Способ выявления в биологическом материале днк вируса гепатита в при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной пцр

Изобретение относится к медицине и, в частности, к вирусологии и инфекционным заболеваниям. Предложен способ выявления вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке путем определения в биопробе ДНК вируса методом ПЦР с дальнейшим секвенированием фрагментов. Выявление проводят в плазме и/или сыворотке крови, сгустке крови, ротоглоточных смывах, сперме, тканях печени. Выявление проводится в два этапа. На первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер: 5'-ctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgc-3', обратный праймер: 5'-cagaccaatttatgcctacagcctccta-3'). На втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов генома ВГВ. Способ обеспечивает повышение специфичности и чувствительности диагностики вируса гепатита В. 4 пр., 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к проблеме изучения инфекционных вирусных заболеваний, и касается поиска новых направлений в специфической диагностике хронического вирусного гепатита В.

Клинические проявления хронического вирусного гепатита В многообразны и зависят, в основном, от биологических свойств вируса и его взаимодействия с иммунной системой хозяина. Вирус гепатита В характеризуется высокой степенью генетической гетерогенности в связи с использованием обратной транскриптазы в процессе репликации вируса. Определение генотипов и субтипов вируса гепатита В важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, а также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии. Одной из форм естественного течения хронического вирусного гепатита В является оккультный гепатит В, характеризующийся сохранением ДНК вируса гепатита B в печени и, в значительно более низкой, часто не идентифицируемой, концентрации в периферической крови пациентов с негативным HBsAg. Более 20% больных серонегативны по всем маркерам вируса гепатита В [Torbenson М., Thomas D.L. Occult hepatitis В // Lancet Infect. Dis. 2002. vol. 2. P. 479-486]. При этом оккультный ВГВ может играть существенную роль в развитии фиброза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [Raimondo G., Pollicino Т., Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection // J. Hepatol. 2007. vol. 46. P. 160-170].

Глубокое типирование, позволяющее выявлять субтипы вируса, важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, что обретает большую значимость в связи с общемировой тенденцией к смещению за счет миграционной активности распространенности тех или иных генотипов и субтипов ВГВ в различных регионах и выявлению редких субтипов в нехарактерных для них географических ареалах [Raimondo G., Pollicino Т., Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection // J. Hepatol. 2007. vol. 46. P. 160-170]. Глубокое типирование также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии, так как, например, для ВГВ субтипа D1 показана высокая частота мутаций в промоторе гена Core, ассоциированных с развитием гепатоцеллюлярной карциномы, а также значительно более высокая, чем при ВГВ субтипа D2, частота двойной мутации, приводящей к уменьшению или предотвращению синтеза HBeAg, в то время как субтип А2 редко ассоциируется с HBeAg(-) заболеванием или раком печени [Bissinger A.L., Fehrle С, Werner C.R., Lauer U.M., Malek N.P., Berg CP. Epidemiology and Genotyping of Patients with Chronic Hepatitis B: Genotype Shifting Observed in Patients from Central Europe // Pol J Microbiol. - 2015 - 64(1): 15-21; Khan, A. Novel point mutations and mutational complexes in the enhancer II, core promoter and precore regions of hepatitis В virus genotype D1 associated with hepatocellular carcinoma in Saudi Arabia / Khan A., Al Balwi M.A., Tanaka Y., Hajeer A., Sanai P.M., Al Abdulkarim I., Al Ayyar L., Badri M., Saudi D., Tamimi W., Mizokami M., Al Knawy B. // Int. J. Cancer. - 2013. - vol. 133 (12). P. 2864-2871).

Субтипы Al, С, B2-B5 и H связаны с более серьезными осложнениями, чем субтипы А2, В1 и В6 [Khan, A. Novel point mutations and mutational complexes in the enhancer II, core promoter and precore regions of hepatitis В virus genotype D1 associated with hepatocellular carcinoma in Saudi Arabia / Khan A., Al Balwi M.A., Tanaka Y., Hajeer A., Sanai P.M., Al Abdulkarim I., Al Ayyar L., Badri M., Saudi D., Tamimi W., Mizokami M., Al Knawy B. // Int. J. Cancer. - 2013. - vol. 133 (12). P. 2864-2871].

В то время как прямое секвенирование нуклеотидной последовательности является золотым стандартом для классификации генотипов и субгенотипов вируса гепатита В [Banerjee, P.A Rare HBV Subgenotype D4 with Unique Genomic Signatures Identified in North-Eastem India - An Emerging Clinical Challenge? / Banerjee P., Mondal R.K., Nandi M., Ghosh S., Khatun M., Chakraborty N., Bhattacharya S., RoyChoudhury A., Banerjee S., Santra A., Sil S., Chowdhury A., Bhaumik P., Datta S. // PLoS One. -2014. - vol. 9 (10). e109425], используемые для выявления вируса гепатита В методики на основе технологии ПЦР недостаточно чувствительны для выявления вируса гепатита В низких концентраций при малых объемах клинического материала и/или основаны на выявлении коротких консервативных фрагментов нуклеотидных последовательностей, что не позволяет осуществлять глубокое типирование вируса.

Известен метод выявления ВГВ, основанный на полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, представленный в коммерческом наборе "АмплиСенс® HBV-FL" (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Принцип тестирования основывается на экстракции ДНК из плазмы крови совместно с ВКО и проведении амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «по конечной точке» (формат FEP) или в режиме «реального времени» (формат FRT). Данный метод позволяет выявить вирус при низких концентрациях, до 5 МЕ/мл. Однако для обнаружения вируса столь низких концентраций необходимо соблюдение двух условий экстракции ДНК: обязателен большой объем образца (1000 мл плазмы крови) и специализированный набор для выделения ДНК, использующийся вкупе с автоматической станцией для экстракции нуклеиновых кислот.

При использовании более доступных и широко распространенных методов экстракции ДНК, включая коммерческие наборы для выделения НК «АмплиПрайм Рибо-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва), с объемом экстракции 100 мкл, предел аналитической чувствительности составляет 200 МЕ/мл и 100 МЕ/мл для форматов FEP и FRT соответственно. Полученные в ходе амплификации фрагменты невозможно использовать для секвенирования и дальнейшего глубокого типирования вируса в связи с их небольшой протяженностью.

Известен также набор реагентов для выявления и дифференциации генотипов А, В, С и D вируса гепатита В (HBV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® HBV-генотип-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Принцип тестирования основывается на экстракции ДНК из плазмы крови и амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием олигонуклеотидов, высокоспецифичных к коротким консервативным участкам ВГВ генотипов А, В, С и D. К недостаткам метода относится низкая аналитическая чувствительность - 500 МЕ/мл и, как и при первом решении, невозможность дальнейшего секвенирования фрагментов для глубокого типирования вируса. Таким образом, данный метод не позволяет обнаружить иные генотипы, выявить субтипы вируса и не может быть использован при низкой вирусной нагрузке.

Известен также набор реагентов для выявления мутаций устойчивости ВГВ к противовирусным препаратам в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием продуктов амплификации «АмплиСенс® HBV-Resist-Seq» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Использование двухэтапной ПЦР позволяет увеличить чувствительность метода для получения достаточных для анализа протяженных фрагментов генома вируса. Тем не менее, порог чувствительности относится к недостаткам метода, так как составляет 150 МЕ/мл. Кроме того, метод предназначен для секвенирования фрагмента ревертазного (RT) домена P-гена ВГВ размером 970 п.н., не позволяющего определить субтип вируса.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе зарубежных коллег, посвященной передаче ВГВ от матери ребенку [Candotti D., Danso K., Allain J-P. Matemofetal transmission of hepatitis В vims genotype E in Ghana, west Africa // J. Gen. Virol. - 2007. - vol. 88. - P. 2686-2695, doi: 10.1099/vir.0.83102-0]. Метод заключается в гнездовой ПЦР с последовательным использованием двух пар праймеров: на первом этапе прямой праймер 5'-ACATACTCTTTGGAAGGCKG-3' и обратный праймер 5'-CGTCAGCAAACACTTGGC-3', на втором этапе прямой праймер 5'-GCCTCATTTTGYGGGTCA-3' и обратный праймер 5'-AGCAAARCCCAAAAGACC-3'. При этом ПЦР для каждого раунда проводили в конечном объеме 50 мкл с 2,25 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из дНТФ, 1 мкМ каждого праймера, 1X ПЦР-буфера II, 1 ед. полимеразы AmpliTaq (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom), ДНК-матрицы 10 мкл. при следующих условиях: тридцать пять циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 48°С в течение 30 секунд и элонгацию при 72°С в течение 30 секунд. Чувствительность предложенного метода достигала 10 МЕ/мл. Недостаток метода заключается в необходимости большого объема плазмы крови для экстракции ДНК (500 мкл), а также в невозможности убедиться в полноценности генома вируса за счет секвенирования как минимум двух из четырех участков генома ВГВ, как это было рекомендовано на совещании по оккультному ВГВ [Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis В virus infection. // Journal of Hepatology. - 2008. - vol. 49. №4. - Р. 652-657].

1. Авторами предложен метод выявления вируса гепатита В методом «гнездовой» ПЦР с использованием на втором этапе нескольких пар праймеров, фланкирующих четыре региона генома вируса. В том числе фрагменты, включающие рекомендованный для гено- и субтипирования ВГВ регион Pre-S1/Pre-S2/S область 2848-3182…1-835 нт., core регион область 1901-2452 нт., регион X область 1374-1838 нт., регион pol область 247-1280 нт., согласно представленному в международной базе данных GenBank изоляту Mart-B47 (НЕ974377.1) [Brichler S., Lagathu G., Chekaraou M.A. et al. African, Amerindian and European hepatitis В virus strains circulate on the Caribbean Island of Martinique // J. Gen. Virol. 2013. vol. 94 (Pt 10). P. 2318-2329].

Технический результат - повышение специфичности, чувствительности и возможности дифференцировать изоляты вируса гепатита В с высокой идентичностью нуклеотидных последовательностей.

Сущность метода заключается в том, что на первом этапе проводится амплификация ДНК методом асимметричной полимеразной цепной реакции с использованием протяженных олигонуклеотидных праймеров с разной температурой плавления, комплементарных области наибольшего сходства геномов различных изолятов вируса гепатита В. Для повышения чувствительности проводится вторая полимеразная цепная реакция с использованием продукта амплификации первой реакции и внутренних (вложенных, гнездовых) праймеров, некоторые из которых были предложены на совещании по оккультному вирусному гепатиту В [Candotti D., Danso K., Allain J-P. Matemofetal transmission of hepatitis В virus genotype E in Ghana, west Africa // J. Gen. Virol. - 2007. - vol. 88. - P. 2686-2695, doi: 10.1099/vir.0.83102-0]. При этом состав реакционного буфера изменяется на разных этапах.

На первом этапе используются протяженные олигонуклеотидные праймеры:

Прямой праймер 5'-CTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3'

Обратный праймер 5'-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCCTA-3'

Состав амплификационной смеси на первом этапе:

3 пмоль/л прямого праймера, 30 пмоль/л обратного праймера, по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата, 7,5 ммоль/л MgCl2, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), формамид 4% от конечного объема, глицерин 6% от конечного объема, 10 мкл раствора ДНК, вода без нуклеаз до конечного объема 30 мкл.

ПЦР проводят при следующих условиях:

после денатурации при 95°C в течение 5 минут устанавливали 35 циклов амплификации в режиме: 95°C - 30 сек, 68°C - 5 мин; затем финальная элонгация при 72°C - 5 мин.

На втором этапе используют одну из пар праймеров:

Пара 1:

Прямой праймер 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3'

Обратный праймер 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3'

Пара 2:

Прямой праймер 5'-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3'

Обратный праймер 5'-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3'

Пара 3:

Прямой праймер 5'-CCATACTGCGGAACTCCTAGC-3'

Обратный праймер 5'-CCCAAGGCACAGCTTGGAGG-3'

Пара 4:

Прямой праймер 5'-TCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTC-3'

Обратный праймер 5'-AGTTCCGCAGTATGGATCGG-3'

Состав амплификационной смеси на втором этапе:

15 пмоль/л каждого праймера, по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата, 6,7 ммоль/л MgCl2, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), DMSO 10% от конечного объема, формамид 4% от конечного объема, 10 мкл продукта амплификации первого этапа, вода без нуклеаз до конечного объема 30 мкл.

ПЦР проводят при следующих условиях:

после денатурации при 95°C в течение 5 минут устанавливали 35 циклов амплификации в режиме: 95°C - 30 сек, 52°C - 30 сек, 72°C - 1 мин 30 сек; затем финальная элонгация при 72°C - 5 мин.

Таким образом, предложенный метод отличается от прототипа тем, что на первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер 5'-ctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgc-3', обратный праймер 5'-cagaccaatttatgcctacagcctccta-3'), на втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов геном ВГВ, при этом в составе амплификационной смеси на каждом этапе неравномерное соотношение дезоксинуклеозидтрифосфатов и высокая концентрация MgCl2, на первом этапе в смеси присутствуют формамид и глицерин в количестве 4% и 6% от конечного объема соответственно, а на втором этапе формамид и DMSO в количестве 4% и 10% от конечного объема соответственно.

Аналитическую чувствительность метода проверяли методом поэтапного разведения.

Были выбраны 10 образцов плазмы крови, содержащие различные концентрации ВГВ. Вирусную нагрузку предварительно измеряли с помощью стандартизированного набора для количественного определения ДНК ВГВ в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». «АмплиСенс® НВУ-Монитор-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва).

Каждый образец поэтапно разводили предварительно проанализированной плазмой крови без ВГВ (чистой плазмой) следующим образом. Аликвоту образца объемом 100 мкл вносили в микропробирку Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 100 мкл чистой плазмы, тщательно пипетировали и переносили 100 мкл полученного пула в новую микропробирку, куда снова добавляли 100 мкл чистой плазмы, пипетировали и 100 мкл нового пула переносили в третью пробирку и т.д. до десятикратного последовательного разведения (таб. 1).

После разведения осуществляли экстракцию ДНК из каждого пула разведения каждого образца с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Полученные образцы ДНК амплифицировали, согласно предложенному методу. Результаты выявления вируса в пулах разведения представлены в таблице 2.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен электрофорез продуктов амплификации второго этапа (праймеры 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3', 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3') последовательных разведений образца №9, вирусная нагрузка 5*103 МЕ/мл. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 9,7 МЕ/мл) виден очень слабо. На фиг. 2 представлен Черно-белый негатив фотографии 1. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 9,7 МЕ/мл) обозначен овалом.

Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода.

Пример 1

Больные с различной степенью выраженности фиброза печени и циррозом: 11 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С, 5 пациентов с гепатитом неясной этиологии. Все пациенты серонегативны к вирусу гепатита В. При использовании стандартных наборов ДНК вируса гепатита В не была выявлена в плазме крови. При использовании нашего метода ДНК вируса гепатита В в плазме крови была выявлена у 6 пациентов с ХВГС и у всех пациентов с криптогенным гепатитом. Полученные результаты были подтверждены при получении биопсийного материала печени.

Пример 2

Больная с клинической картиной острого гепатита, начавшейся после пребывания в стационаре по причине, не связанной с заболеваниями печени. Высказаны подозрения об инфицировании пациентки в клинике. ДНК вируса гепатита В стандартными методами не выявлен. При использовании нашего метода ДНК вируса гепатита В в плазме крови выявлен, осуществлено секвенирование региона Pre-S1/Pre-S2/S, проведен филогенетический анализ для сравнения с вирусом гепатита В, выявленным у пациентов стационара (предположительный источник инфекции). Показаны значимые отличия изолятов. Высказано предположение об активации репликации оккультного вируса гепатита В на фоне иммуносупресси.

Пример 3

Больной из Центральной Африки спустя несколько месяцев после пребывания в РФ поступил в госпиталь с симптомами острого гепатита в тяжелой форме. При использовании стандартных методов был выявлен вирус гепатита В, генотипировать вирус не удалось. При использовании нашего метода в плазме крови больного были выявлены и типированы два изолята вируса гепатита В: субтипа D2 и субтипа А1, не характерного для РФ. Предположительно невозможность типирования стандартным методом с использованием коммерческого набора объясняется множественными мутациями вируса. Высказано предположение об активации репликации оккультного вируса гепатита В субтипа А1 на фоне подавления иммунитета при инфицировании вирусом гепатита В субтипа D2.

Пример 4

Представлены 155 клинических образцов из Республики Гвинея, в том числе 130 образцов сыворотки крови в объеме, не превышающем 80 мкл, а также 25 клинических образцов посмертных ротоглоточных соскобов. ДНК Вируса гепатита В не удалось выявить при использовании стандартных методов. При использовании предлагаемого нами способа выявлена ДНК вируса гепатита В в 19 образцах, полученных из сыворотки крови, а также в 13 образцах, полученных из ротоглоточных соскобов, при этом ДНК вируса гепатита В выявлена как в HBsAg (+) образцах, так и в HBsAg (-) образцах. Проведено секвенирование региона Pre-S1/Pre-S2/S. Представлены субтипы ВГВ: А2, A3, D1, D2, D3, Е. Таким образом, подтверждается возможность использования предлагаемого способа для выявления в малых объемах клинических образцов вируса гепатита В разных генотипов и субтипов, включая генотипы и субтипы не характерные для РФ.

Также в течение 2015-2016 года было проведено более 800 исследований предложенным методом на основе технологии ПЦР. Выявлен высокий процент встречаемости оккультного гепатита В среди доноров в географических регионах с высокой распространенностью вирусных гепатитов. Показана широкая распространенность оккультного вируса гепатита В у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Способ выявления ДНК вируса гепатита B в биологическом материале на основе двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием амплифицированных фрагментов четырех регионов вируса, отличающийся тем, что на первом этапе применяется асимметричная ПЦР с протяженными олигонуклеотидными праймерами, а именно прямой праймер 5'-CTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3' и обратный праймер 5'-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCCTA-3', продукты которой затем используют для второго этапа амплификации с одной из следующих пар вложенных праймеров: пара 1 прямой праймер 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3' обратный праймер 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3' или пара 2 прямой праймер 5'-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3' обратный праймер 5'-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3', или пара 3 прямой праймер 5'-CCATACTGCGGAACTCCTAGC-3' обратный праймер 5'-CCCAAGGCACAGCTTGGAGG-3', или пара 4 прямой праймер 5'-TCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTC-3' обратный праймер 5'-AGTTCCGCAGTATGGATCGG-3', причем амплификационная смесь для первого этапа содержит: 0,3 мкл прямого праймера (конц. 10 пмоль/л), 3 мкл обратного праймера (концентрация 10 пмоль/л), 2,5 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (где содержится по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата), 6 мкл MgCl2 (25 мМ), 2,5 мкл буфера для Taq ДНК-полимеразы (включает 750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), 1,2 мкл формамида, 1,8 мкл глицерина, 0,5 мкл рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, 1 ед.), 10 мкл раствора ДНК, 2,2 мкл вода без нуклеаз, общий объем смеси 30 мкл. амплификационная смесь для второго этапа содержит: по 1,5 мкл прямого и обратного праймеров (концентрация 10 пмоль/л), 2,5 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов, (содержащей по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата), 5 мкл MgCl2 (25 мМ), 2,5 мкл буфера для Taq ДНК-полимеразы (включает 750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), 1,2 мкл формамида, 3 мкл DMSO, 0,5 мкл рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, 1 ед.), 10 мкл продукта амплификации первого этапа, 2,3 мкл вода без нуклеаз, общий объем смеси 30 мкл.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК3) в вегетативных органах растений яблони, винограда, озимой пшеницы.

Изобретение относится к области медицины, а именно спортивной медицины, и предназначено для оптимизации дифференцированного преподавания физической культуры студентам с учетом их физической работоспособности и тренированности.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ обработки опухолевых клеток композицией, содержащей дихлорацетат натрия (ДХА) и кофеин бензоат натрия.

Изобретение относится к медицине и может применяться в кардиохирургии и касается способа определения предикторов сохраненной функции синусового узла у пациентов с длительно персистирующей фибрилляцией предсердий.

Изобретение относится к животноводству и ветеринарии и может быть использовано при оценке воспроизводительной способности коров мясных пород. Определяют воспроизводительные качества маток крупного рогатого скота мясного направления продуктивности по элементному составу шерсти.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики немалиновой миопатии, при котором у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани, проводят иммуногистохимическое выявление фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1α), для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор для уменьшения фонового неспецифического окрашивания, затем срезы инкубируют с поликлональными антителами кролика к белку HIF-1α, после промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, покрывают фотозащитным реагентом и проводят люминесцентную микроскопию, а при выявлении локусов округлой и/или овальной формы красной окраски диаметром 3-5 мкм под оболочкой мышечного волокна диагностируют немалиновую миопатию.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН).

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ профилактики африканской чумы свиней, включающий выявление животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и перинатологии, и может быть использовано для прогнозирования неврологических нарушений у новорожденных с задержкой внутриутробного развития плода (ЗВРП).

Изобретение касается способа оценки вирусной контаминации воздуха РНК-содержащими вирусами, возбудителями острых респираторных вирусных инфекций в помещении. Представленный способ включает отбор проб воздуха с помощью пробоотборника «Флора - 100», который размещают по определенной схеме, и идентификацию микроорганизмов, при этом дополнительно устанавливают мембранный фильтр в пробоотборник, в чашку с отобранной пробой помещают 10 мл среды для сохранения и стабилизации РНК вирусов, а идентификацию вирусов проводят путем определения содержания нуклеиновых кислот возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ прогнозирования восприимчивости человека, инфицированного вирусом гепатита С (HCV), к терапии пэгинтерфероном альфа-2a, рибавирином и противовирусным агентом прямого действия.

Изобретение относится к биохимии. Описан набор для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV (bovine immunodeficiency virus)), содержащий пару специфичных праймеров и ДНК-зонд, методом ПЦР в режиме реального времени.

Способ относится к микробиологии и может применяться для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам. Способ количественной оценки литической активности бактериофагов предусматривает приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма, выращенной при заданных условиях и соединенной с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом.

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры.

Изобретение относится к области медицины, в частности к применению молекулярных маркеров ВПЧ ВКР и их качественных и количественных характеристик для прогнозирования течения гиперпролиферативных заболеваний ШМ.
Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен состав агарового покрытия для выявления вируса Мачупо. Первичное агаровое покрытие содержит: аминокислотный витаминный комплекс (АВК), раствор Эрла, фетальную телячью сыворотку, 5%-ный раствор бикарбоната натрия, деминерализованную воду, 2,9%-ный раствор 1-глутамина, антибиотики, бактоагар «BacteriologCal» или «Bacto™ Agar». Вторичное агаровое покрытие содержит: аминокислотный витаминный комплекс (АВК), раствор Эрла, фетальную телячью сыворотку, бикарбонат натрия, деминерализованную воду, 0,1%-ный раствор нейтрального красного, бактоагар «Bacteriologi Cal» или « Bacto™ Agar». Изобретение обеспечивает увеличение чувствительности метода выявления вируса Мачупо. 3 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине и, в частности, к вирусологии и инфекционным заболеваниям. Предложен способ выявления вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке путем определения в биопробе ДНК вируса методом ПЦР с дальнейшим секвенированием фрагментов. Выявление проводят в плазме иили сыворотке крови, сгустке крови, ротоглоточных смывах, сперме, тканях печени. Выявление проводится в два этапа. На первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами. На втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов генома ВГВ. Способ обеспечивает повышение специфичности и чувствительности диагностики вируса гепатита В. 4 пр., 2 ил., 2 табл.

Наверх