Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика



Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика
Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика
Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика
Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика
Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика

 


Владельцы патента RU 2633511:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе" (RU)
Погожева Валерия Владимировна (RU)
Лапчинская Ольда Анастасьевна (RU)
Катруха Генрих Степанович (RU)

Заявлена группа изобретений, которая может быть использована при производстве антибактериального антибиотика диметилванкомицина сульфата, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми и анаэробами. Предлагается штамм Amycolatopsis orientalis – продуцент диметилванкомицина, депонированный в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ Ас-1984, и способ получения диметилванкомицина. Способ получения диметилванкомицина включает культивирование штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, сорбцию антибиотика из нативного раствора на катионите КБ-2 (Na+), десорбцию антибиотика, нейтрализацию элюата катионитом КУ-2-20 (Н+) и сорбцию (pH 6,8) антибиотика на Амберлит CG-25 (NH4+) с последующей элюцией диметилванкомицина (0,05-0,3) н. раствором аммиака. Водный раствор антибиотика концентрируют и осаждают ацетоном. Изобретение позволяет получить антибиотик 97,4% чистоты. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего противобактериальный антибиотик диметилванкомицин.

Антибиотик диметилванкомицин по химическому строению относится к полициклическим антибиотикам группы ванкомицина-ристомицина (далбагептидам), являющимся жизнеспасающими средствами при лечении особо тяжелых инфекций.

Диметилванкомицин эффективен при лечении заболеваний, вызываемых грамположительными бактериями, включая метициллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка (MRSA) и многие анаэробы, в том числе возбудителя псевдомембранного колита Clostridium difficile.

Диметилванкомицин служит также исходной субстанцией в получении полусинтетических производных природной структуры для улучшения химиотерапевтических показателей, в том числе ослабления аллергизирующего действия, характерного для гликопептидных антибиотиков.

Впервые диметилванкомицин, как один из шести компонентов, был обнаружен в составе комплекса гликопептидных антибиотиков, образуемого мутантным штаммом культуры Nocardia orientalis 2450 - мирового продуцента ванкомицина [2]. Известен штамм этой культуры Amycolatopsis (прежнее название Nocardia) orientalis subsp. Eremomycini ВКПМ-Ас-807 - промышленный продуцент близкого к ванкомицину антибиотика эремомицина [3], принятый в качестве прототипа.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм №9325 - продуцент диметилванкомицина путем селекционного преобразования свойств известного штамма Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-Ас 807 в результате последовательного двухступенчатого воздействия N-метилнитрозомочевины и гамма-лучей 60Со на споры исходной культуры и отбора оригинального мутантного продуцента диметилванкомицина среди мутагенизированной популяции колоний актиномицета, выросших на селективном фоне устойчивости к ванкомицину.

Полученный новый штамм №9325 депонирован в коллекции культур ГосНИИ «Генетика» под номером штамм ВКПМ-Ас-1984.

Изобретение включает способ выделения образованного диметилванкомицина при глубинном культивировании нового штамма-продуцента, предусматривающий сорбцию его из нативного раствора на карбоксильном катеоните КБ-2 в солевой форме с последующей десорбцией 0,3 н. раствором аммиака, концентрацией и хроматографической очисткой от примесей микробных метаболитов с использованием Амберлита CG-25 (NH3+) и катеонита КУ-2-20 (Н+), осаждением ацетоном субстанции 97,4% чистоты из водного раствора антибиотика.

Штамм Amycolatopsis orientalis subsp. ВКПМ-Ас-1984 с антибиотической активностью 1800 мкг в 1 мл ферментационной жидкости обладает способностью синтеза диметилванкомицина в виде монокомпонента и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984

Длительность выращивания для изучения таксономических признаков (7-21) суток при температуре 28°C. Для засева диагностических сред используется споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глюкозо-аспарагиновом агаре или на среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера. Данные приведены в таблице №1.

Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия прямые или слегка извилистые, распадающиеся на фрагменты различной длины; поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°C, оптимум роста 28°C и в диапазоне значений pH (5,0 - 10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на провокационной среде Треснера с лимонно-кислым железом.

Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, фруктозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, рибозу, арабинозу, маннит, мальтозу; умеренно - сорбит; не утилизирует сахарозу, рафинозу, целлюлозу.

Антагонистические свойства. Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 при росте на агаровых средах умеренно угнетает рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и не действует на грамотрицательные бактерии Escherichia colli, Comamonas terrigena, Providencia stuartii.

Хранение штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом. Антибиотическая активность штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 при глубинном культивировании определяется луночным методом диффузии в агар (среда №2 Гаузе) с использованием в качестве тест-микроорганизма Bacillus subtilis АТСС 6633 и сравнением зон подавления роста образцами испытуемой ферментационной жидкости с калибровочной кривой стандарта эремомицина сульфата (100 мкг, 50 мкг, 25 мкг, 12,5 мкг). Биологическая активность получаемой биосинтезом и химически очищенной субстанции антибиотика определяется трехдозным вариантом метода (ГФХ, стр. 949).

Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 поясняется следующим примером.

Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, выращенной в течение (10-14) суток при 28°C на среде Линденбайна, засевают питательную среду (150 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) и выращивают при 28°C в течение (24-36) часов на круговой качалке при (220-240) об/мин.

Состав посевной среды, %:

Среда стерилизуется в течение 30 мин при давлении 1,0 атм. при 120°C.

Выросшим мицелием в количестве (5-10) % засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:

Стерилизация среды в течение 30 мин при давлении 1,0 атм. при 120°C.

Ферментационное культивирование проводят при 28°C в течение 120 часов на качалке при (220-240) об/мин. Диметилванкомицин накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотическую активность определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis АТСС 6633. Содержание диметилванкомицина при биосинтезе штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 к окончанию ферментации составляет 1800 мкг в 1 мл культуральной жидкости.

Для выделения диметилванкомицина проводят его сорбцию из нативного раствора (отфильтрованной от мицелия ферментационной жидкости) на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме.

Способ выделения поясняется следующим примером

Пример 2

1 л ферментационной жидкости, содержащей 1,8 г антибиотика, подкисляют серной кислотой до pH 6,7. Мицелий отделяют, промывают дистиллированной водой, нативный раствор, объединенный с промывной водой (1,1 л), пропускают через колонку с катионитом КБ-2 (Na+) с десорбцией антибиотика 0,3 н. раствором аммиака. Элюат нейтрализуют при использовании катеонита КУ-2-20 (Н+) и при pH 6,8 сорбируют на Амберлит CG-25 (NH4+) с последующим вытеснением антибиотика раствором аммиака (0,05-0,3) н. и удалением избытка аммиака использованием катеонита КУ-2-20 (Н+). Водный раствор антибиотика концентрируют упариванием в вакууме и диметилванкомицин осаждается добавлением ацетона. Получено 0,738 г субстанции диметилванкомицина сульфата 97,4% чистоты (метод ВЭЖХ). Выход составляет 41% от содержания диметилванкомицина в ферментационной жидкости.

Антибиотик, полученным заявленным способом, представляет собой белый аморфный порошок, легко растворимый в воде и практически нерастворимый в органических растворителях; имеет УФ-спектр, характерный для ванкомициновой группы антибиотиков-гликопептидов с максимумом поглощения при 280 нм и батохромным сдвигом (20-25 нм) при щелочной реакции.

ВЭЖХ анализ полученного диметилванкомицина проводили на жидкостном хроматографе "Knauer" (Germany) с автоматической системой обработки данных и спектрофотометрическим детектором К-2501; колонка из нержавеющей стали длиной 150 мм с внутренним диаметром 4 мм, заполненная сорбентом "Диасфер-110-С16" (БиоХимМак СТ, Москва) с размером частиц 5 мкм. Для элюции антибиотика использовали систему, состоящую из 0,2% раствора HCOONH4 и ацетилнитрила при изменении линейного градиента элюции от 12 до 35% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детектирование при длине волны 280 нм, температура хроматографирования - комнатная, объем петли 20 мкл. В этих условиях время выхода диметилванкомицина - 10,97 мин, время выхода ванкомицина - 6,36 мин.

Показатели, характеризующие диметилванкомицин сульфат (физико-химические свойства, антибактериальная активность), полностью соответствуют показателям, которые определены для диметилванкомицина сульфата, защищенного патентом US 0159180 с брутто-формула C68H79Cl2N9O24, мол. масса 1477.3 Да, УФ-спектр, λmax2O)=280 нм. Таким образом, создан новый мутантный штамм - активный продуцент диметилванкомицина Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, отличающийся от известного по способности образовывать новый для штамма-прототипа антибиотик в виде монокомпонента, а также по характеру роста на диагностических агаровых средах и по степени усвоения источников углерода (таблица 2).

Использование нового штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 и способа выделения антибиотика для коммерческого получения диметилванкомицина позволяет осуществить выход целевого продукта 97,4% чистоты в количестве 0,738 г из 1 л ферментационной жидкости.

Источники информации

1. Shashkov A.S., Tsvetkov D.E., Grachev A.A., Lapchinskaia O.A., Lavrova-Balashova M.F., Ponomarenko V.I., Katrukha G.S., Nifantiev N.E. Structural analysis of Antibiotic INA 9301 from Amycolatopsis orientalis. Natural product communication. Vol.3(10), P. 1631-1638 (2008).

2. Патент ЕР US 0159180 (1985).

3. Патент RU 2352631 от 10.10.2008 г.

1. Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 - продуцент антибиотика диметилванкомицина.

2. Способ получения антибиотика диметилванкомицина, предусматривающий культивирование продуцента Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, сорбцию из нативного раствора на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме, десорбцию антибиотика 0,3 н. раствором аммиака, упаривание элюата в вакууме, осаждение диметилванкомицина ацетоном с последующей хроматографической очисткой антибиотика от примесей микробных метаболитов с использованием катионитов Амберлита CG-25 (NH3+) и КУ-2-20 (Н+) и осаждением ацетоном субстанции диметилванкомицина сульфата из водного раствора антибиотика.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ упаковки грибных спор, грибные споры, упакованные вышеуказанным способом, и запечатанная упаковка с жизнеспособными спорами грибов.
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ культивирования штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma для получения белково-витаминной добавки с астаксантином.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных предусматривает получение фильтрата культур стафиококка путем выращивания культур стафилокока на мясопептонном агаре с последующим культивированием в термостате при 37оС в течение 8-10 дней.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению каркасных материалов на основе белковых конструкций, и может быть использовано в медицине. На основе минимального рекомбинантного эластомерного мотива (триболин-1, Trib-1mut) белка резилина насекомых Tribolium castaneum (триболин-2, Trib-2mut) рекомбинантным путем получена белковая конструкция, которую используют в способах агрегации с целью формирования основы сетки биоматрикса.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к выделенному полипептиду, вызывающему образование нейтрализующих антител к токсинам Clostridium difficile.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм актиномицета Streptomyces globisporus К-35/15, обладающий энтомоцидными и акарицидными свойствами, депонирован в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 04205 и может быть использован для защиты растений от вредных насекомых - фитофагов, в том числе колорадского жука, паутинных клещей, тлей.

Группа изобретений относится к биотехнологии, медицинской и пищевой промышленности. Предложены питательные композиции для стимулирования мукозальной иммунной системы, способ изготовления и их применения.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен штамм бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP для детекции ионов меди, биосенсор и способ детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к экологическим препаратам, обеспечивающим очистку почвы и водной поверхности, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Изобретения относятся к биотехнологии. Предложены композиция, способ улучшения окружающей среды на птицеферме, способ снижения образования аммиака и ингибирования ферментов уреазы, способ снижения уровня патогенных бактерий, способ уничтожения вредителей в подстилке для птицы, способ предотвращения пододерматита у птиц.

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для производства антибиотика эремомицина. Предложены штамм Amycolatopsis orientalis и способ получения антибиотика эремомицина.

Изобретение относится к способу комплексной экстракции биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья. Указанный способ заключается в том, что воздушно-высушенное измельченное сырье предварительно подвергают микроволновому воздействию в среде Чапека при мощности 300-350 Вт и температуре 100-105°С, а затем засеивают культурой актиномицетов Streptomyces sp.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность. Заявлен природный гликопептидный антибиотик ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству антибиотика, эффективного при лечении инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными и грамположительными микроорганизмами.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма - продуцента антибактериального антибиотика ристомицина из группы полициклических гликопептидов (далбагептидов).
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве апрамицина, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве антибактериального антибиотика линкомицина гидрохлорида, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми, и некоторыми анаэробами.
Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента противоопухолевого антибиотика карминомицина, применяемого в терапии сарком мягких тканей, лимфосаркомах, ретикулосаркомах, хорионэпителиомах, острых миелобластомах и лимфобластомах, хронических миелоидных лейкемиях, и способа получения антибиотика.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных предусматривает получение фильтрата культур стафиококка путем выращивания культур стафилокока на мясопептонном агаре с последующим культивированием в термостате при 37оС в течение 8-10 дней.
Наверх