Способ выявления в биологическом материале днк вируса гепатита в при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной пцр



Способ выявления в биологическом материале днк вируса гепатита в при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной пцр
Способ выявления в биологическом материале днк вируса гепатита в при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной пцр
Способ выявления в биологическом материале днк вируса гепатита в при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной пцр

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2633755:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) (RU)

Изобретение относится к медицине и, в частности, к вирусологии и инфекционным заболеваниям. Предложен способ выявления вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке путем определения в биопробе ДНК вируса методом ПЦР с дальнейшим секвенированием фрагментов. Выявление проводят в плазме и/или сыворотке крови, сгустке крови, ротоглоточных смывах, сперме, тканях печени. Выявление проводится в два этапа. На первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер: 5'-ctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgc-3', обратный праймер: 5'-cagaccaatttatgcctacagcctccta-3'). На втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов генома ВГВ. Способ обеспечивает повышение специфичности и чувствительности диагностики вируса гепатита В. 4 пр., 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к проблеме изучения инфекционных вирусных заболеваний, и касается поиска новых направлений в специфической диагностике хронического вирусного гепатита В.

Клинические проявления хронического вирусного гепатита В многообразны и зависят, в основном, от биологических свойств вируса и его взаимодействия с иммунной системой хозяина. Вирус гепатита В характеризуется высокой степенью генетической гетерогенности в связи с использованием обратной транскриптазы в процессе репликации вируса. Определение генотипов и субтипов вируса гепатита В важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, а также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии. Одной из форм естественного течения хронического вирусного гепатита В является оккультный гепатит В, характеризующийся сохранением ДНК вируса гепатита B в печени и, в значительно более низкой, часто не идентифицируемой, концентрации в периферической крови пациентов с негативным HBsAg. Более 20% больных серонегативны по всем маркерам вируса гепатита В [Torbenson М., Thomas D.L. Occult hepatitis В // Lancet Infect. Dis. 2002. vol. 2. P. 479-486]. При этом оккультный ВГВ может играть существенную роль в развитии фиброза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [Raimondo G., Pollicino Т., Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection // J. Hepatol. 2007. vol. 46. P. 160-170].

Глубокое типирование, позволяющее выявлять субтипы вируса, важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, что обретает большую значимость в связи с общемировой тенденцией к смещению за счет миграционной активности распространенности тех или иных генотипов и субтипов ВГВ в различных регионах и выявлению редких субтипов в нехарактерных для них географических ареалах [Raimondo G., Pollicino Т., Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection // J. Hepatol. 2007. vol. 46. P. 160-170]. Глубокое типирование также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии, так как, например, для ВГВ субтипа D1 показана высокая частота мутаций в промоторе гена Core, ассоциированных с развитием гепатоцеллюлярной карциномы, а также значительно более высокая, чем при ВГВ субтипа D2, частота двойной мутации, приводящей к уменьшению или предотвращению синтеза HBeAg, в то время как субтип А2 редко ассоциируется с HBeAg(-) заболеванием или раком печени [Bissinger A.L., Fehrle С, Werner C.R., Lauer U.M., Malek N.P., Berg CP. Epidemiology and Genotyping of Patients with Chronic Hepatitis B: Genotype Shifting Observed in Patients from Central Europe // Pol J Microbiol. - 2015 - 64(1): 15-21; Khan, A. Novel point mutations and mutational complexes in the enhancer II, core promoter and precore regions of hepatitis В virus genotype D1 associated with hepatocellular carcinoma in Saudi Arabia / Khan A., Al Balwi M.A., Tanaka Y., Hajeer A., Sanai P.M., Al Abdulkarim I., Al Ayyar L., Badri M., Saudi D., Tamimi W., Mizokami M., Al Knawy B. // Int. J. Cancer. - 2013. - vol. 133 (12). P. 2864-2871).

Субтипы Al, С, B2-B5 и H связаны с более серьезными осложнениями, чем субтипы А2, В1 и В6 [Khan, A. Novel point mutations and mutational complexes in the enhancer II, core promoter and precore regions of hepatitis В virus genotype D1 associated with hepatocellular carcinoma in Saudi Arabia / Khan A., Al Balwi M.A., Tanaka Y., Hajeer A., Sanai P.M., Al Abdulkarim I., Al Ayyar L., Badri M., Saudi D., Tamimi W., Mizokami M., Al Knawy B. // Int. J. Cancer. - 2013. - vol. 133 (12). P. 2864-2871].

В то время как прямое секвенирование нуклеотидной последовательности является золотым стандартом для классификации генотипов и субгенотипов вируса гепатита В [Banerjee, P.A Rare HBV Subgenotype D4 with Unique Genomic Signatures Identified in North-Eastem India - An Emerging Clinical Challenge? / Banerjee P., Mondal R.K., Nandi M., Ghosh S., Khatun M., Chakraborty N., Bhattacharya S., RoyChoudhury A., Banerjee S., Santra A., Sil S., Chowdhury A., Bhaumik P., Datta S. // PLoS One. -2014. - vol. 9 (10). e109425], используемые для выявления вируса гепатита В методики на основе технологии ПЦР недостаточно чувствительны для выявления вируса гепатита В низких концентраций при малых объемах клинического материала и/или основаны на выявлении коротких консервативных фрагментов нуклеотидных последовательностей, что не позволяет осуществлять глубокое типирование вируса.

Известен метод выявления ВГВ, основанный на полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, представленный в коммерческом наборе "АмплиСенс® HBV-FL" (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Принцип тестирования основывается на экстракции ДНК из плазмы крови совместно с ВКО и проведении амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «по конечной точке» (формат FEP) или в режиме «реального времени» (формат FRT). Данный метод позволяет выявить вирус при низких концентрациях, до 5 МЕ/мл. Однако для обнаружения вируса столь низких концентраций необходимо соблюдение двух условий экстракции ДНК: обязателен большой объем образца (1000 мл плазмы крови) и специализированный набор для выделения ДНК, использующийся вкупе с автоматической станцией для экстракции нуклеиновых кислот.

При использовании более доступных и широко распространенных методов экстракции ДНК, включая коммерческие наборы для выделения НК «АмплиПрайм Рибо-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва), с объемом экстракции 100 мкл, предел аналитической чувствительности составляет 200 МЕ/мл и 100 МЕ/мл для форматов FEP и FRT соответственно. Полученные в ходе амплификации фрагменты невозможно использовать для секвенирования и дальнейшего глубокого типирования вируса в связи с их небольшой протяженностью.

Известен также набор реагентов для выявления и дифференциации генотипов А, В, С и D вируса гепатита В (HBV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® HBV-генотип-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Принцип тестирования основывается на экстракции ДНК из плазмы крови и амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием олигонуклеотидов, высокоспецифичных к коротким консервативным участкам ВГВ генотипов А, В, С и D. К недостаткам метода относится низкая аналитическая чувствительность - 500 МЕ/мл и, как и при первом решении, невозможность дальнейшего секвенирования фрагментов для глубокого типирования вируса. Таким образом, данный метод не позволяет обнаружить иные генотипы, выявить субтипы вируса и не может быть использован при низкой вирусной нагрузке.

Известен также набор реагентов для выявления мутаций устойчивости ВГВ к противовирусным препаратам в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием продуктов амплификации «АмплиСенс® HBV-Resist-Seq» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Использование двухэтапной ПЦР позволяет увеличить чувствительность метода для получения достаточных для анализа протяженных фрагментов генома вируса. Тем не менее, порог чувствительности относится к недостаткам метода, так как составляет 150 МЕ/мл. Кроме того, метод предназначен для секвенирования фрагмента ревертазного (RT) домена P-гена ВГВ размером 970 п.н., не позволяющего определить субтип вируса.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе зарубежных коллег, посвященной передаче ВГВ от матери ребенку [Candotti D., Danso K., Allain J-P. Matemofetal transmission of hepatitis В vims genotype E in Ghana, west Africa // J. Gen. Virol. - 2007. - vol. 88. - P. 2686-2695, doi: 10.1099/vir.0.83102-0]. Метод заключается в гнездовой ПЦР с последовательным использованием двух пар праймеров: на первом этапе прямой праймер 5'-ACATACTCTTTGGAAGGCKG-3' и обратный праймер 5'-CGTCAGCAAACACTTGGC-3', на втором этапе прямой праймер 5'-GCCTCATTTTGYGGGTCA-3' и обратный праймер 5'-AGCAAARCCCAAAAGACC-3'. При этом ПЦР для каждого раунда проводили в конечном объеме 50 мкл с 2,25 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из дНТФ, 1 мкМ каждого праймера, 1X ПЦР-буфера II, 1 ед. полимеразы AmpliTaq (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom), ДНК-матрицы 10 мкл. при следующих условиях: тридцать пять циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 48°С в течение 30 секунд и элонгацию при 72°С в течение 30 секунд. Чувствительность предложенного метода достигала 10 МЕ/мл. Недостаток метода заключается в необходимости большого объема плазмы крови для экстракции ДНК (500 мкл), а также в невозможности убедиться в полноценности генома вируса за счет секвенирования как минимум двух из четырех участков генома ВГВ, как это было рекомендовано на совещании по оккультному ВГВ [Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis В virus infection. // Journal of Hepatology. - 2008. - vol. 49. №4. - Р. 652-657].

1. Авторами предложен метод выявления вируса гепатита В методом «гнездовой» ПЦР с использованием на втором этапе нескольких пар праймеров, фланкирующих четыре региона генома вируса. В том числе фрагменты, включающие рекомендованный для гено- и субтипирования ВГВ регион Pre-S1/Pre-S2/S область 2848-3182…1-835 нт., core регион область 1901-2452 нт., регион X область 1374-1838 нт., регион pol область 247-1280 нт., согласно представленному в международной базе данных GenBank изоляту Mart-B47 (НЕ974377.1) [Brichler S., Lagathu G., Chekaraou M.A. et al. African, Amerindian and European hepatitis В virus strains circulate on the Caribbean Island of Martinique // J. Gen. Virol. 2013. vol. 94 (Pt 10). P. 2318-2329].

Технический результат - повышение специфичности, чувствительности и возможности дифференцировать изоляты вируса гепатита В с высокой идентичностью нуклеотидных последовательностей.

Сущность метода заключается в том, что на первом этапе проводится амплификация ДНК методом асимметричной полимеразной цепной реакции с использованием протяженных олигонуклеотидных праймеров с разной температурой плавления, комплементарных области наибольшего сходства геномов различных изолятов вируса гепатита В. Для повышения чувствительности проводится вторая полимеразная цепная реакция с использованием продукта амплификации первой реакции и внутренних (вложенных, гнездовых) праймеров, некоторые из которых были предложены на совещании по оккультному вирусному гепатиту В [Candotti D., Danso K., Allain J-P. Matemofetal transmission of hepatitis В virus genotype E in Ghana, west Africa // J. Gen. Virol. - 2007. - vol. 88. - P. 2686-2695, doi: 10.1099/vir.0.83102-0]. При этом состав реакционного буфера изменяется на разных этапах.

На первом этапе используются протяженные олигонуклеотидные праймеры:

Прямой праймер 5'-CTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3'

Обратный праймер 5'-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCCTA-3'

Состав амплификационной смеси на первом этапе:

3 пмоль/л прямого праймера, 30 пмоль/л обратного праймера, по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата, 7,5 ммоль/л MgCl2, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), формамид 4% от конечного объема, глицерин 6% от конечного объема, 10 мкл раствора ДНК, вода без нуклеаз до конечного объема 30 мкл.

ПЦР проводят при следующих условиях:

после денатурации при 95°C в течение 5 минут устанавливали 35 циклов амплификации в режиме: 95°C - 30 сек, 68°C - 5 мин; затем финальная элонгация при 72°C - 5 мин.

На втором этапе используют одну из пар праймеров:

Пара 1:

Прямой праймер 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3'

Обратный праймер 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3'

Пара 2:

Прямой праймер 5'-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3'

Обратный праймер 5'-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3'

Пара 3:

Прямой праймер 5'-CCATACTGCGGAACTCCTAGC-3'

Обратный праймер 5'-CCCAAGGCACAGCTTGGAGG-3'

Пара 4:

Прямой праймер 5'-TCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTC-3'

Обратный праймер 5'-AGTTCCGCAGTATGGATCGG-3'

Состав амплификационной смеси на втором этапе:

15 пмоль/л каждого праймера, по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата, 6,7 ммоль/л MgCl2, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), DMSO 10% от конечного объема, формамид 4% от конечного объема, 10 мкл продукта амплификации первого этапа, вода без нуклеаз до конечного объема 30 мкл.

ПЦР проводят при следующих условиях:

после денатурации при 95°C в течение 5 минут устанавливали 35 циклов амплификации в режиме: 95°C - 30 сек, 52°C - 30 сек, 72°C - 1 мин 30 сек; затем финальная элонгация при 72°C - 5 мин.

Таким образом, предложенный метод отличается от прототипа тем, что на первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер 5'-ctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgc-3', обратный праймер 5'-cagaccaatttatgcctacagcctccta-3'), на втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов геном ВГВ, при этом в составе амплификационной смеси на каждом этапе неравномерное соотношение дезоксинуклеозидтрифосфатов и высокая концентрация MgCl2, на первом этапе в смеси присутствуют формамид и глицерин в количестве 4% и 6% от конечного объема соответственно, а на втором этапе формамид и DMSO в количестве 4% и 10% от конечного объема соответственно.

Аналитическую чувствительность метода проверяли методом поэтапного разведения.

Были выбраны 10 образцов плазмы крови, содержащие различные концентрации ВГВ. Вирусную нагрузку предварительно измеряли с помощью стандартизированного набора для количественного определения ДНК ВГВ в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». «АмплиСенс® НВУ-Монитор-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва).

Каждый образец поэтапно разводили предварительно проанализированной плазмой крови без ВГВ (чистой плазмой) следующим образом. Аликвоту образца объемом 100 мкл вносили в микропробирку Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 100 мкл чистой плазмы, тщательно пипетировали и переносили 100 мкл полученного пула в новую микропробирку, куда снова добавляли 100 мкл чистой плазмы, пипетировали и 100 мкл нового пула переносили в третью пробирку и т.д. до десятикратного последовательного разведения (таб. 1).

После разведения осуществляли экстракцию ДНК из каждого пула разведения каждого образца с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Полученные образцы ДНК амплифицировали, согласно предложенному методу. Результаты выявления вируса в пулах разведения представлены в таблице 2.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен электрофорез продуктов амплификации второго этапа (праймеры 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3', 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3') последовательных разведений образца №9, вирусная нагрузка 5*103 МЕ/мл. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 9,7 МЕ/мл) виден очень слабо. На фиг. 2 представлен Черно-белый негатив фотографии 1. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 9,7 МЕ/мл) обозначен овалом.

Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода.

Пример 1

Больные с различной степенью выраженности фиброза печени и циррозом: 11 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С, 5 пациентов с гепатитом неясной этиологии. Все пациенты серонегативны к вирусу гепатита В. При использовании стандартных наборов ДНК вируса гепатита В не была выявлена в плазме крови. При использовании нашего метода ДНК вируса гепатита В в плазме крови была выявлена у 6 пациентов с ХВГС и у всех пациентов с криптогенным гепатитом. Полученные результаты были подтверждены при получении биопсийного материала печени.

Пример 2

Больная с клинической картиной острого гепатита, начавшейся после пребывания в стационаре по причине, не связанной с заболеваниями печени. Высказаны подозрения об инфицировании пациентки в клинике. ДНК вируса гепатита В стандартными методами не выявлен. При использовании нашего метода ДНК вируса гепатита В в плазме крови выявлен, осуществлено секвенирование региона Pre-S1/Pre-S2/S, проведен филогенетический анализ для сравнения с вирусом гепатита В, выявленным у пациентов стационара (предположительный источник инфекции). Показаны значимые отличия изолятов. Высказано предположение об активации репликации оккультного вируса гепатита В на фоне иммуносупресси.

Пример 3

Больной из Центральной Африки спустя несколько месяцев после пребывания в РФ поступил в госпиталь с симптомами острого гепатита в тяжелой форме. При использовании стандартных методов был выявлен вирус гепатита В, генотипировать вирус не удалось. При использовании нашего метода в плазме крови больного были выявлены и типированы два изолята вируса гепатита В: субтипа D2 и субтипа А1, не характерного для РФ. Предположительно невозможность типирования стандартным методом с использованием коммерческого набора объясняется множественными мутациями вируса. Высказано предположение об активации репликации оккультного вируса гепатита В субтипа А1 на фоне подавления иммунитета при инфицировании вирусом гепатита В субтипа D2.

Пример 4

Представлены 155 клинических образцов из Республики Гвинея, в том числе 130 образцов сыворотки крови в объеме, не превышающем 80 мкл, а также 25 клинических образцов посмертных ротоглоточных соскобов. ДНК Вируса гепатита В не удалось выявить при использовании стандартных методов. При использовании предлагаемого нами способа выявлена ДНК вируса гепатита В в 19 образцах, полученных из сыворотки крови, а также в 13 образцах, полученных из ротоглоточных соскобов, при этом ДНК вируса гепатита В выявлена как в HBsAg (+) образцах, так и в HBsAg (-) образцах. Проведено секвенирование региона Pre-S1/Pre-S2/S. Представлены субтипы ВГВ: А2, A3, D1, D2, D3, Е. Таким образом, подтверждается возможность использования предлагаемого способа для выявления в малых объемах клинических образцов вируса гепатита В разных генотипов и субтипов, включая генотипы и субтипы не характерные для РФ.

Также в течение 2015-2016 года было проведено более 800 исследований предложенным методом на основе технологии ПЦР. Выявлен высокий процент встречаемости оккультного гепатита В среди доноров в географических регионах с высокой распространенностью вирусных гепатитов. Показана широкая распространенность оккультного вируса гепатита В у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Способ выявления ДНК вируса гепатита B в биологическом материале на основе двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием амплифицированных фрагментов четырех регионов вируса, отличающийся тем, что на первом этапе применяется асимметричная ПЦР с протяженными олигонуклеотидными праймерами, а именно прямой праймер 5'-CTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3' и обратный праймер 5'-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCCTA-3', продукты которой затем используют для второго этапа амплификации с одной из следующих пар вложенных праймеров: пара 1 прямой праймер 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3' обратный праймер 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3' или пара 2 прямой праймер 5'-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3' обратный праймер 5'-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3', или пара 3 прямой праймер 5'-CCATACTGCGGAACTCCTAGC-3' обратный праймер 5'-CCCAAGGCACAGCTTGGAGG-3', или пара 4 прямой праймер 5'-TCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTC-3' обратный праймер 5'-AGTTCCGCAGTATGGATCGG-3', причем амплификационная смесь для первого этапа содержит: 0,3 мкл прямого праймера (конц. 10 пмоль/л), 3 мкл обратного праймера (концентрация 10 пмоль/л), 2,5 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (где содержится по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата), 6 мкл MgCl2 (25 мМ), 2,5 мкл буфера для Taq ДНК-полимеразы (включает 750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), 1,2 мкл формамида, 1,8 мкл глицерина, 0,5 мкл рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, 1 ед.), 10 мкл раствора ДНК, 2,2 мкл вода без нуклеаз, общий объем смеси 30 мкл. амплификационная смесь для второго этапа содержит: по 1,5 мкл прямого и обратного праймеров (концентрация 10 пмоль/л), 2,5 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов, (содержащей по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата), 5 мкл MgCl2 (25 мМ), 2,5 мкл буфера для Taq ДНК-полимеразы (включает 750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), 1,2 мкл формамида, 3 мкл DMSO, 0,5 мкл рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, 1 ед.), 10 мкл продукта амплификации первого этапа, 2,3 мкл вода без нуклеаз, общий объем смеси 30 мкл.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК3) в вегетативных органах растений яблони, винограда, озимой пшеницы.

Изобретение относится к области медицины, а именно спортивной медицины, и предназначено для оптимизации дифференцированного преподавания физической культуры студентам с учетом их физической работоспособности и тренированности.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ обработки опухолевых клеток композицией, содержащей дихлорацетат натрия (ДХА) и кофеин бензоат натрия.

Изобретение относится к медицине и может применяться в кардиохирургии и касается способа определения предикторов сохраненной функции синусового узла у пациентов с длительно персистирующей фибрилляцией предсердий.

Изобретение относится к животноводству и ветеринарии и может быть использовано при оценке воспроизводительной способности коров мясных пород. Определяют воспроизводительные качества маток крупного рогатого скота мясного направления продуктивности по элементному составу шерсти.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики немалиновой миопатии, при котором у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани, проводят иммуногистохимическое выявление фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1α), для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор для уменьшения фонового неспецифического окрашивания, затем срезы инкубируют с поликлональными антителами кролика к белку HIF-1α, после промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, покрывают фотозащитным реагентом и проводят люминесцентную микроскопию, а при выявлении локусов округлой и/или овальной формы красной окраски диаметром 3-5 мкм под оболочкой мышечного волокна диагностируют немалиновую миопатию.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН).

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ профилактики африканской чумы свиней, включающий выявление животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и перинатологии, и может быть использовано для прогнозирования неврологических нарушений у новорожденных с задержкой внутриутробного развития плода (ЗВРП).

Изобретение касается способа оценки вирусной контаминации воздуха РНК-содержащими вирусами, возбудителями острых респираторных вирусных инфекций в помещении. Представленный способ включает отбор проб воздуха с помощью пробоотборника «Флора - 100», который размещают по определенной схеме, и идентификацию микроорганизмов, при этом дополнительно устанавливают мембранный фильтр в пробоотборник, в чашку с отобранной пробой помещают 10 мл среды для сохранения и стабилизации РНК вирусов, а идентификацию вирусов проводят путем определения содержания нуклеиновых кислот возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ прогнозирования восприимчивости человека, инфицированного вирусом гепатита С (HCV), к терапии пэгинтерфероном альфа-2a, рибавирином и противовирусным агентом прямого действия.

Изобретение относится к биохимии. Описан набор для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV (bovine immunodeficiency virus)), содержащий пару специфичных праймеров и ДНК-зонд, методом ПЦР в режиме реального времени.

Способ относится к микробиологии и может применяться для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам. Способ количественной оценки литической активности бактериофагов предусматривает приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма, выращенной при заданных условиях и соединенной с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом.

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры.

Изобретение относится к области медицины, в частности к применению молекулярных маркеров ВПЧ ВКР и их качественных и количественных характеристик для прогнозирования течения гиперпролиферативных заболеваний ШМ.
Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для определения состояния здоровья женщины в периоде климактерия. Определяют степень тяжести симптомов приливов и степень тяжести симптомов потливости по 10-балльной визуально-аналоговой шкале. Выявляют дефицит секреции мелатонина с помощью теста-опросника на дефицит мелатонина. Определяют метаболит 6-сульфатоксимелатонина в двух порциях мочи. Проводят анализ сыворотки крови и определяют фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, эстрадиол, пролактин, общий тестостерон, тиреотропный гормон, инсулин, глюкозу крови. Оценивают степень тяжести климактерического синдрома. Определяют период жизни женщины. Определяют ожидаемую продолжительность жизни. Определяют биологический возраст. Оценивают качество жизни с помощью опросника «SF-36» совместно с «WHQ». Дополнительно для женщин в период перименопаузы определяют прогестерон. Для женщин в период постменопаузы выявляют генитоуринарный менопаузальный синдром и поздние обменные нарушения. Способ позволяет достоверно определить состояние здоровья женщины в периоде климактерия за счет оценки комплекса наиболее значимых показателей. 7 з.п. ф-лы, 3 пр.
Наверх