множественное число и наоборот, если контекст явно не указывает иное. Термин "или" является неисключающим, если не изменен, например, на "либо". За исключением примеров или фрагментов, где указано иное, все использованные здесь числа, означающие количества ингредиентов или условия реакций должны пониматься в качестве модифицированных во всех случаях термином "около".

В соответствии с использованным здесь значением, термин "иммуногенная композиция" означает композицию, способную индуцировать иммунный ответ, такой как антительный или клеточный иммунный ответ, при введении субъекту. Иммуногенные композиции настоящего изобретения могут являться или не являться иммунозащитными или терапевтическими. Если иммуногенные композиции настоящего изобретения предупреждают, облегчают, смягчают или устраняют заболевание у субъекта, то иммуногенная композиция может необязательно называться вакциной. В соответствии с использованным здесь значением, термин "иммуногенная композиция" не должен ограничиваться вакцинами.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "антиген" означает любое вещество, индуцирующее иммунный ответ, направленный против данного вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой пептид или полипептид, а в других вариантах осуществления изобретения он может представлять собой любое химическое вещество или остаток, например углевод, который индуцирует иммунный ответ, направленный против данного вещества.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "связывает" означает связь двух или более молекул нековалентными или ковалентными связями. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых связывание двух или более молекул осуществляется ковалентной связью, данные две или более молекулы могут быть слиты вместе или сшиты вместе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых связывание двух или более молекул осуществляется нековалентной связью, данные две или более молекулы могут образовывать комплекс.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "комплекс" означает набор двух или более молекул, пространственно соединенных иным образом, чем ковалентное взаимодействие; например, они могут быть соединены электростатическими взаимодействиями, водородной связью или гидрофобными взаимодействиями (то есть силами Ван-дер-Ваальса).

В соответствии с использованным здесь значением, термин "слитый" означает, что, по меньшей мере, один белок или пептид физически связан со вторым белком или пептидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения продукт слияния обычно представляет собой ковалентную связь, однако другие охватываемые термином "слитый" связи включают, например, связь через электростатическое взаимодействие или гидрофобное взаимодействие и им подобные. Ковалентная связь может охватывать связь в виде слитого белка или химическое связывание, например, через дисульфидную связь, образованную между двумя цистеиновыми остатками.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "слитый полипептид" или "слитый белок" означает белок, созданный путем соединения двух или более полипептидных последовательностей вместе. Слитые полипептиды, охватываемые данным изобретением, включают продукты трансляции химерной генетической конструкции, которая соединяет ДНК последовательности, кодирующие один или несколько антигенов или их фрагментов или мутантов, с ДНК последовательностью, кодирующей второй полипептид, для образования одной открытой рамки считывания. Другими словами "слитый полипептид" или "слитый белок" представляет собой рекомбинантный белок из двух или более белков, соединенных пептидной связью. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй белок, с которым слиты антигены, представляет собой комплементарную аффинную молекулу, которая способна взаимодействовать с первой аффинной молекулой комплементарной аффинной пары.

Термины "полипептид" и "белок" могут применяться взаимозаменяемо для описания полимера из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, и для целей заявляемого изобретения, с типичной минимальной длиной, составляющей, по меньшей мере, 25 аминокислот. Термины "полипептид" и "белок" могут охватывать мультимерный белок, например белок, содержащий более одного домена или субъединицы. В соответствии с использованным здесь значением, термин "пептид" означает последовательность связанных пептидной связью аминокислот длиной менее 25 аминокислот, например от около 4 аминокислот до 25 аминокислот. В данное определение включены белки и пептиды, которые могут быть составлены из линейно выстроенных аминокислот, связанных пептидными связями при биологическом, рекомбинантном или синтетическом способе получения и составленные из встречающихся или не встречающихся в природных условиях аминокислот. Определением "белок" охватываются полноразмерные белки и их фрагменты длиной более 25 аминокислот. Данные термины также включают полипептиды с котрансляционными (например, расщеплением сигнального пептида) и посттрансляционными модификациями полипептида, такими как, например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, липидирование, протеолитическое расщепление (например, расщепление металлопротеазами) и им подобными. Более того, в соответствии с использованным здесь значением, термин "полипептид" означает белок, который включает модификации, такие как делеции, добавления или замены (в целом консервативные по своей природе, как известно специалисту в данной области) в нативной последовательности при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Данные модификации могут быть преднамеренными, например путем сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например за счет мутаций хозяев, которые продуцируют белки или в результате ошибок, связанных с ПЦР-амплификацией или другими рекомбинантными ДНК способами.

Под "сигнальной последовательностью" понимается последовательность нуклеиновой кислоты, которая при связывании с молекулой нуклеиновой кислоты обеспечивает секрецию продукта (например, белка или пептида), кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность предпочтительно расположена 5' относительно молекулы нуклеиновой кислоты.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "гликозилированный по N-связи" или "гликозилирование по N-связи" означает ковалентное присоединение сахарного остатка к аспарагиновым остаткам в полипептиде. Сахарные группы могут включать (без ограничения) глюкозу, маннозу и N-ацетилглюкозамин. Также включены модификации гликанов, например сиалирование.

"Антиген-презентирующая клетка" или "АРС" представляет собой клетку, которая экспрессирует молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) и может иметь чужеродный антиген в комплексе с МНС на своей поверхности. Примеры антиген-презентирующих клеток представляют собой дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, фибробласты (кожи), тимусные эпителиальные клетки, эпителиальные клетки щитовидной железы, глиальные клетки (мозга), панкреатические бета-клетки и эндотелиальные клетки сосудов.

Использованный в контексте "функциональной части антигена" термин "функциональная часть" или "функциональный фрагмент" означает часть антигена или антигенный полипептид, который обеспечивает тот же эффект, что и остаток полного антигена, например индуцирует иммунный ответ у субъекта или обеспечивает связывание с другой молекулой, например включает, по меньшей мере, эпитоп.

"Часть" антигена-мишени в соответствии с использованным здесь значением данного термина означает, по меньшей мере, длину, соответствующую 3 аминокислотным последовательностям, и может составлять, например, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 8, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19, по меньшей мере, 20 или, по меньшей мере, 25 аминокислот или более, включительно.

Термины "цитотоксический Т лимфоцит" или "CTL" означает лимфоциты, которые индуцируют апоптоз в клетках-мишенях. CTL образуют антиген-специфичные конъюгаты с клетками-мишенями через взаимодействие TCR с обработанным антигеном (Ag) на поверхностях клеток-мишеней, что приводит к апоптозу клеток-мишеней. Апоптозные тельца удаляются макрофагами. Термин "CTL ответ" применяется для описания основного иммунного ответа, опосредуемого CTL клетками. В соответствии с использованным здесь значением, термин "клеточно-опосредованный иммунитет" или "CMI" означает иммунный ответ, которые не включает антитела или комплемент, но включает активацию, например, макрофагов, NK клеток, антиген-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов (Т-клеток) и высвобождение различных цитокинов в ответ на антиген. В ином случае CMI означает иммунные клетки (такие как Т-клетки и другие лимфоциты), которые связываются с поверхностью других клеток с антигеном (таких как антиген-презентующие клетки (APS) и вызывают ответ. Ответ может включать либо иные лимфоциты и/или любые другие белые кровяные клетки (лейкоциты) и высвобождение цитокинов. Клеточный иммунитет защищает организм за счет: (i) активации антиген-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), которые способны уничтожать клетки организма с эпитопами чужеродного антигена на их поверхности, такие как инфицированные вирусом клетки и клетки с внутриклеточными бактериями; (2) активации макрофагов и NK клеток, позволяя им уничтожать внутриклеточные патогены; и (3) стимулирования клеток для секреции ряда цитокинов, которые влияют на функционирование других клеток, включенных в адаптивные иммунные ответы и врожденные иммунные ответы.

В соответствии с использованным здесь значением термин "иммунная клетка" означает любую клетку, которая может высвобождать цитокин в ответ на прямое или непрямое антигенное стимулирование. В термин "иммунные клетки" здесь включаются лимфоциты, включая естественные клетки-убийцы (NK клетки), Т-клетки (CD4+ и/или CD8+клетки), В-клетки, макрофаги и моноциты, Th клетки; Th1 клетки; Th2 клетки; лейкоциты; дендритные клетки; макрофаги; мачтовые клетки и моноциты и любые другие клетки, которые способны продуцировать цитокинную молекулу в ответ на прямое или непрямое антигенное стимулирование. Как правило, иммунная клетка представляет собой лимфоцит, например Т-клеточный лимфоцит.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "цитокин" означает молекулу, высвобождаемую из иммунной клетки в ответ на стимулирование антигеном. Примеры данных цитокинов включают (без ограничения): GM-CSF; IL-1α; IL-1β; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-17A, IL-17F или другие члены семейства IL-17, IL-22, IL-23, IFN-α; IFN-β; IFN-γ; MIP-1α; MIP-1β; TGF-β; TNFα or TNFβ. Термин "цитокин" не включает антитела.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "субъект" означает любое животное, в котором индуцирование иммунного ответа является полезным. Субъект может представлять собой дикое, домашнее, коммерческое животное или животное-компаньон, такое как птица или млекопитающее. Субъект может представлять собой человека. Несмотря на то, что в одном варианте осуществления данного изобретения предполагается, что иммуногенные композиции, как описано здесь, могут быть также подходящими для терапевтического или профилактического лечения у людей, оно также применимо к теплокровным позвоночным, например млекопитающим, таким как не являющиеся людьми приматы (в частности, высшие приматы), овцы, собаки, грызуны (например, мыши или крысы), гвинейские свиньи, козы, свиньи, кошки, кролики, коровы и немлекопитающие, такие как курицы, утки или индейки. В другом варианте осуществления изобретения субъект представляет собой дикое животное, например птицу, такую как для целей диагностики птичьего гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой опытное животное или заменитель животного в качестве модели заболевания. Субъект может представлять собой субъекта с потребностью в ветеринарном лечении в случае, если индуцирование иммунного ответа на антиген применимо для предотвращения заболевания и/или контроля распространения заболевания, например SIV, STL1, SFV или в случае заболевания скота, заболевания копыта или пасти или в случае болезни Марека птиц или птичьей инфлюэнцы или других подобных заболеваний.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "патоген" означает организм или молекулу, которая вызывает заболевание или расстройство у субъекта. Например, патогены включают (без ограничения) вирусы, грибки, бактерии, паразиты и другие инфекционные организмы или их молекулы, а также таксономически связанные макроскопические организмы, относимые к категориям водорослей, грибков, дрожжей, простейших и им подобных.

"Раковая клетка" означает раковую, предраковую или трансформированную клетку т vivo, ex vivo или в культуре ткани, которая обладает спонтанными или индуцированными изменениями фенотипа, которые необязательно включают поглощение нового генетического материала. Несмотря на то, что трансформация может возникать в результате инфицирования трансформирующим вирусом и включения новой геномной нуклеиновой кислоты или поглощения экзогенной нуклеиновой кислоты, она также может возникать спонтанно или в результате воздействия канцерогена, приводя, таким образом, к мутации эндогенного гена. Трансформирование/рак связаны, например, с морфологическими изменениями, иммортализацией клеток, отклонением контроля роста, образованием очагов, безъякорным ростом, злокачественностью, потерей контактного ингибирования и ограничением роста на основе плотности, фактором роста или сывороточной независимостью, опухоль-специфичными маркерами, инвазивностью или метастазами и ростом опухоли в подходящих животных-хозяевах, таких как голые мыши. См., например, Freshney, culture animal cells: manual basic tech. (3-е изд., 1994).

Термин "дикий тип" означает встречающуюся в природных условиях нормальную полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок или его часть или белковую последовательность или ее часть, соответственно, в том виде, в котором она обычно существует in vivo.

Термин "мутант" означает организм или клетку с любым изменением в ее генетическом материале, в частности, с изменением (то есть делецией, заменой, добавлением или альтерацией), относящимся к полинуклеотидной последовательности дикого вида или с любым изменением, относящимся к последовательности белка дикого типа. Термин "вариант" может применяться взаимозаменяемо с термином "мутант". Несмотря на то, что часто считается, что изменение в генетическом материале приводит к изменению функционирования белка, термины "мутант" и "вариант" означают изменение в последовательности белка дикого типа вне зависимости от того, оказывает ли данное изменение влияние на функционирование белка (например, усиливает, ослабляет, придает новую функцию) или от того, что данное изменение не влияет на функционирование белка (например, мутация или вариация являются молчащими).

Термин "фармацевтически приемлемый" означает соединения и композиции, которые могут быть введены млекопитающим без неспецифической токсичности. Термин "фармацевтически приемлемые носители" не включает культуральную среду ткани. Примерные фармацевтически приемлемые соли включают (без ограничения) соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и им подобные и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и им подобные. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны из уровня техники.

Представляет преимущество то, что белки или полипептиды часто содержат иные аминокислоты, чем 20 аминокислот, которые обычно считаются 20 встречающимися в природных условиях аминокислотами, и что многие аминокислоты, включая терминальные аминокислоты, могут быть модифицированы в целевом полипептиде либо путем естественных процессов, таких как гликозилирование или с помощью других посттрансляционных модификаций или способов на основе химических модификаций, которые хорошо известны из уровня техники. Известные модификации, которые могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения, включают (без ограничения) ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение остатка гема, ковалентное присоединение полинуклеотида или производного полинуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, поперечное связывание, циклизацию, образование дисульфидного мостика, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолетический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфирование, опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование и убикитинирование, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфацию, опосредованное трансферной РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинирование.

В соответствии с использованным здесь значением, термины "гомологический" или "гомологичный" применяются взаимозаменяемо и, при применении для описания полинуклеотида или полипептида, означают, что два полинуклеотида или полипептида или их обозначенные части при оптимальном выравнивании и сравнении, например с помощью BLAST версии 2.2.14 с параметрами выравнивания по умолчанию, являются идентичными с подходящими нуклеотидными инсерциями или делениями или аминокислотными инсерциями или делениями в, по меньшей мере, 70% нуклеотидов, обычно от около 75% до около 99%, например, по меньшей мере, от около 98% до около 99% нуклеотидов. В случае полипептида должна присутствовать, по меньшей мере, 50%-ная идентичность аминокислот в полипептиде. В соответствии с использованным здесь значением, термины "гомолог" или "гомологичный" также означают гомологичность относительно структуры. Специалистом в данной области может быть легко осуществлено определение гомологов генов или полипептидов. В контексте указанной процентной доли указанная процентная гомологичность означает, по меньшей мере, данную процентную долю аналогичности аминокислот. Например, 85% гомологичность означает, по меньшей мере, 85% аналогичности аминокислот.

В соответствии с использованным здесь значением, определение "гетерологичный" относительно последовательности нуклеиновой кислоты, белков или пептидов означает, что эти молекулы не встречаются в данной клетке в природных условиях. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая описанный здесь слитый антигенный пептид, который вводится в клетку, например, в контексте вектора экспрессии белка, представляет собой гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты.

Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность служит в качестве последовательности-образца, с которой сравниваются исследуемые последовательности. При применении алгоритма сравнения последовательностей исследуемые последовательности и последовательности-образцы вводят в компьютер, устанавливают координаты подпоследовательности, если необходимо, и устанавливают программные параметры алгоритма. Алгоритм сравнения последовательностей затем подсчитывает процентную долю идентичности последовательностей для исследуемой последовательности(ей) по сравнению с последовательностью-образцом на основе установленных программных параметров. При необходимости или желании, может быть проведено оптимальное выравнивание сравниваемых последовательностей с помощью любого из многих подходов, поскольку они хорошо известны из уровня техники.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "вариант" может означать полипептид или нуклеиновую кислоту, которая отличается от встречающегося в природных условиях полипептида или нуклеиновой кислоты наличием одной или нескольких делеций аминокислоты или нуклеиновой кислоты, добавлениями, заменами или модификациями боковых цепей, однако сохраняет одну или несколько специфических функций или биологических эффектов встречающейся в природных условиях молекулы. Аминокислотные замены включают альтерации, при которых аминокислота заменяется иным встречающимся в природных условиях или нетрадиционным аминокислотным остатком. Данные замены могут быть классифицированы как "консервативные", при которых аминокислотный остаток, содержащийся в полипептиде, заменяется другой встречающейся в природных условиях аминокислотой с аналогичными характеристиками в плане полярности, функциональности боковых цепей или размера. Замены, охватываемые вариантами как описано здесь, также могут быть "неконсервативными", при которых аминокислотный остаток, который присутствует в пептиде, заменен на аминокислоту с различными свойствами (например, замена заряженной или гидрофобной аминокислоты аланином) или, альтернативно, при которой встречающаяся в природных условиях аминокислота заменена нетрадиционной аминокислотой. Также термином "вариант" при использовании относительно полинуклеотида или полипептида охватываются вариации в первичной, вторичной или третичной структуре, в отличие от исходного полинкулеотида или полипептида, соответственно (например, по сравнению с полинуклеотидом или полипептидом дикого типа).

Термин "по существу аналогичен" при использовании относительно варианта антигена или функционального производного антигена по сравнению с исходным антигеном означает, что данная конкретная последовательность отличается от последовательности антигенного полипептида наличием одной или нескольким замен, делеций или добавлений, однако сохраняет, по меньшей мере, 50% или более, например, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90% или более, включительно, функций антигена, который индуцирует иммунный ответ у субъекта. При определении полинуклеотидных последовательностей, все полинуклеотидные последовательности, способные кодировать по существу аналогичные аминокислотные последовательности, рассматриваются в качестве по существу аналогичных контрольной полинуклеотидной последовательности вне зависимости от различий в последовательности ко донов. Нуклеотидная последовательность является "по существу аналогичной" исходной антигенной последовательности нуклеиновой кислоты, если: (а) нуклеотидная последовательность гибридизируется с кодирующими участками нативной антигенной последовательности, или (b) нуклеотидная последовательность способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью нативного антигена при условиях средней жесткости и обладает биологической активностью, аналогичной нативному антигенному белку; или (с) нуклеотидные последовательности деградируют благодаря генетическому коду, относящемуся к нуклеотидным последовательностям, указанным в (а) или (b). По существу аналогичные белки, как правило, более чем на 80% аналогичны соответствующей последовательности нативного белка.

Варианты могут включать консервативные или неконсервативные аминокислотные изменения, как описано здесь. Изменения в полинуклеотидах могут приводить к аминокислотным заменам, добавлениям, делециям, слиянию и усечениям в полипептиде, кодируемом исходной последовательностью. Варианты также могут включать инсерции, делеции или замены аминокислот, включая инсерции и замены аминокислот и других молекул, которые обычно не встречаются в пептидной последовательности, представляющей собой базис данного варианта, например (без ограничения) инсерции орнитина, которые обычно не встречаются в белках человека. "Консервативные аминокислотные замены" происходят в связи с заменой одной аминокислоты другой с аналогичными структурными и/или химическими свойствами. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны из уровня техники. Например, каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены одной на другую: (1) Аланин (А), Серии (S), Треонин (Т); (2) Аспарагиновая кислота (D), Глютаминовая кислота (Е); (3) Аспарагин (N), Глютамин (Q); (4) Аргинин (R), Лизин (K); (5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (М), Валин (V); и (6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W). См., например, Creighton, proteins (W.Н. Freeman & Co., 1984).

Выбор консервативных аминокислот может быть основан на месторасположении заменяемой аминокислоты в пептиде, например если аминокислота находится снаружи пептида и подвергается воздействию растворителей, или внутри пептида и не подвергается воздействию растворителей. Выбор данных консервативных аминокислотных замен лежит в компетенции специалиста в данной области. Соответственно, является возможным выбор консервативных аминокислотных замен аминокислот снаружи пептида или пептида (то есть аминокислот, подвергаемых воздействию растворителя). Данные замены включают (без ограничения) следующие замены: замену Y на F, Т на S или K, Р на А, Е на D или Q, N на D или G, R на K, G на N или А, Т на S или K, D на N или Е, I на L или V, F на Y, S на Т или А, R на K, G на N или А, K на R, А на S, K или Р.

Альтернативно, также является возможным выбор консервативных аминокислотных замен, подходящих для аминокислот внутри пептида или пептида (то есть аминокислот, не подвергаемых воздействию растворителя). Например, специалист в данной области может применять следующие консервативные замены: замену Y на F, Т на А или S, I на L или V, W на Y, М на L, N на D, G на А, Т на А или S, D на N, I на L или V, F на Y или L, S на А или Y и А на S, G, Т или V. В некоторых вариантах осуществления изобретения LF полипептиды, включая неконсервативные аминокислотные замены, также охватываются термином "варианты". В соответствии с использованным здесь значением, термин "неконсервативная замена" означает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, который обладает иными химическими свойствами. Неограничивающие пример неконсервативных замен включают аспарагиновую кислоту (D), заменяемую на глицин (G); аспарагин (N), заменяемый на лизин (K); и аланин (А), заменяемый на аргинин (R).

В соответствии с использованным здесь значением, термин "производное" означает пептиды, которые были химически модифицированы, например, с помощью убиквитинирования, метки, пегилирования (созданием производного с помощью полиэтиленгликоля) или добавлением других молекул. Молекула также представляет собой "производное" другой молекулы, если она содержит дополнительные химические группы, которые обычно не являются частью данной молекулы. Данные группы могут увеличивать растворимость, абсорбцию, биологический полупериод существования молекулы и так далее. Группы могут альтернативно снижать токсичность молекулы или устранять или ослаблять нежелательный побочный эффект молекулы и так далее. Группы, способные опосредовать данные эффекты описаны в remington's pharmaceutical sciences (21-е изд., Tory, ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).

Термин "функциональный" при применении совместно с "производным" или "вариантом" означает белковую молекулу, которая обладает биологической активностью, которая по существу аналогична биологической активности сущности или молекулы, производным или вариантом которой она является. "По существу аналогичная" в данном контексте означает, что биологическая активность, например антигенность полипептида, составляет, по меньшей мере, 50% активности эталона, например, соответствующего полипептида дикого типа, например, по меньшей мере, 60% активности, по меньшей мере, 70% активности, по меньшей мере, 80% активности, по меньшей мере, 90% активности, по меньшей мере, 100% активности или даже более (то есть вариант или производное обладает большей активность, чем дикий тип), например 110% активности, 120% активности или более включительно.

Термин "рекомбинантный" при применении для описания молекулы нуклеиновой кислоты означает полинуклеотид геномного, кДНК, вирусного, полусинтетического и/или синтетического происхождения, который, благодаря своему происхождению или манипуляции, не связан со всеми или частью полинуклеотидных последовательностей, с которыми он связан в природе. Термин "рекомбинантный" при применении относительно пептида, полипептида, белка или рекомбинантного слитого белка означает полипептид, получаемый путем экспрессии из рекомбинантного полинуклеотида. Термин "рекомбинантный" при применении относительно клетки-хозяина означает клетку-хозяина, в которую был введен рекомбинантный полинуклеотид. Термин "рекомбинантный" также применяется здесь относительно материала (например, клетки, нуклеиновой кислоты, белка или вектора), который был модифицирован путем введения гетерологичного материала (например, клетки, нуклеиновой кислоты, белка или вектора).

Термин "вектор" означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать или опосредовать экспрессию гетерологичной нуклеиновой кислоты, которой она связана с клеткой-хозяином; плазмида представляет собой категорию вида, охватываемого термином "вектор". Термин "вектор", как правило, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации и другие объекты, необходимые для репликации и/или присутствия в клетке-хозяине. Векторы, способные направлять экспрессию генов и/или последовательности нуклеиновой кислоты, с которой они оперативно связаны, называются здесь "векторами экспрессии". В целом, применяемые векторы экспрессии зачастую находятся в форме "плазмид", которые относятся к молекулам двухспиральной кольцевой ДНК, которые, в своей векторной форме, не связаны с хромосомой и, как правило, содержат объекты для стабильной или переходной экспрессии или кодированную ДНК. Другие векторы экспрессии, которые могут применяться в способах, как описано здесь, включают (без ограничения) плазмиды, эписомы, искусственные бактериальные хромосомы, искусственные дрожжевые хромосомы, бактериофаги или вирусные векторы, при этом данные векторы могут встраиваться в геном хозяина или самостоятельно реплицироваться в определенной клетке. Вектор может представлять собой ДНК или РНК вектор. Также могут применяться другие формы векторов экспрессии с аналогичными функциями, которые известны специалистам в данной области, например самореплицирующиеся экстрахромосомные векторы или векторы, которые встраиваются в геном хозяина. Предпочтительные векторы представляют собой векторы, способные осуществлять самостоятельную репликацию и/или экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они связаны.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "сниженный" или "снижать" или "понижать" в целом означает понижение на статистически значимую величину по сравнению с эталоном. Для устранения сомнения "сниженный" означает статистически значимое понижение на, по меньшей мере, 10% по сравнению с эталонным уровнем, например понижение на, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90% или более до и включая 100% понижение (то есть нулевой уровень по сравнению с эталонным образцом) или любое понижение в диапазоне 10-100% по сравнению с эталонным уровнем в соответствии с определением здесь данного термина.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "низкий" в целом означает статистически более низкое количество; для устранения сомнения "низкий" означает статистически значимое значение на 10% ниже, чем эталонный уровень, например значение, по меньшей мере, на 20% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере, на 30% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере, на 40% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере, на 50% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере, на 60% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере, на 70% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере, на 80% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере, на 90% ниже, чем эталонный уровень, на 100% ниже включительно, чем эталонный уровень (то есть нулевой уровень по сравнению с эталонным образцом).

В соответствии с использованными здесь значениями, термины "увеличенный" или "увеличение" в целом означает увеличение на статистически значимое количество; такое как статистически значимое увеличение, по меньшей мере, на 10% по сравнению с эталонным уровнем, включая увеличение, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 100% или более включительно, например, по меньшей мере, 2-кратное, по меньшей мере, 3-кратное, по меньшей мере, 4-кратное, по меньшей мере, 5-кратное, по меньшей мере, 10-кратное увеличение или более по сравнению с эталонным уровнем в соответствии с определением здесь данного термина.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "высокий" в целом означает более высокий на статистически значимое количество по сравнению с эталоном; такое как статистически значимое значение, по меньшей мере, на 10% выше эталонного уровня, например, по меньшей мере, на 20% выше, по меньшей мере, на 30% выше, по меньшей мере, на 40% выше, по меньшей мере, на 50% выше, по меньшей мере, на 60% выше, по меньшей мере, на 70% выше, по меньшей мере, на 80% выше, по меньшей мере, на 90% выше, по меньшей мере, на 100% выше включительно, например, по меньшей мере, 2-кратно выше, по меньшей мере, 3-кратно выше, по меньшей мере, 4-кратно выше, по меньшей мере, 5-кратно выше, по меньшей мере, 10-кратно выше или более по сравнению с эталонным уровнем.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "включающий" означает, что другие элементы также могут присутствовать в добавление к указанным присутствующим элементам. Применение "включающий" указывает на включение, не ограничение.

Термин "состоящий из" относится к композициям, способам и их соответствующим компонентам как описано здесь, которые не включают ни один элемент, не перечисленный в данном описании варианта их осуществления.

В соответствии с использованным здесь значением термин "состоящий по существу из" означает элементы, необходимые для указанного варианта осуществления. Данный термин не ограничивает присутствие элементов, которые материально не затрагивают основу и новизну или функциональную характеристику(и) данного варианта осуществления изобретения.

Также должно быть понятно, что все базовые размеры или аминокислотные размеры, а также все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и приведены в целях описания. Несмотря на то, что при осуществлении или исследовании данного описания могут применяться способы и материалы, являющиеся аналогичными или эквивалентными описанным здесь способам и материалам, здесь описаны подходящие способы и материалы.

В соответствии с использованным здесь значением, термин "биотин" означает само соединение биотин и его аналоги, производные и варианты. Таким образом, термин "биотин" включает биотин (цис-гексагидро-2-окси-1Н-тиено [3,4]имидазол-4-пентановую кислоту) и любые его производные и аналоги, включая биотин-подобные соединения. Данные соединения включают, например, биотин-эпсилон-N-лизин, биоцитингидразид, аминные или сульфгидрильные производные 2-иминобиотина и сложный эфир биотинил-эпсилон-аминокапроновой кислоты N-гидроксисукцинимида, сульфосукцинимидиминобиотин, биотинбромацетилгидразид, п-диазобензоилбиоцитин, 3-(N-малеимидпропионил)биоцитин, дестиобиотин и им подобные. Термин "биотин" также включает варианты биотина, которые могут специфично связываться с одним или несколькими веществами из группы, включающей Ризавидин, авидин, стрептавидин, тамавидиновый остаток или другие авидин-подобные пептиды.

Несмотря на то, что вышеизложенное изобретение было описано в некоторых подробностях для целей ясности понимания, в свете концепции данного изобретения специалисту в данной области будет понятно, что в него могут быть внесены определенные изменения и модификации без выхода за рамки сути или области, охватываемой формулой изобретения. Нижеследующие примеры предназначены для целей иллюстрирования настоящего изобретения; тем не менее, осуществление изобретения не ограничено или сужено данными примерами каким-либо образом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Экспрессия растворимого рекомбинантного биотин-связывающего белка и его слитых белков в Е. coli с высоким выходом

Применяемый в данных исследования рекомбинантный Ризавидин (rRhavi) представляет собой N-терминальную модифицированную версию, которая содержит только остатки от 45 до 179 белка дикого типа. Для оптимизации уровня экспрессии rRhavi в Е. coli генную последовательность, которая кодирует полипептиды Ризавидина (45-179) изменяли, используя Е. coli-предпочтительные кодоны экспрессии, затем синтезировали и клонировали в PET21b вектор. Для обеспечения правильного фолдинга и получения высокого выхода растворимого рекомбинантного белка ДНК последовательность, кодирующую сигнальную последовательность периплазматической локализации Е. coli (19 аминокислот, MKKIWLALAGLVLAFSASA, SEQ ID NO:2) вводили в 5' конец синтетического гена rRhavi. Считается, что данная сигнальная последовательность будет автоматически удалена из рекомбинантного белка после его таргетинга в периплазму Е. coli в процессе экспрессии.

ДНК последовательность, кодирующая участок с гибким линкером и гистидиновую метку (GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH, SEQ ID NO:14) были напрямую введены в 3' конец синтетического гена rRhavi. Это способствует очистке рекомбинантного биотин-связывающего белка. Кроме того, антиген может быть введен в линкер с гибким линкером на каждой стороне, например антиген может быть введен между аминокислотами S и V линкера. Поскольку данный антиген отделен от биотин-связывающего белка пептидным линкером (GGGGSSS, SEQ ID NO:22) и от гистидиновой метки пептидным линкером (VDKLAAALE, SEQ ID NO:11), это может стабилизировать слитый белок.

Для конструирования слитых белков Ризавидин-антиген ДНК последовательность, кодирующую участок с гибким линкером, состоящим из семи аминокислот (GGGGSSS, SEQ ID NO:22), может быть напрямую вставлена в 3' конец синтетического гена rRhavi для обеспечения стабилизации слитого белка. Гены, кодирующие кандидатные антигены (полноразмерные или желаемые фрагменты) амплифицировали из геномной ДНК целевых патогенов с помощью обычных ПЦР-процедур и вставляли в вектор экспрессии rRhavi сразу после линкерного участка.

Для экспрессии белка плазмиды, содержащие конструкции-мишени, трансформировали в штамм BL21 Е. coli (DE3), применяя стандартную процедуру теплового шока. Отдельную колонию брали в свежем виде с планшета (или применяли запас глицерола позже) и прививали в 30 мл среды Лурия-Бертани (LB), содержащей ампициллин (Amp+) для инкубирования в течение ночи при 37°С. На второй день 5 мл начальной культуры прививали в 1 литр среды LB/Amp+ и инкубировали при 37°С до достижения OD₆₀₀=1. После охлаждения среды до 16°С 0,2 мМ итоговой концентрации IPTG добавляли в культуры для индуцирования в течение ночи.

Белки очищали из периплазматической фракции с применением модифицированного протокола осмотического шока. Вкратце, бактериальные клетки из культуры объемом 6 литров собирали и ресуспендировали в 120 мл буфера, содержащего 30 мМ трис (рН 8,0), 20% сахарозы и 1 мМ EDTA. После взбалтывания при комнатной температуре в течение 20 минут клетки заново гранулировали с помощью центрифугирования при 10000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант собирали в качестве фракции 1, а клетки ресуспендировали в 80 мл ледяного раствора, содержащего 5 мМ MgCl₂, ингибитор протеиназы и DNaзу. После взбалтывания при 4° в течение 20 минут смесь подвергали центрифугированию при 13000 об/мин в течение 20 минут, а супернатант собирали в качестве фракции 2. После добавления конечной концентрации 150 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ имидазола супернатант, соединяющий фракцию 1 и фракцию 2, применяли на Ni-NTA колонке. Белки, элюированные из Ni-NTA колонки далее очищали с помощью гель-фильтрации с применением колонки Superdex 200 с очистителем АКТА. Собирали и концентрировали пиковые фракции, содержащие целевой белок. Концентрацию белка измеряли с применением набора для анализа белка ВСА от Bio-Rad. Очищенные белки аликвотировали, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С для применения в будущем.

Конструкция биотин-связывающего белка схематично показана на Фиг.1, a SDS-PAGE очищенного биотин-связывающего белка показан на Фиг.2.

Конструкция слитых белков, включающих биотин-связывающий белок сзематично показана на Фиг.3, а примерный SDS-PAGE очищенных слитых белков показан на Фиг.4.

Пример 2: Липидированное производное биотин-связывающих белков

Липидированное производное рекомбинантного биотин-связывающего белка полчали с применением способа, аналогичного способу, описанному в Примере 1. Липидированное производное, применяемое в данном исследование представляет собой N-терминальную модифицированную версию Ризавидина дикого типа, которая содержит только остатки от 45 до 179 белка дикого типа. Для оптимизации уровня экспрессии rRhavi в Е. coli генную последовательность, которая кодирует полипептиды Ризавидина (45-179) изменяли, используя Е. coli-предпочтительные кодоны экспрессии, затем синтезировали и клонировали в PET21b вектор. Для обеспечения липидирования, правильного фолдинга и получения высокого выхода растворимого рекомбинантного белка ДНК последовательность, кодирующую сигнальную липидационную последовательность (19 аминокислот, MKKVAAFVALSLLMAGC, SEQ ID NO:3) вводили в 5' конец синтетического гена rRhavi. Липидирование будет добавлено в Cys остатке липидационной последовательности бактериями, например Е. coli, в процессе экспрессии.

Для экспрессии белка плазмиду, содержащую конструкции-мишени, трансформировали в штамм BL21 Е. coli (DE3), применяя стандартную процедуру теплового шока. Отдельную колонию брали в свежем виде с планшета (или применяли запас глицерола позже) и прививали в 30 мл среды Лурия-Бертани (LB), содержащей ампициллин (Amp+) для инкубирования в течение ночи при 37°С. На второй день 5 мл начальной культуры прививали в 1 литр среды LB/Amp+и инкубировали при 37°С до достижения OD₆₀₀=1. После охлаждения среды до 16°С 0,2 мМ итоговой концентрации IPTG добавляли в культуры для индуцирования в течение ночи.

Липидированный Ризавидин очищали из фракции мембраны Е. coli. Клетки Е. coli собирали и ресуспендировали в лизисном буфере (20 мМ трис, 500 мМ NaCl, pH 8,0), содержащем ингибиторы протеазы, DNaзу, 10 мМ Mg+ и лизоцим. Клетки разрушали с помощью одного цикла заморозки и оттаивания, при этом супернатант удаляли после центрифугирования при 13000 об/мин в течение 45 минут. Клеточные гранулы затем ресуспендировали в лизисном буфере, содержащем 0,5% SDOC, и гомогенизировали с помощью гомогенизатора. Лизаты затем подвергали центрифугированию при 13000 об/мин в течение 45 минут, при этом супернатант собирали для аффинной очистки. Липидированный rhavi элюировали лизисным буфером, содержащим 0,5% SDOC и 300 мМ Im.

Белки, элюированные из Ni-NTA колонки, далее очищали с помощью гель-фильтрации с применением колонки Superdex 200 с очистителем АКТА. Собирали и концентрировали пиковые фракции, содержащие целевой белок. Концентрацию белка измеряли с применением набора для анализа белка ВСА от Bio-Rad. Очищенные белки аликвотировали, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С для применения в будущем.

Полученный Липидированный биотин-связывающий белок схематично показан на Фиг.5, a SDS-PAGE очищенного липидированного биотин-связывающего белка показан на Фиг.6.

Пример 3: TLR2 активность липидированного биотин-связывающего белка

TLR2 активность липидированного биотин-связывающего белка анализировали на НЕК TLR2 клетках. НЕК TLR2 клетки высевали на 24-луночный планшет при 5×10⁵ клеток на лунку в объеме 500 мкл. Добавляли Липидированный биотин-связывающий белок при различных концентрациях для стимулирования при 37°С в течение ночи. Супернатанты собирали на второй день для IL-8 измерения с помощью ELISA. В качестве контроля использовали клетки НЕК 293 для стимулирования при тех же условиях.

Определяли TLR2 активность липидированного биотин-связывающего белка. Результаты показали, что липидированный биотин-связывающий белок индуцировал получение IL-8 из клеток HEK TLR2, но не из клеток HEK293 (Фиг.7).

Пример 4: Негемолитические мутанты Hla и слитые белки

ДНК последовательность, кодирующую зрелый полипептид Hla (аминокислоты от 27 до 319) клонировали из генома Staphylococcus aurues. Все негемолитические мутанты Hla получали сайт-направленным мутагенезом с применением QuickChange. Для получения Hla-биотин-связывающих слитых белков ДНК последовательность, кодирующую Hla дикого типа или мутантный Hla вставляли после следующего ниже участка гена биотин-связывающего белка. Все конструкции клонировали в PET21b и трансформировали в Е. coli для экспрессии как описано выше.

Получали негемолитические мутанты Hla. Примерные негемолитические варианты Hla схематично показаны на Фиг.8. SDS-PAGE очищенных диких или негемолитических вариантов Hla и слитого белка показаны на Фиг.9 и 10.

Пример 5: Гемолитическая активность Hla дикого типа, мутантного Hla и слитых белков

Гемолитическая активность Hla дикого типа, мутантного Hla и их слитых белков с биотин-связывающим белком анализировали с применением кровяных клеток кролика. Красные кровяные клетки из 250 мкл крови кролика гранулировали, дважды промывали PBS и затем ресуспендировали в 10 мл PBS, Hla дикого типа, мутантный Hla и слитые белки разбавляли PBS при указанных концентрациях и затем добавляли на 96-луночный планшет при 100 мкл на лунку. Кровяные клетки добавляли в 96-луночный планшет, содержащий Hla и слитые белки при 25 мкл на лунку и затем инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Супернатанты собирали после центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 минут и анализировали с помощью ELISA ридера при OD450.

Анализировали гемолитическую активность Hla дикого типа, мутантного Hla и слитых белков. Результат показывают, что мутантный Hla обладает намного более низкой гемолитической активностью по сравнению с Hla дикого типа (Фиг.11). Также, слитые белки Н1а, включающие биотин-связывающий белок, обладали еще более низкой гемолитической активностью по сравнению с неслитым белком мутантного Hla.

Пример 6: Стимулирующая активность слитого белка мутантного Н1а

Макрофаговые клетки С57 дикого типа стимулировали слитым мутантным белком негемолитического Н1а. Клетки высевали на 24-луночный планшет при 5×10⁵ клеток на лунку. Слитый белок мутантного Hla разбавляли питательной средой и добавляли в лунки при указанных концентрациях для стимулирования при 37°С в течение ночи. Супернатанты собирали на второй день после центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 минут и затем анализировали на секрецию цитокинов с помощью ELISA. Анализировали стимулирующую активность слитого белка мутантного Н1а. Результаты показали, что слитый белок мутантного Hla (rhavi-Hla209) индуцировал получение множества воспалительных цитокинов, включая TNF-α, IL-6, 11-23, IL-1β и IL-17 (Фиг.13).

Пример 7. Липидированные биотин-связывающие белки и слитые белки мутантного Hla обеспечивают иммунный ответ на другие антигены

Вакцинные конструкции на основе MAPS получали из биотинилированного капсульного полисахарида пневмококков серотипа-1, слитых с Ризавидином туберкулезных антигенов и одним из группы, включающей нелипидированный Ризавидин, липидированный Ризавидин и rhavi-Hla209. Мышей иммунизировали различными MAPS конструкциями и анализировали и сравнивали Т-клеточные ответы на туберкулезные антигены в различных иммунизированных группах после 3 иммунизации. Вкратце, цельная кровь из различных групп мышей стимулировали очищенными ТВ белками in vitro при 37°С в течение 6 дней и определяли концентрацию цитокинов в супернатанте с помощью ELISA.

Результаты показали, что группы мышей, получавших MAPS комплекс, содержащий липидированный Ризавидин или содержащий rhavi-Hla209 продуцировали лучшие Th17 (IL-17A) и Th1 клеточные (IFN-γ) ответы на туберкулезные антигены (Фиг.14). Это указывает на то, что липидированный Ризавидин и rhavi-Hla209 могут действовать в качестве костимулятора/адъюванта в составе MAPS вакцины.

Является понятным, что вышеизложенное подробное описание и примеры приведены лишь для целей иллюстрирования и не должны рассматриваться в качестве ограничивающих область, охватываемую данным изобретением. Специалисту в данной области будет понятно, что различные изменения и модификации описанных вариантов осуществления изобретения могут быть реализованы без выхода за рамки концепции и области, охватываемой настоящим изобретением. Также, все указанные патенты и другие публикации намеренно приведены здесь для ссылки с целью описания и изложения, например описанные в данных публикациях способы, которые могут применяться с настоящим изобретением. Данные публикации приведены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. В этом отношении ничто не должно толковаться в качестве допущения того, что изобретатели не имеют права первенства относительно данного описания на основании более раннего изобретения или по какой-либо иной причине. Все утверждения относительно даты или содержания данных документов основаны на информации, доступной заявителям, и не образуют какого-либо допущения относительно правильности дат или содержания данных документов.

Все патенты и другие публикации, приведенные в описании и примерах, намеренно включены здесь для ссылки для любых целей. Данные публикации приведены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. В этом отношении ничто не должно толковаться в качестве допущения того, что изобретатели не имеют права первенства относительно данного описания на основании более раннего изобретения или по какой-либо иной причине. Все утверждения относительно даты или содержания данных документов основаны на информации, доступной заявителям, и не образуют какого-либо допущения относительно правильности дат или содержания данных документов.

Несмотря на то что здесь были изложены и описаны предпочтительные варианты осуществления изобретения, специалистам в данной области будет очевидно, что могут быть осуществлены различные модификации, добавления, замены и им подобные без выхода за рамки концепции изобретения и что они, таким образом, рассматриваются лежащими в области, охватываемой данным изобретением как определено в формуле изобретения.

Также, специалистам в данной области будет очевидно, что любой из описанных и проиллюстрированных здесь различных вариантов осуществления изобретения может быть также модифицирован для включения особенностей, присущих любому из других описанных здесь вариантов осуществления изобретения вплоть до еще не указанной здесь степени.

1. Слитый биотин-связывающий белок, включающий: растворимый биотин-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 15, и антигенный белок или пептид, причем слитый белок не включает аминокислоты 1-44 белка Ризавидина дикого типа.

2. Слитый биотин-связывающий белок по п. 1, в котором растворимый биотин-связывающий белок включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 1, и слитый белок включает пептидный линкер между антигенным белком или пептидом и биотин-связывающим белком.

3. Слитый биотин-связывающий белок по п. 2, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

4. Слитый биотин-связывающий белок по любому из пп. 1-3, в котором антигенный белок или пептид представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из: пневмококковых антигенов, туберкулезных антигенов, антигенов сибирской язвы, антигенов ВИЧ, антигенов сезонного или эпидемического гриппа, антигенов гриппа, антигенов коклюша, антигенов Staphylococcus aureus, менингококковых антигенов, Haemophilus антигенов, антигенов папилломавируса человека, антигенов Е. coli, антигенов Salmonella, антигенов Enterobacter, антигенов Pseudomonas, антигенов Klebsiella, антигенов Citrobacter, антигенов Clostridia, антигенов кишечных патогенов, ракового или опухолевого антигенов, токсоидов, токсинов или их частей или их комбинаций.

5. Слитый биотин-связывающий белок по любому из пп. 1-4, в котором антигенный пептид или белок включает вариант альфа-гемолизина S. aureus.

6. Слитый биотин-связывающий белок по п. 5, в которм вариант альфа-гемолизина S. aureus обладает сниженной гемолитической активностью по сравнению с эквивалентным титром альфа-гемолизина (Hla) дикого типа.

7. Слитый биотин-связывающий белок по п. 5 или 6, в котором вариант альфа-гемолизина S. aureus включает мутацию в одном или более аминокислотных остатках 205, 213 и 209-211 альфа-гемолизина S. aureus дикого типа.

8. Слитый биотин-связывающий белок по п. 5 или 6, в котором вариант альфа-гемолизина S. aureus включает одну из следующих мутаций в альфа-гемолизине S. aureus дикого типа: (i) остаток 205 W на A; (ii) остаток 213 W на А; или (iii) остатки 209-211 DRD на AAA.

9. Слитый биотин-связывающий белок по п. 5 или 6, в котором вариант альфа-гемолизина S. aureus включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25.

10. Слитый биотин-связывающий белок по п. 5, в котором вариант альфа-гемолизина S. aureus включает аминокислоты 27-319 альфа-гемолизина S. aureus дикого типа.

11. Слитый биотин-связывающий белок по любому из пп. 5-10, причем слитый белок обладает по меньшей мере на 25% сниженной гемолитической активностью по сравнению с эквивалентным титром альфа-гемолизина (Hla) дикого типа.

12. Слитый биотин-связывающий белок по любому из пп. 1-11, причем слитый белок дополнительно включает бактериальную сигнальную последовательность на N-конце.

13. Слитый биотин-связывающий белок по пп. 1-12, причем слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 28.

14. Способ индуцирования иммунного ответа против антигенного белка или пептида у субъекта, включающий введение субъекту слитого биотин-связывающего белка по любому из пп. 1-13, причем слитый биотин-связывающий белок включает антигенный белок или пептид, а иммунный ответ представляет собой иммунный ответ против антигенного белка или пептида.

15. Способ по п. 14, где иммунный ответ представляет собой ответ антител или В-клеточный ответ.

16. Способ по п. 14, где иммунный ответ представляет собой CD4+ Т-клеточный ответ или CD8+ Т-клеточный ответ.

17. Способ по п. 16, где CD4+ Т-клеточный ответ включает Th1, Th2 или Th17 ответ.

18. Способ по п. 14, где иммунный ответ представляет собой ответ антител или В-клеточный ответ и Т-клеточный ответ.