Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами



Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами

 


Владельцы патента RU 2633692:

ВАН, Цзин (CN)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен суспензионный микрочип для мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, содержащий набор праймеров для выявления Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi, Bartonella, вируса энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, бабезиоза и эрлихиоза. Также рассмотрены способы мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, с применением суспензионного микрочипа. Данное изобретение может быть использовано для обнаружения основных патогенов, передающихся клещами, с целью профилактики заболеваний. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами.

Предпосылки изобретения

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой протокол амплификации нуклеиновых кислот in vitro, разработанный в середине 1980-х, и также является часто используемой в настоящее время техникой для тестирования нуклеиновых кислот. Способ, применяемый для тестирования ПЦР-продукта, представляет собой электрофорез в агарозном геле (AGE), при этом с помощью AGE можно разделять ДНК-фрагменты с различающимся размером около 100 п.о. При помощи AGE невозможно разделить ПЦР-продукты с длинами фрагментов, мало отличающимися или идентичными друг другу. Кроме того, с помощью AGE определяют наличие ПЦР-продукта путем возбуждения флуоресцентного красителя ультрафиолетовым светом с образованием флуоресцентного свечения, при этом чувствительность данного тестирования является относительно низкой. Также с помощью AGE определяют продукты по их размеру, что характеризуется низкой специфичностью и не дает возможность разделять фрагменты одинаковых размеров, полученные с помощью неспецифической амплификации. Более того, красители, обычно применяемые для электрофореза, такие как этидия бромид, представляют собой канцерогены, таким образом, являясь вредными для здоровья при постоянном контакте.

Клещ является кровососущим паразитом, который паразитирует на поверхности тела животных. Как один из самых важных переносчиков заболеваний клещ представлен различными видами, которые широко распространены, и имеют много жизненных форм, а также способны к поражению различных хозяев, таких как птицы, рептилии, млекопитающие и т.п., и способны к распространению многих видов патогенов, при этом большинство заболеваний, вызванных распространением патогенов, являются серьезными природно-очаговыми заболеваниями и зоонозами, и для большинства этих болезней не существует эффективной вакцины, что наносит большой ущерб человеческому здоровью и животноводческому хозяйству. Исследование способа недиагностического тестирования заболеваний, передающихся клещами, в дальнейшем должно расширяться, и в настоящее время необходимо создать удобный и эффективный способ недиагностического мультиплексного тестирования заболеваний, передающихся клещами, с высокой чувствительностью и большой специфичностью. Предыдущие исследования были направлены на тестирование одного вида патогена, и некоторые методы недиагностического тестирования в предшествующем уровне техники были недостаточно чувствительны для раннего выявления большинства случаев инфекционных заболеваний, передающихся клещами; и, кроме того, с точки зрения биологической классификации, патогены, передающиеся клещами, относятся к различным микроорганизмам, таким как бактерии, вирусы, риккетсии, спирохеты и т.п., и в настоящее время большинство тестов на патогены, передающиеся клещами, направлено только на один вид патогена, и такие тесты выполняют специалисты из различных областей классификации патогенов в соответствии со своими профессиональными сферами, что является тратой человеческих ресурсов и денег, и независимое внедрение тестирования в соответствующие профессиональные области не выгодно для принятия комплексных контролирующих мер с высокой эффективностью. Поэтому тестирование патогенов, передающихся клещами, нужно рассмотреть комплексно, в связи со множеством факторов.

Суспензионный микрочип, также называемый жидким микрочипом или жидким чипом, является очень гибкой многофункциональной технологической платформой, которая дает возможность проведения исследований, таких как определение биологических макромолекул типа белков и нуклеиновых кислот, а также идентификация и анализ рецепторов и лигандов. При помощи суспензионного микрочипа выполняют качественный и количественный анализ тестируемого объекта посредством флуоресцентных кодированных микросфер, способных к соединению с зондом, и тестирование через два лазерных луча, при этом для достижения мультиплексного тестирования нуклеиновых кислот 100 видов различных биологических реакций могут быть осуществлены в одной реакционной ячейке. Однако известный способ недиагностического тестирования с помощью суспензионных микрочипов требует больших затрат времени и имеет сложные этапы. В связи с наличием мультиплексного зонда при мультиплексном тестировании выбор температуры гибридизации также является затруднением в развитии технологии.

Краткое описание изобретения

Для решения проблем, существующих в предшествующем уровне техники, целью настоящего изобретения является обеспечение способа недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, с высокой чувствительностью и большой специфичностью.

Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, в частности, включающий следующие этапы:

1) разработка специфического праймера для тестирования, соответствующего нуклеотидной последовательности ПЦР-амплифицированного участка, внесение в GenBank для определения специфичности праймера, связывание в процессе синтеза 5'-конца прямого праймера со специфической этикеткой (Tag) и биотиновое мечение 5'-конца обратного праймера;

2) гибридизация продуктов реакции с соответствующими кодированными микросферами соответственно после завершения ПЦР;

3) специфическое захватывание Tag-последовательности ПЦР-продукта с помощью анти-Tag на микросферах при определенных условиях;

4) добавление стрептавидин-фикоэритрина для связывания с биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами, тестирование продукта с применением системы суспензионных микрочипов LUMINAX и проведение качественного и количественного анализа тестируемого объекта возбуждением красной флуоресценции в среде микросфер и возбуждением фикоэритрина, связанного посредством определенных реакций на поверхности микросфер, где праймерная последовательность представлена следующим образом.

Кроме того, необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем соединения их с помощью вставочной последовательности, и 5'-конец обратного праймера метить биотином.

Более того, гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и стрептавидина-фикоэритрина (SA-PE), в то же время в этих условиях можно осуществлять связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.

Улучшенный способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включает следующие этапы:

1) проведение ПЦР-амплификации тестируемого образца;

2) добавление соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-амплифицированным продуктом;

3) тестирование гибридизированных микросфер с помощью прибора;

где определенный праймер для тестирования разработан соответственно тестируемому вирусу, где 5'-конец прямого праймера связан со специфической Tag, С9 или С18 включается между прямым праймером и Tag как дополнительное плечо и 5'-конец обратного праймера метится биотином.

Кроме того, праймерная последовательность представлена следующим образом.

Кроме того, необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем соединения их с помощью вставочной последовательности, и 5'-конец обратного праймера метить биотином.

Более того, гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и SA-PE, в то же время в этих условиях может осуществляться связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.

Также для амплификации необходимы следующие условия:

В настоящем изобретении раскрыт высокопроизводительный способ недиагностического тестирования, в котором применяется система на основе суспензионных микрочипов в качестве платформы для специфической идентификации патогенов, передающихся клещами, при помощи комбинации технологии мультиплексной ПЦР и этикетка (Tag)-технологии с высокой чувствительностью и высокой специфичностью тестирования, обеспечивающими основу для мониторинга заболеваний, передающихся клещами, а также тестирование и предупреждение возникновения новых патогенов, передающихся клещами, способных распространяться в нашей стране.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 представлена кривая зависимости доза-эффект интенсивности флуоресценции на поверхности кодированных микросфер от плотности ДНК, где в определенном диапазоне интенсивность флуоресценции на поверхности кодированных микросфер положительно коррелирует с количеством добавленной матрицы, где горизонтальная координата отображает количество матричной ДНК, добавленное в пробирку для мультиплексной ПЦР, и вертикальная координата отображает интенсивность флуоресценции на поверхности соответствующих кодированных микросфер. Полуколичественный анализ нуклеиновых кислот проводили с помощью аппроксимации стандартной кривой.

На фигуре 2 проиллюстрированы результаты тестирования вируса клещевого энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, Babesia spp., Ehrlichia, Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi и Bartonella с помощью способа, разработанного в настоящем изобретении; где ось X отображает тестируемый образец, ось Y отображает тестируемые микросферы и ось Z отображает измеренный флуоресцентный сигнал (MFI).

Подробное описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение проиллюстрировано более подробно, как указано далее, со ссылкой на прилагаемые графические материалы, где иллюстративные варианты осуществления представлены в прилагаемых графических материалах. Однако настоящее изобретение может быть осуществлено в различного рода формах и, таким образом, при рассмотрении не должно ограничиваться приведенными здесь примерами вариантов осуществления. В действительности, представленные варианты осуществления даны для того, чтобы сделать настоящее изобретение целостным и завершенным и в полной мере передать суть настоящего изобретения специалисту в данной области.

Настоящее изобретение описывает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, а также относится к усовершенствованиям способа недиагностического тестирования с помощью суспензионных микрочипов и к условиям реакции, и этапам способа ПЦР, и, в частности, к внедрению вырожденных праймеров в тестирование с помощью суспензионных микрочипов. Чип, применяемый в этом способе, в основном состоит из микросфер с последовательностями Tag, биотинилированного праймера, праймера с Tag и стрептавидин-фикоэритрина, при этом способ включает следующие этапы: осуществление амплификации мультиплексной ПЦР с получением меченых мультиплексных целевых продуктов с применением прямого праймера с Tag и обратного праймера с биотинилированным концом и осуществление множественной гибридизации посредством специфичности связывания между последовательностями Tag и усреднения температуры гибридизации, где не только захват микросферами ПЦР-продуктов, но также и связывание стрептавидин-фикоэритрина и биотина на ПЦР-продуктах, захваченных микросферами, достигается в процессе гибридизации, и затем стимулирование распределения флуоресценции в среде микросфер с использованием красного лазера для определения типа ПЦР-продукта на основании разных цветов сред микросфер, возбуждение фикоэритрина с применением зеленого лазера и измерение количества зарегистрированных флуоресцирующих молекул, связанных в среде микросфер для косвенного определения содержания ПЦР-продуктов, связанных в средах микросфер.

В TAG-технике по настоящему изобретению применяется Tag, которая содержит только три основания и таким образом не может быть связана ни с одной природной ДНК и ПЦР-продуктом, таким образом, обеспечивается специфичность процесса гибридизации и усреднение условий гибридизации, а также процесс тестирования становится более удобным и эффективным. Настоящее изобретение в основном направлено на всестороннее тестирование различных патогенов, переносимых взятым из природы клещом, таких как вирус клещевого энцефалита и Rickettsia австралийской лихорадки Q. Высокопроизводительное тестирование, осуществляемое при обработке образцов взятых из природы клещей одной партии для определения патогенов, передающихся клещами, экономно и эффективно, что может способствовать упрощению тестирования, стадий мониторинга и процедур контроля заболеваний и мер предупреждения для повышения эффективности и уменьшения количества повторной работы. Настоящее тестирование также может быть использовано для экспресс-теста патогенов, переносимых с объектами импорта и экспорта из-за границы или с пищевыми продуктами и т.д.

Настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включающий:

во-первых, разработку специфического праймера для тестирования в соответствии с нуклеотидной последовательностью ПЦР-амплифицированной области, внесение праймера в GenBank для определения специфичности праймера, связывание в процессе синтеза 5'-конца прямого праймера со специфической Tag и мечение биотином 5'-конца обратного праймера;

гибридизацию продуктов реакции с соответствующими кодированными микросферами соответственно после завершения ПЦР;

специфическое захватывание Tag-последовательности ПЦР-продукта с помощью анти-Tag микросфер при определенных условиях;

затем добавление стрептавидин-фикоэритрина для связывания с биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами, тестирование с применением системы суспензионных микрочипов LUMINAX и проведение качественного и количественного анализа тестируемого объекта посредством возбуждения красной флуоресценции в среде микросфер и возбуждением фикоэритрина, связанного посредством определенных реакций на поверхности микросфер.

В указанном способе необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем связывания их с помощью вставочной последовательности и 5'-конец обратного праймера необходимо метить биотином. Гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и SA-PE, в то же время в этих условиях можно осуществлять связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.

Настоящее изобретение также предусматривает способ мультиплексной ПЦР, способный эффективно амплифицировать 9 видов патогенов, передающихся клещами, включающий следующие этапы:

1. разработка специфического праймера для тестирования в соответствии с нуклеотидной последовательностью ПЦР-амплифицированной области, выравнивание праймера с применением программного обеспечения BIOEDIT и внесение праймера в GenBank для определения специфичности праймера;

2. разработка некоторых праймеров для патогенов в виде вырожденных праймеров для лучшей избыточности тестирования и положительных результатов тестирования всех патогенов, относящихся к соответствующему виду;

3. присоединение 5'-конца прямого праймера к специфической Tag, включение С9 или С18 между прямым праймером и Tag как дополнительное плечо в процессе синтеза и мечение 5'-конца обратного праймера биотином;

4. составление реакционной системы ПЦР согласно оптимизированному соотношению и осуществление амплификации при оптимизированных условиях.

Настоящее изобретение также предусматривает улучшенный способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включающий следующие этапы: 1. проведение ПЦР-амплификации тестируемого образца; 2. добавление соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-амплифицированным продуктом и 3. тестирование гибридизированных микросфер на приборе.

Оптимизированная система и оптимизированные условия амплификации, включенные в способ ПЦР-амплификации по настоящему изобретению, выглядят следующим образом.

Условия амплификации:

В настоящем изобретении способ добавления соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-продуктом включает

1. добавление 3500 микросфер каждого типа микросфер, имеющих метки анти-Tag, в раствор для гибридизации, так что общее количество микросфер составляет 35 мкл, и затем вычисление соответствующего количества, которое следует добавить согласно результатам подсчета микросфер;

2. добавление 5-17 мкл соответствующих ПЦР-продуктов, полученных при использовании ДНК патогенов, передающихся клещами, в качестве матриц в соответствующие пробирки и затем равномерное перемешивание смеси многократным пипетированием;

3. затем добавление 4 нг/мкл SA-PE в 1 × растворе ТМАС в каждую лунку с получением общего объема 80 мкл;

4. гибридизацию в течение определенного времени при 37°С;

5. перенос гибридизированного продукта на пластину фильтра для фильтрации несвязанных ПЦР-продуктов путем всасывания и затем добавление 80 мкл 1 × раствора ТЕ в каждую лунку и осциллирование для ресуспендирования микросфер;

6. тестирование продукта на приборе после завершения реакции. Систему Bio-PlexTM применяют для тестирования, где численность микросфер определяют возбуждением красной флуоресценции в среде микросфер и количественный анализ связанных ПЦР-продуктов проводят при помощи возбуждения фикоэритрина на поверхности микросфер.

По сравнению с традиционным способом недиагностического ПЦР-тестирования настоящее изобретение имеет преимущество в том, что:

1. благодаря системе усиления сигнала в устройстве и усилению функции биотин-авидина чувствительность тестирования ПЦР-продуктов настоящего изобретения выше, чем при электрофорезе в агарозном геле (AGE);

2. благодаря захватыванию ПЦР-продуктов специфическими зондами специфичность тестирования по настоящему изобретению намного выше, чем при способе, с помощью которого ПЦР-продукты определяют на основании длины фрагментов;

3. настоящее изобретение может быть использовано для разделения и идентифицирования фрагментов со схожей или одинаковой длиной, так что конструкция праймеров для мультиплексной ПЦР может быть гибкой.

По сравнению с традиционным способом мультиплексного недиагностического тестирования настоящее изобретение имеет преимущество в том, что:

1. температура гибридизации усредняется посредством применения TAG-технологии, так что реакция гибридизации продуктов мультиплексной ПЦР патогенов может быть проведена при одной и той же температуре, тем самым улучшая производительность тестирования;

2. конструкция, которая вводит TAG-последовательность в 5'-конец прямого праймера, и мечение 5'-конца обратного праймера биотином в процессе синтеза праймера позволяют проводить реакцию гибридизации между микросферами и ПЦР-продуктами одновременно с реакцией между биотином и стрептавидин-фикоэритрином, что экономит время реакции и повышает эффективность тестирования;

3. введение вырожденных оснований позволяет диапазону тестирования не быть ограниченным определенным видом, или определенным пораженным болезнью или инфицированным растением, таким образом, система мультиплексного тестирования может применяться для тестирования видов.

Как показано на фигурах 1 и 2, настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, который применяется для тестирования девятикратных ПЦР-продуктов вируса клещевого энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, Babesia spp., Ehrlichia, Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi и Bartonella, где способ включает следующие этапы:

1. определение диагностических фрагментов вышеупомянутых двенадцати вирусов, получение последовательности гена-кандидата из GenBank NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США), разработка специфического праймера для тестирования с использованием программного обеспечения и синтез корреляционных праймерных последовательностей, где 5'-конец прямого праймера помечается Tag, связанной с праймером посредством С9 или С18 (имеющими одинаковый результат связывания); и мечение 5'-конца обратного праймера биотином с праймерной последовательностью, показанной в таблице 1, и разбавление этих праймеров до 10 мкмоль/л;

2. проведение амплификации вышеупомянутых девяти видов патогенов, тестируемых при помощи выполнения мультиплексной ПЦР с использованием вышеуказанных праймеров.

Всего тестировали 100 экземпляров собранных образцов клещей путем проведения общего моделирования; образец определяли как положительный, если измеренное значение флуоресценции было равным или в три раза выше фонового значения флуоресценции, при этом тестировали 1 экземпляр Rickettsia австралийской лихорадки Q и 2 экземпляра вируса клещевого энцефалита, что соответствует результатам в изолированной культуре и флуоресцентной количественной ПЦР, и таким образом все образцы были определены верно.

Захватывание и тестирование ПЦР-продукта, подвергаемого тестированию захватыванием зондом, проводили посредством следующих стадий:

i. добавляли 3500 микросфер каждого типа микросфер, имеющих метки анти-Tag, в раствор для гибридизации, так что общее содержание микросфер составляло 35 мкл, и затем вычисляли соответствующее количество для добавления согласно результатам подсчета микросфер;

ii. добавляли 5-17 мкл соответствующих ПЦР-продуктов патогенов, передающихся клещами, в соответствующие пробирки и затем производили равномерное перемешивание смеси многократным пипетированием;

iii. затем добавляли 4 нг/мкл SA-PE в 1 × растворе ТМАС в каждую лунку с получением общего объема 80 мкл;

iv. проводили гибридизацию в течение определенного времени при 37°С;

v. переносили гибридизированный продукт на пластину фильтра для фильтрации несвязанных ПЦР-продуктов путем всасывания и затем добавляли 80 мкл 1 × раствора ТЕ в каждую лунку и осциллировали для ресуспендирования микросфер;

vi. тестировали продукт на приборе после завершения реакции. Систему Bio-PlexTM применяли для тестирования, где численность микросфер определяли возбуждением красной флуоресценции в средах микросфер и количественный анализ связанных ПЦР-продуктов проводили при помощи возбуждения фикоэритрина на поверхности микросфер.

Количественное тестирование

Тестируемые целевые нуклеиновые кислоты серийно разводили согласно общим правилам с разведением более чем на 6 порядков и затем выполняли ПЦР разведенных последовательностей посредством вышеуказанного способа ПЦР и при вышеуказанных условиях реакции. Тестирование ПЦР-продуктов осуществляли, как описано выше, и уравнение, предусматриваемое системой анализа Bio-Plex версии 4.0, использовали для аппроксимации стандартной кривой, основанной на результатах тестирования, таким образом, количественного определения тестируемых образцов нуклеиновых кислот достигали только замещением значений MFI соответствующих тестируемых образцов согласно стандартной кривой.

Например, геном Borreia burgdorferi серийно разводили в 10 раз до 8 фг-800 нг, ПЦР-амплификацию и тестирование выполняли на разведенном геноме согласно разработанному способу и результаты тестирования аппроксимировали стандартной кривой, основанной на уравнении кривой: стандартная кривая: FI=-6,53652+(1881,23+6,53652) / ((1+(конц. / 14,9405)^-1,61702))^0,916998, при этом предел тестирования, рассчитанный по стандартной кривой, составлял 173 фг/пробу.

Анализ Результатов

Вместе с этим тестированием в качестве фона тестирования также проводили тестирование гибридизации негативных контролен ПЦР. Для каждой системы тестирования и каждого фона тестирования выходные данные, полученные с помощью прибора, представляли собой значение медианы интенсивности флуоресценции (MFI) идентичным образом подсчитанных микросфер в соответствующей реакционной системе, т.е. статистическое среднее значение интенсивностей сигналов микросферы, соответствующих идентичным образом подсчитанным микросферам (100 или более). Значения интенсивности флуоресценции (MFI) и фоновые значения MFI (BFI) соответствующих лунок считывали с помощью системы суспензионных микрочипов Bio-Plex.

Анализ результатов

Образец определяли как положительный, если значение MFI тестируемого образца превышало интенсивность фонового сигнала тестирования более чем в три раза.

1. Суспензионный микрочип для мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, содержащий набор следующих праймеров

Объект выявления Праймерная пара Последовательность (5'-3')
Francisella tularensis Fr-55-f AGGTTCAGCTACAGCATCTATCGC
Fr-55-r TACCCCTCTGCCATTAGCACC
Rickettsia австралийской лихорадки Q Q-44-f GAAGCGCAACAAGAAGAACAC
Q-44-r TGGAAGTTATCACGCAGTTG
Borrelia burgdorferi Во-33-f ATGCACATCTGGTGTTAACTA
Во-33-r GACTTATCACCGGCAGTCTTA
Bartonella Barton-20-f GCTATGTCTGCATTCTATCA
Barton-20-r GATCYTCAATCATTTCTTTCCA
вирус энцефалита TBEV-36-f: ACAGACTTGARATGGCCATGTGGAG
TBEV-36-r CCCATCACTCCTGTGTCACACT
вирус синьцзянской
геморрагической
лихорадки
XHF-61-F2 TGGACACYTTCACAAACTC
XHF-61-R3 GACAAATTCCCTGCACCA
Rickettsiae группы
пятнистой
лихорадки
SF-54-f GGCAATTAATATCGCTGACGG
SF-54-r GCATCTGCACTAGCACTTTC
бабезиоз Babesia-53- f CTTAGTATAAGCTTTTATACAGC
Babesia-53- r ATAGGTCAGAAACTTGAATGATACA
эрлихиоз Ehrlichia-42-F CAATTGCTTATAACCTTTTGGT
Ehrlichia-42- R CCCTATTAGGAGGGATACGACCTT

2. Способ мультиплексного выявления с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, с применением суспензионного микрочипа по п. 1, включающий следующие этапы:

1) применение праймеров для специфического выявления согласно нуклеотидной последовательности ПЦР-амплицированной области, подтверждение специфичности праймера, выявленного в GenBank, связывание специфической Tag с 5'-концом прямого праймера и проведение мечения биотином 5'-конца обратного праймера в процессе синтеза;

2) перекрестное сшивание продукта реакции с соответствующей кодированной микросферой после ПЦР;

3) специфическое захватывание Tag-последовательности ПЦР-продукта с помощью анти-Tag на микросферах при определенных условиях и

4) добавление стрептавидин-фикоэритрина для связывания с биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами, выявление с применением системы суспензионных микрочипов LUMINAX и проведение качественного и количественного анализа выявляемых объектов посредством возбуждения красной флуоресценции в среде микросфер и фикоэритрина, связанного посредством определенных реакций на поверхности микросфер.

3. Способ выявления по п. 2, где к 5'-концу прямого праймера необходимо искусственно добавлять участок метки, который связан со вставочной последовательностью, и 5'-конец обратного праймера метят биотином.

4. Способ выявления по п. 2, где микросферы, ПЦР-амплифицированный продукт, SA-PE добавляют одновременно с перекрестным сшиванием при температуре 37°С, в то же время при этих условиях могут осуществлять объединение стрептавидин-фикоэритрина с биотином на ПЦР продукте, захваченном микросферами.

5. Способ мультиплексного выявления с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, с применением суспензионного микрочипа по п. 1, где способ выявления включает следующие этапы:

1) проведение ПЦР-амплификации выявляемых образцов;

2) добавление соответствующей микросферы для перекрестного сшивания с ПЦР продуктом и

3) использование компьютера для выявления микросфер после перекрестного сшивания;

где специфический праймер, применяемый для выявления, применяют в соответствии с определяемым вирусом, и 5'-конец прямого праймера связывают со специфической Tag, обеспечивают включение С9 или С18 между праймером и Tag в качестве дополнительного плеча, и 5'-конец обратного праймера метят биотином.

6. Способ выявления по п. 5, где к 5'-концу прямого праймера необходимо искусственно добавлять участок метки, который связан со вставочной последовательностью, и 5'-конец обратного праймера метят биотином.

7. Способ выявления по п. 5, где микросферы, ПЦР-амплифицированный продукт, SA-PE добавляют одновременно для перекрестного сшивания при температуре 37°С и в то же время при этих условиях могут осуществлять присоединение стрептавидин-фикоэритрина к биотину на ПЦР продукте, захваченном микросферами.

8. Способ выявления по п. 5, где условия амплификации являются следующими



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способ определения устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам второго ряда - фторхинолонам, аминогликозидам и капреомицину, наборы зондов детекции и праймеров амплификации и применение способа для подтверждения клинического диагноза туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью.

Изобретение относится к зонду для детекции полиморфизма V600 в гене BRAF. Изобретение представляет собой флуоресцентно меченый олигонуклеотид (Р1), который, по меньшей мере, на 80% идентичен последовательности оснований длиной от 10 до 50 оснований, включающей основания 228-237 последовательности оснований, указанной в SEQ ID NO:1, в котором основание, соответствующее основанию 237, представляет собой цитозин, меченный флуоресцентным красителем, причем олигонуклеотид распознает полиморфизм, по меньшей мере, в одном из оснований 228-230 последовательности оснований, указанной в SEQ ID NO:1, при условии, что олигонуклеотид отличается от олигонуклеотида, указанного в SEQ ID NO:7 или 19.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы.

Настоящее изобретение относится к биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путём амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S рРНК.
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Заявлен набор для оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР, включающий компоненты для выделения ДНК, видоспецифичные олигонуклеотидные пары праймеров для проведения одностадийной экспресс-идентификации нескольких однонуклеотидных замен в аллелях генов MTHFR, MTR, MTRR и компоненты для детекции результатов гель-электрофорезом.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью.

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике и онкологии, и касается способа выявления генных мутаций BRAF в опухолях человека. Осуществляют амплификацию исследуемого фрагмента гена BRAF посредством асимметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan: BRAF-15-sense – 5'-ROX-aggtgattttggtctagctacagtgaaatc-BHQ2 и BRAF-15-antisense – 5'-Су5-acccactccatcgagatttcactgta-BHQ2 и праймерами: прямой – 5'-gagatctactgttttcctttactt, обратный – 5'-ggccaaaaatttaatcagt.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для стандартизации эффективности амплификации набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации перестроенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, полученном из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем каждый рецептор адаптивной иммунной системы содержит вариабельный участок и соединительный участок, причем композиция содержит: множество синтетических матричных олигонуклеотидов, причем каждый синтетический матричный олигонуклеотид имеет известную концентрацию до амплификации и олигонуклеотидную последовательность общей формулы: , причем: (а) V представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 20 и не более 1000 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей вариабельный (V) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый V содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка; (b) J представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 15 и не более 600 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей соединительный (J) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый J содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка; (с) U1 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) первой специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (d) U2 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) второй специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (e) присутствует по меньшей мере один из B1, В2, В3 и В4 и каждый из B1, В2, В3 и В4 содержит олигонуклеотид В, содержащий последовательность штрихкода из 3-25 последовательных нуклеотидов, которая уникальным образом идентифицирует в качестве спаренной комбинации, (i) уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка из (а) и (ii) уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка из (b); (f) R либо отсутствует, либо содержит сайт распознавания рестрикционного фермента, который содержит олигонуклеотидную последовательность, отсутствующую в (а)-(е); и причем: (g) множество синтетических матричных олигонуклеотидов содержит количество по меньшей мере а или по меньшей мере b уникальных олигонуклеотидных последовательностей в зависимости от того, какое значение больше, причем а представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, а b представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, и композиция содержит по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности V-участка и по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности J-участка.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках rs9652490 LINGO1 (A>G), rs11856808 LINGO1 (C>Т), rs10968280 LINGO2 (А>Т), rs7033345 LINGO2 (C>Т), rs1412229 LINGO2 (А>Т), rs10812774 LINGO2 (C>Т) и rs3794087 SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, композицию для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, набор для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, который включает в себя композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом и реакционную пробирку, набор для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ обратной транскрипции РНК-матрицы, способ амплификации нуклеиновой кислоты, композицию ПЦР с обратной транскрипцией для диагностики злокачественного новообразования.

Изобретение относится к области диагностической медицины. Образец цельной крови, собранный в антисвертывающий раствор, центрифугируют. Отбирают плазму. Из плазмы выделяют внДНК, которые модифицируют при помощи бисульфита натрия. Проводят МС-ПЦР с использованием специально подобранных праймеров и зондов для контрольного гена FDPS и аберрантно-метилированных маркерных генов RARbeta2, RASSF1A и TCF21. Далее проводят сравнительный анализ результатов ПЦР с учетом полученного Ct для выявляемых генов. Если значение Ct≤35,1 для гена FDPS и Ct≤41 для генов RARbeta2 и/или RASSF1A и/или Ct≤42,5 для гена TCF 21, то делают заключение о наличии рака легкого у пациента. Технический результат заключается в упрощении известного способа, повышении его чувствительности и специфичности. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера. Всего разработаны четыре системы праймеров для четырех типов мутаций мтДНК m.11778G>A, m.8993T>G, m.3243A>G, m.8344A>G, ассоциированных с наследственными митохондриальными заболеваниями, представленные в виде лиофилизированных веществ. Изобретение обеспечивает молекулярно-генетическую детекцию патогенных мутаций митохондриальной ДНК, ассоциированных с наследственными митохондриальными патологиями, и определение уровня гетероплазмии по данным мутациям. 1 з. п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к молекулярной генетике. Описан способ определения полиморфизма генов, ассоциированных с летальным рецессивным генетическим дефектом крупного рогатого скота. Конкретно гена аполипротеина В (АРОВ), ассоциированного с гаплотипом HCD. Определяют полиморфизм гена АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, с помощью специфичного однопробирочного метода полимеразной цепной реакции. При этом продукты амплификации аллелей А и N различаются по длине - фрагмент длиной 215 п.о. соответствует аллелю А, фрагмент длиной 327 п.о. соответствует аллелю N, а идентификация генотипов животных осуществляется по результатам электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле. Способ может быть использован в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене АРОВ крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом фертильности HCD, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота. 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к сельскохозяйственной области биотехнологии и животноводству и касается способа оценки плодовитости свиней пород ландрас и крупная белая. Способ включает выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена LIF с использованием праймеров 5'-ATGTGGATGTGGCCTACGG-3' и 5'GGGAACAAGGTGGTGATGG-3', рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LIF эндонуклеазой рестрикции DraIII, определение генотипов и отбор животных с генотипом AA/LIF, причем один фрагмент размером 407 п. н. соответствует генотипу АА, два фрагмента размером 266- и 144 н.п. - генотипу ВВ, три фрагмента 407-, 266- и 144 н.п. - генотипу АВ. Животные с генотипом AA/LIF обладают высокими показателями плодовитости. Изобретение позволяет эффективнее проводить оценку плодовитости свиноматок пород ландрас и крупная белая и отбирать свиней, генетически предрасположенных к более высоким показателям плодовитости. 2 ил., 2 табл., 2 пр.
Наверх