Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека

Авторы патента:


Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека
Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека

 


Владельцы патента RU 2634381:

АБЛИНКС Н.В. (BE)

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности нанотелам против сывороточного альбумина человека, а также к полипептидам против сывороточного альбумина человека, содержащим одно или более таких нанотел. Нанотела согласно изобретению используют для получения биспецифичных и триспецифичных полипептидов, связывая их с одним или двумя нанотелами против антигенов, отличных от сывороточного альбумина человека. Настоящее изобретение позволяет получить нанотела и полипептиды, их содержащие, обладающие улучшенным сродством к сывороточному альбумину человека. 9 н. и 20 з.п. ф-лы, 62 ил., 47 табл., 65 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к улучшенным нанотелам (Nanobodies™) против фактора некроза опухоли (TNF-альфа), а также к полипептидам, содержащим или по существу состоящим из одного или более таких нанотел. [Примечание: Nanobody™, Nanobodies™ и Nanoclone™ являются товарными знаками от Ablynx N.V.]

Также изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие нанотела и полипептиды; к способам приготовления таких нанотел и полипептидов; к клеткам-хозяевам, экспрессирующих или способных к экспрессии таких нанотел или полипептидов; к композициям, содержащим такие нанотела, полипептиды, нуклеиновые кислоты или клетки-хозяева; и к применениям таких нанотел, таких полипептидов, таких нуклеиновых кислот, таких клеток-хозяев или таких композиций, а именно, в профилактических, терапевтических и диагностических целях, таких как профилактические, терапевтические и диагностические цели, приведенные ниже.

Другие аспекты, воплощения, преимущества и применения изобретения станут понятны из дальнейшего описания, приведенного ниже.

Уровень техники

WO 04/041862 заявителя относится к нанотелам против TNF-альфа и к их приготовлению и применению, в частности, для профилактики и/или лечения заболеваний и нарушений, связанных с и/или опосредованных TNF-альфа, таких как воспаление, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, рассеянный склероз, болезнь Аддисона, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный паротит, диабет 1 типа, эпидидимит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена—Барре, тиреоидит Хашимото, гемолитическая анемия, системная красная волчанка, мужское бесплодие, множественный склероз, злокачественная миастения, пузырчатка, псориаз, ревматический полиартрит, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия, Синдром Шегрена, спондилоартропатия, тиреоидит и васкулит.

Анти-TNF нанотела в соответствии с WO 04/041862 могут быть гуманизированными и могут быть одновалентными или поливалентными, последние из которых приводят к повышенному сродству к TNF. Анти-TNF Nanobodies™ no WO 04/041862 могут также быть мультиспецифичными, и могут, в частности, быть представлены в форме мультиспецифичной конструкции, содержащей два или более нанотел против TNF и дополнительно нанотело, направленное против сывороточного белка, такого как сывороточный альбумин человека, который приводит к удлинению времени полужизни in vivo.

WO 04/041862 также относится к способам приготовления анти-TNF нанотел, к нуклеиновым кислотам или конструкциям, кодирующим анти-TNF нанотела, а также к фармацевтическим композициям, содержащим анти-TNF нанотела, которые могут быть пригодными для внутривенного, подкожного, перорального, сублингвального, топического, назального, вагинального или ректального применения или для применения путем ингаляционного введения. Анти-TNF нанотела согласно WO 04/041862 могут также применяться для диагностических целей, необязательно в виде комплекса.

ЕР 0486526 описывает связывающие TNF-альфа-лиганды против специфичного эпитопа TNF. Среды связывающих лигандов упоминаются однодоменные антитела ("dAbs").

Reiter et al., J. Mol. Biol. (1999), 290, 685-698, описывают однодоменные антитела против TNF-альфа, полученные из рандомизированной фаговой дисплейной библиотеки, которая создавалась начиная с домена VH, происходящего из мышиной гибридомы.

WO 00/29004 описывает мышиные однодоменные антитела ("микротела") против TNF-альфа.

WO 04/003019, в частности, описывает лиганды. Содержащие первый связывающий домен против TNF-альфа и второй связывающий домен против сывороточного белка, такого как сывороточный альбумин.

Раскрытие изобретения

Основная цель настоящего изобретения состоит в обеспечении нанотел против TNF-альфа, в частности против TNF-альфа человека.

В особенности, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении нанотел против TNF-альфа, а именно против TNF-альфа человека, и в обеспечении белков или полипептидов, содержащих такие нанотела, которые пригодны для терапевтического и/или диагностического применения, и, в частности, для профилактики, лечения и/или диагностики одного или более заболеваний или нарушений, связанных с и/или опосредованных TNF-альфа, которые упоминались выше, и/или которые могут применяться для приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения одного или более заболеваний, связанных с и/или опосредованных TNF-альфа, которые указаны выше.

Кроме того, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении нанотел против TNF-альфа, и в обеспечении белков или полипептидов, содержащих такие нанотела, при этом каждый альтернативен нанотелам и полипептидам против TNF-альфа, описанным в WO 04/041862, и/или которые имеют одно или более улучшенных свойств или характеристик, по сравнению с нанотелами и полипептидами против TNF-альфа, описанными в WO 04/041862.

Более того, целью настоящего изобретения является обеспечение нанотел против TNF-альфа, и обеспечение белков или полипептидов, содержащих такие нанотела, которые усовершенствованы, по сравнению с нанотелами и полипептидами против TNF-альфа, описанными в WO 04/041862, в отношении одного или более из следующих свойств или характеристик:

- повышенное сродство к TNF-альфа, или в моновалентной форме, в мультивалентной форме (например, в бивалентной форме) и/или в мультиспецифичной форме (например, одна из мультиспецифичных форм, описанная в WO 04/041862 или приведенная ниже);

- лучшая пригодность для форматирования в мультивалентный формат (например, для бивалентного формата);

- лучшая пригодность для форматирования в мультиспецифичный формат (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже);

- повышенная пригодность или предрасположенность для "гуманизированных" замещений (как определено здесь); и/или

- меньшая иммуногенность, либо в моновалентном формате, в мультивалентном формате (например, в бивалентном формате) и/или в мультиспецифичном формате (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже) в моновалентном формате;

- повышенная стабильность, или в моновалентном формате, в мультивалентном формате (например, в бивалентном формате) и/или в мультиспецифичном формате (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже) в моновалентном формате;

- повышенная специфичность по отношению к TNF-альфа, или в моновалентном формате, в мультивалентном формате (например, в бивалентном формате) и/или в мультиспецифичном формате (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже) в моновалентном формате;

- сниженная или при необходимости повышенная перекрёстная реактивность с TNF-альфа из различных видов;

и/или

- одно или более других свойств, подходящих для фармацевтического применения (включая профилактическое применение и/или терапевтическое применение) и/или для диагностического применения (включая, но не ограничиваясь, применение для изображаемых целей), или в моновалентном формате, в мультивалентном формате (например, в бивалентном формате) и/или в мультиспецифичном формате (например, один из мульти специфичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже).

Данные цели достигаются с помощью нанотел, белков и полипептидов, описанных в данном документе. Эти нанотела также обозначаются здесь как "Нанотела изобретения"; и эти белки и полипептиды также в совокупности обозначаются здесь "полипептиды изобретения".

Поскольку нанотела и полипептиды, описываемые здесь, главным образом предназначаются для терапевтического и/или диагностического применения, они направлены против (как определено здесь) человеческого TNF-альфа. Однако не исключается (но также и не является желаемым), что нанотела и полипептиды, описываемые здесь, демонстрируют перекрестную реактивность с TNF-альфа от одного или более других видов теплокровных животных, например, с TNF-альфа от одного или более других видов приматов и/или с TNF-альфа от одного или более других видов животных, которые часто применяются в экспериментальных моделях болезней (например, мышь, крыса, кролик, свинья или собака), и, в особенности, в экспериментальных моделях болезней и нарушений, связанных с TNF-альфа (такие как экспериментальные модели на видах и животных, указанные в данном документе). В связи с этим, для специалиста в данной области является ясным, что такая перекрестная реактивность, при наличии, может иметь преимущества от усовершенствования лекарственного средства, поскольку обеспечиваются нанотела и полипептиды против человеческого TNF-альфа, которые тестируются в таких моделях заболеваний.

Настоящее изобретение в его широком понимании также не ограничивается или характеризуется специфичной антигенной детерминантой, эпитопом, частью, доменом, субъединицей или конфирмацией (где применимо) TNF-альфа, против которого направлены нанотела и полипептиды изобретения.

Однако, в предпочтительном воплощении, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, направлены против и/или могут связываться с эпитопом TNF-альфа, который находится в и/или является частью сайта(ов) связывания с TNF-рецепторами (напр., сайты связывания для TNF-RI, THF-RII, также известные как р55 или р75). Из уровня техники хорошо известно, что тример TNF содержит три сайта связывания с рецепторами, которые по существу эквивалентны и которые образованы с помощью/на стыке двух мономеров TNF с тримером TNF. Например, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, предпочтительно направлены против и/или могут связываться с эпитопом TNF-альфа, который содержит следующие аминокислотные остатки TNF-альфа: Gln в положении 88, Lys в положении 90 и/или Glu в положении 146.

В частности, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, направлены против и/или могут связываться с эпитопом тримера TNF-альфа, который находится в и/или является частью сайта(ов) связывания с TNF-рецепторами. Например, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, могут быть направлены против и/или могут связываться с эпитопом тримера TNF-альфа, который содержит следующие аминокислотные остатки: Gin в положении 88 и Lys в положении 90 в первом мономере TNF (обозначаемый здесь как "мономер А"), и Glu в положении 146 во втором мономере TNF (обозначаемый здесь как "мономер В") (в котором Мономер А и Мономер В совместно, в тримере TNF, из сайта(ов) связывания с TNF-рецепторами).

Более того, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, могут быть направлены против и/или могут связываться с эпитопом тримера TNF-альфа, который содержит вышеуказанные аминокислоты (Gin в положении 88 в мономере А; Lys в положении 90 в мономере А и Glu в положении 146 в мономере В), и в дополнение, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все, из следующих аминокислотных остатков мономера А TNF-альфа: Gly в положении 24, Gin в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Не в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91. Asn в положении 92, Не в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Не в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140 и следующие остатки в мономере В: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Альтернативно, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, могут быть направлены против и/или могут связываться с эпитопом TNF-альфа, который содержит вышеуказанные аминокислоты (Gln в положении 88 в мономере А; Lys в положении 90 в мономере А и Glu в положении 146 в мономере В), и в дополнение, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все, из следующих аминокислотных остатков TNF-альфа мономера A: Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 80, Ser в положении 81, Tyr в положении 87, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ser в положении 95, Не в положении 97, Glu в положении 135, Не в положении 136, Asn в положении 137 и следующие остатки в мономере В: Ala в положении 33, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Такой эпитоп может определяться при помощи структурного анализа нанотела, кристаллизованного в комплексе с молекулой TNF, или при помощи других способов, таких как картирование эпитопов посредством метода Pepscan.

Для сравнения необходимо отметить, что на основании данных кристаллографии (не показаны), можно увидеть, что нанотело 3Е из WO 04/041862 связывается с другим эпитопом (т.е. эпитопом, содержащим Tyr в положении 141, Asp в положении 140, Gln в положении 67, Gly в положении 24 и Glu в положении 23), чем предпочтительный эпитоп изобретения.

Таким образом, в другом аспекте, настоящее изобретение относится к вариабельному домену иммуноглобулина (или его пригодного фрагмента), который может связываться с эпитопом TNF-альфа, который находится в и/или является частью сайта связывания с TNF-рецепторами, и предпочтительно с эпитопом, который содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, и предпочтительно все из следующих аминокислотных остатков TNF-альфа: Gin в положении 88; Lys в положении 90 и Glu в положении 146. Такой вариабельный домен иммуноглобулина предпочтительно представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи, и, в частности, вариабельный домен тяжелой цепи, который может являться любым вариабельным доменом тяжелой цепи млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина человека, вариабельные домены тяжелой цепи мыши и вариабельные домены тяжелой цепи Camelid (такие как вариабельные домены тяжелой цепи из четырехцепочечных иммуноглобулинов Camelid или вариабельные домены тяжелой цепи (VHH домены) от так называемых антител тяжелой цепи). Вариабельный домен иммуноглобулина предпочтительно представляет собой доменное антитело или монодоменное антитело или пригоден для применения в качестве (моно) доменного антитела. Наиболее предпочтительно, вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой нанотело (как здесь определено), и особенно предпочтительными, но не ограничивающими примерами нанотел, которые пригодны для применения в данном аспекте изобретения, являются РМР1С2 (TNF1, SEQ ID NO: 52) и PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), а также гуманизированные и другие их варианты (что в дальнейшем здесь описывается).

Также вышеуказанный вариабельный домен иммуноглобулина может быть гуманизированным (как например и без ограничений), описываемый здесь, в отношении нанотел. Изобретение также относится к белкам и полипептидам, которые содержат или по существу состоят из таких вариабельных доменов иммуноглобулинов, которые могут, например, представлять собой те, которые as здесь описываются. Альтернативно, такие вариабельные домены могут являться частью конструкций ScFv, биспецифичных конструкций, химерного антитела или структур антитела и других иммуноглобулиновых конструкций, которые, например, рассмотрены Hoogenboom (Nature Biotechnology (1997), 15:125-126). Предпочтительно, однако, чтобы вариабельные домены иммуноглобулинов, направленные против указанного эпитопа, представляли нанотела, при этом белки и полипептиды, содержащие такие нанотела, могут быть такими, как далее описывается.

Таким образом, некоторые предпочтительные аспекты изобретения относятся к:

I) Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, что и нанотело TNF1 (SEQ ID NO: 52).

II) Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, что и нанотело TNF3 (SEQ ID NO: 60).

III) Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, которое, по меньшей мере, содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере А и Glu в положении 146 в мономере В.

IV) Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, которое содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере А; Lys в положении 90 в мономере А и Glu в положении 146 в мономере В; и которое дополнительно содержит, по меньшей мере, содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все, из следующих аминокислотных остатков TNF-альфа мономера A: Gly в положении 24, Gin в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Не в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Не в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Не в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140 и следующие остатки в мономере В: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

V) Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, которое содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере А и Glu в положении 146 в мономере В; и которое дополнительно содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все, из следующих аминокислотных остатков TNF-альфа мономера A: Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Не в положении 80, Ser в положении 81, Tyr в положении 87, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ser в положении 95, Ile в положении 97, Glu в положении 135, Не в положении 136, Asn в положении 137 и следующие остатки в мономере В: Ala в положении 33, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое имеет значение Koff (константы диссоциации) для TNF более чем 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно более чем 1⋅10-3.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое имеет значение ЕС50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанных в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое больше чем значение ЕС50 для нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по аналогичному анализу; или гуманизированный вариант такого нанотела.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое имеет значение ЕС50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанных в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше чем 12 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое имеет значение ЕС50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанных в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше чем 5 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое имеет значение ЕС50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанных в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше чем 3 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

И некоторые предпочтительные аспекты этого воплощения относятся к:

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое представляет собой нанотело класса GLEW.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое представляет собой гуманизированное нанотело класса GLEW.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое содержит остаток аргинина (R) в положении 103.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое содержит остаток аргинина (R) в положении 103, и которое является гуманизированным.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое представляет собой нанотело класса GLEW, и которое содержит остаток аргинина (R) в положении 103, и которое является гуманизированным.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое содержит остаток лейцина (L) в положении 108.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как здесь определено) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30)

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором:

a) CDR1 содержит:

аминокислотную последовательность DYWMY; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и

b) CDR2 содержит:

аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и

с) CDR3 содержит:

аминокислотную последовательность SPSGFN; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%,

даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором:

CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN; или

CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором:

а) CDR1 представляет собой:

аминокислотную последовательность DYWMY; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и в котором:

b) CDR2 представляет собой:

аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и в котором:

c) CDR3 представляет собой:

аминокислотную последовательность SPSGFN; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором:

CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN; или

CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором:

любая аминокислотная замена является предпочтительно консервативной аминокислотной заменой; и/или

Указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, по сравнению с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

И некоторые другие предпочтительные аспекты этого воплощения относятся к:

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое является нанотелом класса KERE.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое является гуманизированным Нанотелом класса KERE.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), которое, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как здесь определено) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 98 (TNF33).

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором:

a) CDR1 представляет собой:

аминокислотную последовательность NYYMG; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

b) CDR2 представляет собой:

аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

с) CDR3 представляет собой:

аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором:

CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I)-V), в котором:

любая аминокислотная замена является предпочтительно консервативной аминокислотной заменой; и/или

указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотных делеций или инсерций, по сравнению с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

и вместе с еще другими некоторыми особенно предпочтительными аспектами:

VI) Белку или полипептиду, который содержит или по существу состоит из нанотела по любому из вышеуказанных I)-V).

VII) Белку или полипептиду, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела по любому из вышеуказанных I)-V).

VIII) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V).

IX) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V) и который остается таким же, как и указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, что опосредовано указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

X) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V) и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания для рецептора TNF на тримере TNF.

XI) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V), связанных посредством пригодного линкера.

XII) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V), связанных посредством пригодного линкера, и который пегилирован.

XIII) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V) и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

XIV) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, и который является таким же, как и указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, что опосредовано указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредована таким перекрестным сшиванием.

XV) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, и который способен к внутримолекулярному связыванию, по меньшей мере, с двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

XVI) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из вышеуказанных I)-V) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека.

XVII) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из вышеуказанных I)-V) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, и который является таким же, как и указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, что опосредовано указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредована таким перекрестным сшиванием рецептора.

XVIII) Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I)-V) и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из вышеуказанных I)-V) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, и который способен к внутримолекулярному связыванию, по меньшей мере, с двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI)-XVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является гуманизированным нанотелом.

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI)-XVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является гуманизированным вариантом нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI)-XVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI)-XVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI)-XVIII), который содержит или по существу состоит из двух гуманизированных нанотел по любому из вышеуказанных I)-V), и одного гуманизированного варианта нанотела ALB I (SEQ ID NO: 63).

Следует отметить, что если нанотело обозначается как "по любому из вышеуказанных I)-V)", то соответствует, по меньшей мере, по одному из I)-V), может быть по двум или более из I)-V), и могут также включать любой один или более из других аспектов, которые указываются как "по любому из вышеуказанных I)-V)". Аналогично, если белок или полипептид обозначается как "по любому из вышеуказанных VI)-XVIII)", то соответствует, по меньшей мере, по одному из VI)-XVIII), может быть по двум или более из VI)-XVIII), и могут также включать любой один или более из других аспектов, которые указываются как "по любому из вышеуказанных VI)-XVIII)".

Также в объем изобретения входит то, что, если применимо, нанотело или полипептид изобретения может связываться с двумя или более антигенными детерминантами, эпитопами, частями, доменами, субъединицами или конфирмациями TNF-альфа. При этом, антигенные детерминанты, эпитопы, части, домены или субъединицы TNF-альфа, с которыми связаны нанотела и/или полипептиды изобретения, могут быть по существу аналогичными (например, если TNF-альфа содержит множественные структурные фрагменты или присутствует как мультимер) или могут отличаться (и во втором случае, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться с такими разными антигенными детерминантами, эпитопами, частями, доменами, субъединицами TNF-альфа со сродством и/или специфичностью, которые могут одинаковыми или отличаться). Также, например, если TNF-альфа находится в активированной конформации и в неактивированной конформации, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться как с одной такой конформацией, так и с обеими этими конформациями (т.е. со сродством и/или специфичностью, которые могут одинаковыми или отличаться). Также, например, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться с конформацией TNF-альфа, в которой они связаны с подходящим лигандом, могут связываться с конформацией TNF-альфа, в которой они не связаны с подходящим лигандом, или могут связываться с обеими такими конформациями (опять же, со сродством и/или специфичностью, которые могут одинаковыми или отличаться).

Также предполагается, что нанотела и полипептиды изобретения могут, главным образом, связываться со всеми природными или синтетическими аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами TNF-альфа, или, по меньшей мере, с теми аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами TNF-альфа, которые содержат одну или более антигенных детерминант или эпитопы, которые являются по существу аналогичными антигенной(ым) детерминанте(ам) или эпитопу(ам), с которыми связаны нанотела и полипептиды изобретения в TNF-альфа (напр., в TNF-альфа дикого типа). Кроме того, при этом, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться с такими аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами со сродством и/или специфичностью, которые такие же или отличаются от (т.е. выше или ниже), сродства и специфичности, с которыми нанотела изобретения связываются с (дикий тип) TNF-альфа. Также в объем изобретения входит то, что нанотела и полипептиды изобретения связываются с некоторыми аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами TNF-альфа, но не с другими.

Как правило, нанотела и полипептиды изобретения будут, по меньшей мере, связываться с теми формами (включая мономерные, мультимерные и сопутствующие формы), которые наиболее релевантны с биологической и/или терапевтической точки зрения, что ясно для специалиста в данной области.

Также поскольку TNF-альфа присутствует в мономерной форме и в мультимерных формах, в частности в тримерной форме, то в объем изобретения входит то, что нанотела и полипептиды изобретения связываются только с TNF-альфа в мономерной форме, или что нанотела и полипептиды изобретения дополнительно связываются также с одной или более таких мультимерных форм, с такой как тримерная форма TNF; или могут связываться только с такой мультимерной формой (напр., тримерной). Таким образом, обычно, если в данном описании ссылка относится к нанотелу, белок или полипептиду, которое направлено к TNF-альфа, то необходимо понимать, что это также содержит нанотела, направленные против TNF-альфа в его тримерной форме (включая, но не ограничиваясь, нанотела против сайтов связывания рецепторов (напр., сайтов связывания для TNF-RI, THF-RII, также известных как р55 или р75, этого тримера). Во всех этих случаях, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться с такими мультимерами или ассоциированными белковыми комплексами со сродством и/или специфичностью, которые могут быть аналогичными или отличаться от (т.е. выше или ниже) сродства и/или специфичности, с которыми нанотела и полипептиды изобретения связываются с TNF-альфа в его мономерном и неассоциированном состоянии.

Также, главным образом, полипептиды изобретения, которые содержат два или более нанотела, направленных против TNF-альфа, могут связываться с более высокой авидностью, чем соответствующие мономерное нанотело или нанотела.

Например, и без ограничения, многовалентный (как определено здесь) белок или полипептид, который содержит два или более нанотел, которые направлены против различных эпитопов TNF-альфа, многовалентный (как определено здесь) белок или полипептид который содержит два или более нанотел, которые направлены против различных эпитопов TNF-альфа может связываться с TNF-альфа с более высокой авидностью, чем соответствующие мономеры.

Более того, многовалентный (как определено здесь) белок или полипептид, который содержит два или более нанотел, которые направлены против TNF-альфа, может (и обычно будет) связываться с более высокой авидностью с мультимером TNF-альфа чем с мономером TNF-альфа, и будет, как правило, также связываться с более высокой авидностью, чем соответствующие мономерные нанотела. В таком многовалентном белке или полипептиде, два или более нанотел могут, например, быть направлены против таких же эпитопов, по существу аналогичных эпитопов, или различных эпитопов. В одном воплощении такого многовалентного белка или полипептида, два или более нанотел, могут быть одинаковыми (и, следовательно, быть направленными против одного эпитопа).

Последнее представляет собой особенную значимость, поскольку известно, что начальный этап сигнальной трансдукции, опосредованный TNF, включает связывание TNF рецепторов с молекулами TNF, каждая из которых содержит три сайта связывания рецепторов (см., например: Peppel et al., J. Exp. Meal., 174 (1991), 1483-1489; Engelmann et al., J. Biol. Chem., 265 (1990), 14497; Smith and Baglioni, J. Biol. Chem., 264 (1989), 14646). Например, как описано в работе Peppel et al., рекомбинантный моновалентный домен рецептора TNF - который был способен только к блокированию одного сайта связывания рецептора на тримере TNF — не был в состоянии препятствовать связыванию рецепторов TNF с другими двумя сайтами связывания рецепторов; несмотря на то, что рекомбинантный белок, который содержит два таких внеклеточных домена - следовательно, способный блокировать два сайта связывания рецепторов - обеспечивал поразительную эффективность по сравнению с моновалентным внеклеточным доменом.

В настоящем изобретении, было обнаружено, что моновалентные нанотела способны к связыванию с TNF альфа таким образом, что активность TNF снижается, как в моделях in vitro, в клеточных моделях и в моделях ex vivo (см. «Экспериментальный раздел» ниже). Хотя изобретение не ограничивается каким-либо специфическим механизмом, объяснением или гипотезой, предполагается, что из-за их небольшого размера и высокого сродства к TNF-альфа, два или три моновалентных нанотел изобретения способны к одновременному захвату двух или трех различных сайтов связывания рецепторов на тримере TNF, таким образом, предохраняя тример от стимулирования рецепторного связывания и, следовательно, от стимулирования сигнальной трансдукции (однако не исключены и другие механизмы действия: например, в зависимости от эпитопа, против которого они направлены, нанотело изобретения может также ингибировать связь TNF в тримерном состоянии).

Также следует отметить, что дополнительно или в качестве альтернативы к связыванию с двумя или более сайтами связывания рецепторов на одном тримере TNF, белки или полипептиды настоящего изобретения, которые содержат или по существу состоят из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), которые направлены против эпитопов TNF-альфа, могут связываться (напр., внутримолекулярно) с эпитопами на двух отдельных молекулах TNF-альфа (напр., двух отдельных тримерах).

Однако, в соответствии с одним особенно предпочтительным воплощением, изобретение относится к белок или полипептиду, который содержит или по существу состоит из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), где каждый направлен против эпитопов TNF-альфа (и, в частности, тримера TNF-альфа), которые находятся и/или составляют часть сайта(ов) связывания рецепторов TNF-тримера, так что указанный полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать связывание с рецепторами TNF, что опосредовано указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредована таким рецепторным связыванием.

В частности, в соответствии с эти предпочтительным воплощением, изобретение относится к белок или полипептиду, который содержит или по существу состоит из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), которые каждый направлены против эпитопов на TNF-альфа (и, в частности, тримера TNF-альфа), которые находятся и/или составляют часть сайта(ов) связывания рецепторов TNF-тримера, где указанные вариабельные домены иммуноглобулинов связаны друг с другом таким образом, что белок или полипептид способен одновременно связываться с двумя или более сайтами связывания рецепторов на одном тримере TNF (другими словами, способен к внутримолекулярному связыванию, по меньшей мере, с двумя сайтами связывания TNF рецепторов на тримере TNF). В этом воплощении, два или более вариабельных доменов иммуноглобулинов предпочтительно являются как определено выше и наиболее предпочтительно являются нанотелами (так что белок или полипептид является многовалентной конструкцией нанотела, как в дальнейшем будет здесь определено). Также, в этом воплощении, два или более вариабельных доменов иммуноглобулинов могут быть аналогичными или отличаться; и могут быть направленными против различных эпитопов с сайта(ов) связывания TNF рецепторов, но предпочтительно направлены против одного эпитопа.

В одном предпочтительном аспекте этого воплощения, два или более вариабельных доменов иммуноглобулинов направлены против эпитопов тримера TNF-альфа, при этом эпитопы находятся и/или составляют часть сайта(ов) связывания TNF-рецепторов. Например, два или более вариабельных доменов иммуноглобулинов предпочтительно направлены против и/или могут связываться с эпитопом тримера TNF-альфа, который содержит следующие аминокислотные остатки: Gin в положении 88 и Lys в положении 90 на первом мономере TNF (обозначаемый здесь как "мономер А"), и Glu в положении 146 на втором мономере TNF (обозначаемый здесь как "мономер В") (где Мономер А и Мономер В вместе, в TNF тримере, из сайта(ов) связывания TNF-рецепторов).

Как в дальнейшем дополнительно описывается более подробно относительно нанотела, в таком белке или полипептиде, по меньшей мере, два вариабельных доменов иммуноглобулинов предпочтительно связаны таким образом, что расстояние между N-концом и С-концом двух вариабельных доменов иммуноглобулинов, находящихся в таком белке или полипептиде, составляет предпочтительно, по меньшей мере, 50 ангстрем, и более предпочтительно порядка 55-200 ангстрем, и более предпочтительно порядка ангстрем, в частности, порядка 65-150 ангстрем.

В особенно предпочтительном аспекте этого воплощения, эти две или более иммуноглобулиновые последовательности представляют собой нанотела, и предпочтительно выбираются из нанотел, указанных здесь. Некоторые особенно предпочтительные нанотела для применения в данном воплощении изобретения представляют собой РМР1С2 (TNF1, SEQ ID NO: 52) и/или PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), а также гуманизированные и другие их варианты (как здесь описывается); с РМР1С2 (TNF1, SEQ ID NO: 52) и его гуманизированными вариантами, являющимися особенно предпочтительными.

В связи с чем, настоящее воплощение будет описываться более подробно в отношении нанотел. Однако для специалиста в данной области будет ясно, что идея данного воплощения может аналогично применяться и к вариабельным доменам иммуноглобулинов.

В этом воплощении изобретения, две или более иммуноглобулиновых последовательностей будут, как правило, связываться через один или более пригодные линкеры, при этом линкеры являются такими, что каждая иммуноглобулиновая последовательность может связываться с различным сайтом связывания рецептора на одном тримере TNF. Пригодные линкеры будут в частности зависеть от эпитопов (расстояния между ними) на тримере TNF, с которыми иммуноглобулиновые последовательности связаны, и для специалиста на основании раскрываемого здесь будет понятно, что необязательно после некоторой ограниченной степени рутинного экспериментирования. Например, если две или более иммуноглобулиновых последовательностей являются (одно) доменными антителами или нанотелами, то пригодные линкеры могут выбираться из линкеров, описываемых здесь, но с размером линкера, который соответствует двум или более (одно) доменным антителам или нанотелам, каждый из которых связываться с различным сайтом связывания рецептора на одном тримере TNF.

Кроме того, если два или более иммуноглобулиновых последовательностей, которые связаны с сайтами связывания рецепторов TNF-альф, представляют собой (одно) доменные антитела или нанотела, то они могут также связываться друг с другом через третье (одно) доменное антитело или нанотело (где две или более иммуноглобулиновые последовательности могут быть связаны непосредственно с третьим (одно) доменным антителом/нанотелом посредством пригодных линкеров). Такое третье (одно) доменное антитело или нанотело может, например, быть (одно) доменным антителом или нанотелом, которое обеспечивает повышенное время полужизни, что дополнительно здесь описано. Например, последнее (одно) доменное антитело или нанотело может являться (одно) доменным антителом или нанотелом, которое проявляет способность к связыванию (человеческим) сывороточным белком, таким как (человеческий) сывороточный альбумин, что дополнительно здесь описано.

Альтернативно, две или более иммуноглобулиновых последовательностей, который связаны с сайтом(ами) связывания рецепторов TNF-альфа, могут присоединяться последовательно (либо непосредственно, либо через пригодный линкер) и третье (одно) доменное антитело или нанотело (которое может обеспечивать повышенное время полужизни, как описано выше) может соединяться непосредственно или через линкер с одной из этих двух или более вышеуказанных иммуноглобулиновых последовательностей. Некоторыми неограничивающими примерами таких конструкций являются конструкции из SEQ ID NOS: 93 или 94.

В частности, было обнаружено в изобретении (см. здесь указанные результаты кристаллографии,) что, если нанотела, присутствующие в многовалентном или мультиспецифичном белке или полипептиде изобретения, связаны со специфичным эпитопом, описанным выше (которым является эпитоп TNF1 и его гуманизированные варианты, а также TNF3 и его гуманизированные варианты), то, предпочтительно, два (или более) анти-TNF нанотела, присутствующие в таком белке или полипептиде, должны быть связаны таким образом, что расстояние между N-концом и С-концом двух анти-TNF нанотел, присутствующих в таком белке или полипептиде, должно, предпочтительно, составлять, по меньшей мере, 50 ангстрем, и более предпочтительно порядка 55-200 ангстрем, и, в частности, порядка 65-150 ангстрем (с максимумом, который составляет менее критического, и выбранный из соображений удобства, напр., на предмет экспрессии/продукции белка); или в более общем смысле, что указанное расстояние должно быть таким, что оно позволяет белок или полипептиду подвергаться внутримолекулярному связыванию с TNF-тримером (т.е. вместо межмолекулярного связывания). Расстояние между N-концом и С-концом двух анти-TNF нанотел может определяться с помощью любых пригодных способов, таких как кристаллография или молекулярное моделирование (как здесь описывается). Эти способы также обеспечивают возможность определить, способен ли специфичный многовалентный или мультиспецифичный белок или полипептид обеспечить внутримолекулярное моделирование. Альтернативно, настоящее изобретение также обеспечивает простой эксперимент при использовании гель-хроматографии (как описывается Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129), которая может применяться для определения, будет ли данный белок или полипептид изобретения (преимущественно) обеспечивать внутримолекулярное связывание с TNF-тримером или (преимущественно) межмолекулярное связывание между двумя или более TNF-тримерами. Таким образом, в одном конкретном воплощении изобретения, белок или полипептид изобретения является предпочтительно таким, что, в этом эксперименте, он преимущественно или по существу исключительно приводит к внутримолекулярному связыванию. Однако, как подчеркнуто выше, следует отметить, что белки или полипептиды изобретения, которые действуют посредством внутримолекулярного связывания отдельных молекул TNF-альфа (напр., тримеров), также включены в объем настоящего изобретения.

Таким образом, в другом предпочтительном аспекте, изобретение обеспечивает многовалентный или мультиспецифичный белок или полипептид, который содержит, по меньшей мере, два нанотела против TNF-альфа (и, в особенности, тримера TNF-альфа), где указанные нанотела предпочтительно направлены к по существу такому же эпитопу, как нанотело РМР1С2 (как здесь отмечено), и где указанные, по меньшей мере, два нанотела соединены таким образом, что расстояние между N-концом и С-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел такое, что белок или полипептид способен подвергаться внутримолекулярному связыванию (как здесь описывается) с TNF-тримером. Предпочтительно, в таком белке или полипептиде, расстояние между N-концом и С-концом двух анти-TNF нанотел составляет, по меньшей мере, 50 ангстрем, и более предпочтительно порядка 55-200 ангстрем, и, в частности, порядка 65-150 ангстрем.

В таком предпочтительном белке или полипептиде, два или более нанотел могут соединяться любым пригодным образом, если только может достигаться предпочтительное расстояние между N-концом и С-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел, и/или если белок или полипептид способен подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером.

Например, в простейшей конструкции, по меньшей мере, два нанотела непосредственно соединены через пригодный линкер или спейсер, который обеспечивает предпочтительное расстояние между N-концом и С-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел и который предоставляет возможность белок или полипептиду подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером. Пригодные линкеры здесь описываются, и могут - например, и без ограничений - содержать аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность предпочтительно имеет длину в 14 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 17 аминокислот, как например, около 20-40 аминокислотной последовательности (которая, при использовании расстояния в 3,5 ангстрема для одной аминокислоты, соответствует длинам линкера в 49 ангстрем, 59,5 ангстрем и около 70 ангстрем, соответственно; с максимальным количеством аминокислот, что рассчитывалось таким же образом из расчета расстояний, как определено выше). Предпочтительно, такая аминокислотная последовательность должна быть такой, чтобы предоставлять возможность белок или полипептиду подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером.

Таким образом, в другом предпочтительном аспекте, изобретение обеспечивает многовалентный или мультиспецифичный белок или полипептид, который содержит, по меньшей мере, два нанотела против TNF-альфа (и, в частности, тримера TNF-альфа), в котором указанные нанотела предпочтительно направлены к по существу такому же эпитопу, как нанотело РМР1С2 (как указано здесь), и в котором указанные, по меньшей мере, два нанотела непосредственно соединены друг с другом с помощью пригодного линкера или спейсера так, что расстояние между N-концом и С-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел такое, что белок или полипептид способен подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером. Предпочтительно, в таком белке или полипептиде, расстояние между N-концом и С-концом двух анти-TNF нанотел (и, следовательно, предпочтительная длина линкера или спейсера) составляет, по меньшей мере, 50 ангстрем, и более предпочтительно порядка 55-200 ангстрем, и, в частности, порядка 65-150 ангстрем.

Более предпочтительно, в этом предпочтительном аспекте, линкер или спейсер является аминокислотной последовательностью, которая содержит, по меньшей мере, 14, предпочтительно, по меньшей мере, 17, более предпочтительно, по меньшей мере, 20 аминокислот (с некритическим максимумом, выбранным из соображений удобства, который составляет около 50, и предпочтительно около 40 аминокислот). В одном предпочтительном, но не ограничивающем воплощении, линкер по существу состоит из глициновых и сериновых остатков (как в дальнейшем описывается). Например, один пригодный линкер представляет собой GS30 линкер, описываемый здесь, который содержит 30 аминокислотных остатков.

В другом воплощении, по меньшей мере, два нанотела против TNF-альфа связаны друг с другом через другие агенты (необязательно через один или два линкера), как например другой белок или полипептид. В этом воплощении, возможно желаемо иметь предпочтительное расстояние (т.е. как упоминается выше) между N-концом и С-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел, например, такое, что белок или полипептид может еще подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером. В этом воплощении, по меньшей мере, два нанотела могут быть связаны непосредственно другим агентом, или при использовании пригодного линкера или спейсера, и в этом случае до достижения предпочтительного расстояния и/или желаемого внутримолекулярного связывания. Агентом может быть любой пригодный агент, который не снижает (чрезмерно) связывание белка или полипептида с TNF и/или в дальнейшем желаемые биологические и фармакологические свойства белка или полипептид. По существу, агент может быть по существу неактивным или может быть биологически активным, и как таковой может или не может улучшать желаемые свойства белка или полипептида и/или может предоставлять одно или более дополнительные желаемые свойства для белка или полипептида. Например, и без ограничения, агент может увеличивать время полужизни белка или полипептида, и/или может снижать его иммуногенность или улучшать любые другие желаемые свойства. В одном предпочтительном воплощении, агент может быть другим нанотелом (включая, но не ограничиваясь, третье нанотело против TNF-альфа, хотя это необязательно и обычно менее предпочтительно), и, в частности. Другим нанотелом, которое обеспечивает время полужизни белка или полипептида, как, например, нанотело, которое направленно против сывороточного белка, например, против сывороточного альбумина человека. Примерами таких белков и полипептидов являются те, которые здесь описываются.

Таким образом, в одном воплощении, изобретение относится к многовалентной мультиспецифичной конструкции, содержащей две или более иммуноглобулиновые последовательности (или их пригодные фрагменты), каждая из которых направлена против эпитопов на TNF-альфа (напр., тримере TNF-альфа), которые находятся в и/или составляют часть сайта связывания рецепторов, и которые связаны друг с другом посредством, по меньшей мере, одной иммуноглобулиновой последовательностью, которая обеспечивает повышенное время полужизни (и необязательно посредством одного или более пригодных линкеров), так, что указанный полипептид, после связывания с TNF тримером, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредована указанным тримером TNF. Такой полипептид может быть таким, что указанные в начале заявки две или более иммуноглобулиновые последовательности могут каждая связываться с различным сайтом связывания рецептора на тримере TNF.

В частности, в этом воплощении, полипептид может содержать тривалентное биспецифичное нанотело, которое содержит два нанотела, каждое из которых направлено против эпитопов на TNF-альфа (и, в особенности, тримере TNF-альфа), которые находятся в и/или составляют часть сайта связывания рецепторов, где указанные нанотела связаны друг с другом посредством третьего нанотела, которое обеспечивает повышенное время полужизни (напр., нанотело, которое направлено к сывороточному белок, такому как сывороточный альбумин человека), где каждое из вышеуказанных двух нанотел могут быть непосредственно связаны с указанным третьим нанотелом или через один или более пригодные линкеры, так что указанный полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется указанным тримером TNF. Такой полипептид может быть таким, что каждое из вышеуказанных двух нанотел может связываться с другим сайтом связывания рецептора на TNF-тримере. Кроме того, некоторыми особенно предпочтительными нанотелами для применения в этом воплощении изобретения являются РМР1С2 (TNF1, SEQ ID NO: 52) и/или PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), а также гуманизированные и другие их варианты (как здесь описывается); с РМР1С2 (TNF1, SEQ ID NO: 52) и его гуманизированными вариантами, которые являются особенно предпочтительными; и нанотела, направленные против сывороточного альбумина человека, описанные здесь. Некоторыми предпочтительными, но не ограничивающими, конструкциями данного воплощения изобретения являются TNF 24 (SEQ ID NO: 90), TNF 26 (SEQ ID NO: 92), TNF 27 (SEQ ID NO: 93), TNF 28 (SEQ ID NO: 94), TNF 60 (SEQ ID NO: 417) и TNF 62 (SEQ ID NO: 418), из которых TNF 60 является особенно предпочтительным.

Таким образом, некоторые предпочтительные аспекты данного воплощения изобретения относятся к:

XIX) Белку или полипептиду, который содержит или по существу состоит из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), при этом каждый из которых направлен против эпитопов на TNF-альфа (и, в частности, тримере TNF-альфа), которые находятся в и/или составляют часть сайта(ов) связывания рецепторов тримера TNF, так что указанный полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, опосредуемое указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

XX) Белку или полипептиду, который содержит или по существу состоит из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), при этом каждый из которых направлен против эпитопов на TNF-альфа (и, в частности, тримере TNF-альфа), которые находятся в и/или составляют часть сайта(ов) связывания рецепторов тримера TNF, так что указанный полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов связаны друг с другом таким образом, что белок или полипептид способен одновременно связываться с двумя или более сайтами связывания рецепторов на одном тримере TNF.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов способны связываться с некоторыми эпитопами, например, как нанотело TNF1 (SEQ ID NO: 52).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов способны связываться против эпитопа с сайта связывания рецепторов TNF тримера TNF, который, по меньшей мере, содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере А и Glu в положении 146 в мономере В.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов способны связываться против эпитопа с сайта связывания рецепторов TNF тримера TNF, который, по меньшей мере, содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере А и Glu в положении 146 в мономере В; и что дополнительно содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или почти все следующие аминокислотные остатки мономера А TNF-альфа: Gly в положении 24, Gin в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Не в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91. Asn в положении 92, Ile в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Не в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140 и следующие остатки в мономере В: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов способны связываться против эпитопа с сайта связывания рецепторов TNF тримера TNF, который, по меньшей мере, содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере А; Lys в положении 90 в мономере А и Glu в положении 146 в мономере В; и который дополнительно содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все следующие аминокислотные остатки мономера А TNF-альфа: Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 80, Ser в положении 81, Tyr в положении 87, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ser в положении 95, Не в положении 97, Glu в положении 135, Не в положении 136, Asn в положении 137 и следующие остатки в мономере В: Ala в положении 33, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором, по меньшей мере, два вариабельных домена иммуноглобулинов связаны таким образом, что расстояние между N-концом первого вариабельного домена иммуноглобулина и С-концом второго вариабельного домена иммуноглобулина, присутствующих в таком белке или полипептиде, составляет, по меньшей мере, 50 ангстрем.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором расстояние N-концом первого вариабельного домена иммуноглобулина и С-концом второго вариабельного домена иммуноглобулина составляет между 55-200 ангстрем.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором расстояние N-концом первого вариабельного домена иммуноглобулина и С-концом второго вариабельного домена иммуноглобулина составляет между 65-150 ангстрем.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулина связаны друг с другом через линкер или спейсер.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором линкер или спейсер представляют собой аминокислотную последовательность.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором линкер или спейсер содержит, по меньшей мере, 14 аминокислотных остатков.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором линкер или спейсер содержит, по меньшей мере, 17-50 аминокислотных остатков.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором линкер или спейсер по существу состоит из глициновых или сериновых остатков.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором линкер или спейсер представляет собой GS30 (SEQ ID NO: 69).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулина связаны друг с другом посредством другого агента.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанный другой агент представляет собой белковый или полипептидный агент.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанный другой агент предоставляет, по меньшей мере, одно желаемое свойство белок или полипептиду, или повышает, по меньшей мере, одно желаемое свойство белка или полипептида.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанный другой агент увеличивает время полужизни белка или полипептида и/или снижает иммуногенность белка или полипептида.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором каждый из первого и второго вариабельного домена иммуноглобулина связан с указанным другим агентом через линкер или спейсер.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором линкер или спейсер представляет собой аминокислотную последовательность.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором линкер или спейсер по существу состоит из глициновых и сериновых остатков.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором указанный другой агент представляет собой нанотело.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором другой агент представляет собой нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является гуманизированным нанотелом.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является гуманизированным вариантом нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является ALB 8.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением Koff для TNF лучше чем 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше чем 1⋅10-3 (1/с); или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением ЕС50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, что описано в примере 1 (ниже 3) в WO 04/041862, которое лучше значения ЕС50 нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по результатам аналогичного анализа; или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением ЕС50, определенным по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, что описано в примере 1 (ниже 3) в WO 04/041862, которое лучше 12 нМ; или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением ЕС50, определенным по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, что описано в примере 1 (ниже 3) в WO 04/041862, которое лучше 5 нМ; или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением ЕС50, определенным по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, что описано в примере 1 (ниже 3) в WO 04/041862, которое лучше 3 нМ; или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела по любому из вышеуказанных XIX)-XX), которые гуманизированы;

со следующими некоторыми особенно предпочтительными аспектами данного изобретения:

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела класса GLEW.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела с аргининовым остатком (R) в положении 103.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела класса GLEW с аргининовым остатком (R) в положении 103.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела с, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичностью последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в которых:

a) CDR1 содержит:

- аминокислотную последовательность DYWMY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и

b) CDR2 содержит:

- аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и

c) CDR3 содержит:

- аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в которых CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в которых CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в которых:

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и

- CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XDC)-XX), в которых:

а) CDR1 представляет собой:

- аминокислотную последовательность DYWMY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и в котором:

b) CDR2 представляет собой:

- аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и в котором:

c) CDR3 представляет собой:

- аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 является аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG;

или

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых

- любой аминокислотной заменой является предпочтительно консервативная аминокислотная замена; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов выбираются из группы, состоящей из нанотела TNF 1 (SEQ ID NO: 52) и гуманизированных вариантов нанотела TNF 1 (SEQ ID NO: 52).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов выбираются из группы, состоящей из TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) и TNF 30 (SEQ ID NO: 96);

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой TNF 30 (SEQ ID NO: 96);

и со следующими некоторыми особенно предпочтительными аспектами этого воплощения:

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела класса KERE.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела с, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичностью последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 98 (TNF33).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых:

a) CDR1 содержит:

- аминокислотную последовательность NYYMG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

b) CDR2 содержит:

- аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

с) CDR3 содержит:

- аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых:

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 содержит аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY (SEQ ID NO: 436).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых:

a) CDR1 представляют собой:

- аминокислотную последовательность NYYMG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

b) CDR2 представляет собой:

- аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

c) CDR3 представляет собой:

- аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX)-XX), в которых:

- любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов выбираются из группы, состоящей из нанотела TNF 3 (SEQ ID NO: 60) и гуманизированных вариантов нанотела TNF 3 (SEQ ID NO: 60).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX)-XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов выбираются из группы, состоящей из TNF20 (SEQ ID NO: 83), TNF21 (SEQ ID NO: 84), TNF 22 (SEQ ID NO: 85), TNF23 (SEQ ID NO: 86) или TNF33 (SEQ ID NO: 99).

Следует отметить, что если белок или полипептид представляет собой вышеуказанное как "по любому из вышеуказанных XIX)-XX)", то это означает, что, по меньшей мере, по одному из XIX)-XX), и может быть по обоим XIX) и XX), и также может включать любой один или более других аспектов, которые обозначены как "по любому из вышеуказанных XIX)-XX)".

Однако необходимо указать, что изобретение не ограничивается каким-либо специфическим механизмом действия или гипотезой. А именно, было обнаружено, что моновалентные нанотела изобретения также могут быть активными в анализах и моделях, описываемых здесь, которые подтверждают, что внутримолекулярное связывание с тримером TNF, хотя предпочтительное по одному воплощению изобретения, не требуется для достижения желаемого действия и эффекта нанотел, белков и полипептидов, описываемых в данном документе. Аналогично, также охватывается объемом изобретения, что белки и полипептиды, описываемые здесь, обеспечивают их желаемое действие посредством любого подходящего механизма (т.е. путем межмолекулярного связывания, внутримолекулярного связывания или даже путем связывания с мономерным TNF, таким образом ингибируя образование тримеров TNF).

Также в объем изобретения входит применение частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей и/или производных нанотел и полипептидов изобретения, и/или применение белков или полипептидов содержащих или по существу состоящих из таковых, поскольку они являются пригодными для применений, представленных здесь. Такие части, фрагменты, аналоги, мутанты, варианты, аллели, производные, белки и/или полипептиды будут рассмотрены при дальнейшем описании данного документа.

В другом аспекте, изобретение относится к нанотелу (как определено здесь), против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4 соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3 соответственно), в котором:

(i) CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR1 SEQ ID NO: 15-21 или из группы, состоящей из последовательностей CDR1 SEQ ID NO: 164-197;

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-21, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 164-197, где

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(ия)" (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-21, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 164-197, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и в котором:

(ii) CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR2 из SEQ ID NO: 22-28, или из группы, состоящей из последовательностей CDR2 из SEQ ID NOS: 232-265;

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR2 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22—28, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR2 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 232-265, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(ия)" (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR2 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-28, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR2 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 232-265, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и в котором:

(iii) CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR3 SEQ ID NO: 29-33, или из группы, состоящей из последовательностей CDR3 SEQ ID NO: 300-333;

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-33, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 300-333, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(ия)" (как определено здесь) или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 330-333, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

или из группы, состоящей из последовательностей CDR3 из SEQ ID NO: 34-35 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из SEQ ID NO: 34 и 35, где:

(1) любая аминокислотная замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(ия)" (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из SEQ ID NO: 34 и 35, где:

(1) любая аминокислотная замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

Нанотела против TNF-альфа, которые описывались выше и будут в дальнейшем описаны ниже, также относятся здесь к нанотелам изобретения.

Среди нанотел изобретения, нанотела, содержащие один или более CDR, точно перечисленные выше, являются особенно предпочтительными; нанотела, содержащие два или более CDR, точно перечисленные выше, являются более предпочтительными; и нанотела, содержащие три CDR, точно перечисленные выше, являются наиболее предпочтительными.

Некоторые особенно предпочтительные, но не ограничивающие, комбинации последовательностей CDR можно видеть в таблице I ниже, в которой перечисляются CDR и каркасные последовательности, которые присутствуют во многих предпочтительных (но не ограничивающих) нанотелах изобретения. Как будет понятно для специалиста, комбинации последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, которые встречаются в одном клоне (т.е. последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, которые упоминаются на одной линии в таблице I), обычно будут предпочтительными (хотя изобретение в его широком смысле не ограничивается этим, и также содержит другие пригодные комбинации последовательностей CDR, указанных в таблице I).

Кроме того, в нанотелах изобретения, которые содержат комбинации CDR, приведенные в таблице I, каждый CDR может заменяться на CDR, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с указанными CDR; где

(1) любая аминокислотная замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 (как указывалось в предыдущем параграфе) "аминокислотное(ых) отличие(ия)" (как определено здесь) с указанным(и) CDR одной из вышеприведенных аминокислотных последовательностей, где:

(1) любая аминокислотная замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

Однако, как будет понятно для специалиста, (комбинации) последовательностей CDR, приведенные в таблице I, будут, главным образом, предпочтительными.

Таким образом, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, одна из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 надлежаще выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I; или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% "идентичности последовательности" (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I. В данном контексте, под "надлежаще выбранной" понимается, что, в зависимости от конкретного случая, последовательность CDR1 выбирается из пригодных последовательностей CDR1 (т.е. как определено здесь), последовательность CDR2 выбирается из пригодных последовательностей CDR2 (т.е. как определено здесь) и последовательность CDR3 выбирается из пригодных последовательностей CDR3 (т.е. как определено здесь), соответственно.

В частности, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, последовательность CDR3 надлежащим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR3, приведенных в таблице I или из группы последовательностей CDR3, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3, приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR3, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3, приведенной в таблице I.

Предпочтительно, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, две из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 надлежаще выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I, или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I.

В особенности, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, присутствующая последовательность CDR3 надлежащим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR3, приведенных в таблице I, или из группы последовательностей CDR3, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3, приведенной в таблице I, соответственно; и, по меньшей мере, одна из присутствующих последовательностей CDR1 и CDR2 надлежаще выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I, или из группы последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I.

Наиболее предпочтительно, в нанотелах изобретения, все три присутствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 надлежаще выбираются из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I, или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые содержат 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I.

Даже более предпочтительно, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, одна из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 надлежаще выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I. Предпочтительно, в этом воплощении, по меньшей мере, одна или предпочтительно обе другие две присутствующие последовательности CDR подходящим образом выбираются из последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей CDR, соответственно, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей, соответственно, приведенных в таблице I.

В частности, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, присутствующая последовательность CDR3 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из CDR3, приведенной в таблице I. Предпочтительно, в этом воплощении, по меньшей мере, одна и предпочтительно обе присутствующие последовательности CDR1 и CDR2 подходящим образом выбирается из групп последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностями CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, которые содержат 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I.

Даже более предпочтительно, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, две присутствующие последовательности из CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I. Предпочтительно, в этом воплощении, оставшаяся имеющаяся последовательность CDR подходящим образом выбирается из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей CDR, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые содержат 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей, приведенных в таблице I.

В частности, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, последовательность CDR3 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR3, приведенных в таблице I, и либо последовательность CDR1 либо последовательность CDR2 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I. Предпочтительно, в этом воплощении, оставшаяся имеющаяся последовательность CDR подходящим образом выбирается из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей CDR, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с соответствующими последовательностями CDR, приведенными в таблице I.

Даже более предпочтительно, в нанотелах изобретения, все три имеющиеся последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I.

Также, главным образом, комбинации CDR, приведенные в таблице I (т.е. те, которые указаны на той же линии в таблице I) являются предпочтительными. Таким образом, является, в целом, предпочтительным, что, если CDR в нанотеле изобретения представляет собой последовательность CDR, указанную в таблице I, или подходящим образом выбирается из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностью CDR, приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с последовательностью CDR, приведенной в таблице I, то, по меньшей мере, одна и предпочтительно обе другие CDR подходящим образом выбираются из последовательностей CDR, которые принадлежат к той же комбинации в таблице I (т.е. указанные на той же линии в таблице I), или подходящим образом выбираются из группы последовательностей CDR которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностью(ями) CDR, принадлежащих к той же комбинации, и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с последовательностью(ями) CDR, принадлежащих к аналогичной комбинации. Другие предпочтения, указанные в параграфах выше, также применяются для комбинаций CDR, указанных в таблице I.

Таким образом, через неограничивающие примеры, нанотело изобретения может например, содержать последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1, указанной в таблице I, последовательность CDR2, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное отличие с одной из последовательностей CDR2, указанных в таблице I (но принадлежащей к другой комбинации), и последовательность CDR3.

Некоторые предпочтительные нанотела изобретения могут, например, содержать: (1) последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1 указанной в таблице I, последовательность CDR2, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное отличие с одной из последовательностей CDR2, указанных в таблице I (но принадлежащей к другой комбинации), и последовательность CDR3, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR3, указанной в таблице I (но принадлежащей к другой комбинации); или (2) последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1 указанной в таблице I; последовательность CDR2, и одну из последовательностей CDR3, приведенную в таблице I; или (3) последовательность CDR1; последовательность CDR2, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR2, приведенной в таблице I; и последовательность CDR3, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотные отличия с последовательностью CDR3, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации, что и последовательность CDR2.

Некоторые особенно предпочтительные нанотела изобретения могут, например, содержать: (1) последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1, указанной в таблице I; последовательность CDR2, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное отличие с последовательностью CDR2, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; и последовательность CDR3, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с последовательностью CDR3, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; (2) последовательность CDR1; CDR2, приведенная в таблице I, и последовательность CDR3, приведенная в таблице I (в котором, последовательность CDR2 и последовательность CDR3 могут принадлежать к разным комбинациям).

Некоторые даже более предпочтительные нанотела изобретения могут, например, содержать: (1) последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1, указанной в таблице I; последовательность CDR2, приведенная в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; и последовательность CDR3, указанная в таблице I, которая принадлежит к разной комбинации; или (2) последовательность CDR1, указанная в таблице I; последовательность CDR2, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотные отличия с последовательностью CDR2, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; и более чем 80% идентичности последовательности с последовательностью CDR3, приведенной в таблице I, которая состоит из той же разной комбинации.

Особенно предпочтительные нанотела изобретения могут, например, содержать последовательность CDR1, указанную в таблице I, последовательность CDR2, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с последовательностью CDR2, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; и последовательность CDR3, указанную в таблице I, которая принадлежит к аналогичной.

В наиболее предпочтительном в нанотелах изобретения, имеющиеся последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из одной комбинации последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I.

Предпочтительно, если последовательность CDR подходящим образом выбирается из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из последовательностей CDR, приведенных в таблице I; и/или если CDR последовательность подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с одной из последовательностей CDR, приведенных в таблице I, то:

i) любая аминокислотная замена представляет собой, предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

ii) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с последовательностью CDR, приведенной в таблице I.

В соответствии с неограничивающим, но предпочтительным воплощением изобретения, последовательности CDR в нанотелах изобретения представляют собой те, которые описаны выше, и также такие, что нанотела изобретения связываются с TNF-альфа с константой диссоциации (KD) 10-5-10-12 моль/литр (М) или менее, и предпочтительно 10-7-10-12 моль/литр (М) или менее и более предпочтительно 10-8-10-12 моль/литр (М), и/или с константой ассоциации (KA), по меньшей мере, 107 М-1, предпочтительно, по меньшей мере, 10 М-1 , более предпочтительно, по меньшей мере, 109 М-1, такой как, по меньшей мере, 1012 М-1; и, в частности, с KD менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, такой как менее 500 нМ. Значения KD и KA нанотел изобретения против TNF-альфа могут определяться способом, известным самим по себе, например, с помощью анализа, здесь описываемого.

В соответствии с другим предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением изобретения (a) CDR1 имеет длину между 1 и 12 аминокислотными остатками, и, как правило, между 2 и 9 аминокислотными остатками, такую как в 5, 6 или 7 аминокислотных остатка; и/или (b) CDR2 имеет длину между 13 и 24 аминокислотными остатками, и, как правило, между 15 и 21 аминокислотными остатками, такую как в 16 и 17 аминокислотных остатка; и/или (с) CDR3 имеет длину между 2 и 35 аминокислотными остатками, и, как правило, между 3 и 30 аминокислотными остатками, такую как между 6 и 23 аминокислотными остатками.

В одном аспекте, изобретение обеспечивает нанотела против TNF-альфа, которые лучше производятся, чем нанотела 3Е, лучше производятся, чем нанотела по WO 04/041862.

В частности, некоторыми предпочтительными аспектами этого воплощения изобретения являются:

XXI) Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), которое имеет значение Koff для TNF лучше чем 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10-3 (1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

XXII) Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), которое имеет значение ЕС50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, описанного в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое выше значения ЕС50 для нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по результатам того же анализа; или гуманизированный вариант такого нанотела.

XXIII) Нанотело против TNF-альфа, которое имеет значение ЕС50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, описанного в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 12 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

XXIV) Нанотело против TNF-альфа, которое имеет значение ЕС50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, описанного в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

XXV) Нанотело против TNF-альфа, имеет значение ЕС50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, описанного в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела;

со следующими особенно предпочтительными аспектами:

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), которое представляет собой нанотело класса GLEW.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), которое содержит аргининовый остаток (R) в положении 103.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), которое содержит лейциновый остаток (L) в положении 108.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

a) CDR1 содержит:

- аминокислотную последовательность DYWMY; или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и

b) CDR2 содержит:

- аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и

с) CDR3 содержит:

- аминокислотную последовательность SPSGFN; или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

a) CDR1 представляет собой:

- аминокислотную последовательность DYWMY; или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и в котором:

b) CDR2 представляет собой:

- аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и в котором:

c) CDR3 представляет собой:

- аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG;

или

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

- любая аминокислотная замена представляет собой, предпочтительно, консервативную аминокислотную замену; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями). и с некоторыми другими особенно предпочтительные аспектами, а именно:

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), которое представляет собой нанотело класса KERE.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 98 (TNF33).

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

a) CDR1 содержит:

- аминокислотную последовательность NYYMG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

b) CDR2 содержит:

- аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

c) CDR3 содержит:

- аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 содержит аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

a) CDR1 представляет собой:

- аминокислотную последовательность NYYMG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

b) CDR2 представляет собой:

- аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

c) CDR3 представляет собой:

- аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), в котором:

- любая аминокислотная замена представляет собой, предпочтительно, консервативную аминокислотную замену; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

- Нанотело по любому из XXI)-XXV), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

и с еще некоторыми другими, особенно предпочтительными аспектами, а именно:

XXVI) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела по любому из XXI)-XXV).

XXVII) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV).

XXVIII) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV) и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

XXIX) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV) и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF .

XXX) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV), связанных посредством пригодного линкера.

XXXI) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV), связанных посредством пригодного линкера, и которое является пегилированным.

XXXII) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV) и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

XXXIII) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, и которое является таковым, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, что опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

XXXIV) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

XXXV) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV) и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из XXI)-XXV) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека.

XXXVI) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV) и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из XXI)-XXV) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, и которое является таковым, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

XXXVII) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI)-XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из XXI)-XXV) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белок или полипептид по любому из XXVI)-XXXVII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из XXVI)-XXXVII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB I (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XXVI)-XXXVII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из XXVI)-XXXVII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из XXVI)-XXXVII), который содержит или по существу состоит из двух гуманизированных нанотел по любому из XXI)-XXV) и одного гуманизированного варианта нанотела ALB I (SEQ ID NO: 63).

Следует отметить, что если нанотело представляет собой, указанное выше, как "по любому из вышеуказанных XXI)-XXV)", то оно представляет собой, по меньшей мере, по одному из XXI)-XXV), может быть по двум или более из XXI)-XXV), и также может включать любой один или более из других аспектов, которые указаны как "по любому из вышеуказанных XXI)-XXV)". Аналогично, если белок или полипептид представляет собой, указанное выше, как "по любому из вышеуказанных XXVI)-XXXVII)", то он представляет собой, по меньшей мере, по одному из XXVI)-XXXVII), может быть по двум или более из XXVI)-XXXVII), и также может включать любой один или более из других аспектов, которые указаны как "по любому из вышеуказанных XXVI)-XXXVII)".

Клон, который, как было обнаружено, является особенно пригодным в качестве анти-TNF нанотела, представляет собой клон РМР1С2 (TNF1). Как можно видеть из сравнительных данных KYM-анализа в таблице 39, TNF1 имеет значение EC50, которое в четыре раза больше такового для лучшего моновалентного нанотела, описанного в WO 04/41862 (нанотело 3Е), а именно 2466 нМ для РМР1С2 в сравнении с 12 нМ для 3Е (как можно увидеть из таблицы 39, все нанотела TNF1-TNF 9 изобретения обеспечивают лучшие значения ЕС50 в данном анализе, чем 3Е). В связи с этим, также необходимо отметить, что нанотело 3Е из WO 04/41862 принадлежит к "классу KERE" (как здесь описывается), и может, следовательно, гуманизироваться в меньшей степени, чем нанотело РМР1С2 (которое принадлежит к "классу GLEW"). Если нанотело РМР1С2 сравнивать с нанотелом 1А из WO 04/41862, нанотело класса GLEW с большей степенью гомологии в последовательности с РМР1С2 (по обоим CDR и каркасам), то значение ЕС50, полученное для РМР1С2 в анализе KYM, более чем в 50 раз лучше, т.е. 2,466 нМ для РМР1С2 по сравнению с 100 нМ для 1А.

Соответственно, нанотела, которые содержат одну или более, предпочтительно любые две и более, предпочтительно все три имеющиеся CDR в клоне РМР1С2 (или последовательности CDR, которые получены из него или аналогичны ему) являются особенно предпочтительными в изобретении. Также эти нанотела предпочтительно принадлежат к "103 P, R, S группе" (как определено здесь), и наиболее предпочтительно имеют R в положении 103, и предпочтительно также содержат GLEW или GLEW-подобную последовательность в положениях 44-47. Также, если эти нанотела принадлежат к "103 Р, R, S группе" (и, в частности, если они имеют R в положении 103), одной предпочтительной, но не ограничивающей, гуманизированной заменой является 108Q на 108L. Другие предпочтительные, но не ограничивающие, гуманизированные замены в данных предпочтительных нанотелах представляют собой одну или более из тех, которые присутствуют в гуманизированных вариантах TNF1, описываемых здесь, как, например, TNF13, TNF14, TNF 29 или TNF30, как будет немедленно понятно при сравнении последовательности TNF1 с этими гуманизированными последовательностями.

Таким образом, в особенно предпочтительном нанотеле изобретения, по меньшей мере, одна из имеющихся последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232 и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1), или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере, 99% "идентичность последовательности" (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232 и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Предпочтительно, в данных предпочтительных нанотелах изобретения, по меньшей мере, две из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1), или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере, 99% "идентичность последовательности" (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232 и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Наиболее предпочтительно, в данных предпочтительных нанотелах изобретения, все три присутствующие последовательности CDR1, CDR2 HCDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232 и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1), или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% " идентичность последовательности" (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Даже более предпочтительно, в данных предпочтительных нанотелах изобретения, по меньшей мере, одна из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232 и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1). Предпочтительно, в этом воплощении, по меньшей мере, одна или предпочтительно обе другие две имеющиеся последовательности CDR подходящим образом выбираются из последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232 и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Даже более предпочтительно, в данных предпочтительных нанотелах изобретения, по меньшей мере, две из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232 и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1). Предпочтительно, в этом воплощении, оставшаяся имеющаяся последовательность CDR подходящим образом выбираются из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232 и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Особенно предпочтительные нанотела изобретения содержат последовательность CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательность CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательность CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательности CDR, присутствующие в клоне TNF1).

Нанотела с вышеуказанными последовательностями CDR предпочтительно имеют каркасные последовательности, которые здесь описываются. Некоторые особенно предпочтительные, но не ограничивающие, комбинации каркасных последовательностей можно видеть в вышеприведенной таблице I. Как будет ясно для специалиста, комбинация последовательностей FR1, FR2, FR3 и FR4, которые встречаются в том же клоне (т.е. последовательностей FR1, FR2, FR3 и FR4, которые указаны на одной линии в таблице I), будут, как правило, предпочтительными (хотя изобретение в широком смысле не ограничивается ими, и также содержит другие пригодные комбинации каркасных последовательностей, указанных в таблице I).

А именно, некоторыми предпочтительными аспектами этого воплощения изобретения являются:

XXXVIII) Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), в котором:

а) CDR1 содержит:

- аминокислотную последовательность DYWMY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и

b) CDR2 содержит:

- аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и

c) CDR3 содержит:

- аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXVIII), в котором:

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXVIII), в котором:

- любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

- Нанотело по XXXVIII), которое представляет собой нанотело класса GLEW.

- Нанотело по XXXVIII), которое содержит аргининовый остаток (R) в положении 103.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

- Нанотело по XXXVIII), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по XXXVIII), которое содержит лейциновый остаток (L) в положении 108.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет значение Koff для TNF лучше 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10-3 (1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения ЕС50 для нанотела VHH ЗЕ (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по результатам того же анализа; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет значение ЕС50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет значение ЕС50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанное в примере I, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

XXXIX) Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3 соответственно), в котором:

a) CDR1 представляет собой:

- аминокислотную последовательность DYWMY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и в котором:

b) CDR2 представляет собой:

- аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и в котором:

c) CDR3 представляет собой:

- аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXIX), в котором:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG;

или

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXIX), в котором:

- любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

- Нанотело по XXXIX), которое представляет собой нанотело класса GLEW.

- Нанотело по XXXIX), которое содержит аргининовый остаток (R) в положении 103.

- Нанотело по XXXIX), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

- Нанотело по XXXIX), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по XXXIX), которое содержит лейциновый остаток (L) в положении 108.

- Нанотело по XXXIX), которое имеет значение Koff для TNF лучше 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10-3 (1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXIX), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения ЕС50 для нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по тому же анализу, или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXIX), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXIX), имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXIX), которое выбирается из группы, состоящей из TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) и TNF 30 (SEQ ID NO: 96).

- Нанотело по XXXIX), которое представляет собой TNF 30 (SEQ ID NO: 96); с некоторыми другими предпочтительными аспектами:

- XL) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из нанотела по XXXVIII) или XXXIX).

- XLI) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела по XXXVIII) или XXXIX).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), которые непосредственно связаны друг с другом или связаны друг с другом посредством линкера.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), которые связаны друг с другом посредством аминокислотной последовательности.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), которые связаны друг с другом посредством аминокислотной последовательности (как, например, без ограничения, посредством аминокислотной последовательности, которая содержит глициновые и сериновые остатки), которая содержит, по меньшей мере, 14 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 17 аминокислот, например, около 20-40 аминокислот (например, как линкер GS30).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 7 (SEQ ID NO: 73), в котором оба нанотела TNF 1 гуманизированы.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 55 (SEQ ID NO: 419) или TNF 56 (SEQ ID NO: 20).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который является пегилированным.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора; и/или который таков, что указанный белок или полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF, и белок или полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) связаны друг с другом посредством, по меньшей мере, одного нанотела, направленного против сывороточного альбумина человека, и в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) либо связаны непосредственно с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, либо связаны с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, посредством линкера.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) связаны друг с другом посредством, по меньшей мере, одного нанотела, направленного против сывороточного альбумина человека, и в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) либо связаны непосредственно с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, либо связаны с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, посредством линкера, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность (как, например, без ограничения, линкер, который содержит глициновые и сериновые остатки), и, в особенности, аминокислотную последовательность, которая содержит 3-40 аминокислотных остатков, например, 5-15 аминокислотных остатков (как, например, линкер GS9).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) связаны друг с другом посредством, по меньшей мере, одного нанотела, направленного против сывороточного альбумина человека, и в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) либо связаны непосредственно с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, либо связаны с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, посредством линкера, и который белок или полипептид таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора; и/или который белок или полипептид таков, что указанный белок или полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB I (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из двух гуманизированных нанотел по любому из XL) или XLI) и одного гуманизированного варианта нанотела ALB I (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF24 (SEQ ID NO: 90), в котором оба нанотела TNF 1, а также нанотело ALB 1 гуманизированы.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из двух нанотела TNF 30 и одного нанотела ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 60 (SEQ ID NO: 417).

- Следует отметить, что если нанотело представляет собой указанное выше, как "по XXXVIII" или "по XXXIX", то оно представляет собой, по меньшей мере, по одному из XXXVIII) и/или XXXIX), и также может включать любой один или более из других аспектов, которые указаны как "по XXXVIII" или "по XXXDC". Аналогично, если белок или полипептид представляет собой указанное выше, как "по любому из вышеуказанных XL) или XLI)", то он представляет собой, по меньшей мере, по одному из XL)-XLI), может быть по двум или более из XL)-XLI), и также может включать любой один или более из других аспектов, которые указаны как "по любому из вышеуказанных XL) или XLI)".

Для нанотел, основанных на вышеуказанном нанотеле TNF1 (включая, но не ограничиваясь, гуманизированные нанотела), каркасные последовательности могут, как правило, быть, как здесь описывается, и предпочтительно представляют собой следующие:

a) FR1 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 130; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 130;

и

b) FR2 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 198; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 198;

и

c) FR3 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 266; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 266; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 266;

и

d) FR4 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность of SEQ ID NO: 334; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 334; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 334;

в котором аминокислотные отличия, имеющиеся в каркасных последовательностях, являются более предпочтительными, как здесь описывается.

Нанотела против TNF-альфа, которые содержат каркасные области, как описано выше (т.е. аналогично к TNF1), и в которых, по меньшей мере, одна из каркасных областей (а также любые две, любые три или все четыре каркасные области) гуманизирована, составляют следующий аспект изобретения. Такие нанотела могут, в частности, иметь CDR, которые таковы, что нанотело имеет значение Koff для TNF лучше 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10-3 (1/с); и/или иметь CDR, которые таковы, что нанотело имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения ЕС50 нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по аналогичному анализу; и, в частности, лучше 12 нМ, в частности, лучше 5 нМ, даже в особенности лучше 3 нМ. Кроме того, или альтернативно, такие нанотела предпочтительно направлены против одного и того же эпитопа TNF (т.е. тримера TNF), например, TNF1.

В частности, изобретение относится к нанотелу против TNF-альфа, которое представляет собой гуманизированный вариант нанотела против TNF-альфа, при этом нанотело против TNF-альфа имеет следующие каркасные последовательности: FR1: SEQ ID NO: 130; FR2: SEQ ID NO: 198; FR3: SEQ ID NO: 266; и FR4: SEQ ID NO: 334. Такое нанотело может, в частности, иметь CDR, которые таковы, что нанотело имеет значение Koff для TNF лучше 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10-3 (1/с); и/или иметь CDR, которые таковы, что нанотело имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862 которое лучше значения ЕС50 для нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 в аналогичном анализе; и, в частности, лучше 12 нМ, в частности, лучше 5 нМ, даже в особенности лучше 3 нМ. Также, или альтернативно, такие нанотела предпочтительно направлены против одного и того же эпитопа TNF (т.е. тримера TNF), например, TNF1.

Другим клоном, который, как было обнаружено в особенности применим как анти-TNF нанотело, является клон PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60). Как можно увидеть из сравнительных данных KYM-анализа, представленных в таблице 39, TNF3 имеет значение ЕС50, которое более чем в 15 раз лучше такового для наилучшего моновалентного нанотела, описанного в WO 04/41862.

Таким образом, нанотела, которые содержат одну или более, предпочтительно любые две и более, предпочтительно все три CDR, имеющиеся в клоне PMP5F10 (или последовательности CDR, которые получены из него или ему соответствуют) являются особенно предпочтительными в изобретении. Также эти нанотела предпочтительно принадлежат к классу KERE.

В частности, некоторыми предпочтительными аспектами этого воплощения изобретения являются:

XLII) Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), в котором:

a) CDR1 содержит:

- аминокислотную последовательность NYYMG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

b) CDR2 содержит:

- аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

c) CDR3 содержит:

- аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG.

- Нанотело по XLII), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

- Нанотело по XLII), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLII), в котором:

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 содержит аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLII), в котором:

- любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

- Нанотело по XLII), которое представляет собой нанотело класса KERE.

- Нанотело по XLII), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 99 (TNF33).

- Нанотело по XLII), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по XLII), которое имеет значение Koff для TNF лучше 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10-3 (1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLII), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения ЕС50 для нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по тому же анализу; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLII), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLII), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

XLIII) Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), в котором:

a) CDR1 представляет собой:

- аминокислотную последовательность NYYMG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

b) CDR2 представляет собой:

- аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

c) CDR3 представляет собой:

- аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLIII), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG.

- Нанотело по XLIII), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

- Нанотело по XLIII), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLIII), в котором:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLIII), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLIII), в котором:

- любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

- Нанотело по XLIII), которое представляет собой нанотело класса KERE.

- Нанотело по XLIII), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 99 (TNF33).

- Нанотело по XLIII), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по XLIII), которое имеет значение Koff для TNF лучше 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 2⋅10-3 (1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLIII), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения ЕС50 для нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по тому же анализу; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLIII), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое составляет лучше 5 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLIII), которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862 которое лучше 3 нМ; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLIII), которое выбирается из группы, состоящей из SEQ ID N0 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 98 (TNF33), TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) и TNF 30 (SEQ ID NO: 96) с некоторыми другими предпочтительными аспектами, а именно:

XLIV) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из нанотела по XLII) или XLIII).

XLV) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела по XLII) или XLIII).

XLVI) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по XLII) или XLIII).

XLVII) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по XLII) или XLIII) и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

XLVIII) Белок или полипептид, который содержит два нанотела по XLII) или XLIII) и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 6 (SEQ ID NO: 72) или TNF 9 (SEQ ID NO: 75), в котором оба нанотела TNF 3 гуманизированы.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), который является пегилированным.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по XLII) или XLIII), и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора; и/или который таков, что указанный белок или полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF, и где белок или полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB I (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), который содержит или по существу состоит из двух гуманизированных нанотел по любому из XLIV) или XLVIII) и одного гуманизированного варианта нанотела ALB I (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF26 (SEQ ID NO: 92), в котором оба нанотела TNF 3, а также нанотело ALB 1, гуманизированы.

Следует отметить, что если нанотело обозначается как "по XLII" или "по XLIII", это соответствует, по меньшей мере, по одному из XLII) и/или XLIII), и может также включать любой один или более других аспектов, которые обозначаются выше как "по XLII)" или "по XLIII)". Аналогично, если белок или полипептид обозначается как "по любому из XLIV) или XLVIII)", то соответствует, по меньшей мере, по одному из XL)-XLI), может быть по двум или более из XLIV)-XLVIII), и может также включаться любой один или более из других аспектов, которые указываются как "по любому из вышеуказанных XLIV) или XL VIII).

Для нанотел, основанных на вышеуказанном нанотеле TNF3 (включая, но не ограничиваясь, гуманизированные нанотела), каркасные последовательности могут являться, в целом, как здесь описывается, и предпочтительно следующими:

a) FR1 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 138; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 138;

и

b) FR2 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 206; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 206;

и

c) FR3 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 274; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 274; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 274;

и

d) FR4 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 342; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 342;

где аминокислотные отличия, имеющиеся в каркасных последовательностях, более предпочтительны, как здесь описывается.

В другом аспекте, изобретение относится к нанотелу с аминокислотной последовательностью, которая выбирается из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52-60, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 76-86, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 95-99, из группы, состоящей из SEQ ID NO 105-129 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют более 80%, предпочтительно более 90%, более предпочтительно более 95%, а также 99% или более "идентичности последовательности" (как определено здесь) с одной или более аминокислотный последовательностей из SEQ ID NO: 52-60, SEQ ID NO: 76-86, SEQ ID NO: 95-99 или SEQ ID NO 105-129, где последние аминокислотные последовательности наиболее предпочтительно имеют каркасные последовательности, которые являются таковыми, как дополнительно указывается ниже в общем описании каркасных последовательностей нанотел.

В соответствии со специфическим, но не ограничивающим, воплощением последние аминокислотные последовательности являются "гуманизированными", как дополнительно здесь описывается.

Наиболее предпочтительно, нанотела изобретения выбираются из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52-60, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 76-86, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 95-99, или из группы, состоящей из SEQ ID NO 105-129, из которых "гуманизированные" нанотела из SEQ ID NO 76-86 и SEQ ID NO: 95-99 могут являться особенно предпочтительными.

Как указано выше, особенно предпочтительное нанотело изобретения представляет собой клон РМР1С2 (TNF1; SEQ ID NO: 52). Таким образом, в предпочтительном аспекте, изобретение относится к нанотелу с аминокислотной последовательностью, которая выбирается из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют более чем 80%, предпочтительно более чем 90%, более предпочтительно более чем 95%, а также 99% или более "идентичности последовательности" (как определено здесь) с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 52, где последние аминокислотные последовательности наиболее предпочтительно имеют каркасные последовательности, которые являются таковыми, как дополнительно указывается ниже в общем описании каркасных последовательностей нанотел.

Особенно предпочтительными являются гуманизированные варианты клона РМР1С2 (TNF1; SEQ ID NO: 52). Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры таких гуманизированных вариантов являются клоны TNF13 (SEQ ID NO: 76), TNF14 (SEQ ID NO: 77), TNF29 (SEQ ID NO: 95) и TNF 30 (SEQ ID NO: 96). Таким образом, в предпочтительном аспекте, изобретение относится к гуманизированному нанотелу с аминокислотной последовательностью, которая выбирается из группы, состоящей из SEQ ID NO: 76, 77, 95 или 96, или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют более чем 80%, предпочтительно более чем 90%, более предпочтительно более чем 95%, а также 99% или более "идентичности последовательности" (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 76, 77, 95 или 96, где последние аминокислотные последовательности наиболее предпочтительно имеют каркасные последовательности, которые являются таковыми, как дополнительно указывается ниже в общем описании каркасных последовательностей нанотел.

В соответствии с одним предпочтительным воплощением, нанотело изобретения представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF I (SEQ ID NO: 52).

Некоторыми предпочтительными аспектами этого воплощения изобретения являются:

XLIX) Гуманизированный вариант нанотела TNF 1, который имеет значение Koff для TNF лучше 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10-3 (1/с).

L) Гуманизированный вариант нанотела TNF 1, который имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения ЕС50 для нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по тому же анализу.

LI) Гуманизированный вариант нанотела TNF 1, который имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5 нМ.

LII) Гуманизированный вариант нанотела TNF 1, который имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3 нМ.

LIII) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела, которое представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX)-LII)

LIV) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX)-LII) (необязательно связанных посредством линкера).

LV) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX)-LII) (необязательно связанных посредством линкера), и которые таковы, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

LVI) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX)-LII) и которые способны к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

LVII) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 7 (SEQ ID NO: 73), в котором оба нанотела TNF 1 гуманизированы.

LVIII) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 7 (SEQ ID NO: 73), в котором оба нанотела TNF 1 гуманизированы, и который является пегилированным.

LIX) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX)-LII), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно Нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

LX) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX)-LII), где каждый связан (необязательно связаны посредством линкера) с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека. Белок или полипептид по любому из LIII)-LX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из LIII)-LX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB I (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из LIII)-LX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из LIII)-LX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из LIII)-LX), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF24 (SEQ ID NO: 90), в котором оба нанотела TNF 1, также как и нанотело ALB TNF 1, гуманизированы.

- Белок или полипептид по любому из LIII)-LX), который содержит или по существу состоит из двух нанотел TNF 30 и одного нанотела ALB 8.

Согласно одному предпочтительному воплощению, нанотело изобретения представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF 3 (SEQ ID NO: 60).

Некоторыми предпочтительными аспектами этого воплощения изобретения являются:

LXI) Гуманизированный вариант нанотела TNF 3, который имеет значение Koff для TNF лучше 2⋅10-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10-3 (1/с).

LXII) Гуманизированный вариант нанотела TNF 3, который имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862 которое лучше значения ЕС50 для нанотела VHH 3Е (SEQ ID NO: 4) из WO 04/041862 по тому же анализу.

LXIII) Гуманизированный вариант нанотела TNF 3, который имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5 нМ.

LXIV) Гуманизированный вариант нанотела TNF 3, которое имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3 нМ.

LXV) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела, которое представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF 3 по любому из LXI)-LXIV).

LXVI) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI)-LXIV) (необязательно связанных посредством линкера).

LXVII) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI)-LXIV) (необязательно связанных посредством линкера), и которые таковы, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

LXVIII) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI)-LXIV) и которые способны к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

LXIX) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 6 (SEQ ID NO: 72) или TNF 9 (SEQ ID NO: 75), в котором оба нанотела TNF 3 гуманизированы.

LXX) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 6 (SEQ ID NO: 72) или TNF 9 (SEQ ID NO: 75), в котором оба нанотела TNF 3 гуманизированы, и который является пегилированным.

LXXI) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI)-LXIV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

LXXII) Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI)-LXIV), каждое из которых связано (необязательно связано посредством линкера) с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид по любому из LXV)-LXXII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из LXV)-LXXII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из LXV)-LXXII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из LXV)-LXXII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из LXV)-LXXII), которое содержит или по существу состоит из полипептида TNF26 (SEQ ID NO: 92), в котором оба нанотела TNF 3, так же как и нанотело ALB 1, гуманизированы.

В другом аспекте, изобретение относится к полипептиду, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела против TNF-альфа, как определено здесь. Такие полипептиды также относятся здесь к "полипептидам изобретения" и могут являться таковыми, как дополнительно здесь в дальнейшем описывается и/или как, в целом, описывается в WO 04/041862 для нанотел, раскрываемых здесь, и могут, например, быть многовалентными полипептидами или мультиспецифичными полипептидами, опять же, как дополнительно описывается здесь ниже.

Предпочтительно, полипептид изобретения является как бивалентным, так и тривалентным (т.е. содержащий два или три нанотела изобретения, соответственно, необязательно связанных посредством одного или двух линкеров, как определено ниже, соответственно) или мультиспецифичным полипептидом, содержащим одно или два, и предпочтительно два, нанотела изобретения и, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного белка, и в частности, против сывороточного белок человека, а также против сывороточного альбумина человека.

В одном предпочтительном, но не ограничивающем, воплощении, нанотела изобретения, присутствующие в полипептидах изобретения, выбираются из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52-60 и SEQ ID NO 105-129 или из их гуманизированных вариантов, и в частности из "гуманизированных" нанотел из SEQ ID NO 76-86 и SEQ ID NO: 95-99. Нанотела против сывороточного альбумина человека, присутствующие в полипептидах изобретения, являются таковыми, как определено ниже, и более предпочтительно выбираются из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61-67, SEQ ID NO: 87-89 и SEQ ID NO: 100-104, и в частности из "гуманизированных" нанотел против сывороточного альбумина человека из SEQ ID NO 76-86 и SEQ ID NO 100-104.

В отношении нанотел, присутствующих в полипептидах изобретения, необходимо отметить, что для специалиста будет понятно, что нанотела, которые определены здесь как "предпочтительные" (или как "более предпочтительные", "даже более предпочтительные", и т.д.) являются также предпочтительными (или более предпочтительные, или даже более предпочтительные, и т.д.) для применения в полипептидах, здесь описываемых. Таким образом, полипептиды, которые содержат или по существу состоят из одного или более "предпочтительных" нанотел изобретения, в целом, будут являться предпочтительными, и полипептиды, которые содержат или по существу состоят из одного или более "более предпочтительных" нанотел изобретения, будут, в общем, являться более предпочтительными, и т.д.

Таким образом, в изобретении, полипептиды, которые содержат одно или более нанотела, которые по существу состоят из одного из предпочтительных вариантов клона РМР1С2 (TNF1; SEQ ID NO: 52), где указанные предпочтительные варианты таковы, как определено здесь, являются особенно предпочтительными. Даже более предпочтительными являются полипептиды, которые содержат одно или более нанотела, которые по существу состоят из одного из гуманизированных вариантов клона РМР1С2 (TNF1; SEQ ID NO: 52), где указанные предпочтительные варианты таковы, как определено здесь (примеры включают, без ограничения, TNF13, TNF14, TNF29 и TNF30). TNF30 является особенно предпочтительной гуманизированной "структурной единицей" для применения в полипептидах изобретения.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры таких белков и полипептидов являются сами РМР1С2, гуманизированные варианты TNF13, TNF14, TNF29 и TNF30; конструкции SEQ ID NO: 70 (TNF4), SEQ ID NO: 73 (TNF7), SEQ ID NO: 90 (TNF24), SEQ ID NO: 93 (TNF27); и конструкции SEQ ID NO: 417 (TNF60), SEQ ID NO: 419 (TNF55) и SEQ ID NO: 420 (TNF56), где последние три конструкции содержат гуманизированный вариант TNF 30 как структурную единицу.

Как указано здесь, нанотела и конструкции, описываемые здесь, могут быть пегилированными, или содержать одно или более (дополнительные) аминокислотные остатки, которые вводятся для пегилирования и/или облегчения пегилирования. Два предпочтительных, но не ограничивающих, примера таких полипептидов являются TNF55 и TNF56, оба из которых содержат дополнительный цистеиновый остаток для облегчения связывания PEG-группы.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры полипептидов изобретения являются бивалентными полипептидами изобретения, содержащими SEQ ID NO: 70-75, и мультиспецифичными полипептидами изобретения, содержащими SEQ ID NO: 90-94 и SEQ ID NO 417-420.

Как можно увидеть из данных, представленных ниже, и в частности из данных, приведенных в Сравнительном примере, нанотела и/или полипептиды изобретения обладают улучшенными свойствами. В частности, белки и полипептиды изобретения могут обладать улучшенным сродством к человеческому TNF-альфа (выраженному как значение EC50 в анализе KYM, описываемому здесь), по сравнению с коммерчески доступными биологическими анти-TNF препаратами Enbrel™, Humira™ и Remicade™. Также нанотела, описываемые здесь, могут обладать улучшенным сродством к TNF-альфа по сравнению с наилучшими нанотелами, которые описаны в Международной заявке WO 04/041862. Таким образом, можно предположить, что полипептиды изобретения, содержащие, по меньшей мере, одно из нанотел изобретения, будут также обладать улучшенными свойствами по сравнению с полипептидами, которые содержат только нанотела против TNF-альфа, описываемые в WO 04/041862.

Кроме того, полипептид, как описывается здесь, который содержит два или более (и предпочтительно два) нанотел, которые описываются здесь (и необязательно, например, нанотело против сывороточного альбумина человека), имеют значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения ЕС50 для Humira® и Remicade®, и, предпочтительно, также лучше для Enbrel® по тому же анализу.

Например, такой белок или полипептид предпочтительно имеет значение ЕС50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 0,2 нМ, предпочтительно лучше 0,1 нМ, а также лучше чем 0,7 нМ и, в частности, лучше 0,4 нМ.

Также заявителем показывается, что нанотела против мышиного TNF-альфа и полипептиды, содержащие нанотела против мышиного TNF-альфа, демонстрируют существенную биологическую активность в следующих моделях болезней (данные не показаны):

- Модель колита, вызванного введением декстрана сульфата натрия ("DSS") при использовании как нормальных мышей, так и мышей с нокаутом IL-10, как описывается Okayasu et al. (Gastroenterol 1990, 98(3): 694);

- Модель артрита ("RA"), коллаген-индуцированный артрит ("CIA"), как описывается Courtenay et al. (Nature 1980, 283(5748): 666), при использовании как нормальных мышей, так и мышей с нокаутом IL-10;

- Мышиная модель IBD для мышей с нокаутом IL-10, как, например, описывается Rennick etal. (Clin Immunol Immunopathol 1995, 76(3 Pt 2): S174);

- Модель RA Коллиаса, как, например, описывается Keffer et al. (EMBO J 1991,10(13): 4025);

- Модель IBD, вызванного введением 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты ("TNBS"), как описывается Elson etal. (J Immunol 1996, 157(5): 2174);

- CIA модель RA, описываемая Koppieters et al. (рукопись в процессе подготовки);

- Модель фибробластов, полученных из синовиальной оболочки (описываемая ниже); и

- Мышиная модель «воздушный карман».

Предпочтительно, нанотела, описываемые здесь, являются лучше нанотела 1А из WO 04/041862 в, по меньшей мере, одной из вышеуказанных моделях, и предпочтительно во всех этих моделях; и более предпочтительно являются лучше нанотела 3Е из WO 04/041862 в, по меньшей мере, одной из вышеуказанных моделях, и предпочтительно во всех этих моделях. Также полипептиды, описываемые здесь, предпочтительно эквивалентны или лучше Humira® или Remicade® в, по меньшей мере, одной из вышеуказанных моделях, и предпочтительно во всех этих моделях; и более предпочтительно также эквивалентны или лучше Enbrel®, по меньшей мере, в одной из вышеуказанных моделях, и предпочтительно во всех этих моделях.

Эти данные подтверждают, что нанотела против TNF-альфа и полипептиды, их содержащие, а также нанотела и полипептиды, описываемые в WO 04/041862, и в частности нанотела и полипептиды, описываемые здесь, должны обладать терапевтическим действием против заболеваний и нарушений, опосредованных TNF, а также заболеваний и нарушений, указанных выше.

В другом аспекте, изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует нанотело изобретения и/или полипептид изобретения. Такая нуклеиновая кислота будет также упоминаться ниже как "нуклеиновая кислота изобретения" и может, например, быть в виде генетической конструкции, как определяется ниже.

В другом аспекте, изобретение относится к хозяину или клетке-хозяину, который экспрессирует или способен к экспрессии нанотела изобретения и/или полипептида изобретения; и/или которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую нанотело изобретения и/или полипептид изобретения. Такой хозяин или клетка-хозяин также может быть аналогичным с хозяевами или клетками-хозяевами, описываемыми в WO 04/041862, но экспрессирующий или способный к экспрессии нанотела изобретения и/или полипептида изобретения и/или, содержащий нуклеиновую кислоту, как здесь описывается.

Изобретение дополнительно относится к продукту или композиции, содержащему или состоящему из нанотела изобретения, полипептида изобретения; и/или нуклеиновой кислоты изобретения. Такой продукт или композиция может, например, представлять собой фармацевтическую композицию (как описывается ниже) или продукт или композицию для диагностического применения (что также описывается ниже). Такой продукт или композиция может также быть аналогичным продуктам и композициям, описываемым в WO 04/041862, но содержащий или состоящий из нанотела изобретения, полипептида изобретения или нуклеиновой кислоты изобретения.

Изобретение дополнительно относится к способам приготовления или производства нанотел, полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, которые здесь описываются, где способы представляют собой такие, которые дополнительно описываются ниже. Также, в целом, нанотела, полипептиды, нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, продукты и композиции, описываемые здесь, могут также приготавливаться способом, аналогичным со способом, описываемым в WO 04/041862.

Изобретение дополнительно относится к способам применения и использования вышеуказанных нанотел, полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, здесь описываемых, где способы применения и использования включают, но не ограничиваются, способы применения и использования, которые описываются ниже, и/или дополнительно способы использования и применения нанотел против TNF-альфа и/или их содержащих полипептидов, указанные в WO 04/041862.

Другие аспекты, воплощения, преимущества и применения изобретения станут ясными из дальнейшего описания.

Подробное описание изобретения

Вышеуказанные и другие аспекты и воплощения изобретения станут ясными из дальнейшего описания, в котором:

а) Если не указано или не определено иное, все используемые термины имеют их обычное значение для данной области техники, которое будет понятно для специалиста. Ссылки приведены, например, на общепринятые справочники, а также Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd. Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), так же как и на общий уровень техники, приводимый здесь;

b) Если не указано иное, термин "иммуноглобулиновая последовательность" — используется ли здесь для обозначения антитела к тяжелой цепи или для стандартного четырехцепочечного антитела - применяется как общий термин, включающий как полноразмерное антитело, его отдельные цепи, так же как и все его части, домены или фрагменты (включая, но не ограничиваясь, антигенсвязывающие домены или фрагменты, а также VHH домены или VH/VL домены, соответственно). В дополнение, термин "последовательность", в используемом здесь значении (например, в терминах, как "иммуноглобулиновая последовательность", "последовательность антитела, "последовательность вариабельного домена", "VHH последовательность" или "белковая последовательность"), должен пониматься, в целом, как включающий и релевантную аминокислотную последовательность, так же как и последовательности нуклеиновых кислот или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, если контекстом не предусмотрено более ограниченное значение;

c) Если не указано иное, все способы, этапы, техники и манипуляции, которые специально не описываются подробно, могут выполняться и осуществляются способом, по существу известным, который будет понятным для специалиста. Ссылка, например, снова приведена на общепринятые справочники, на общий уровень техники, указанный выше, и дополнительно на ссылки, цитируемые здесь;

d) Аминокислотные остатки будут указаны в соответствии с общепринятым трехбуквенным или однобуквенным аминокислотным кодом, как указано в таблице 1;

Таблица 1:
однобуквенный и трехбуквенный аминокислотный код
Неполярный, незаряженный (при pH 6,0-7,0)(3) Аланин Ala A
Валин Val V
Лейцин Leu L
Изолейцин Ile I
Фенилаланин Phe F
Метионин(1) Met M
Триптофан Trp W
Пролин Pro P
Полярный, незаряженный (при pH 6,0-7,0) Глицин(2) Gly G
Серин Ser S
Треонин Thr Т
Цистеин Cys C
Аспарагин Asn N

Глутамин Gln Q
Тирозин Tyr Y
Полярный, заряженный(при pH 6,0-7,0) Лизин Lys K
Аргинин Arg R
Гистидин(4) His H
Аспартат Asp D
Глутамат Glu E
Примечания:
(1) Иногда также считается полярной незаряженной аминокислотой.
(2) Иногда также считается неполярная незаряженной аминокислотой.
(3) Как будет ясно для специалиста, то, что аминокислотный остаток указывается в этой таблице как либо заряженный или незаряженный при pH 6,0-7,0, не отражается в любом случае на заряде, указанный аминокислотный остаток может иметь при pH ниже 6,0 и/или при pH выше 7,0; аминокислотные остатки, указанные в таблице могут быть либо заряженными и/или незаряженными при таких более высоких или низких pH, как будет ясно для специалиста.
(4) Как известно из уровня техники, заряд остатка His в целом зависим от даже небольшого изменения pH, но остаток His может рассматриваться, в общем, по существу незаряженным при pH около 6,5.

e) Для целей сравнения двух или более нуклеотидных последовательностей, процент "идентичности последовательности" между первой нуклеотидной последовательности и второй нуклеотидной последовательностью может быть рассчитан путем деления [количества нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности, которое идентично количеству нуклеотидов в соответствующих положениях во второй нуклеотидной последовательности] на [общее количество нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности] и умноженное на [100%], где каждая делеция, инсерция, замена или дополнение нуклеотида во второй нуклеотидной последовательности - сравнительно с первой нуклеотидной последовательностью — рассматривается как отличие в одном нуклеотиде (положении).

Альтернативно, степень идентичности последовательности между двумя или более нуклеотидными последовательностями может быть рассчитана при использовании известного компьютерного алгоритма для анализа последовательностей, а также NCBI Blast v2.0, используя установки по умолчанию.

Некоторые другие способы, компьютерные алгоритмы и установки для определения степени идентичности последовательности, например, описываются в WO 04/037999, ЕР 0 967 284, ЕР 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 и GB 2 357 768-A.

Обычно, для определения процента "идентичности последовательности" между двумя нуклеотидными последовательностями по способу расчета, представленному выше, нуклеотидная последовательность с большим количеством нуклеотидов выбирается в качестве "первой" нуклеотидной последовательности, а другая нуклеотидная последовательность будет являться "второй" нуклеотидной последовательностью;

е) Для сравнения двух или более аминокислотных последовательностей, процент "идентичности последовательности" между первой нуклеотидной последовательности и второй нуклеотидной последовательностью может быть рассчитан путем деления [количества аминокислотных остатков в первой нуклеотидной последовательности, которое идентично количеству аминокислотных остатков в соответствующих положениях во второй аминокислотной последовательности] на [общее количество аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности] и умноженное на [100%], где каждая делеция, инсерция, замена или дополнение аминокислотного остатка во второй аминокислотной последовательности - сравнительно с первой аминокислотной последовательностью - рассматривается как отличие в одном аминокислотном остатке (положении), т.е. как "аминокислотное отличие", как определено ниже.

Альтернативно, степень идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями может быть рассчитана при использовании известного компьютерного алгоритма, такого как указано выше для определения степени идентичности последовательности для нуклеотидных последовательностей, опять же при использовании общепринятых установок.

Как правило, для определения процента "идентичности последовательности" между двумя аминокислотными последовательностями по способа расчета, приведенному выше, аминокислотная последовательность с большим числом аминокислотных остатков выбирается в качестве "первой" аминокислотной последовательности, и другая аминокислотная последовательность будет являться "второй" аминокислотной последовательностью.

Также, для определения степени идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями, специалист может принимать во внимание так называемые "консервативные" аминокислотные замены, которые в общем могут описываться как аминокислотные замены, где аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком аналогичной химической структуры и который имеет небольшое или по существу не имеет влияния на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Такие консервативные аминокислотные замены хорошо известны из уровня техники, например, из WO 04/037999, GB-A-2 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 и WO 01/09300; и (предпочтительные) типы и/или комбинации таких замен могут выбираться на основе соответствующих рекомендаций из WO 04/037999, так же и из WO 98/49185 и из дополнительных ссылок, цитируемых здесь.

Такие консервативные замены предпочтительно представляют собой замены, где одна аминокислота со следующими группами (а) - (е) замещается другим аминокислотным остатком аналогичной группы: (а) малые алифатические, неполярные или слабо полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные, отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (с) полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (d) большие алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, Не, Val и Cys; и (е) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp.

Особенно предпочтительными консервативными заменами являются следующие: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; He на Leu или на Val; Leu на Не или на Val; Lys на Arg, на Gin или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp; и/или Phe на Val, на Не или на Leu.

Любые аминокислотные замены, применяемые к полипептидам, описываемые здесь, могут также основываться на анализе частот аминокислотных вариаций между гомологичными белками различных видов, разработанном Schuiz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, на анализе структурирующих потенциалов, разработанном Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 и Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, и на анализе гидрофобности групп в белках, разработанном Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981, и Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, все включены здесь путем ссылки. Сведения о первичной, вторичной и третичной структуре нанотел представлены в описании и в общем уровне техники, приведенном выше. Также, для этих целей, кристаллическая структура VHH домена из ламы, например, представлена Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol.3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; и Decanniere et al., Structure, Vol.7, 4, 361 (1999). Дополнительная информация относительно некоторых аминокислотных остатков, которые в присутствуют в традиционных VH доменов из VH/VL области, и потенциальных «camelizing» замен в этих положениях можно обнаружить в уровне технике для нанотел, цитируемом здесь;

g) аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот указываются как "точно такие же", если они имеют 100% идентичности последовательности (как определено здесь) вдоль всей их длины;

h) при сравнении двух аминокислотных последовательностей, термин "аминокислотное отличие" относится к инсерции, делеции или замене одного аминокислотного остатка в положении первой последовательности, сравнительно со второй последовательностью; при этом предполагается, что две аминокислотные последовательности могут содержать одно, два или более таких аминокислотных отличий;

i) последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность рассматривается как "(в) по существу изолированной (форме)" - например, сравнительно с ее нативным биологическим источником и/или реакционной средой или средой культивирования, из которой она была получена - когда разделена от, по меньшей мере, одного другого компонента, с которым, как правило, ассоциируется в указанном источнике или среде, таком как другая нуклеиновая кислота, другой белок/полипептид, другой биологический компонент или макромолекула, или, по меньшей мере, один контаминант, примесь или второстепенный компонент. В частности, последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность рассматривается как "по существу выделенная", если она очищена, по меньшей мере, 2-кратно, в частности, по меньшей мере, 10-кратно, более в частности, по меньшей мере, 100-кратно, и до 1000-кратно или более. Последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, которая находится "по существу в выделенном виде" предпочтительно по существу гомогенна, как определено при использовании пригодного способа, такого как пригодный хроматографический способ, например, способ электрофореза в полиакриламидном геле;

j) Термин "домен" в используемом здесь значении, обычно относится глобулярной области цепи антитела, и, в частности, к глобулярной области тяжелой цепи антитела, или к полипептид, который по существу состоит из такой глобулярной области. Как правило, такой домен будет содержать пептидные петли (например, 3 или 4 пептидные петли), стабилизированные, складка или путем дисульфидных связей.

k) Термин "антигенная детерминанта" относится к эпитопу на антигене, распознающийся антиген-связывающей молекулой (а также нанотелом или полипептидом изобретения), а именно антиген-связывающим сайтом указанной молекулой. Термины "антигенная детерминанта" и "эпитоп" могут также являться здесь взаимозаменяемыми.

l) Аминокислотная последовательность (например нанотела, антитела, полипептида изобретения, или, в целом, антиген связывающего белка или полипептида или их фрагменты), которая может связываться с, которая имеет сродство к и/или которая имеет специфичность к специфичной антигенной детерминанте, эпитопу, антигену или белок (или к, по меньшей мере, их одной части, фрагменту или эпитопу) указывается как "против" или "направленная против" указанной антигенной детерминанты, эпитопа, антигена или белка.

m) Термин "специфичность" относится к числу различных типов антигенов или антигенных детерминант, к которым определенная антиген-связывающая молекула или молекула постоянная равновесия (а также нанотела или полипептида изобретения) может присоединяться. Специфичность антиген-связывающего белка может определяться с учетом сродства и/или авидности. Сродство, представленное константой равновесия для диссоциации антигена с антиген-связывающим белком (KD), измеряется на связывающую способность между антигенной детерминантой и антиген-связывающим сайтом: чем меньше значение KD, тем сильнее связывающая способность между антигенной детерминантой и молекулой, содержащей антиген-связывающий сайт (альтернативно, сродство также может выражаться как константа сродства (KA), которая соответствует 1/KD). Как будет понятно для специалиста (например, на основании дополнительного описания), сродство может определяться способом, известным per se, в зависимости от специфичности интересующего антигена. Авидность представляет собой величину силы связывания между антиген-связывающей молекулой (такой как, нанотело или полипептид изобретения) и соответствующим антигеном. Авидность относится как к сродству между антигенной детерминантой и ее антиген-связывающим сайтом на антиген-связывающей молекуле и к количеству соответствующих сайтов связывания, имеющихся антиген-связывающей молекуле. Обычно антиген-связывающие белки (а также нанотела и/или полипептиды изобретения) могут связываться с константой диссоциации (KD), составляющей 10-5-10-12 моль/литр (М) или менее, и предпочтительно 10-7-10-12 моль/литр (М) или менее и более предпочтительно 10-8-10-12 моль/литр, и/или с константой ассоциации (KD), по меньшей мере, 107 М-1, предпочтительно, по меньшей мере, 108 М-1, более предпочтительно, по меньшей мере, 109 М-1, а также, по меньшей мере, 1012 М-1. Любое значение KD больше, чем 10-4 М обычно считается, что отражает неспецифичное связывание. Предпочтительно, нанотело или полипептид изобретения будет связываться с желательным антигеном с KD менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, а также менее 500 нМ. Специфичное связывание антиген-связывающего белка с антигеном или антигенной детерминантой может определяться любым пригодным способом, известным per se, включая, например, анализ Скэтчарда и/или анализы конкурентного связывания, такие как радиоиммунный анализ (RIA), иммуноферментный анализ (EIA) и сэндвич-анализ конкурентного связывания, и другие их варианты, известные по сути из уровня техники.

n) как дополнительно в дальнейшем описывается, аминокислотная последовательность и структура нанотела может рассматриваться - без каких-либо ограничений - как содержащая четыре каркасных областей или "FR", которое относятся в уровне техники и в дальнейшем к "Каркасная область 7" или "FR1"; "Каркасная область 2" или "FRF; "Каркасная область 3" или "FRF; и "Каркасная область 4" или "FR4", соответственно; где каркасные области прерванные тремя гипервариабельными областями или "CDR", которое обозначаются в уровне техники как "Гипервариабельная область 1" или "CDRI"; как "Гипервариабельная область 2" или "CDR2"; и как "Гипервариабельная область 3" или "CDR3", соответственно;

о) как также дополнительно в дальнейшем описывается, общее число аминокислотных остатков в нанотеле может составлять порядка 110-120, предпочтительно 112-115, и наиболее предпочтительно 113. Однако необходимо отметить, что части, фрагменты или аналоги (как дополнительно в дальнейшем описывается) нанотела по существу не ограничены по их длине и/или размеру, так же как части, фрагменты или аналоги соответствуют дополнительным требованиям, приведенным ниже, и также предпочтительно пригодны для целей, описываемых ниже;

p) аминокислотные остатки нанотела нумеруются в соответствии с обычной нумерацией для VH доменов, приведенную Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), которая применяется для VHH доменов из Camelids в статье Riechmann and Muyldermans, указанной выше (см., например, фигуру 2 указанной ссылки). В соответствии с нумерацией, FR1 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 31-36, FR2 нанотела содержит аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102, и FR4 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В связи с чем, следует указать, что - как известно из уровня техники для VH доменов и для VHH доменов - общее число аминокислотных остатков в каждом из CDR может отличаться и может не соответствовать общему числу, указанному в Номенклатуре Кабата (что одно или более положений по номенклатуре Кабата может не быть занятым в действительной последовательности, или действительная последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, допустимое по номенклатуре Кабата). Это означает, что, в целом, нумерация по Кабату может или не может соответствовать действительному числу аминокислотных остатков в действительной последовательности. В общем, однако, можно указать, что согласно нумерации аминокислотных остатков в CDR, положение 1 по номенклатуре Кабата соответствует началу FR1 и наоборот, положение 36 по номенклатуре Кабата соответствует началу FR2 и наоборот, положение 66 по номенклатуре Кабата соответствует началу FR3 и наоборот, и положении 103 по номенклатуре Кабата соответствует началу FR4 и наоборот.]

Альтернативные способы нумерации аминокислотных остатков VH доменов, чьи способы также могут применяться аналогичным образом к VHH доменам от Camelids и к Нанотелам, представляют собой способы, описываемые Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), так называемое "AbM определение" и так называемое "контактное определение". Однако, в настоящем описании, формуле и фигурах, нумерация по Кабату как применяется для VHH доменам Riechmann and Muyldermans будет следующей, если другое не определено, и

q) Фигуры, Перечень последовательностей и Экспериментальная часть/примеры предоставлены только для дополнительного пояснения изобретение и не должны интерпретироваться или истолковываться как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемой формулы.

Для общего описания антител к тяжелым цепям и их вариабельных доменов, ссылки можно отнести к следующим источникам, которые описывают общий уровень техники: WO 94/04678, WO 95/04079 и WO 96/34103 (Vrije Universiteit Brussel); WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 WO 02/48193 (Unilever); WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 и WO 03/055527 (Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)); WO 03/050531 (Algonomics N.V.); WO 01/90190 (National Research Council of Canada); WO 03/025020 (=EP 1433793) (Institute of Antibodies); так же как и WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551; Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8; Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies and Riechmann, Protein Eng. 1996 Jun; 9(6): 531-7; Desmyter et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 803-11; Sheriff et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 733-6; Spinelli et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414(3): 521-6; Vu et al., Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch et al., Journal of Camel Practice and Research 1997; 4: 177-182; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 1998 Jan 23; 275(3): 413-8; Lauwereys et al., EMBO J. 1998 Jul 1; 17(13): 3512-20; Frenken et aL.Res Immunol. 1998 Jul-Aug; 149(6):589-99; Transue et al., Proteins 1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Muyldermans and Lauwereys, J. Mol. Recognit. 1999 Mar-Apr; 12 (2): 131-40; van der Linden et al., Biochim. Biophys. Acta 1999 Apr 12; 1431(1): 37-46.; Decanniere et al. Structure Fold. Des. 1999 Apr 15; 7(4): 361-70; Ngyuen et al., Mol. Immunol. 1999 Jun; 36(8); 515-24; Woolven et al., Immunogenetics 1999 Oct; 50 (1-2): 98-101; Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2): 25-38; Spinelli et al., Biochemistry 2000 Feb 15; 39(6): 1217-22; Frenken et al., J. Biotechnol. 2000 Feb 28; 78(1): 11-21; Nguyen et al., EMBO J. 2000 Mar 1; 19(5): 921-30; van der Linden et al., J.Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-95; Decanniere et al., J. Mol. Biol. 2000 Jun 30; 300 (I): 83-91; van der Linden et al., J. Biotechnol. 2000 Jul 14; 80(3): 261-70; Harmsen et al., Mol. Immunol. 2000 Aug; 37(10): 579-90; Perez et al., Biochemistry 2001 Jan 9; 40(1): 74-83; Conrath et al., J. Biol. Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Muyldermans et al., Trends Biochem Sci. 2001 Apr;26(4):230-5; Muyldermans S., J. Biotechnol. 2001 Jun; 74 (4): 277-302; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 2001 Jul 13;27б (28): 26285-90; Spinelli et al., J. Mol. Biol. 2001 Aug 3; 311 (I): 123-9; Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother. 2001 Oct; 45 (10): 2807-12; Decanniere et al., J. Mol. Biol. 2001 Oct 26; 313(3): 473-8; Nguyen et al., Adv Immunol. 2001; 79: 261-96; Muruganandam et al., FASEB J. 2002 Feb; 16 (2): 240-2; Ewert et al., Biochemistry 2002 Mar 19; 41 (11): 3628-36; Dumoulin et al., Protein Sci. 2002 Mar; 11 (3): 500-15; Cortez-Retamozo et al., Int. J. Cancer. 2002 Mar 20; 98 (3): 456-62; Su et al., Mol. Biol. Evol. 2002 Mar; 19 (3): 205-15; van der Vaart JM., Methods Mol Biol. 2002; 178: 359-66; Vranken et al., Biochemistry 2002 Jul 9; 41 (27): 8570-9; Nguyen et al., Immunogenetics 2002 Apr; 54 (I): 39-47; Renisio et al., Protein 2002 Jun 1; 47 (4): 546-55; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 2002 Jun 28; 277 (26); 23645-50; Ledeboer et al., J. Dairy Sci. 2002 Jun; 85 (б): 1376-82; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2002 Aug 16; 277 (33): 29897-907; Ferrat et al., Biochem. J. 2002 Sep 1; 366 (Pt 2): 415-22; Thomassen et al., Enzyme and Microbial Technol. 2002; 30: 273-8; Harmsen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002 Dec; 60 (4): 449-54; Jobling et al., Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 77-80; Conrath et al., Dev. Сотр. Immunol. 2003 Feb; 27 (2): 87-103; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem. 2003 Mar-Apr; 14 (2): 440-8; Lah et al., J. Biol. Chem. 2003 Apr 18; 278 (16): 14101-11; Nguyen et al., Immunology. 2003 May; 109 (I): 93-101; Joosten et al., Microb. Cell Fact. 2003 Jan 30; 2 (I): 1; Li et al., Proteins 2003 Jul 1; 52 (1): 47-50; Loris et al., Biol Chem. 2003 Jul 25; 278 (30): 28252-7; van Koningsbruggen et al., J. Immunol. Methods. 2003 Aug; 279 (1-2): 149-61; Dumoulin et al., Nature. 2003 Aug 14; 424 (6950): 783-8; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003 Sep 19; 332 (З): 643-55; Yau et al., J. Immunol. Methods. 2003 Oct 1; 281 (1-2): 161-75; Dekker et al., J. Virol. 2003 Nov; 77 (22): 12132-9; Meddeb-Mouelhi et al., Toxicon. 2003 Dec; 42 (7): 785-91; Verheesen et al., Biochim. Biophys. Acta 2003 Dec 5; 1624 (1-3): 21-8; Zhang et al., J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (I): 49-56; Stijiemans et al., J Biol Chem. 2004 Jan 9; 279 (2): 1256-61; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Spinelli et al„ FEBS Lett. 2004 Apr 23; 564 (1-2): 35-40; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem. 2004 May-Jun; 15 (З): 664-71; Nicaise et al., Protein Sci. 2004 Jul; 13 (7): 1882-91; Omidfar et al., Tumour Biol. 2004 Jul-Aug; 25 (4): 179-87; Omidfar et al., Tumour Biol. 2004 Sep-Dec; 25(5-6): 296-305; Szynol et al., Antimicrob Agents Chemother. 2004 Sep;48(9):3390-5; Saerens et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 10; 279 (50): 51965-72; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 17; 279 (51): 53593-601; Dolk et al., Appl. Environ. Microbiol. 2005 Jan; 71(1): 442-50; Joosten et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2005 Jan; 66(4): 384-92; Dumoulin et al., J. Mol. Biol. 2005 Feb 25; 346 (3): 773-88; Yau et al., J Immunol Methods. 2005 Feb; 297 (1-2): 213-24; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2005 Apr 8; 280 (14); 14114-21; Huang et al., Eur. J. Hum. Genet. 2005 Apr 13; Dolk et al., Proteins. 2005 May 15; 59 (З): 555-64; Bond et al., J. Mol. Biol. 2005 May 6;348(3):699-709; Zarebski et al., J. Mol. Biol. 2005 Apr 21; (досрочная электронная публикация).

По использующейся в вышеуказанных ссылках терминологии, вариабельные домены, имеющиеся в природных антителах к тяжелым цепям, будут также относиться к "VHH доменам", для того, чтобы отличать их от вариабельных доменов тяжелых цепей, которые присутствуют в традиционных четырехцепочечных антителах (которые будет относиться здесь далее к "VH доменами"), и от вариабельных доменов легких цепей, которые представлены в традиционных 4-цепочечных антителах (которые будет относиться здесь далее к "VL доменами"),

Как указанно в предыдущем уровне техники, VHH домены имеют число уникальных структурных характеристик и функциональных свойств, которые делают выделенные VHH домены (так же как и нанотела, на их основе, которые разделяют эти структурные характеристики и функциональные свойства с природными VHH доменами) и белки, содержащие их, высоко полезными для применения в качестве функциональных антиген-связывающих доменов или белков. В частности, и без ограничений, VHH домены (которые "сконструированы" путем природы для функционального связывания с антигеном при отсутствии и без любого взаимодействия с легкой цепью вариабельного) и нанотела могут функционировать как единичные, относительно небольшие, функциональные антиген-связывающие структурные единицы, домены или белок. Это отличает VHH домены от VH и VL доменов традиционных 4-цепочечных антител, которые сами по себе обычно не подходят для практического применения в качестве отдельных антиген-связывающих белков или доменов, но нужны для комбинирования в некоторой форме или других для обеспечения функциональной антиген-связывающей единицы (как в, например, традиционных фрагментах антител, таких как Fab фрагменты; в ScFv фрагментах, которые состоят из VH домена, ковалентно связанного с VL доменом).

Из-за этих уникальных свойств, применение VHH доменов и нанотел в качестве отдельных антиген-связывающих белков или как антиген-связывающих доменов (т.е. в качестве части более крупного белка ил полипептиды) обеспечивает количество значимых преимуществ перед применением традиционных VH и VL доменов, scFv или традиционных фрагментов антител (таких как Fab- или F(ab’)2-фрагменты):

- только один домен требуется для связывания антигена с высоким сродством и с высокой селективностью, так, что не существует необходимости в присутствии двух отдельных доменах, а также гарантии того, что эти два домена присутствуют в правильной пространственной конформации или конфигурации (т.е. через использование сконструированных особенным образом линкеров, например, с scFv);

- VHH домены и нанотела могут экспрессироваться из отдельного гена и не требуются посттрансляционный фолдинг или модификации;

- VHH домены и нанотела могут с легкостью конструироваться в многовалентных и мультиспецифичных форматах (как дополнительно обсуждается здесь);

- VHH домены и нанотела высоко растворимы и не имеют тенденции к агрегации (по сравнению антиген-связывающими доменами, полученными от мышей, описываемое в Ward et al., Nature, Vol.341, 1989, p.544);

- VHH домены и нанотела проявляют высокую стабильность к действию температуры, рН, протеаз и других денатурирующих агентов и условий (см., например, Ewert et al., supra);

- VHH домены и нанотела легки и относительно не дороги в приготовлении, даже по шкале, требуемой для изготовления. Например, VHH домены, нанотела и белки/полипептиды, их содержащие, могут продуцироваться при использовании микробной ферментации (напр., как дополнительно описывается здесь) и не требуют применения экспрессирующих систем млекопитающих, как, например, в случае с традиционными фрагментами антител;

- VHH домены и нанотела имеют относительно небольшой размер (примерно 15 кДа, или в 10 раз меньше, чем традиционный IgG) по сравнению с традиционными 4-цепочечными антителами и их антиген-связывающими фрагментами, и, следовательно, показывают более высокую пенетрацию в тканях (включая, но не ограничиваясь, солидные опухоли и другие ткани) чем такие традиционные 4-цепочечные антитела и их антиген-связывающие фрагменты;

- VHH домены и нанотела могут демонстрировать так называемые полость-связывающие свойства (в частности, вследствие их удлиненной CDR3 петли, сравнительно с традиционными VH доменами) и могут, следовательно, также достигать мишени и эпитопы, которые не достижимы для традиционных 4-цепочечных антител и их антиген-связывающих фрагментов. Например, было показано, что VHH домены и нанотела могут ингибировать ферменты (см., например: WO 97/49805; Transue et al., (1998), supra; Lauwereys et al., (1998), supra).

Как указанно выше, изобретение в целом относится к нанотелам. направленным против TNF-альфа, так же как и к полипептидам, содержащих или по существу состоящих из одного или более таких нанотел, которые могут использоваться для профилактики и/или диагностики, описываемых ниже и в WO 04/041862.

Как также указано выше и дополнительно описывается ниже, изобретение дополнительно относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие нанотела и полипептиды, к способам приготовления таких нанотел и полипептидов, к клеткам-хозяевам, экспрессирующих или способных к экспрессии таких нанотел или полипептидов, к применениям таких нанотел, полипептидов, нуклеиновых кислот или клеток-хозяев, и к композициям, содержащим такие нанотела, полипептиды, нуклеиновые кислоты или клетки-хозяева.

В целом, необходимо казать, что термин "нанотела" в используемом здесь значении, в его широком понимании не ограничивается специфическим способом приготовления. Например, как будет обсуждаться детально в дальнейшем описании, нанотела изобретения могут быть получены (1) путем выделения VHH домена из природного антитела тяжелой цепи; (2) путем экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей природный VHH домен; (3) путем "гуманизации" (как описывается ниже) природного VHH домена или путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей такой гуманизированный VHH домен; (4) путем "камелизации" (как описывается ниже) природного VH домена из любых видов животных, в частности видов млекопитающих, а также от человека, или путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей такой камелизированный such VH домен; (5) путем "камелизации" "доменного антитела", или "Dab", как описывается Ward et al. (supra), или путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей такой камелизированный VH домен; (6) при использовании синтетических или полусинтетических способов для приготовления белков, полипептидов или других аминокислотных последовательностей; (7) путем приготовления нуклеиновой кислоты, кодирующей нанотело, при использовании способов для синтеза нуклеиновой кислоты, с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты, полученной таким образом; и/или (8) путем любых комбинаций вышеуказанного. Пригодные способы и методы для осуществления вышеуказанных будут понятны специалисту на основании приведенного описания и, например, включают способы и методы, описываемые более детально в дальнейшем.

Однако, в соответствии со специфическим воплощением, нанотела изобретения не имеют аминокислотную последовательность, которая точно такая же, как (т.е. степень идентичности последовательности составляет 100%) аминокислотная последовательность природного VH домена, такая как аминокислотная последовательность природного VH домена из млекопитающих, и, в частности, от человека.

Один особенно предпочтительный класс нанотел изобретения содержит нанотела с аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности природного VHH домена, но которая "гуманизирована", т.е. путем замены одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности указанной природной VHH последовательности одним или более аминокислотными остатками, которые встречаются в соответствующем(их) положении(ях) в VH домене из традиционного 4-цепочечного антитела от человека (напр., указанное выше). Это может осуществляться способом, известным per se, который будет понятен специалисту, например, на основании дополнительного описания, приведенного ниже, и предыдущего уровня техники относительно гуманизации, приведенного здесь. Кроме того, следует указать, что такое гуманизированное нанотело изобретения может быть получено любым пригодным образом, известным per se (т.е. как указывается в пунктах (1)-(8) выше) и, таким образом, строго не ограничены полипептидами, которые получены при использовании полипептида, который содержит природный VHH домен как исходный материал.

Предпочтительная, но не ограничивающая, гуманизирующая замена для нанотела, принадлежащего к 103 P,R,S-группе и/или GLEW-группе (как определено здесь) представляет собой 108Q-108L.

Другой особенно предпочтительный класс нанотел изобретения содержит нанотела с аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности природного VH домена, которая "камелизирована", т.е. путем замены одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности природного VH домена из традиционного 4-цепочечного антитела одним или более аминокислотными остатками, которые встречаются в соответствующем(их) положении(ях) в VH домене антитела тяжелой цепи. Это может осуществляться способом, известным per se, который будет понятен специалисту, например, на основании дополнительного описания, приведенного ниже. Ссылкой может являться также WO 94/04678. Такая камелизация может предпочтительно происходить в аминокислотных положениях, которые присутствуют во взаимосвязи VH-VL и в так называемых Camelidae характеристических остатках (см., например, также WO 94/04678), как также указано ниже. Предпочтительно, VH домен или последовательность, которые используются как исходный материал или отправная точка для генерации или конструирования камелизованного нанотела, предпочтительно является VH последовательностью из млекопитающего, более предпочтительно VH последовательностью человека. Однако следует указать, что такое камелизированное нанотело изобретения может быть получено любым пригодным образом, известным per se (т.е. как указывается в пунктах (1)-(8) выше) и, таким образом, строго не ограничены полипептидами, которые получены при использовании полипептида, который содержит природный VHH домен как исходный материал.

Например, кроме того, как дополнительно описывается ниже, "гуманизация" и "камелизация" могут осуществляться путем обеспечения нуклеотидной последовательности, которая кодирует такой природный VHH домен или VH домен, соответственно, и, затем изменяет, способом, известным per se, один или более кодонов в указанной нуклеотидной последовательности, например, как новая нуклеотидная последовательность кодирует гуманизированное или камелизированное нанотело изобретения, соответственно, и затем экспрессируется нуклеотидная последовательность, таким образом полученная, способом, известным per se, таким образом обеспечивается желаемое нанотело изобретения. Альтернативно, на основе аминокислотной последовательности природного VHH домена или VH домена, соответственно, аминокислотная последовательность желаемого гуманизированного или камелизированного нанотела изобретения, соответственно, может быть сконструирована и затем синтезирована de novo при использовании способов пептидного синтеза, известных per se. Также, на основании аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности природного VHH домена или VH домена, соответственно, нуклеотидная последовательность, кодирующая желаемое гуманизированное или камелизированное нанотело изобретения, соответственно, может быть сконструирована и затем синтезирована de novo при использовании способов синтеза нуклеиновой кислоты, известных per se, после чего, нуклеотидная последовательность, таким образом полученная, может экспрессироваться образом, известным per se, так что обеспечивается желаемое нанотело изобретения.

Другие пригодные пути и способы получения нанотел изобретения и/или нуклеотидных последовательностей и/или нуклеиновых кислот, кодирующих их, начиная с (аминокислотной последовательности) природных VH доменов или предпочтительно VHH доменов и/или с нуклеотидных последовательностей и/или последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих их, будут понятны специалистам и могут, например, содержать комбинации одной или более аминокислотных последовательностей и/или нуклеотидных последовательностей из природных VH доменов (таких как, одна или более FR и/или CDR) с одной или более аминокислотными последовательностями и/или нуклеотидными последовательностями из природных VHH доменов (например, одна или более FR или CDR), пригодным образом, так, что обеспечивается (нуклеотидная последовательность или кодирующая нуклеиновая кислота) нанотело изобретения.

В соответствии с одним предпочтительным, но не ограничивающим, аспектом аспекта изобретения, нанотело в его широком понимании может, в общем, определяться как полипептид, содержащий:

a) аминокислотную последовательность, которая содержит четыре каркасных областей/последовательностей, прерванных тремя гипервариабельными участками/последовательностями, где аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

и/или

b) аминокислотную последовательность, которая содержит четыре каркасных областей/последовательностей, прерванных тремя гипервариабельными участками/последовательностями, где аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата представляет собой Е и где аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R;

и/или

c) аминокислотную последовательность, которая содержит четыре каркасных областей/последовательностей, прерванных тремя гипервариабельными участками/последовательностями, где аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Р, R и S, и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S.

Таким образом, в первом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотела изобретения могут иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

где FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

и/или в которой:

ii) аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата представляет собой Е и в которой аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R;

и/или в которой:

iii) аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Р, R и S, и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S;

и в которой:

iv) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В частности, нанотело против TNF-альфа по изобретению может иметь структуру:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой

i) аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

и/или в которой:

ii) аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата представляет собой Е и в которой аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R;

и/или в которой:

iii) аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Р, R и S, и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S;

и в которой:

iv) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В частности, по одному предпочтительному, но не ограничивающему, аспекту из аспектов изобретения, нанотело может, в целом, определяться как полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая содержит четыре каркасные области/последовательности, прерванные тремя гипервариабельными участками/последовательностями, где:

а-1) аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из G, Е, D, G, Q, R, S, L; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из G, Е или Q; и

а-2) аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из L, R или С; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из L или R; и

а-3) аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из W, R или S; и представляет собой предпочтительно W или R, и представляет собой наиболее предпочтительно W;

а-4) аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

или где:

b-1) аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Е и Q; и

b-2) аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R; и

b-3) аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из W, R и S; и представляет собой предпочтительно W;

b-4) аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Q и L; и представляет собой предпочтительно Q;

или где:

с-1) аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из G, Е, D, Q, R, S и L; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из G, Е и Q; и

с-2) аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из L, R и С; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из L и R; и

с-3) аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Р, R и S; и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S; и

с-4) аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Q и L; представляет собой предпочтительно Q.

Таким образом, в другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из G, Е, D, G, Q, R, S, L; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из G, E или Q;

и в которой:

ii) аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из L, R или С; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из L или R;

и в которой:

iii) аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из W, R или S; и представляет собой предпочтительно W или R, и представляет собой наиболее предпочтительно W;

и в которой:

iv) аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

и в которой:

v) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В другом предпочтительным, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Е и Q;

и в которой:

ii) аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R;

и в которой:

iii) аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из W, R и S; и представляет собой предпочтительно W;

и в которой:

iv) аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

и в которой:

vi) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из G, Е, D, Q, R, S и L; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из G, Е и Q;

и в которой:

ii) аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из L, R и С; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из L и R;

и в которой:

iii) аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Р, R и S; и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S;

и в которой:

iv) аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Q и L; и представляет собой предпочтительно Q;

и в которой:

v) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

Две особенно предпочтительные, но не ограничивающие, группы нанотел изобретения выбираются в соответствии с вышеуказанным а); в соответствии с вышеуказанным I)-4); в соответствии с вышеуказанным b); в соответствии с вышеуказанным b-1)-b-4); в соответствии с вышеуказанным с); и/или в соответствии с вышеуказанным с-1)-с-4), где:

a) аминокислотные остатки в положениях 44-47 по номенклатуре Кабата образуют последовательность GLEW (или GLEW-подобной последовательности, как определено ниже) и аминокислотный остаток в положении 108 представляет собой Q;

или где:

b) аминокислотные остатки в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата образуют последовательность KERE или KQRE (или KERE-подобной последовательности) и аминокислотный остаток в положении 108 представляет собой Q или L, и представляет собой предпочтительно Q.

Таким образом, в другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) аминокислотные остатки в положениях 44-47 по номенклатуре Кабата образуют последовательность GLEW (или GLEW-подобной последовательности, как определено ниже) и аминокислотный остаток в положении 108 представляет собой Q;

и где:

ii) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) аминокислотные остатки в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата образуют последовательность KERE или KQRE (или KERE-подобной последовательности) и аминокислотный остаток в положении 108 представляет собой Q или L, и представляет собой предпочтительно Q;

и в которой:

ii) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В нанотелах изобретения, в которых аминокислотные остатки в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата образуют последовательность KERE или KQRE, аминокислотный остаток в положении 37 представляет собой наиболее предпочтительно F. В нанотелах изобретения, в которых аминокислотные остатки в положениях 44-47 по номенклатуре Кабата образуют последовательность GLEW, аминокислотный остаток в положении 37 выбирается из группы, состоящей из Y, Н, I, V или F, и представляет собой наиболее предпочтительно F.

Таким образом, без ограничения данного документа, с учетом аминокислотных остатков, имеющихся в положениях, указанных выше, нанотела изобретения могут, в общем, классифицироваться на основании следующих трех групп:

a) "GLEW-группа": нанотела с аминокислотной последовательностью GLEW в положениях 44-47 по номенклатуре Кабата и Q в положении 108 по номенклатуре Кабата. Как дополнительно здесь описывается, нанотела в этой группе, как правило, имеют V в положении 37, и могут иметь W, P, R или S в положении 103, и предпочтительно имеют W в положении 103. GLEW группа также содержит некоторые GLEW-подобные последовательности, а также те, которые указаны в таблице 2 ниже;

b) "KERE-группа": нанотела с аминокислотной последовательностью KERE или KQRE или в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата и Q или L в положении 108 по номенклатуре Кабата. Как дополнительно здесь описывается, нанотела в этой группе, как правило, имеют F в положении 37, L или F в положении 47; и могут иметь W, P, R или S в положении 103, и предпочтительно иметь W в положении 103;

c) "103 P, R, S-группа": нанотела с P, R или S в положении 103. Эти нанотела могут иметь либо аминокислотную последовательность GLEW в положениях 44-47 номенклатуры Кабата или аминокислотную последовательность KERE или KQRE в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата, последняя наиболее предпочтительна в сочетании с F в положении 37 и L или F в положении 47 (как определено для KERE-группы); и могут иметь Q или L в положении 108 по номенклатуре Кабата, и предпочтительно иметь Q.

Таким образом, в другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотела изобретения могут являться нанотелами, принадлежащими к GLEW-группе (как определено здесь), и где CDR1, CDR2 и CDR3 являются, как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотела изобретения могут являться нанотелами, принадлежащими к KERE-группе (как определено здесь), и где CDR1, CDR2 и CDR3 являются, как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

Таким образом, в другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотела изобретения могут являться нанотелами, принадлежащими к 103 Р, R, S-группе (как определено здесь), и где CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

Кроме того, в более общем и в дополнение к 108Q, 43E/44R и 103 P, R, S остаткам, указанным выше, нанотела изобретения могут содержать то, в одном или более положениях, что, в традиционном VH домене, будут образовывать (часть) область VH/VL, содержать один или более аминокислотные остатки, которые более высоко заряжены, чем аминокислотные остатки, которые встречаются в природе, в таком(их) же положении(ях) в соответствующем природном VH или VHH домене, и в частности один или более заряженные аминокислотные остатки (как указано в таблице 1).

Такие замены включают, но не ограничиваются, GLEW-подобные последовательности, указанные в таблице 2 ниже; так же как и замены, которые описываются в Международной Заявке WO 00/29004 для так называемых "микротел", напр., Q в положении 108 и KLEW в положениях 44-47.

В некоторых воплощениях нанотел изобретения, аминокислотный остаток в положении 83 выбирается из группы, состоящей из L, M, S, V и W; и представляет собой предпочтительно L.

Также, в некоторых воплощениях нанотел изобретения, аминокислотный остаток в положении 83 выбирается из группы, состоящей из R, K, N, Е, I и Q; и представляет собой наиболее предпочтительно или K или Е (для нанотел, соответствующих природному VHH домену) или R (для "гуманизированных" нанотел, как описывается ниже). Аминокислотный остаток в положении 84 в некоторых воплощениях выбирается из группы, состоящей из Р, А, R, S, D и V, и представляет собой наиболее предпочтительно Р (для нанотел, соответствующих природному VHH домену) или R (для "гуманизированных" нанотел, как описывается ниже).

Кроме того, в некоторых воплощениях нанотел изобретения, аминокислотный остаток в положении 104 выбирается из группы, состоящей из G и D; и представляет собой наиболее предпочтительно G.

Совместно, аминокислотные остатки в положениях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108, которые в нанотелах являются, как указанных выше, будут также относиться здесь к "Характеристическим (Hallmark) остаткам". Характеристические остатки и аминокислотные остатки в соответствующих положениях наиболее близкородственного человеческого VH домена, VH3, резюмированы в таблице 2.

Некоторые особенно предпочтительные комбинации этих характеристических остатков, которые встречаются в природных VHH доменах, указаны в таблице 3. Для сравнения, соответствующие аминокислотные остатки человеческого VH3, называемого DP-47, указываются курсивом.

Таблица 2:
Характеристические остатки в нанотелах
Положение Человеческий VH3 Характеристические остатки
11 L, V; преимущественно L L, M, S, V,W; предпочтительно L
37 V, I, F; как правило, V F(1), Y, Н, I или V, предпочтительно F(1) или Y
44(8) G G(2), E(3), D, Q, R, S, L; предпочтительно G(2), E(3) или Q; наиболее предпочтительно G(2) или E(3)
45(8) L L(2), R(3), С, I, L, Р, Q, V; предпочтительно L(2) или R(3)
47(8) W,Y W(2), L(1) или F(1), A, G, I, M, R, S или Y; предпочтительно W(2), L(1), F(1) или R
83 R или К; как правило, R R, K(5), N, E(5), I, M или Q; предпочтительно K или R; наиболее предпочтительно K
84 А, Т, D; преимущественно А Р(5), A, L, R, S, D, V; предпочтительно Р
103 W W(4), P(6), R(6), S; предпочтительно W
104 G G или D; предпочтительно G
108 L, M или Т; преимущественно L Q, L(7) или R; предпочтительно Q или L(7)
Примечания:
(1): В частности, но не исключительно, в комбинации с KERE (SEQ ID NO: 437) или KQRE (SEQ ID NO: 438) в положениях 43-46.
(2): Как правило, как GLEW (SEQ ID NO: 439) в положениях 44-47.
(3): Как правило, как KERE или KQRE в положениях 43-46, напр., как KEREL (SEQ ID

NO: 440), KEREF (SEQ ID NO: 441), KQREL (SEQ ID NO: 442), KQREF (SEQ ID NO: 443) или KEREG (SEQ ID NO: 444) в положениях 43-47. Альтернативно, возможны также последовательности, такие как TERE (SEQ ID NO: 445) (например, TEREL (SEQ ID NO: 446)), KECE (SEQ ID NO: 447) (например, KECEL (SEQ ID NO: 448) or KECER (SEQ ID NO: 449)), RERE (SEQ ID NO: 450) (например, REREG (SEQ ID NO: 451)), QERE (SEQ ID NO: 452) (например, QEREG (SEQ ID NO: 453)), KGRE (SEQ ID NO: 454) (например, KGREG (SEQ ID NO: 455)), KDRE (SEQ ID NO: 456) (например, KDREV (SEQ ID NO: 457)). Некоторые другие возможные, но наименее предпочтительные последовательности включают, например, DECKL (SEQ ID NO: 458) и NVCEL (SEQ ID NO: 459).
(4): С обеими GLEW в положениях 44-47 и KERE или KQRE в положениях43-46.
(5): Часто как КР или ЕР в положениях 83-84 природных VHH доменов.
(6): В частности, но не исключительно, в сочетании с GLEW в положениях 44-47.
(7): С ограничением, что если положения 44-47 являются GLEW, положение 108 представляет собой всегда Q.
(8): GLEW группа также содержит GLEW-подобные последовательности в положениях 44-47, такие как, например, GVEW (SEQ ID NO: 460), EPEW (SEQ ID NO: 461), GLER (SEQ ID NO: 462), DQEW (SEQ ID NO: 463), DLEW (SEQ ID NO: 464), GIEW (SEQ ID NO: 465), ELEW (SEQ ID NO: 466), GPEW (SEQ ID NO: 467), EWLP (SEQ ID NO: 468), GPER (SEQ ID NO: 469), GLER (SEQ ID NO: 470) и ELEW.

Таблица 3:
Некоторые предпочтительные комбинации характеристических остатков в природных нанотелах
Для гуманизации этих комбинаций, ссылка дана к описанию.
11 37 44 45 47 83 84 103 104 108
DP-47 (человеческий) М V G L W R А W G L
"KERE" группа L F Е R L K Р W G Q
L F Е R F Е Р W G Q
L F Е R F K Р W G Q
L Y Q R L K Р W G Q
L F L R V K Р Q G Q
L F Q R L K Р W G Q
L F Е R F K Р W G Q
"GLEW" группа L V G L W K S W G Q
М V G L W K Р R G Q

В нанотелах, каждый аминокислотный остаток в любом другом положении, чем характеристический остаток может являться любым аминокислотным остатком, который встречается в природе в соответствующих положениях (по номенклатуре Кабата) природного VHH домена.

Такие аминокислотные остатки будут ясны для специалиста. Таблицы 4-7 указывают некоторые неограничивающие остатки, которые могут присутствовать в каждом положении (по номенклатуре Кабата) FR1, FR2, FR3 и FR4 природных VHH доменов. Для каждого положения, аминокислотный остаток, который наиболее часто встречается в каждом природном VHH домене (и который представляет собой наиболее предпочтительный аминокислотный остаток для указанного положения в нанотеле) указывается жирным шрифтом; и другие предпочтительные аминокислотные остатки для каждого положения подчеркнуты (примечание: число аминокислотных остатков, которые найдены в положениях 26-30 природных VHH доменов подтверждают гипотезу, лежащую в основе номенклатуры Chothia (ранее), что остатки в этих положениях уже составляют часть CDR1)

В таблицах 4-7, некоторые из неограничивающих остатков, которые присутствуют в каждом положении человеческого VH3 домена, также отмечаются. Кроме того, для каждого положения, аминокислотный остаток, который наиболее часто встречается в каждом положении природного человеческого VH3 домена, указывается жирным шрифтом; и другие предпочтительные аминокислотные остатки подчеркнуты.

Таблица 4:
Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR1 (для примечаний, см. примечания к таблице 2)
Пол. Аминокислотный(ые) остаток(ки):
Человеческий VH3 VHH’s верблюжьих
1 E, Q Q, A, E, D, H, R
2 V V, A, E, G, L, M, Q
3 Q Q, K, E, H, P, R, Y
4 L L, F, P, R, V
5 V, L Q, E, L, V, M, P, A, I
6 E E, D, Q, A, H
7 S, T S, F, H
8 G, R G, A, R
9 G G, E
10 G, V G, D, R, A, E, N, T, V
11 Характеристический остаток: L, M, S, V, W, F, N, P, T, Y; предпочтительно L
12 V, I V, A, G, M
13 Q, K, R Q, E, K, D, G, A, H, L, N, P, R, T
14 P A, Q, A, G, P, T, V, E, F, I, N, S
15 G G
16 G, R G, A, E, D, N, P, R, S, V, W
17 S S, L-T, N, P, А, С
18 L L, V, M, Q, R

19 R, K R, K, L, N, S, Т, A, F, G, I, M, Q
20 L L, F, I, V, M, S
21 S S, F, Т, G, Н, Р, А
22 С С
23 А, Т A, D, Р, S, Т, V, Е, G, I, L, Q, R
24 А А, I, S, Т, V, С, Е, F, G, L, N, Р, Q, Y

Таблица 4:
Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR1 (продолжение)
Пол. Аминокислотный(е) остаток(ки):
Человеческого VH3 VHH’s верблюжьих
25 S S, A, F, Р, T, L, V
26 G G, D, Е, R, S, V, A, I, M, Р, Т
27 F S, Р, R, L, Р, G, N, A, D, Е, Н, I, K, M, Q, T, V, Y
28 Т N, T, Е, D, S, I, R, A, G, R, F, Y, L, M, P, V
29 F, V F, L, D, S, I, G, V, A, Е, Р, T, Y
30 S, D, G N, S, Е, G, A, D, M, T, Н, I, Р, R, V, W

Таблица 5:
Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR2 (для примечаний, см. примечания к таблице 2)
Пол. Аминокислотный(ые) остаток(ки):
Человеческий VH3 VHH’s верблюжьих
36 W W
37 Характеристический остаток; F(1), Y, Н, I, A, L, P, S или V предпочтительно F(1) или Y
38 R R
39 Q Q, Н, Р, R, A, D, G, L, E
40 А A, F, G, Р, T, V, I, L, N, R, S, Y
41 P, S, T P, A, L, S, I, Q, T
42 G G, E, D, R, T, V
43 K K, D, E, N, Q, R, T, V, A, L, M, S
44 Характеристический остаток: G(2), Е(3), D, Q, R, S, L, А, F, K, M, N, Р, V, W, Y: предпочтительно G(2), E(3) или Q; наиболее предпочтительно G(2) или Е(3)
45 Характеристический остаток: L(2), R(3), С, I, L, Р, Q, V, D, Е, G, Н, K, Т; предпочтительно L(2) или R(3)
46 E,V E, D, K, Q, V, A, G, N
47 Характеристический остаток: W(2), L(1) или F(1) A, G, I, M, R, S, D, E, Н, K, Q, T, R предпочтительно W(2), L(1), F(1) или R
48 V V, I, L, A, C, E, F, G, Н, M, Р, Q, R, S, T V W Y
49 S, A, G A, S, A, G, T, V, D, E, I, L, O, R, Y

Таблица 6:
Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR3 (для примечаний, см. примечания к таблице 2)
Пол. Аминокислотный(ые) остаток(ки):
Человеческий VH3 VHH’s верблюжьих
66 R R
67 F F, L, V, А, D, I, S, Y
68 Т Т, A, S, D, F, G, I, К, N
69 I I, M, V, A, F, L, R, S, Т
70 S S, A, F, E, G, K, Р, Т, V
71 R R, G, I, К, Q, S, Т, W, А, F, L, M, N
72 D,E D, Е, G, N, V, А, Н, I, L, Q, S, Т
73 N, D, G N, D, F, I, K, S, Т, Y, А, G, Н, L, M, R, V
74 A, S А, D, G, N, Р, S, Т, F, Н, I, L, R, V, Y
75 K K, А, Е, K, L, N, Q, R, D, G, I, M, S, Т, V, W
76 N,S N, D, K, R, S, Т, Y, Е, G, Н, I, Q
77 S, T, I Т, А, Е, I, M, S, K, L, N, R, V
78 L, A V, L, A, F, G, I, M, E, N, Q, R, S, T, W
79 Y, H Y, А, D, F, Н, S, Т, С, Е, I, L, N, V, W
80 L L, F, V, М
81 Q Q, Е, R, Т, G, Н, I, К, L, М, N
82 M М, I, L, V, G, Р, Т
82а N, G N, D, G, Н, S, Т, А, Е, I, K, R, V
82b S S, N, D, G, R, А, С, Е, F, I, K, М, P, T, V
82с L L, Р, М, Т, V
83 Характеристический остаток: R, K(5), N, E(5), I, M, A, D, G, L, Q, S, Т или Q; предпочтительно K или R; наиболее предпочтительно K
84 Характеристический остаток: Р(5), А, предпочтительно Р, L, R, S, D, V, F, G. Н. N, Т, Y;
85 E, G Е, D, G, Q, A, N, R, V, Y
86 D D, Е, F, Y
87 Т, М Т, S, А, С, М
88 А A, G, S, D, L, N, Р
89 V, L V, A, D, I, L, M, N, R, T, E, F, S
90 Y Y, F, Е, Н, N
91 Y, H Y, D, Р, Н, L, S, Т, V, С, I, N, R, W
92 С С
93 А, K, Т А, N, G, Н, К, R. S, Т, V, Y, Е, F, I, L, M, Q
94 K, R, T А, V, С, F, G, I, L, R, S, D, Е, K, М, N, Р, Q, Т, W, Y, Т или K

Таблица 7:
Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR4 (для примечаний, см. примечания к таблице 2)
Пол. Аминокислотный(ые) остаток(ки);
Человеческий VH3 VHH верблюжьих
103 Характеристический остаток; W(4), Р(6), R(6), S, F, G, K, L, N, Q, V, Y; предпочтительно W
104 Характеристический остаток: G, A, R, S, Т или D; предпочтительно G
105 Q, R Q, Е, K, Р, R, G, Н, L, S, V
106 G G
107 Т T, A, I, N, P
108 Характеристический остаток: Q, L(7), Е, Н, N, Р, Т или R; предпочтительно Q или L(7)
109 V V
110 Т Т, I, А
111 V V, А, I, G
112 S S, F, А, L, Р, Т, Y
113 S S, A, L, P, F, T

Таким образом, в другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) Характеристические остатки являются, как определено выше;

и в которой:

ii) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) FR1 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 4; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 4; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и в которой:

ii) FR2 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и в которой:

iii) FR3 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

Или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и в которой:

iv) FR4 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотаое(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и в которой:

v) CDR1, CDR2 и CDR3 являются, как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений;

в которой характеристические остатки указаны как и соответствуют, как определено здесь выше, и где числа между скобками относятся к аминокислотным положениям по номенклатуре Кабата.

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) FR1 выбирается из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей:

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 7; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристический остаток в положении соответствует, как указано в вышеприведенной последовательности;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 7; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и (3) характеристический остаток в положении соответствует, как указано в вышеприведенной последовательности;

и в которой:

ii) FR2 выбирается из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей:

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в котором:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

iii) FR3 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 83 и 84 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 83 и 84 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

iv) FR4 выбирается из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей:

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 103, 104 и 108 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 103,104 и 108 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

v) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

и в которой:

i) FR1 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 4; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристический остаток в положении соответствует, как определено в вышеприведенной последовательности;

и в которой:

ii) FR2 выбирается из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем

характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

iii) FR3 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) Характеристические остатки в положениях 83 и 84 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

iv) FR4 выбирается из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в котором:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 7; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) Характеристические остатки в положениях 103, 104 и 108 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

v) CDR1, CDR2 и CDR3 являются, как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1 - CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

i) FR1 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 4; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) Характеристический остаток в положении соответствует, как указано в вышеприведенной последовательности;

и в которой:

ii) FR2 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в котором:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) Характеристические остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

iii) FR3 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в котором:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 83 и 84 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

iv) FR4 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 7; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристические остатки в положениях 103, 104 и 108 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

v) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

Некоторые другие каркасные последовательности, которые могут присутствовать в нанотелах изобретения, могут быть найдены в Европейском патенте ЕР 656946, указанном выше (см., например, также выданный эквивалентный патент США №5759808).

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1-3, соответственно, и в которой:

и в которой:

i) FR1 выбирается из группы, состоящей из последовательностей FR1, присутствующих в нанотелах из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99,

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одно из указанных последовательностей FR1; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 4; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR1; и

(3) характеристический остаток в положении представляет собой, как определено в указанной последовательности FR1;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR1, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 4; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR1; и

(3) характеристический остаток в положении представляет собой, как определено в указанной последовательности FR1;

и в которой:

ii) FR2 выбирается из группы, состоящей из последовательностей FR2, имеющихся в нанотелах, состоящих из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99,

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR2; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR2; и

(3) характеристические остатки в положениях 37,44, 45 и 47 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR2;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR2, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR2; и

(3) характеристические остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR2;

и в которой:

iii) FR3 выбирается из группы, состоящей из последовательностей FR3, присутствующих в нанотелах, состоящих из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99,

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR3; в котором:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR3; и

(3) характеристические остатки в положениях 83 и 84 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR3;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR3, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делении или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR3; и

(3) характеристические остатки в положениях 83 и 84 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR3;

и в которой:

iv) FR4 выбирается из группы, состоящей из последовательностей FR4, присутствующих в нанотелах, состоящих из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99,

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR4; в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR4; и

(3) характеристические остатки в положениях 103,104 и 108 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR4;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR4, в которой:

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR4; и

(3) характеристические остатки в положениях 103, 104 и 108 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR4;

и в которой:

v) CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

Некоторые особенно предпочтительные нанотела изобретения могут выбираться из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99; в которой:

(1) характеристические остатки могут соответствовать, как показано в вышеприведенной таблице 2;

(2) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно либо консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблицах 4-7; и/или

(3) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

Некоторые даже более особенно предпочтительные нанотела изобретения могут выбираться из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99; в которой:

(1) характеристические остатки соответствуют, как указано в соответствующей последовательности, выбранной из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99;

(2) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблицах 4-7; и/или

(3) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делении или инсерции, сравнительно с соответствующей последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99.

Некоторые из наиболее предпочтительных нанотел изобретения могут выбираться из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99, и, в частности, из гуманизированных нанотел из SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99.

Как может быть ясным из вышеприведенного, термин "нанотела" изобретения, в используемом здесь значении, в их широком понимании также включает природные и синтетические мутанты, варианты, аллели, аналоги и ортологи (в дальнейшем в совокупности указываемые как "аналоги") нанотел, указанных в SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99.

В целом, такие аналоги могут, например, содержать гомологичные последовательности, функциональные части, или функциональную часть гомологичной последовательности (как дополнительно определено ниже) нанотела. В общем, в таких аналогах, каждый аминокислотный остаток (отличный от характеристического остатка) в каждой из каркасных областей может замещаться любым другим аминокислотным остатком, при условии, что полная степень идентичности последовательности каркасных областей остается, как определено выше. Предпочтительно, однако, в таких аналогах:

один или более аминокислотных остатков в вышеуказанных каркасных последовательностях замещаются одним или более аминокислотными остатками, которые имеют природное происхождение, в том же положении в VHH домене, происходящим естественным образом. Некоторые примеры таких замен указаны в вышеприведенных таблицах 4-7;

и/или:

- один или аминокислотных остатков в вышеуказанных каркасных последовательностях замещаются одним или более аминокислотными остатками, которые могут рассматриваться как "консервативная" аминокислотная замена, как здесь описывается выше;

и/или:

- один или аминокислотных остатков в вышеуказанных каркасных последовательностях замещаются одним или более аминокислотными остатками, которые имеют природное происхождение, в том же положении в VHH домене, происходящим естественным образом, у человека. Это, главным образом, относится к "гуманизации" VHH/нанотела, происходящего естественным образом, в общем, и в указанном положении, в частности, и будет подробно обсуждаться в дальнейшем;

и:

- положения, для которых только один аминокислотный остаток упоминается для обоих VH домена и VHH домена в вышеприведенных таблицах 4-7, предпочтительно не замещаются.

Также, несмотря на то, что в общем наименее предпочтительно, в таких аналогах, один или более аминокислотных остатков могут быть вычеркнуты из каркасных областей и/или внесены в каркасные области (необязательно в дополнение к одной или более аминокислотным заменам, как указанно выше), при условии, что полная степень идентичности последовательности каркасных областей остается, как определено выше. Характеристические остатки не должны исключаться. Также, наиболее предпочтительно, аминокислотные остатки, для которых только один аминокислотный остаток упоминается для обоих VH домена и VHH домена в вышеприведенных таблицах 4-7, предпочтительно не исключается.

Предпочтительно, такие аналоги не должны быть таковыми, что они еще могут связываться с, обладают сродством к и/или обладают специфичностью для TNF-альфа, т.е. со сродством и/или специфичностью, которые составляют, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, а также, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 99% или более сродства и/или специфичности, по меньшей мере, одного из нанотел из SEQ ID NO SEQ ID NO 52-60, SEQ ID NO 76-86 или SEQ ID NO 95-99, что определяется при использовании пригодного анализа, например, анализа определения связывания аналога с TNF, и, в частности, одного из анализов, который используется в нижеприведенных примерах.

В целом, такие аналоги могут, например, быть получены путем обеспечения нуклеиновой кислоты, которая кодирует природный VHH домен, изменяя кодоны для одного или более аминокислотных остатков, которые следует гуманизировать, в кодоны для соответствующего(их) человеческого(их) аминокислотного(ых) остатка(ов), экспрессируя нуклеиновую кислоту/нуклеотидную последовательность, таким образом полученную, в пригодном хозяине или экспрессирующей системе; и необязательно изолируя и/или очищая аналог, полученный таким образом, для обеспечения указанного аналога по существу в изолированной форме (как определено здесь выше). Это может, в целом, осуществляться при использовании общеизвестных методов и способов, которые будут ясны специалисту, например, из справочников и ссылок, приведенных здесь и/или из дополнительного дальнейшего описания. Альтернативно, и для примера, нуклеиновая кислота, кодирующая аналог, может синтезироваться способом, известным по существу (например, при использовании автоматизированных устройств для синтезирования последовательностей нуклеиновых кислот с предварительным определением аминокислотной последовательности) и может экспрессироваться в пригодный хозяине или экспрессирующей системе, после чего аналог, полученный таким образом, может необязательно отделяться и/или очищаться для обеспечения указанного аналога по существу в выделенной форме (как определено здесь выше). Другой способ обеспечения аналогов включает химический синтез соответствующей аминокислотной последовательности при использовании способов синтеза пептидов, известных по существу, а также тех, которые в дальнейшем упоминаются.

Также для специалиста, в общем, будет ясно, что нанотела (включая их аналоги) может также приготавливаться, начиная с человеческих VH последовательностей (т.е. аминокислотных последовательностей или соответствующих нуклеотидных последовательностей), а также, например, человеческих VH3 последовательностей, а также DP-47, DP-51, DP-54 или DP-29, путем изменения одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности указанного человеческого VH домена, для обеспечения аминокислотной последовательности, которая имеет (a) Q в положении 108;

и/или (b) Е в положении 44 и/или R в положении 45, и предпочтительно Е в положении 44 и R в положении 45; и/или (с) Р, R или S в положении 103, как описывается выше. Кроме того, это может, в целом, осуществляться при использовании различных методов и способов, указанных у предыдущем параграфе, используя аминокислотную последовательность и/или нуклеотидную последовательность для человеческого VH домена в качестве исходного положения.

Термин нанотела, в используемом здесь значении, в его широком понимании, также содержит части или фрагменты нанотел (включая аналоги) изобретения, как определено выше, которые могут снова быть такими, как дополнительно в дальнейшем описывается.

В целом, части или фрагменты нанотел и/или аналогов имеют аминокислотные последовательности, в которых, в сравнении с аминокислотной последовательностью соответствующего полноразмерного нанотела или аналога, один или более аминокислотных остатков на N-концевой области, один или более аминокислотных остатков на C-концевой области, один или более смежных внутренних аминокислотных остатков, или любая их комбинация, исключены и/или удалены. Это также возможно для объединения одной или более таких частей или фрагментов для обеспечения нанотела изобретения.

Предпочтительно, аминокислотная последовательность нанотела, которая содержит одну или более части или фрагменты полноразмерного нанотела и/или аналога, должна иметь степень идентичности последовательности, по меньшей мере, 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, а также, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с аминокислотной последовательностью соответствующего полноразмерного нанотела.

Также аминокислотная последовательность нанотела, которая содержит одну или более части или фрагменты полноразмерного нанотела и/или аналога, предпочтительно такова, что содержит, по меньшей мере, 10 соседних аминокислотных остатков, предпочтительно, по меньшей мере, 20 соседних аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере, 30 соседних аминокислотных остатков, а также, по меньшей мере, 40 соседних аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности соответствующего полноразмерного нанотела.

В целом, такие части или фрагменты нанотела изобретения будут содержать аминокислотные последовательности, в которых, по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего полноразмерного нанотела изобретения, один или более аминокислотных остатков на N-концевой области, один или более аминокислотных остатков на C-концевой области, один или более смежных внутренних аминокислотных остатков, или любая их комбинация, исключены и/или удалены. Это также возможно для объединения одной или более таких частей или фрагментов для обеспечения нанотела изобретения.

В соответствии с одним предпочтительным воплощением, фрагмент, в используемом здесь значении, содержит, по меньшей мере, одну из CDR, имеющихся в полноразмерном нанотеле изобретения, предпочтительно, по меньшей мере, две из CDR, имеющихся в полноразмерном нанотеле изобретения, более предпочтительно, по меньшей мере, CDR2 и CDR3, имеющихся в полноразмерном нанотеле изобретения, а также например, все три CDR, имеющихся в полноразмерном нанотеле изобретения.

В соответствии с другим особенно предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением, такая часть или фрагмент содержит, по меньшей мере, FR3, CDR3 и FR4 соответствующего полноразмерного нанотела изобретения, т.е. как например, описываемые в Международной заявке WO 03/050531 (Lasters et al.).

Предпочтительно, такие части или фрагменты должны быть такими, что они еще могут связываться с, обладать сродством к и/или обладать специфичностью для TNF-альфа, т.е. со сродством и/или специфичностью, которые составляют, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, а также, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 99% или более сродства и/или специфичности соответствующего полноразмерного нанотела изобретения, например, по анализу определения связывания аналога с TNF, и, в частности, одному из анализов, использующихся в нижеуказанных примерах.

Из вышеприведенного описания, для специалиста будет ясно, что аминокислотные последовательности нанотел, здесь использующихся, отличаются, по меньшей мере, одним аминокислотным положением в, по меньшей мере, одной из каркасных областей от аминокислотных последовательностей природных VH доменов, а также от аминокислотных последовательностей природных VH доменов антител человека. В частности, будет понятно, что аминокислотные последовательности нанотел, здесь использующихся, отличаются, по меньшей мере, одним из Характеристических остатков от аминокислотных последовательностей природных VH доменов, а также от аминокислотных последовательностей природных VH доменов из антител из верблюжьих и/или человека.

Таким образом, по одному специфичному воплощению, нанотело изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая отличается, по меньшей мере, одним аминокислотным положением в одной из каркасных областей от аминокислотной последовательности природного VH домена. В соответствии с более специфичным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело изобретения содержит аминокислотную последовательность, которая отличается на, по меньшей мере, один из характеристических остатков от аминокислотной последовательности природного VH домена.

Из вышеприведенного описания, для специалиста будет ясно, что аминокислотные последовательности некоторых нанотел изобретения, а также гуманизированных нанотел изобретения, будут отличаться на, по меньшей мере, одно аминокислотное положение в, по меньшей мере, одной из каркасных областей (т.е. как в положении характеристического остатка, так и в другом положении) от аминокислотных последовательностей природных VHH доменов. Таким образом, в соответствии с одним специфичным, но не ограничивающим, воплощением, нанотело изобретения содержит аминокислотную последовательность, которая отличается на, по меньшей мере, одно аминокислотное положение в одной из каркасных областей от аминокислотной последовательности природного VH домена. В соответствии с более специфичным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело изобретения содержит аминокислотную последовательность, которая отличается, по меньшей мере, одним из Характеристических остатков от аминокислотной последовательности природного VH домена.

Изобретение в его широком понимании также включает производные нанотела изобретения. Такие производные могут в общем быть получены путем модификации, и, в частности, путем химической и/или биологической (напр., ферментативной) модификации, нанотел изобретения и/или одного или более аминокислотных остатков, которые образуют нанотела изобретения.

Примерами таких модификаций, так же как и примерами аминокислотных остатков с последовательностью нанотел, которые могут модифицироваться таким образом (т.е. либо на белковой основе, но предпочтительно на боковой цепи), являются способы и методы, которые могут применяться для внесения таких модификаций и потенциальные применения и преимущества таких модификаций будут понятны для специалиста.

Например, такая модификация может включать введение (напр., путем ковалентного связывания или другим пригодным образом) одной или более функциональных групп, остатков или частей в или на нанотело изобретения, и, в частности, одной или более функциональных групп, остатков или частей, которые придают одно или более желаемых свойств или функциональностей нанотелу изобретения. Пример такой функциональной группы будет очевиден специалисту.

Например, такая модификация может включать введение (напр., путем ковалентного связывания или другим пригодным образом) одной или более функциональных групп, которые увеличивают время полужизни, растворимость и/или абсорбцию нанотела изобретения, которые снижают иммуногенность и/или токсичность нанотела изобретения, которые устраняют или ослабляют любые нежелательные побочные эффекты нанотела изобретения, и/или которые придают другие полезные свойства и/или уменьшают нежелательные свойства нанотел и/или полипептидов изобретения; или любую комбинацию двух или более вышеуказанных. Примеры таких функциональных групп и способов их введения будут понятны специалисту, и могут, в целом, включать все функциональные группы и способы, указанные в общем уровне техники, цитируемом выше, так же как и функциональные группы и способы, известные по сути, для модификации фармацевтических белков, и, в частности, для модификации антител или фрагментов антител (включая ScFv и однодоменные антитела), для которых ссылка, например, приводится на Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Такие функциональные группы могут, например, быть связаны непосредственно (например, ковалентно) с нанотелом изобретения, или необязательно через пригодный линкер или спейсер, что опять-таки понятно специалисту.

Один из наиболее широко применяемых способов увеличения времени полужизни и/или снижения иммуногенности фармацевтических белков включает связывание подходящего фармацевтически пригодного полимера, а также поли(этиленгликоля) (PEG) или его производных (как, например, метоксиполи(этиленгликоль), или mPEG). В общем, может применяться любая пригодная форма пегилирования, а также пегилирование, применяемое в области технике для антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь, (одно) доменных антител и ScFv); ссылаясь на, например, Chapman, Nat. BiotechnoL, 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) и WO 04/060965. Различные реагенты для пегилирования белков также коммерчески доступны, например, от Nektar Therapeutic, USA.

Предпочтительно, сайт-направленное пегилирование применяется, в частности, через цистеиновый-остаток (см., например, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)). Например, для этого, PEG может связываться с цистеиновым остатком, который является природным в нанотеле изобретения, нанотело изобретения может модифицироваться для пригодного введения одного или более цистеиновых остатков для связывания PEG, или аминокислотная последовательность, содержащая один или более цистеиновых остатков для связывания PEG, может сливаться с N- и/или С-концом нанотела изобретения, всеми используемыми способами белковой инженерии, известными специалисту по существу.

Предпочтительно, для нанотел и белков изобретения, PEG используется с молекулярной массой более 5000, а также более 10000, и менее 200000, а также менее 100000; например, в пределах 20000-80000.

В отношении пегилирования, необходимо указать, что, в целом, изобретение также охватывает любое нанотело изобретения и/или полипептид изобретения, который пегилирован по одному или более аминокислотным положениям, предпочтительно таким образом, что указанное пегилирование либо (1) увеличивает время полужизни in vivo; (2) уменьшает иммуногенность; (3) обеспечивает одно или более дополнительных полезных свойств, известных по сути для пегилирования; (4) по существу не влияет на сродство нанотела и/или полипептида с TNF-альфа (напр., не снижает указанное сродство более чем на 90%, предпочтительно не более чем на 50%, и более предпочтительно не более чем на 10%, что определяется пригодным способом, а также теми, которые описываются в примерах ниже); и/или (4) не оказывает влияния на любые другие желаемые свойства нанотел и/или полипептидов изобретения. Пригодные PEG-группы и способы их связывания, как специфичного, так и неспецифичного, будут понятны для специалиста. Пригодные наборы и реагенты для такого пегилирования могут, например, быть получены от Nektar (CA, USA).

Другая, как правило, наименее предпочтительная модификация включает N-связанное или O-связанное гликозилирование, которое, как правило, является частью котрансляционной и/или посттрансляционной модификации, в зависимости от клетки-хозяина, использующегося для экспрессирования нанотела или полипептида изобретения.

Еще другая модификация может включать введение одной или более детектируемых меток или других групп или частиц, генерирующих сигналы, в зависимости от предполагаемого использования меченного нанотела. Пригодные метки и способы связывания, их использование и выявление будут ясны специалисту, и, например, включают, но не ограничиваются, флуоресцентные метки (такие, как флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, o-фтальдегид, и флуорескамин и флуоресцентные металлы, такие, как 152Eu или другие металлы из лантаноидного ряда), фосфоресцирующие метки, хемилюминесцентные метки или биолюминесцентные метки (такие, как люминол, изолюминол, сложный эфир акридиния, имидазол, соли акридиния, эфир щавелевой кислоты, диоксетан или GFP и его аналоги), радиоактивные изотопы (такие, как 3H, 125I, 32Р, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe и 75Se), металлы, хелаты металлов или катионы металлов (например, катионы металлов, таких как 99mTc, 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga и 68Ga, или других металлов, или катионы металлов, которые особенно подходят для применения в диагностике и визуализации in vivo, in vitro или in situ, а также (157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr и 56Fe), так же как и хромофоры и ферменты (такие, как малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта-V-стероидизомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфа-глицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, биотин-авидинпероксидаза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, β-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаз, глюкозо-VI-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза). Другие пригодные метки будут ясны специалисту, и, например, включают агенты, которые могут выявляться при использовании ЯМР или ЭПР спектроскопии.

Такие меченные нанотела и полипептиды изобретения могут, например, использоваться для анализов in vitro, in vivo или in situ (включая иммунологические анализы, известные по существу, а именно ELISA, RIA, EIA и другие "сэндвич"-анализы, и т.д.), так же как и для целей диагностики и визуализации in vivo, в зависимости от выбора специфичной метки.

Как будет ясно для специалиста, другая модификация может включать введение хелатирующей группы, например, для хелатирования одного из металлов или катионов металлов, указанных выше. Пригодные хелатирующие группы, например, включают, без ограничения, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) или этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).

Еще другая модификация может содержать введение функциональной группы, которая является одной частью специфично связывающей пары, как, например, биотин-(стрепт)авидин связывающая пара. Такая функциональная группа может применяться для связывания нанотела изобретения с другим белком, полипептидом или химическим соединением, который связывается с другой половиной связывающей пары, т.е. через образование связующей пары. Например, нанотело изобретения может связываться с биотином, и соединяться с другим белком, полипептидом, соединением или носителем, связанным с авидином или стрептавидином. Например, такое конъюгированное нанотело может использоваться в качестве репортера, например, в диагностической системе, где детектируемый агент, продуцирующий сигнал, связан с авидином или стрептавидином. Такие связывающие пары могут, например, также применяться для связывания нанотела изобретения с носителем, включая носители, пригодные в - фармацевтических целях. Одним не ограничивающим примером являются липосомальные составы, описанные Сао and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Такие связывающие пары могут также использоваться для соединения терапевтически активного агента с нанотелом изобретения.

Для некоторых способов применения, в частности, для таких способов, в которых предполагается разрушение клетки, которая экспрессирует мишень, против которой направлены нанотела изобретения (напр., в лечении раковой опухоли), или снижение или замедление роста и/или пролиферации такой клетки, нанотела изобретения могут быть соединены с токсином или токсичным остатком или агентом. Примеры токсичных агентов, соединений или остатков, которые могут связываться с нанотелом изобретения для обеспечения, например, цитотоксического соединения, будут понятны для специалиста и могут, например, быть обнаружены в уровне техники, цитируемой выше, и/или в дополнительном дальнейшем описании. Одним примером является так называемая ADEPT™ технология, WO 03/055527.

Другие химические и ферментативные модификации будут понятны специалисту. Такие модификации могут также вводиться для исследовательских целей (напр., для изучения отношений функция-активность). Ссылкой, например, может быть Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997).

Как указанно выше, изобретение также относится к белкам или полипептидам, содержащим, по меньшей мере, один VHH домен (т.е. как установлено при использовании способов изобретения) или, по меньшей мере, одно нанотело, основанное на нем.

Согласно одному неограничивающему воплощению изобретения, такой полипептид изобретения по существу состоит из нанотела. Под "по существу состоит из" понимается, что аминокислотная последовательность полипептида изобретения либо является точно такой же, что и аминокислотная последовательность нанотела (как указано выше), либо соответствует аминокислотной последовательности нанотела, в котором ограниченное число аминокислотных остатков, как, например, 1-10 аминокислотных остатков и, предпочтительно, 1-6 аминокислотных остатков, а также 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков, добавлены к амино-концевой области, к карбокси-концевой области, либо и к амино-концевой области и к карбокси-концевой области аминокислотной последовательности нанотела.

Указанные аминокислотные остатки могут или не могут менять, видоизменять или иным образом влиять на (биологические) свойства нанотела и могут или не могут добавлять дополнительную функциональность нанотелу. Например, такие аминокислотные остатки:

a) могут содержать N-концевой остаток Met, например, как результат экспрессии в гетерологичной клетке-хозяине или организме-хозяине;

b) могут образовывать сигнальную последовательность или лидерную последовательность, которая направляет выделение нанотела из клетки-хозяина после синтеза. Пригодные секреторные лидерные пептиды известны специалистам и могут быть такими, как описывается ниже. Как правило, такая лидерная последовательность будет связываться с N-концом нанотела, хотя изобретение в его широком понимании не ограничивается этим;

c) могут образовывать последовательность или сигнал, которая позволяет нанотелу направляться к и/или проникать или входить в специфичные органы, ткани, клетки, или части или участки клеток, и/или которая позволяет нанотелу проникать или проходить через биологический барьер, например, клеточную мембрану, клеточный слой, а также слой эпителиальных клеток, опухоль, включая солидные опухоли, или гематоэнцефалитический барьер. Примеры таких аминокислотных последовательностей известны специалистам. Некоторые неограничивающие примеры представляют собой малые пептидные векторы ("Рер-транс векторы"), описываемые в WO 03/026700 и в Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004) и Rousselle, J. Pharmacol. Exp.Ther., 296, 124-131 (2001), и мембранную транслокаторную последовательность, описываемую Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003). С-концевые и N-концевые аминокислотные последовательности для внутриклеточного таргетинга фрагментов антител, например, описываются Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004). Другие пригодные способы внутриклеточного таргетинга включают экспрессию и/или применение так называемых одноцепочечных антител ("intrabodies"), содержащих нанотела изобретения, как указывается ниже;

d) могут образовывать "метку", например, аминокислотная последовательность или остаток, которая обеспечивает или облегчает очистку нанотела, например, используя способы сродства, направленные против указанной последовательности или остатка. В дальнейшем, указанная последовательность или остаток может удаляться (напр., путем химического или ферментативного расщепления) для обеспечения последовательности нанотела (для этой цели, метка необязательно может связываться с последовательностью нанотела через расщепляющую линкерную последовательность или содержать расщепляющий фрагмент). Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры таких остатков являются множественные гистидиновые остатки, глутатионовые остатки и myc-tag, такой как AAAEQKLISEEDLNGAA [SEQ ID NO: 476];

e) могут включать один или более аминокислотных остатков, которые функционализированы и/или которые могут служить в качестве сайта для связывания функциональных групп. Пригодные аминокислотные остатки и функциональные группы будут понятны для специалиста и включают, но не ограничиваются, аминокислотные остатки и функциональные группы, указанные здесь для производных нанотел изобретения.

В соответствии с другим воплощением, полипептид изобретения содержит нанотело изобретения, которое является слитым по его амино-концевой области, по его карбокси-концевой области, или по обеим его amino-концевой области и по его карбокси-концевой области с, по меньшей мере, одной дополнительной аминокислотной последовательностью, т.е. для обеспечения слитого белка, содержащего указанное нанотело изобретения и одну или более дополнительных аминокислотных последовательностей. Такое слияние будет также относится здесь к "слиянию нанотела".

Одна или более дополнительных аминокислотных последовательностей могут быть любыми пригодными и/или желаемыми аминокислотными последовательностями. Дополнительные аминокислотные последовательности могут или не могут меняться, видоизменяться или иным образом влиять на (биологические) свойства нанотела и могут или не могут добавлять дополнительную функциональность нанотелу. Предпочтительно, дополнительная аминокислотная последовательность такова, что она предоставляет одно или более желаемых свойств или функциональностей нанотелу или полипептиду изобретения.

Примеры таких аминокислотных последовательностей понятны для специалиста и могут, в целом, содержать все аминокислотные последовательности, которые используются для слияния пептидов, на основании традиционных антител и их фрагментов (включая, но не ограничиваясь, ScFv и однодоменные антитела). Отсылка может быть дана, например, на обзор Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136(2005),

Например, такая аминокислотная последовательность может быть аминокислотной последовательностью, которая повышает время полужизни, растворимость, или абсорбцию, снижает иммуногенность или токсичность, устраняет или ослабляет нежелательные побочные эффекты, и/или предоставляет другие полезные свойства и/или уменьшает нежелательные свойства полипептидов изобретения, сравнительно с нанотелами изобретения по сути. Некоторые не ограничивающие примеры таких аминокислотных последовательностей включают сывороточные белки, а также сывороточный альбумин человека (см., например, WO 00/27435) или гаптеновые молекулы (например, гаптены, которые распознаются циркулирующими антителами, см., например, WO 98/22141).

Дополнительная аминокислотная последовательность может также обеспечивать второй связывающий сайт, где связывающий сайт может быть направленным против любого желаемого белка, полипептида, антигена, антигенной детерминанты или эпитопа (включая, но не ограничиваясь, тот же белок, полипептид, антиген, антигенную детерминанту или эпитоп, против которого нанотело изобретения направлено, или другой белок, полипептид, антиген, антигенную детерминанту или эпитоп). Например, дополнительная аминокислотная последовательность может обеспечивать второй связывающий сайт, который направлен против сывороточного белка (такого как, например, сывороточного альбумина человека или другого сывороточного белка, а также IgG), для обеспечения увеличенного времени полужизни в сыворотке. Ссылка дается, например, на ЕР 0 368 684, WO 91/01743, WO 01/45746 и WO 04/003019 (где указываются различные сывороточные белки). Международную заявку заявителя, названную "Nanobodies™ against amyloid-beta and polypeptides comprising the same for the treatment of degenerative neural diseases such as Alzheimer’s disease" (где указаны ряд других белков), так же как и на Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42.

В соответствии с другим воплощением, одна или более дополнительных аминокислотных последовательностей могут содержать одну или более части, фрагменты или домены традиционных 4-цепочечных антител (и в частности человеческих антител) и/или антител тяжелой цепи. Например, хотя, как правило, наименее предпочтительно, нанотело изобретения может связываться с традиционным (предпочтительно человеческим) VH или VL доменом или с природным или синтетическим аналогом VH или VL домена, опять же необязательно через линкерную последовательность (включая, но не ограничиваясь, другие (одно) доменные антитела, такие как dAb, описанные Ward et al.).

По меньшей мере, одно нанотело может связываться с одним или более (предпочтительно человеческими) CH1, CH2 и/или СН3 доменами, необязательно через линкерную последовательность. Например, нанотело, связанное с пригодным CH1 доменом, может, например, использоваться - совместно с пригодными легкими цепями - для образования фрагментов/структур антител, аналогичных традиционным Fab фрагментам или F(ab’)2 фрагментам, но в которых один или (для F(ab’)2 фрагмента) один или оба традиционных VH доменов замещены нанотелом изобретения. Также два нанотела могут связываться с СН3 доменом (необязательно через линкер) для обеспечения конструкции с увеличенным временем полужизни in vivo.

В соответствии с одним специфичным воплощением полипептида изобретения, одно или более нанотел изобретения могут связываться с одной или более частями, фрагментами или доменами антител, которые придают одну или более эффекторных функций полипептиду изобретения и/или могут придавать способность к связыванию с одним или более Fc рецепторами. Например, для этого, и без ограничения, одна или более дополнительных аминокислотных последовательностей могут содержать один или более CH2 и/или СН3 доменов антитела, таких, которые из антител к тяжелой цепи (как здесь описывается) и более предпочтительно из традиционного человеческого 4-цепочеченого антитела; и/или могут образовывать (часть) и Fc область, например, из IgG, из IgE или из другого человеческого Ig. Например, WO 94/04678 описывает антитела тяжелой цепи, содержащие VHH домен верблюжьих, или их гуманизированное производное (т.е. нанотело), в котором СН2 и/или СН3 домен верблюжьих замещен человеческими СН2 и СН3 доменами, для обеспечения иммуноглобулина, который состоит из 2 тяжелых цепей, каждая из которых содержит нанотело и человеческие СН2 и СН3 домены но не СН1 домен), который иммуноглобулин обладает эффекторной функцией, обеспечиваемой СН2 и СН3 доменами, и который иммуноглобулин может функционировать в отсутствии любых легких цепей. Другие аминокислотные последовательности, которые могут приемлемо связываться с нанотелами изобретения для обеспечения эффекторной функции будут понятны для специалиста и могут выбираться на основании желаемой(ых) эффекторной(ых) функции(ий). О чем упоминается в WO 04/058820, WO 99/42077 и WO 05/017148, так же как и в обзоре Holliger and Hudson, supra. Связывание нанотела изобретения с Fc областью может также приводить к повышению времени полужизни, сравнительно с соответствующим нанотелом изобретения. Для некоторых применений, использование Fc области и/или постоянных доменов (т.е. СН2 и/или СН3 доменов), которые придают повышенное время полужизни без какой-либо биологически значимой эффекторной функции, могут также быть пригодными или даже предпочтительными. Другие пригодные конструкции, содержащие одно или более нанотела и один или более постоянных доменов с повышенным временем полужизни in vivo, будут ясны специалисту, и могут, например, содержать два нанотела, связанных с СН3 доменом, необязательно через линкерную последовательность. В общем, любой слитой белок или производные с повышенным временем полужизни будут предпочтительно иметь молекулярную массу более чем 50 кД, малозначимая величина для почечной абсорбции.

Дополнительные аминокислотные последовательности могут также формировать сигнальную последовательность или лидерную последовательность, которая направляет секрецию нанотела или полипептида изобретения из клетки-хозяина после синтеза (например, для обеспечения пре-, про- или препроформ полипептида изобретения, в зависимости от клетки-хозяина, используемого для экспрессии полипептида изобретения).

Дополнительная аминокислотная последовательность может также формировать последовательность или сигнал, которая позволяет нанотелу или полипептиду изобретения быть направленным к и/или проникать или проходить в специфичные органы, ткани, клетки, или части или отделы клеток, и/или которая позволяет нанотелу или полипептиду изобретения проникать или пересекать биологический барьер, такой как клеточную мембрану, клеточный слой, такой как слой эпителиальных клеток, опухоль, включая солидные опухоли, или гематоэнцефалитический барьер. Пригодные примеры таких аминокислотных последовательностей будут ясны специалисту, и, например, включают, но не ограничиваются, векторы "Peptrans", указанные выше, последовательности, описываемые Cardinale et al. и аминокислотные последовательности и фрагменты антител, по существу известные, которые могут применяться для представления или изготовления нанотел и полипептидов изобретения, как так называемые "intrabodies" - внутриклеточные фрагменты антител, например, которые описываются в WO 94/02610, WO 95/22618, US-A-7004940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1 512 696; и в Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; и в Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170, и в дополнительных ссылках, описываемых здесь.

Для некоторых способов применения, в частности, для таких применений, в которых предполагается уничтожение клетки, которая представляет мишень, против которой направлены нанотела изобретения (напр., в лечении раковой опухоли), или подавление или замедление роста и/или пролиферации такой клетки, нанотела изобретения могут также связываться с (цито)токсичным белком или полипептидом. Примеры таких токсичных белков и полипептидов, которые могут связываться с нанотелом изобретения для обеспечения, например, цитотоксичного полипептида изобретения, будут ясны специалисту и могут, например, быть обнаружены в уровне технике, цитируемом выше, и/или в дополнительном этом описании. Одним примером является так называемая ADEPT™ технология, WO 03/055527.

В соответствии с одним не ограничивающим воплощением, один или более аминокислотных остатков могут добавляться к, включаться в и/или замещаться в аминокислотной последовательности нанотела или полипептида изобретения для обеспечения одного или более специфичных аминокислотных остатков для связывания PEG-группы.

Эффективность белковых лекарственных средств зависит от их активности по уничтожению мишени, но также от внутренних фармакинетик потенциального лекарственного средства. Поскольку почки обычно фильтруют молекулы ниже 60000 дальтон (Да), усилия по снижению клиренса направлены на увеличение молекулярной массы биофармацевтического лекарства через слияния белков (Syed et al., 1997), гликозилирования или модификацию с полиэтиленгликольными полимерами, т.е. ПЭГилирование (Lee et al., 1999; Abuchowski et al., 1977; Nucci et al., 1991; Lecolley, et al. Chem Commun, 2004; Tao et al., J Am Chem Soc, 2004; Mantovani et al., 2005). Эти способы с успехом повышают выделение биофармацевтического лекарства in vivo.

Альтернативно, время полужизни может повышаться при использовании другого пегилирующего агента, POLY PEG, для связывания с бивалентными нан отелами, TNF56 или TNF55. POLY PEG представляет собой полимер в форме расчески с PEG зубьями на метакриловом каркасе. POLY PEG могут отличаться по длине цепи PEG, по метакриловой цепи и по активной концевой группе, которая определяет способ конъюгации POLY PEG с нанотелом. Сайт-специфичная конъюгация с C-концевым цистеином, имеющимся в нанотелах, может обеспечиваться через активную малеимидную концевую группу в POLY PEG.

Изобретение также охватывает любое нанотело изобретения и/или полипептид изобретения, которое гликозилировано по одному или более аминокислотным положениям, что, как правило, зависит от хозяина, используемого для представления нанотела или полипептида изобретения (как дополнительно описывается ниже).

В соответствии с одним не ограничивающим воплощением, один или более аминокислотных остатков могут добавляться к, включаться в и/или замещаться в аминокислотной последовательности нанотела или полипептида изобретения, для обеспечения одного или более специфичных аминокислотных остатков и/или участка, которые могут быть гликозилированы используемым организмом-хозяином. Посредством предпочтительного, но не ограничивающего, примера, N-остаток в положении 50 в CDR2 нанотела изобретения может, например, заменяться на Q, D или S остаток для обеспечения сайта гликозилирования, напр., для гликозилирования Pichia.

В соответствии с другим воплощением, полипептид изобретения может содержать аминокислотную последовательность нанотела, которая слита по ее аминоконцевой области, по ее карбоксиконцевой области, или по ее обеим аминоконцевой и карбоксиконцевой областям, по меньшей мере, с одной дополнительной аминокислотной последовательностью.

Кроме того, указанная(ые) дополнительная(ые) аминокислотная(ые) последовательность(и) могут или не могут менять, видоизменять или же влиять на (биологические) свойства нанотела и могут или не могут добавлять дополнительные функциональности нанотелу.

Например, в соответствии с одним предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением, указанная дополнительная аминокислотная последовательность может содержать, по меньшей мере, одно дополнительное нанотело для обеспечения полипептида изобретения, который содержит, по меньшей мере, два, а также три, четыре или пять нанотел, в котором указанные нанотела могут необязательно быть связаны посредством одной или более линкерных последовательностей (как определено здесь).

Полипептиды изобретения, содержащие два или более нанотела также будут относиться здесь к "многовалентным" полипептидам. Например, "бивалентный" полипептид изобретения содержит два нанотела, необязательно связанных посредством линкерной последовательности, при этом "тривалентный" полипептид изобретения содержит три нанотела, необязательно связанных посредством двух линкерных последовательностей; и т.д.

В многовалентном полипептиде изобретения, два или более нанотел могут являться аналогичными или отличаться. Например, два или более нанотел в многовалентном полипептиде изобретения:

- могут быть направлены против одного и того же антигена, т.е. против одних и тех же частей или эпитопов указанного антигена или против двух или более различных частей или эпитопов указанного антигена; и/или:

- могут быть направлены против различных антигенов;

или их комбинации. Таким образом, бивалентный полипептид изобретения, например:

- может содержать два идентичных нанотела;

- может содержать первое нанотело, направленное против первой части или эпитопа антигена, и второе нанотело, направленное против той же части или эпитопа указанного антигена или против другой части или эпитопа указанного антигена;

- или может содержать первое нанотело, направленное против первого антигена, и второе нанотело, направленное против второго антигена, отличного от указанного первого антигена;

тогда как тривалентный Полипептид изобретения, например:

- может содержать три идентичных или отличных нанотела, направленных против одних и тех же или различных частей или эпитопов одного и того же антигена;

- может содержать два идентичных или отличных нанотела, направленных против одних и тех же или различных частей или эпитопов первого антигена, и третье нанотело, направленное против второго антигена, отличного от указанного первого антигена; или

- может содержать первое нанотело, направленное против первого антигена, второе нанотело, направленное против второго антигена, отличного от указанного первого антигена, и третье нанотело, направленное против третьего антигена, отличного от указанных первого и второго антигенов.

Полипептиды изобретения, которые содержат, по меньшей мере, два нанотела, где, по меньшей мере, одно нанотело направлено против первого антигена, и, по меньшей мере, одно нанотело направлено против второго антигена, отличного от первого антигена, также будет относиться к "мультиспецифичным" нанотелам. Таким образом, "биспецифичное" нанотело представляет собой нанотело, которое содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против первого антигена, и, по меньшей мере, одно дополнительное нанотело, направленное против второго антигена, тогда как "триспецифичное" нанотело представляет собой нанотело, которое содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против первого антигена, по меньшей мере, одно дополнительное нанотело, направленное против второго антигена, и, по меньшей мере, одно дополнительное нанотело, направленное против третьего антигена; и т.д.

Соответственно, в его простейшем виде, биспецифичный полипептид изобретения представляет собой бивалентный полипептид изобретения (как определено здесь), содержащий первое нанотело, направленное против первого антигена, и второе нанотело, направленное против второго антигена, в котором указанные первое и второе нанотела могут необязательно быть связанными посредством линкерной последовательности (как определено здесь); тогда как триспецифичный полипептид изобретения, в его простейшем виде, представляет собой тривалентный полипептид изобретения (как определено здесь), содержащий первое нанотело, направленное против первого антигена, второе нанотело, направленное против второго антигена, и третье нанотело, направленное против третьего антигена, в котором указанные первое, второе и третье нанотела могут необязательно быть связанными через одну или более, и, в частности, одну и более, в частности, две линкерные последовательности.

Тем не менее, как следует из вышеприведенного описания, изобретение не ограничивается тем, в том смысле, что мультиспецифичный полипептид изобретения может содержать любое число нанотел, направленных против двух или более различных антигенов.

Для многовалентных и мультиспецифичных полипептидов, содержащих один или более VHH доменов, и их приготовления, ссылку также можно указать на Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol.276,10. 7346-7350, так же как и на ЕР 0822985.

В полипептидах изобретения, одно или более нанотел и один или более полипептидов могут быть непосредственно связаны друг с другом (как, например, описывается в WO 99/23221) и/или могут быть связаны друг с другом посредством одного или более пригодных спейсеров или линкеров, или любая их комбинация.

Пригодные спейсеры или линкеры для применения в многовалентных и мультиспецифичных полипептидах будут ясны специалисту, и могут, в общем, быть любым линкером или спейсером, используемым в технике, для связывания аминокислотных последовательностей. Предпочтительно, указанный линкер или спейсер представляет собой пригодный для применения в создании белков или полипептидов, которые предполагаются для фармацевтического применения.

Некоторые особенно предпочтительные спейсеры включают спейсеры и линкеры, которые используются в технике для связывания фрагментов антител или доменов антител. Они включают линкеры, указанные в общем уровне техники, цитируемом выше, а так же, например, линкеры, которые используются в технике для создания димеров или ScFv фрагментов (в этом отношении, однако, следует отметить, что поскольку, в димерах и в ScFv фрагментах, используемая линкерная последовательность должна иметь длину, степень жесткости и другие свойства, которые позволяют соответствующим VH и VL доменам сближаться для формирования полного антиген-связывающего сайта, не существует особенного ограничения относительно длины и жесткости линкера, использующегося для полипептида изобретения, так как каждое нанотело, само по себе, формирует полный антиген-связывающий сайт).

Другие пригодные линкеры, в общем, содержат органические соединения или полимеры, в частности, такие, которые пригодны для использования в белках для фармацевтического применения. Например, поли(этиленгликолевые) агенты используются для связывания доменов антител, см., например, WO 04/081026.

Также в объем изобретения входит то, что использующий(е)ся линкер(ы) придают одно или более другие полезные свойства или функциональности полипептидам изобретения, и/или обеспечивают одним или более сайтами для формирования производных и/или для связывания функциональных групп (напр., как описывается здесь, для производных нанотел изобретения). Например, линкеры, содержащие один или более заряженных аминокислотных остатков (см. выше таблицу А-3) могут обеспечивать повышенные гидрофильные свойства, тогда как линкеры, которые формируют или содержат небольшие эпитопы или метки, могут использоваться для целей обнаружения, идентификации и/или очистки. Кроме того, с учетом описания раскрытия изобретения, приведенного здесь, специалист будет способен определить оптимальные линкеры для использования в специфическом полипептиде изобретения, необязательно после проведения некоторых рутинных экспериментов.

В заключение, если два или более линкера используются в полипептидах изобретения, то эти линкеры могут быть одинаковыми или отличаться. Кроме того, на основании раскрытия изобретения, приведенного здесь, специалист будет способен определить оптимальные линкеры для использования в специфическом полипептиде изобретения, необязательно после проведения некоторых рутинных экспериментов.

Линкеры для использования в многовалентных и мультиспецифичных полипептидах будут ясны специалисту, и например, включают gly-ser линкеры, например, тип (glyxsery)z, такие, как (gly4Ser)3 или (gly3ser2)3, как описывается в WO 99/42077, шарниро-подобные участки, такие как шарнирные участки природных антител, состоящих только из тяжелых цепей или аналогичных последовательностей. Для других пригодных линкеров отсылку можно дать на общий уровень техники, цитируемый выше. Некоторые особенно предпочтительные линкеры представлены в SEQ ID NO 68 и 69.

Линкеры могут также обеспечивать некоторые функциональности для многовалентного или мультиспецифичного полипептида. Например, линкеры, содержащие один или более заряженных аминокислотных остатков (см. таблицу 1 выше), могут обеспечивать улучшенные гидрофильные свойства, при этом линкеры, которые формируют или содержат небольшие эпитопы или метки, могут использоваться для целей обнаружения, идентификации и/или очистки.

Как указано здесь, в белке или полипептиде изобретения, анти-TNF нанотела, здесь указанные, предпочтительно связываются таким образом, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать связывание с рецептором TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким рецепторным связыванием; и/или таким образом, что белок или полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF. Пригодные линкеры такие, которые здесь описываются.

Как также здесь указывается, независимо от того, обеспечивает белок или полипептид внутримолекулярное связывание или внемолекулярное связывание, он может быть определен (по меньшей мере, исходно) с помощью гель-хроматографии. С помощью гель-хроматографии комплексы TNF-альфа и антител могут быть проанализированы для обнаружения количества и отношения антитела и молекул TNF-альфа в комплексе. На основании этих данных можно сделать вывод, произошло меж- или внутримолекулярное связывание, как было сделано Santora и его коллегами (Santora, L.C., et al., Anal Biochem. 2001) для установления стехиометрии связывания моноклонального антитела D2E7 (Humira) с TNF-альфа в различных соотношениях антитела и мишени. По молекулярной массе комплекса было сделано заключение, что три молекулы антитела образовали комплекс с тремя тримерами TNF, тем самым показывая, что антитело связано межмолекулярным путем. Аналогичные эксперименты проводились с бивалентными нанотелами, в которых очень короткий линкер индуцировал образование крупномолекулярных комплексов, которое были получены межмолекулярными связями. Однако те же конструкции из бивалентных нанотел с более длинными линкерами извлекались из колонки для гель-фильтрации как мелкие дискретные комплексы, тем самым показывая, что были образованы внутримолекулярные связи. Объединив результаты биоанализа, где более длинный линкер, содержащий нанотело TNF1, имел оптимальную активность (полная нейтрализация числа TNF, используемого в анализе, т.е. 10 пМ), было сделано заключение, что внутримолекулярное связывание бивалентного нанотела эффективно препятствует перекрестному связыванию двух клеточных рецепторов и ассоциированной активации рецепторов. Известные моноклональные антитела, такие как Humira или Remicade, не могут формировать такие внутримолекулярные связи, оставляя всегда два сайта связывания с рецепторами на тримерной молекуле TNF в некоторой степени способными для взаимодействия с клеточным рецептором, который переводит в наименее сильную нейтрализацию, как определено в биоанализе.

Альтернативно, независимо от того, обеспечивает белок или полипептид внутримолекулярное связывание или внемолекулярное связывание, он может быть определен с помощью кристаллографии и/или молекулярного моделирования (или другими пригодными способами in silico). Модель тримерного TNF30/TNF-альфа комплекса была генерирована с учетом кристаллической структуры мономерного комплекса TNF1/TNF-альфа дикого типа. По этой структуре была смоделирована итоговая конструкция TNF30-линкер-ALB8-линкер-TNF30. Конструкция TNF30-линкер-ALB8-линкер-TNF30 была смоделирована, начиная с тримера TNFα с двумя связанными молекулами TNF30. Поскольку структура ALB8 не известна, то вместо него использовалась третья молекула TNF30, которая была помещена между другими двумя нанотелами вдоль линии между N- и С-концами. Затем вручную были добавлены 9 аминокислотных линкеров.

Модель показана на фигуре 62. Очевидно, что 9 аминокислотных линкера совместно с ALB8 обеспечивают достаточно места для расстояния в около 66 Å между двумя доменами TNF30, связанных TNFα. ALB8 сам по себе уже занимает 40 Å, и каждый линкер может занять другие приблизительно 27 Å в полностью растянутой конформации. Как результат, ALB8 обладает некоторой жесткостью движения, и не ожидается, что его связывание с альбумином будет препятствовать связыванию с TNFα.

Кроме того, вероятно, что линкеры могут быть сокращены, не нарушая авидность, особенно для линкера, который представляет собой С-конец ALB8. Это может оказывать положительное действие, заключающееся в повышенном связывании с тем же тримером TNFα по сравнению со сшитыми тримерами, поскольку возможность, что второй TNF30 связывается с различным TNFα, увеличивается с длиной линкера.

Как также дополнительно описывается здесь, мультиспецифичный полипептид изобретения, направленный против желаемого антигена и против, по меньшей мере, одного сывороточного белка, такого как сывороточный белок, указываемый ниже, и, в частности, против сывороточного альбумина человека, может демонстрировать повышенное время полужизни в сыворотке, сравнительно с соответствующим моновалентным нанотелом.

Как указано здесь выше, способы, описываемые здесь, особенно пригодны для образования таких многовалентных и мультиспецифичных полипептидов изобретения.

В полипептиде изобретения, по меньшей мере, одно нанотело может также быть связанными с традиционным VH доменом или с природным или синтетическим аналогом VH домена, необязательно через линкерную последовательность.

В полипептиде изобретения, по меньшей мере, одно нанотело может также быть связанными с VL доменом или с природным или синтетическим аналогом VL домена, необязательно через линкерную последовательность, для обеспечения полипептида изобретения, который находится в аналогичной форме с традиционным scFv фрагментом, но содержащий нанотело вместо VH домена.

В полипептиде изобретения, по меньшей мере, одно нанотело может также быть связанными с одним или более СН1, СН2 и/или СН3 доменом, необязательно через линкерную последовательность. Например, нанотело, связанное с пригодным СН1 доменом может, например, использоваться - вместе с пригодными легкими цепями - с образованием фрагментов/структур антител, аналогичных традиционным Fab фрагментам или F(ab’)2 фрагментам, но в котором один или (в случае F(ab’)2 фрагмента) один или оба традиционных VH доменов заменяются нанотелом. Такие фрагменты могут также быть гетероспецифичными или биспецифичное, т.е. направленными против двух или более антигенов. Нанотело, связанное с пригодными СН2 и СН3 доменами, например, полученное от Camelids, могут использоваться для образования моноспецифичного или биспецифичного антитела тяжелой цепи. В итоге, нанотело, связанное с пригодными СН2 и СН3 доменами, например, полученное от человека, может использоваться - вместе с пригодными легкими цепями - для образования антитела, которое аналогично традиционному 4-цепочечному антителу, но в котором один или оба традиционных VH доменов заменены нанотелом.

Также, в дополнение к одному или более нанотелам, Полипептиды изобретения могут также содержать функциональные группы, части или остатки, например, терапевтически активные субстанции, такие как указанные ниже, и/или маркеры или метки, такие, как флуоресцентные маркеры, изотопы, и т.д., как дополнительно описывается в дальнейшем.

Нанотела изобретения, полипептиды изобретения и их кодирующие нуклеиновые кислоты могут приготавливаться способом, известным по сути, который будет очевиден для специалист из дополнительного описания, приведенного здесь. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, способы приготовления нанотел, полипептидов и нуклеиновых кислот включают способы и методы, указанные выше и/или дополнительно описываемые ниже.

Как будет ясно для специалиста, один особенно пригодный способ приготовления нанотела и/или полипептида изобретения, в общем, содержит следующие этапы:

- экспрессию, в пригодной клетке-хозяине или организме-хозяине (также упоминается здесь как "хозяин согласно изобретению") или в другой пригодной экспрессирующей системе нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанное нанотело или полипептид изобретения (также относится здесь к "нуклеиновой кислоте изобретения"), необязательно с последующим:

- отделением и/или очисткой нанотела или полипептида изобретения, полученным таким образом.

В частности, такой способ может содержать этапы:

- культивирование и/или поддерживание хозяина изобретения в условиях, которые такие, что указанный хозяин изобретения экспрессирует и/или продуцирует, по меньшей мере, одно нанотело и/или полипептид изобретения; необязательно с последующим:

- отделением и/или очисткой нанотела или полипептида изобретения, полученным таким образом.

Нуклеиновая кислота изобретения может находиться в форме одно или двухцепочечной ДНК или РНК, и предпочтительно в форме двухцепочечной ДНК. Например, нуклеотидными последовательностями изобретения могут быть геномная ДНК, кДНК или синтетическая ДНК (такие как ДНК с использованием кодонов, которая специфично адаптирована для экспрессии в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине).

В соответствии с одним воплощением изобретения, нуклеиновая кислота изобретения находится по существу в изолированной форме, как определено здесь выше.

Нуклеиновая кислота изобретения может также находится в форме, присутствует в и/или является частью вектора, такого как, например, плазмида, космида или YAC, которые опять таки могут находиться по существу в изолированной форме.

Нуклеиновые кислоты изобретения могут быть приготовлены или получены способом, известным по сути с учетом сведений об аминокислотных последовательностях для полипептидов изобретения, указанных здесь, и/или могут быть отделены из пригодного природного источника. Для обеспечения аналогов, нуклеотидные последовательности, кодирующие природные VHH домены, могут например, подвергаться сайт-направленному мутагенезу для обеспечения нуклеиновой кислоты изобретения, кодирующей указанный аналог. Также, как будет ясно специалисту, при приготовлении нуклеиновой кислоты изобретения, также несколько нуклеотидных последовательностей, таких как, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность, кодирующая нанотело, и, например, нуклеиновая кислота, кодирующая один или более линкеры, могут быть связаны друг с другом пригодным образом.

Способы создания нуклеиновых кислот изобретения будут ясны специалисту и могут, например, включать, но не ограничиваются, автоматический синтез ДНК; сайт-направленный мутагенез; комбинирование двух или более природных и/или синтетических последовательностей (или двух или более их частей), введение мутаций, которые приводят к экспрессии процессированного продукта экспрессии; введение одного или более сайтов рестрикции (напр., для создания кассет и/или областей, которые могут с легкостью расщепляться и/или лигироваться при использовании пригодных рестрикционных ферментов), и/или введение мутаций с помощью ПЦР реакции при использовании одного или более праймеров с мисматчами, при использовании, например, последовательности природного СПЦР в качестве матрицы. Эти и другие способы будут ясны специалисту, и снова ссылка дается на стандартные справочники, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанные выше, так же как и на нижеуказанные примеры.

Нуклеиновая кислота изобретения может также находится в форме, присутствовать в и/или являться частью генетической конструкции, как будет очевидно для специалиста в данной области техники. Такие генетические конструкции обычно содержат, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту изобретения, которая необязательно связана с одним или более элементами генетических конструкций, известных по сути, такими как, например, с одним или более пригодными регуляторными элементами (такими как пригодный(е) промотор(ы), энхансер(ы), терминатор(ы), и т.д.) и дополнительными элементами генетических конструкций, указанных здесь ниже. Такие генетические конструкции, содержащие, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту изобретения будут также относится здесь как "генетические конструкции изобретения".

Генетические конструкции изобретения могут быть ДНК или РНК, и предпочтительно двухцепочечной ДНК. Генетические конструкции изобретения могут также быть в форме, пригодной для трансформации предполагаемой клетки-хозяина или организма-хозяина, в форме, пригодной для интеграции в геномную ДНК предполагаемой клетки-хозяина или организма-хозяина, в форме, пригодной для независимой репликации, поддержания и/или наследования в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине. Например, генетические конструкции изобретения могут находиться в форме вектора, такого как, например, плазмида, космиды, YAC, вирусного вектора или транспозона. В частности, вектор может являться экспрессирующим вектором, т.е. вектором, который обеспечивает экспрессию in vitro и/или in vivo (напр., в пригодной клетке-хозяине, организме-хозяине и/или экспрессирующей системе).

В предпочтительном, но не ограничивающем, воплощении, генетическая конструкция изобретения содержит

a) по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту изобретения, функционально связанную с

b) одним или более регуляторными элементами, такими как промотор и необязательно пригодный терминатор;

c) и необязательно также

d) одним или более дополнительными элементами генетических конструкций, известных по сути;

где термины "регуляторный элемент", "промотор", "терминатор" и "функционально связанный" имеют их обычное значение, известное в уровне технике (как дополнительно описывается ниже); и где указанные "дополнительные элементы", имеющиеся в генетических конструкциях могут, например, быть 3’- или 5’-UTR (нетранслируемые) последовательности, лидерные последовательности, маркеры выделения, маркеры экспрессии/репортерные гены, и/или элементы, которые могут облегчать или увеличивать (эффективность) трансформации или интеграции. Эти и другие пригодные элементы таких генетических конструкций будут ясны специалисту, и могут, например, зависеть от типа используемой конструкции, предполагаемой клетки-хозяина или организма-хозяина; способа, по которому интересующие нуклеотидные последовательности изобретения экспрессируются (напр., посредством конституционной, транзиторной или индуцируемой экспрессии); и/или используемого способа трансформации.

Предпочтительно, в генетических конструкциях изобретения, указанная, по меньшей мере, одна нуклеиновая кислота изобретения и указанные регуляторные элементы, и необязательно указанный один или более дополнительные элементы, "функционально связаны" друг с другом, что, по сути, означает, что они находятся в функциональной взаимосвязи друг с другом. Например, промотор рассматривается как "функционально связанный" с кодирующей последовательностью, если указанный промотор способен инициировать, или же контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию кодирующей последовательности (где под указанной кодирующей последовательностью следует понимать, что она находится "под контролем" указанного промотора). Обычно, если две нуклеотидные последовательности функционально связаны, то они будут одинаково ориентированы и, как правило, также находится в одной рамке считывания. Они также будут, как правило, находится по существу рядом, хотя это необязательно.

Предпочтительно, регуляторные и дополнительные элементы генетических конструкций изобретения таковы, что они способны обеспечивать их предполагаемые биологические функции в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине.

Например, промотор, энхансер или терминатор должны быть "функциональными" в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине, что значит, что (например) указанный промотор должен являться способным инициировать или же контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию нуклеотидной последовательности - напр., кодирующей последовательности - с которой он функционально связан (как определено здесь).

Некоторые особенно предпочтительные промоторы включают, но не ограничиваются, промоторы, известные сами по себе для экспрессии в бактериальных клетках, а также те, которые приведены в дальнейшем и/или те, которые используются в примерах.

Селекционный маркер должен быть таким, чтобы позволять - т.е. при подходящих селекционных условиях - клеткам-хозяевам и/или организмам-хозяевам, которые (успешно) трансформированы нуклеотидной последовательностью изобретения, дифференцироваться от клеток-хозяев/организмов, которые (успешно) не трансформированы. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры таких маркеров представляют собой гены, которые обеспечивают резистентность к антибиотикам (таким как канамицин или ампициллин), гены, которые обеспечивают температурную резистентность, или гены, которые позволяют клетке-хозяину или организму-хозяину сохраняться при отсутствии некоторых факторов, соединений и/или (питательных) компонентов в среде, которая является важной для существования нетрансформированных клеток или организмов.

Лидерная последовательность должна быть такой, чтобы - в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине - обеспечивать желаемые посттрансляционные модификации и/или такой, чтобы направлять считываемую область мРНК в желаемую часть или органеллу клетки. Лидерная последовательность может также обеспечивать секрецию продукта экспрессии из указанной клетки. А также лидерная последовательность может являться любой про-, пре-, или препропоследовательностью, функционирующей в клетке-хозяине или в организме-хозяине. Лидерная последовательностей может не требоваться для экспрессии в бактериальной клетке.

Маркер экспрессии или репортерный ген должен таким, чтобы - в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине - обеспечивать обнаружение экспрессии (присутствующего гена или нуклеотидной последовательности) генетической конструкции. Маркер экспрессии также, необязательно, может обеспечивать локализацию экспрессированного продукта, напр., в специфической части или органелле клетки и/или в специфической(их) клетке(ах), ткани(ях), органе(ах) или части(ях) многоклеточного организма. Такие репортерные гены могут также экспрессироваться как белок, слитый с аминокислотной последовательностью изобретения. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры включают флуоресцентные белки, такие как GFP.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры пригодных промоторов, терминатора и дополнительных элементов включают такие, которые используются в нижеприведенных примерах. Для некоторых (дополнительных) неограничивающих примеров промоторов, селективных маркеров, лидерных последовательностей, маркеров экспрессии и дополнительных элементов, которые могут быть представлены/использованы в генетических конструкциях изобретения - такие как терминаторы, транскрипционные и/или трансляционные энхансеры и/или факторы интеграции - ссылки представлены на общие справочники, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанных выше, так же как и на примеры, которые приведены в WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-6,207,410, USA №5693492 и ЕР 1 085 089. Другие примеры будут ясны специалисту. Ссылки также приводятся на общий уровень техники, цитируемый выше, и на дополнительные ссылки, цитируемые в дальнейшем.

Генетические конструкции изобретения могут, в целом, обеспечиваться за счет пригодного связывания нуклеотидной(ых) последовательности(ей) изобретения с одним или более дополнительными элементами, описываемыми выше, например, за счет использования способов, описываемых в общих справочниках, по редакцией Sambrook et al. и Ausubel et al., указанных выше.

Часто, генетические конструкции изобретения будут образовываться путем включения нуклеотидных последовательность изобретения в пригодный вектор (экспрессии), известный в чистом виде. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры пригодных векторов экспрессии приведены в дальнейших примерах, а так же упоминаются в дальнейшем.

Нуклеиновые кислоты изобретения и/или генетические конструкции изобретения могут использоваться для трансформации клетки-хозяина или организма-хозяина. Клетка-хозяин или организм-хозяин может являться любой пригодной (грибковой, прокариотной или эукариотной) клеткой или клеточной линией или любым пригодным грибковым, прокариотным или эукариотным организмом, например:

- бактериальным штаммом, включая, но не ограничиваясь, грамотрицательные штаммы, такие как штаммы Escherichia coli; Proteus, например, Proteus mirabilis; Pseudomonas, например, Pseudomonas fluorescens; и грамположительные штаммы, такие как штаммы Bacillus, например, Bacillus subtilis или Bacillus brevis; Streptomyces, например, Streptomyces lividans; Staphylococcus, например, Staphylococcus carnosus; и Lactococcus, например, Lactococcus lactis,

- грибковой клеткой, включая, но не ограничиваясь, клетки из штаммов Trichoderma, например, из Trichoderma reesei; Neurospora, например, из Neurospora crassa;

- Sordaria, например, из Sordaria macrospora, Aspergillus, например, из Aspergillus niger или из Aspergillus soj’ae; или из других нитчатых грибов;

- дрожжевой клеткой, включая, но не ограничиваясь, клетки из штаммов Saccharomyces, например, Saccharomyces cerevisiae; Schizosaccharomyces, например, Schizosaccharomyces pombe, Pichia, например, Pichia pastoris или Pichia methanolica, Hansenula, например, Hansenula polymorpha; Kluyveromyces, например, Kluyveromyces lactis; Arxula, например, Arxula adeninivorans, Yarrowia, например, Yarrowia lipolytica;

- клеткой земноводных или клеточной линией, такой как ооциты Xenopus;

- клеткой, полученной из насекомых, или клеточной линией, таких как клетки/клеточные линии, полученные из чешуекрылых, включая, но не ограничиваясь, клетки Spodoptera SF9 и Sf21, или клетки/клеточные линии, полученные из Drosophila, такие как клетки Schneider и Kc;

- растением и растительной клеткой, например, табачным растением; и/или

- клеткой млекопитающих или клеточной линией, например, полученной клеткой или клеточной линией, полученной от человека, от млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, СНО-клетки, BHK-клетки (например, клетки BHK-21) и клетки человека или клеточные линии, такие как HeLa, COS (например, COS-7) и PER.C6 клетки;

так же как и все другие хозяева или клетки-хозяева, известные per se для экспрессии и продукции антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь, (одно) доменные антитела и фрагменты ScFv), которые будут ясны специалисту. Ссылки относятся к общему уровню техники, цитируемому выше, например, WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann and Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten et al., (2003), supra; Joosten et al., (2005), supra; и дополнительным ссылкам, цитируемым в данном документе.

Нанотела и полипептиды изобретения могут также вводиться и экспрессироваться в одной или более клетках, тканях или органах многоклеточного организма, например, для профилактических и/или терапевтических целей (напр., как генная терапия). Для этого, нуклеотидные последовательности изобретения могут вводиться в клетки или ткани любым пригодным путем, например, таким как (напр., при использовании липосом) или после того как они были внесены в пригодный геннотерапевтический вектор (например, полученный из ретровирусов, такого как аденовирус, или парвовирусов, такого как аденоассоциированный вирус). Как будет также ясно для специалиста, такая генная терапия может осуществляться in vivo и/или in situ в организме пациента путем введения нуклеиновой кислоты изобретения или кодирующего ее пригодного геннотерапевтического вектора пациенту или специфичным клеткам или специфичной ткани или органу пациента; или пригодные клетки (часто взятые из организма пациента для воздействия, таких как эксплантированные лимфоциты, пунктаты костного мозга или биопсии тканей) могут быть обработаны нуклеотидной последовательностью изобретения in vitro и затем пригодным образом вновь внесены в организм пациента. Все это может осуществляться при использовании геннотерапевтических векторов, способов и систем доставки, которые хорошо известны специалистам, например из Culver, K.W., "Gene Therapy", 1994, р. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y), Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995),1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998),30- 36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5580859; US 5589466; или из Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Например, экспрессия in situ фрагментов ScFv (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) и димеров (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)) описана в уровне технике.

Для экспрессии нанотел в клетке, они могут также экспрессироваться как так называемые "интратела", что, например, описывается в WO 94/02610, WO 95/22618 и USA-7004940; WO 03/014960; в Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; и в Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.

Для продукции, нанотела и полипептиды изобретения могут, например, также продуцироваться в молоке трансгенных млекопитающих, например, в молоке кроликов, коров, коз или овец (см., например, US-A-6741957, US-A-6304489 и US-A-6849992 относительно общих способов введения трансгенов млекопитающим), в растениях или частях растений, включая, но не ограничиваясь, их листья, цветки, плоды, семена, корни или клубни (например, в табаке, маисе, сое или люцерне) или в, например, куколке тутового шелкопряда Bombyx mori.

Кроме того, нанотела и полипептиды изобретения могут также экспрессироваться и/или продуцироваться в бесклеточных экспрессирующих системах, и пригодные примеры таких систем будут ясны специалисту. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры включают экспрессию в системе из проростков пшеницы; в системе лизата кроличьих ретикулоцитов; или в системе Е. coli Zubay.

Как указанно выше, одним из преимуществ использования из нанотел является то, что полипептиды, основанные на них, могут приготавливаться посредством экспрессии в пригодной бактериальной системе, и пригодные бактериальные экспрессирующие системы, векторы, клетки-хозяева, регуляторные элементы, и т.д., будут понятны специалисту, например, из ссылок, приведенных выше. Тем не менее, следует отметить, что изобретение в его широком смысле не ограничивается экспрессией в бактериальных системах.

Предпочтительно, в изобретении (in vivo или in vitro) экспрессирующая система, такая как бактериальная экспрессирующая система, применяется для обеспечения полипептидов изобретения в форме, которая пригодна для фармацевтического применения, и такие экспрессирующие системы опять же будут понятны для специалиста. Как также будет ясно специалисту, полипептиды изобретения, пригодные для фармацевтического использования, могут приготавливаться с помощью способов пептидного синтеза.

Для продукции в промышленном масштабе, предпочтительные гетерологичные хозяева для (промышленного) производства нанотел или лекарственных средств на основе нанотело-содержащего белка включают штаммы Е. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae, которые пригодны для широкой экспрессии/продукции/ферментации, и, в частности, для широкой фармацевтической экспрессии/продукции/ферментации. Пригодные примеры таких штаммов будут ясны специалисту. Такие штаммы и системы продукции/экспрессии также предоставляются компаниями, такими как Biovitrum (Uppsala, Sweden).

Альтернативно, клеточные линии млекопитающих, в частности клетки яичника китайского хомячка (СНО), могут применяться для масштабной экспрессии/продукции/ферментации, и, в частности, для масштабной фармацевтической экспрессии/продукции/ферментации. Кроме того, такие системы экспрессии/продукции также предоставляются некоторыми компаниями, указанными выше.

Выбор специфичной экспрессирующей системы будет зависеть частично от требований для определенной посттрансляционной модификации, более специфично, гликозилирования. Продукция нанотело-содержащего рекомбинантного белка, для которого гликозилирование является желаемым или требуемым, вызовет необходимость в применении экспрессирующих хозяев млекопитающих, которые имеют способность гликозилирования экспрессированного белка. При этом, специалисту будет ясно, что способ гликозилирования (т.е. вид, число и положение присоединенных остатков) будет зависеть от клетки или клеточной линии, которая используется для экспрессии. Предпочтительно, используется либо клетка или клеточная линия человека (т.е. приводя к тому, что белок по существу имеет человеческий тип гликозилирования) или клеточная линия другого млекопитающего, что может обеспечивать тип гликозилирования, который по существу и/или функционально такой же, как и гликозилирование у человека или, по меньшей мере, имитирует гликозилирование у человека. В целом, прокариотные хозяева, такие как Е.coli, не обладают способностью гликозилировать белки, и применение низших эукариот, таких как дрожжи, как правило, приводит к типу гликозилирования, который отличается от гликозилирования у человека. Тем не менее, необходимо понимать, что все вышеприведенные клетки-хозяева и экспрессирующие системы могут использоваться в изобретении, в зависимости от получаемого желаемого нанотела или белка.

Таким образом, в соответствии с одним не ограничивающим воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения является гликозилированным. В соответствии с другим не ограничивающим воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения является негликозилированным.

В соответствии с одним предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения продуцируется в бактериальной клетке, в частности, в бактериальной клетке, пригодной для широкомасштабной фармацевтической продукции, такой как клетки штаммов, указанных выше.

В соответствии с другим предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело или полипептид продуцируется в дрожжевой клетке, в частности, в дрожжевой клетке, пригодной для широкомасштабной фармацевтической продукции, такой как клетки штаммов, указанных выше.

В соответствии с еще другим предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения продуцируется в клетке млекопитающего, в частности, в клетке человека или в клетке клеточной линии человека, и в частности, в клетке человека или в клетке клеточной линии человека, которая пригодна широкомасштабной фармацевтической продукции, как, например, клеточные линии, указанные выше.

Если экспрессия в клетке-хозяине используется для продукции нанотел и белков изобретения, то нанотела и белки изобретения могут продуцироваться либо внутриклеточно (напр., в цитозоле, в периплазме или в тельцах включениях) и затем отделяться от клеток-хозяев и необязательно дополнительно очищаться; либо могут продуцироваться внеклеточно (напр., в среде, в которой клетки-хозяева культивируются) и затем отделяться от культуральной среды и необязательно дополнительно очищаться. Если используется эукариотные клетки-хозяева, то, как правило, предпочтительной является внеклеточная продукция поскольку это существенно облегчает дополнительное отделение и выделение полученных нанотел и белков. Бактериальные клетки, такие как штаммы Е.coli, указанные выше, при нормальных условиях не секретируют белки внеклеточно, за исключением нескольких классов белков, таких как токсины и гемолизин, и секреторная продукция в Е.coli относится к транслокации белков через внутреннюю мембрану в периплазматическое пространство. Периплазматическая продукция обеспечивает некоторые преимущества перед цитозольной продукцией. Например, N-концевая аминокислотная последовательность секретируемого продукта может быть идентична натуральному генному продукту после расщепления секреторной сигнальной последовательности специфичной сигнальной пептидазой. Также, по-видимому, в периплазме активность протеазы гораздо ниже, чем в цитоплазме. В дополнение, очистка белок происходит наиболее простым образом вследствие меньшего загрязнения белков в периплазме. Другим преимуществом является то, что могут образовываться правильные дисульфидные связи, поскольку периплазма обеспечивает наиболее окислительную среду, чем цитоплазма. Белки, сверхэкспрессирующиеся в Е.coli, нередко обнаруживаются в нерастворимых агрегатах, так называемых тельцах включения. Эти тельца включения могут располагаться в цитозоле или в периплазме; для извлечения биологически активных белков из этих телец включения требуется процесс денатурации/рефолдинга. Многие рекомбинантные белки, включая терапевтические белки, извлекаются из телец включения. Альтернативно, как будет ясно специалисту, могут применяться такие рекомбинантные штаммы бактерий, которые генетически модифицированы таким образом, что секретируют желаемый белок, и, в частности нанотело или полипептид изобретения.

Таким образом, в соответствии с одним не ограничивающим воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения представляет собой нанотело или полипептид, который продуцируется внутриклеточно и который выделяется из клетки-хозяина и, в частности, из бактериальной клетки или из тельца включения -в бактериальной клетке. В соответствии с другим не ограничивающим воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения представляет собой нанотело или полипептид, который продуцируется внеклеточно, который выделяется из среды, в которой клетки-хозяева культивируются.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, промоторы для использования в таких клетках-хозяевах включают:

- для экспрессии в Е.coli: lac промотор (и его производные, такие как промотор lacUV5); арабинозный промотор; слева - (PL) и справа расположенный (PR) промотор фага лямбда; промотор trp-оперона; гибридные промоторы lac/trp (tac и trc); Т7-промотор (более специфичен, чем Т7-фаг гена 10) и другие промоторы Т-фага; промотор гена устойчивости к тетрациклину Tn10; рекомбинантные варианты вышеуказанных промоторов, которые включают одну или более копий инородной регуляторной операторной последовательности;

- для экспрессии в S. cerevisiae: конститутивные: ADH1 (алкогольдегидрогеназа 1), ENO (энолаза), CYC1 (цитохром с iso-1), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа); PGK1 (фосфоглицераткиназа), PYK1 (пируваткиназа); регулируемые: GAL1,10,7 (ферменты метаболизма галактозы), ADH2 (алкогольдегидрогеназа 2), РН05 (кислая фосфотаза), CUP1 (медный металлотионеин); гетерологичные: CaMV (35S промотор вирус мозаики цветной капусты);

- для экспрессии в Pichia pastoris: AOX1 промотор (алкогольоксидаза I);

- для экспрессии в клетках млекопитающих: немедленный ранний энхансер/промотор человеческого цитомегаловируса (hCMV); вариант немедленного раннего промотора человеческого цитомегаловируса (hCMV), который содержит две тетрациклиновые операторные последовательности, такой, что промотор может регулироваться репрессором Tet; промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (ТК); энхансер/промотор длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (RSV LTR); промотор фактора элонгации трансляции 1α (hEF-1 VH) из человека, шимпанзе, мыши или крысы; SV40 ранний промотор; промотор длинного концевого повтора HIV-1; промотор β-актина.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, векторы для применения с этими клетками-хозяевами включают:

- векторы экспрессии в клетках млекопитающих: pMAMneo (Clontech), рсДНК3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и 1ZD35 (ATCC 37565), так же как и экспрессирующие системы на основе вирусов, такие как те, которые основаны на аденовирусе;

- векторы экспрессии в бактериальных клетках: рЕТ векторы (Novagen) и pQE векторы (Qiagen);

- векторы экспрессии в дрожжах и других грибковых клетках: pYES2 (Invitrogen) и векторы экспрессии Pichia (Invitrogen);

- векторы экспрессии в клетках насекомых: pBlueBacII (Invitrogen) и другие бакуловирусные векторы;

- векторы экспрессии в растениях или растительных клетках: например, векторы, основанные на вирусе мозаики цветной капусты или вирусе табачной мозаики, пригодные штаммы Agrobacterium, или векторы на основании Ti-плазмид.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, секреторные последовательности для применения с этими клетками-хозяевами включают:

- для применения в бактериальных клетках, таких как Е. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, и подобные; TAT сигнальный пептид, С-концевой секреторный сигнал гемолизина;

- для применения в дрожжах: препропоследовательность фактора а-скрещивания, фосфатаза (phol), инвертаза (Sue), и т.д.;

- для применения в клетках млекопитающих: местный сигнал в случае, когда целевой белок имеет эукариотическое происхождение; сигнальный пептид κ-цепи V-J2-C мышиного Ig и т.д.

Пригодные способы трансформирования хозяина или клетки-хозяина изобретения будут ясны специалисту и могут зависеть от предполагаемой клетки-хозяина /организма-хозяина и используемой генетической конструкции. Ссылки снова приводятся на справочники и патентные заявки, указанные выше.

После трансформации, может выполняться стадия обнаружения и выбора тех клеток-хозяев или организмов-хозяев, которые успешно трансформировались с нуклеотидной последовательностью/генетической конструкцией изобретения. Такой стадией выбора может быть, например, стадия, основанная на селективном маркере, присутствующем в генетической конструкции изобретения, или стадия, включающая обнаружение аминокислотной последовательности изобретения, напр., при использовании специфичных антител.

Трансформированная клетка-хозяин (которая может находиться в форме стабильной клеточной линии) или организм-хозяин (который может находиться в форме стабильной мутантной линии или штамма) образуют дополнительные аспекты настоящего изобретения.

Предпочтительно, эти клетки-хозяева или организмы-хозяева таковы, что они экспрессируют или (по меньшей мере) способны экспрессировать (напр., при пригодных условиях) аминокислотную последовательность изобретения (и в случае организма-хозяина: в, по меньшей мере, одной клетке, части, ткани или органе его). Изобретение также включает дополнительные генерации, потомство и/или продукты клетки-хозяина или организма-хозяина изобретения, которые могут, например, быть получены путем клеточного деления или путем полового или бесполого размножения.

Для продуцирования/получения экспрессии аминокислотных последовательностей изобретения, трансформированная клетка-хозяин или трансформированный организм-хозяин может, как правило, храниться, поддерживаться и/или культивироваться при таких условиях, что (желаемая) аминокислотная последовательность изобретения экспрессируется/продуцируется. Пригодные условия будут ясны специалисту и будут, как правило, зависеть от применяемой клетки-хозяина /организма-хозяина, так же как и от регуляторных элементов, которые контролируют экспрессию (релевантной) нуклеотидной последовательности изобретения. Снова ссылки даны на справочники и патентные заявки, указанные выше в абзацах, касающихся генетических конструкций изобретения.

Как правило, пригодные условия могут включать применение пригодной среды, наличия пригодного источника питания и/или пригодных питательных веществ, применение пригодной температуры, и необязательно наличие пригодного индуцирующего фактора или соединения (напр., если нуклеотидные последовательности изобретения находятся под контролем индуцируемого промотора); все из которых могут выбираться специалистом. Снова, при таких условиях, аминокислотные последовательности изобретения могут быть экспрессированы конститутивным способом, транзиторным способом, или только если пригодным образом индуцированы.

Также для специалиста будет ясно, что аминокислотная последовательность изобретения может (сначала) образовываться в незрелой форме (как указанно выше), которая может затем подвергаться посттрансляционной модификации, в зависимости от клетки-хозяина/организма-хозяина, которые используются. Также аминокислотная последовательность изобретения может быть гликозилированной, опять-таки в зависимости от клетки-хозяина/организма-хозяина, которые используются.

Аминокислотная последовательность изобретения может затем отделяться от клетки-хозяина/организма-хозяина и/или от среды, в которой указанная клетка-хозяин или организм-хозяин культивировались, с помощью способов выделения белков и/или очистки, известных per se, а также способов (препаративной) хроматографии и/или электрофореза, способов дифференциальной преципитации, аффинных способов (напр., при использовании специфичной, расщепляемой аминокислотной последовательности, слитой с аминокислотной последовательностью изобретения) и/или препаративных иммунологических способов (т.е. при использовании антител против аминокислотной последовательности, которая выделяется).

В целом, для фармацевтического применения, полипептиды изобретения могут составляться как фармацевтический препарат, содержащий, по меньшей мере, один полипептид изобретения и, по меньшей мере, один фармацевтически пригодный носитель, разбавитель или наполнитель и/или адъювант, и необязательно один или более дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Через неограничивающие примеры, такие составы могут находиться в форме, пригодной для перорального применения, для парентерального применения (такого как внутривенное, внутримышечное или подкожное введение или внутривенная инфузия), для топического применения, для применения путем ингаляций, посредством трансдермального пластыря, посредством имплантата, посредством суппозитория и т.д. Такие пригодные формы для применения - которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими, зависят от способа применения – так же как и от способов и носителей, использующихся в их приготовлении, будут ясны специалисту, и дополнительно описываются ниже.

В общем, нанотела и полипептиды изобретения могут быть составлены и применены любым пригодным способом, известным per se, для которых ссылки даются на общий уровень техники, цитируемый выше (и, в частности, на WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865 и WO 04/041867), так же как и на стандартные справочники, такие как Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990) или Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005).

Например, нанотела и полипептиды изобретения могут быть составлены и применены любым способом, известным per se, для традиционных антител фрагментов антител (включая ScFv и димеры) и других фармацевтически активных белков. Такие составы и способы для приготовления будут ясны специалисту, и, например, включают приготовления пригодных для парентерального применения (например, внутривенного, внутриперитонеального, подкожного, внутримышечного, внутрипросветного, внутриартериального или интратекального введения) или для топического (т.е. трансдермального или интрадермального) применения.

Препараты для парентерального применения могут, например, быть стерильными растворами, суспензиями, дисперсиями или эмульсиями, которые пригодны для инфузии и инъекции. Пригодные носители или разбавители таких препаратов, например, включают, без ограничения, стерилизованную воду и водные буферы и растворы, такие как физиологический раствор с фосфатным буфером, растворы Рингера, раствор декстрозы, и растворы Хэнкса; водные масла; глицерин; этанол; гликоли, такие как пропиленгликоль, или такие как минеральные масла, животные масла и растительные масла, например ореховое масло, соевое масло, так же как и пригодные их смеси. Как правило, водные растворы и суспензии будут предпочтительными.

Нанотела и полипептиды изобретения могут также применяться при использовании геннотерапевтических способов доставки. См., напр., Патент США №5,399,346, который включается посредством отсылки полностью. При использовании геннотерапевтических способов доставки, первичные клетки, трансфицированные геном, кодирующим нанотело или полипептид изобретения могут дополнительно быть трансфицированы тканью специфичных промоторов для нацеливания на специфичные органы, ткани, трансплантаты, опухоли или клетки и могут дополнительно быть трансфицированы сигнальной и стабилизационной последовательностями для субклеточно локализованной экспрессии.

Таким образом, нанотела и полипептиды изобретения могут быть систематически вводиться, напр., перорально, в комбинации с фармацевтически пригодным носителем, таким как инертный разбавитель, или усваиваемым пищевым носителем. Они могут быть заключены в твердые или мягкие желатиновые капсулы, могут быть спрессованы в таблетки, или могут быть включены непосредственно в пищу диеты пациента. Для перорального терапевтического применения, нанотела и полипептиды изобретения могут комбинироваться с одним или более наполнителями и использоваться в форме принимаемых внутрь таблеток, буккальных таблеток, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и подобных. Такие композиции и препараты должны содержать, по меньшей мере, 0,1% нанотела или полипептида изобретения. Процентное содержание композиций и препаратов может, конечно, варьировать и может обычно составлять между от около 2 до около 60% массы данной стандартной лекарственной формы. Количество нанотела или полипептида изобретения в таких терапевтически пригодных композициях таково, чтобы получался эффективный уровень лекарственного средства.

Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и подобные могут также содержать следующее: связующие вещества, такие как трагакант, акация, маисовый крахмал или желатин; наполнители, такие как дикальция фосфат; дезинтегрирующие агенты, такие как маисовый крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и подобные; смягчители, такие как стеарат магния; и подсластители, такие как сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам или ароматизаторы, такие как мятное масло, гаультериевое масло или черешневый ароматизатор могут добавляться. Если стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, то она может содержать, дополнительно к материалам вышеуказанного типа, носитель, а также растительное масло или этиленгликоль. Различные другие материалы могут присутствовать как покрытия или же модифицирующие физические формы твердые лекарственные формы. Например, таблетки, пилюли, или капсулы могут быть покрыты желатином, воском, шеллаком или сахаром и подобными. Сироп или эликсир может содержать нанотела и полипептиды изобретения, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителей, метил и пропилпарабен как стабилизаторы, красители и вкусовые добавки, такие как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Конечно, любой материал, используемый при приготовлении любой стандартной лекарственной формы должен быть фармацевтически пригодным и по существу нетоксичным в использующихся количествах. В дополнение, нанотела и полипептиды изобретения могут включаться в препараты и устройства с замедленным высвобождением.

Лекарственные средства и составы для перорального применения могут также быть обеспечены с энтеросолюбильном покрытием таблетки, что будет позволять конструкциям изобретения быть представленными в желудочной среде и проходить в кишечник. Кроме того, лекарственные средства и составы для перорального применения могут быть составлены пригодным образом для доставки в любую желаемую часть желудочно-кишечного тракта. В дополнение, пригодные суппозитории могут использоваться для доставки в желудочно-кишечного тракт.

Нанотела и полипептиды изобретения могут также вводиться внутривенно или внутриперитонеально с помощью инфузии или инъекции. Растворы нанотел и полипептидов изобретения или их соли могут быть приготовлены в воде, смешанной с нетоксичным сурфактантом. Дисперсии могут также быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетилглицерине и их смесях и маслах. При нормальных условиях хранения и применения, эти лекарственные средства содержат стабилизаторы для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические лекарственные формы, пригодные для инъекции или инфузии, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки, содержащие активный ингредиент, который адаптирован для приготовленных для немедленного приема лекарственного средства стерильных инъецируемых или инфузируемых растворов или дисперсий, необязательно включенных в липосомы. Во всех случаях, итоговая лекарственная форма должна быть стерильной, текучей и стабильной в условиях производства и хранения. Жидкий носитель или наполнитель может быть растворителем или жидкой дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли, и подобные), растительные масла, нетоксические эфиры глицерина и пригодный их смеси. Должная текучесть может поддерживаться, например, с помощью состава липосом, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий или посредством применения сурфактантов. Профилактика действия микроорганизмов могут осуществляться с помощью антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлоробутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала, и подобных. Во многих случаях, предпочтительным будет включать изотонические агенты, например сахара, буферы или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций достигаться путем применения композиций агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные инъецируемые растворы приготавливают путем смешивания нанотел и полипептидов изобретения в требуемом количестве в подходящем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительные способы приготовления включают способы вакуумной сушки и лиофильной сушки, с помощью которых образуется порошок, содержащий активный ингредиент вместе с любым дополнительным желательным ингредиентом, имеющимся в предварительно стерилизованных растворах.

Для местного применения, нанотела и полипептиды изобретения могут применяться в очищенном виде, т.е. если они являются жидкими. Однако будет в целом желаемым наносить их на кожу как композиции или составы в сочетании с дерматологически пригодным носителем, который может быть в твердой или жидкой форме.

Пригодные твердые носители включают конечно разбавленные твердые формы, такие как тальк, глина, микрокристаллическая целлюлоза, кремний, алюминий и подобные. Пригодные жидкие носители включают воду, гидроксиалкилы или гликоли или водно-спиртовые/гликолевые смеси, в которых нанотела и полипептиды изобретения могут растворяться или диспергироваться в эффективных уровнях, необязательно с помощью нетоксических сурфактантов. Адъюванты, такие как ароматизаторы, и дополнительные антимикробные агенты могут быть добавлены для оптимизации свойств для данного использования. Полученные жидкие композиции могут наноситься из гигроскопических прокладок, могут использоваться для импрегнации бандажей и других перевязочных материалов, или могут распыляться на пораженные области при использовании распылителей помпового и аэрозольного типа.

Сгустители, такие как синтетические полимеры, жирные кислоты, соли жирных кислот и эфиры, жирные спирты, модифицированные целлюлозы или модифицированные минеральные материалы могут также использоваться с жидкими носителями для образования легко намазывающихся паст, гелей, мазей, мыла и тому подобного, для нанесения непосредственно на кожу пользователя.

Примеры пригодных дерматологических композиций, которые могут использоваться для доставки нанотел и полипептидов изобретения к коже известны из уровня техники, например, см.: Jacquet et al. (U.S. Pat. No. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. No. 4,559,157) и Wortzman (U.S. Pat. No. 4,820,508).

Используемые дозировки нанотел и полипептидов изобретения могут определяться путем сравнения их действия in vitro и in vivo на моделях животных. Способы экстраполяции эффективных доз мышам, и другим животным, человеку, известны из уровня техники, например, см. патент США №. 4,938,949.

В целом, концентрация нанотел и полипептидов изобретения в жидкой композиции, такой как лосьон, будет составлять от около 0,1 до 25 процентов по массе, предпочтительно от около 0,5 до 10 процентов по массе. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, будет составлять от около 0,1 до 5 процентов по массе, предпочтительно от около 0,5 до 2,5 процентов по массе.

Количество нанотел и полипептидов изобретения, требуемых для применения в лечении, будет изменяться не только в зависимости от определенного нанотела или полипептида, выбранного, но также и от способа применения, природы состояния, которое лечится, и возраста и состояния пациента и будет в итоге составлять по назначению лечащего врача или клинициста. Также дозировка нанотел и полипептидов изобретения изменяется в зависимости от клетки-мишени, опухоли, ткани, трансплантата или органа.

Желаемая доза может удобным образом быть представлена в одноразовой дозе или раздельных дозах, применяемых в подходящих интервалах, например, по две, три, четыре или более субдоз в день. Сами субдозы могут быть дополнительно разделены, напр., по количеству назначенный применений; таких как многократные ингаляции из инсуффлятора или при применении множества капель в глаза.

Режим применения может включать длительное, каждодневное лечение. Под "длительным" понимается, по меньшей мере, длительность в две недели и предпочтительно, в несколько недель, месяцев или лет. Необходимые модификации в этом дозовом интервале могут определяться специалистом в данной области при использовании только рутинных экспериментов, при обучении. См.: Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Дозировка может также регулироваться лечащим врачом для избегания любых осложнений.

В другом аспекте, изобретение относится к способу профилактики и/или лечения, по меньшей мере, одного TNF-связанного заболевания или состояния, которые указаны здесь, при этом указанный способ содержит введение нуждающемуся пациенту фармацевтическую активного количества нанотела изобретения, полипептида изобретения, и/или фармацевтической композиции их содержащей.

В контексте настоящего изобретения, термин "профилактики и/или лечения" не только содержит предупреждение и/или лечение заболевания, но также в общем включает предотвращение начала заболевания, замедления или изменения развития заболевания, предотвращение или замедление начала одного или более симптомов, связанных с заболеванием, снижение и/или ослабление одного или более симптомов, связанных с заболеванием, снижение тяжести и/или длительности заболевания и/или любых симптомов, связанных с ним, и/или предотвращение дополнительного повышения тяжести заболевания и/или любых симптомов, связанных с ним, предотвращение, снижение или изменение любого физиологического поражения, вызванного заболеванием, и в общем любого фармакологического действия, которое полезно для лечащегося пациента.

Объектом лечения может быть любое теплокровное животное, а именно млекопитающее, и, в частности, человек. Как будет ясно специалисту, объектом лечения будет, в частности, персона, страдающая от или подвергнутая риску заболеваний и нарушений, здесь указанных.

Изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания или нарушения, которое может быть предотвращено и/или излечено путем введения нанотела или полипептида изобретения пациенту, указанный способ содержит введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически активного количества нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или фармацевтической композиции, их содержащей.

А именно, изобретение относится к способу профилактики и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из заболеваний и нарушений, здесь перечисленных, указанный способ содержит введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически активного количества нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или фармацевтической композиции, их содержащей.

В другом воплощении, изобретение относится к способу иммунотерапии, и, в частности пассивной иммунотерапии, при этом способ содержит введение субъекту, страдающего от или подвергнутого риску развития заболеваний и нарушений, указанных здесь, фармацевтически активного количества нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или фармацевтической композиции, их содержащей.

В вышеуказанных способах, нанотела и/или полипептиды изобретения и/или содержащие их композиции могут применяться пригодным способом, в зависимости от специфического фармацевтического состава или композиции, которые используются. Таким образом, нанотела и/или полипептиды изобретения и/или содержащие их композиции могут, например, применяться перорально, внутриперитонеально (напр., внутривенно, подкожно, внутримышечно, или посредством любого другого пути введения, который избегает попадание в желудочно-кишечный тракт), трансназально, трансдермально, местно, посредством суппозитории, ингаляции, опять таки в зависимости от специфического фармацевтического состава или композиции, которые используются. Клиницист сможет выбрать пригодный путь введения и пригодный фармацевтический состав или композицию для использования в таких введениях, в зависимости от заболевания или нарушения, которое предотвращается или лечится, других факторов, известных клиницисту.

Нанотела и/или полипептиды изобретения и/или содержащие их композиции применяются в соответствии с режимом лечения, который является пригодным для предотвращения и/или лечения или нарушения, которое предотвращается или лечится. Клиницист в целом сможет определить пригодный режим лечения, в зависимости от факторов, таких как заболевание или нарушение, которое предотвращается или лечится, от тяжести заболевания, которое лечится, и/или от тяжести его симптомов, специфичности используемого нанотела или полипептида, специфичного путем введения и фармацевтического состава или композиции, которые используются, возраста, пола, веса, диеты, общего состояния пациента, и подобных факторов, известных клиницисту.

В общем, режим лечения будет содержать введение одного или более нанотел и/или полипептидов изобретения, или одной или более композиций, их содержащей, в одном или более фармацевтически эффективных количествах или дозах. Специфическое(ие) количество(а) или дозы для применения могут определяться клиницистом, опять таки с учетом факторов, перечисленных выше.

В целом, для профилактики и/или лечения заболеваний и нарушений, указанных выше и зависящих от специфического заболевания или нарушения, которое лечится, активности специфичного нанотела и полипептида изобретения, которые используются, специфичного пути введения и специфичного фармацевтического состава или композиции, использующихся, нанотела и полипептиды изобретения будут в общем применяться в количестве между 1 граммом и 0,01 микрограммом на кг массы тела в день, предпочтительно между 0,1 граммом и 0,1 микрограммом на кг массы тела в день, а также около 1, 10,100 или 1000 микрограммов на кг массы тела в день, либо непрерывно (напр., путем инфузии), в качестве суточной дозы, либо как многократно разделенная доза в течение дня. Клиницист в целом может определить пригодную дневную дозу, в зависимости от факторов, указанных выше. Также будет понятно, что в специфических случаях клиницист сможет выбрать отклонения от этих количеств, например, с учетом факторов, указанных выше, и его экспертной оценки. Обычно некоторые руководства по количеству применения могут быть получены из количеств, которые, как правило, применяются по сравнению с традиционными антителами или фрагментами антител против той же мишени, применяемые посредством по существу тех же путей введения, учитывая различия в сродстве/авидности, эффективности, биораспределении, времени полужизни и подобных факторов, известных специалисту.

Как правило, в вышеуказанном способе, используется одно нанотело или полипептид изобретения. Однако в объем изобретения включается использование двух или более нанотел и/или полипептидов изобретения в комбинации.

Нанотела и полипептиды изобретения могут также использоваться в комбинации с одним или более дополнительными фармацевтически активными соединениями или элементами, т.е. как комбинированный режим лечения, который может или не может привести к синергетическому эффекту. Также клиницист сможет выбрать такие дополнительные соединения и элементы, так же как и пригодный комбинированный режим лечения, на основании факторов, указанных выше и его экспертной оценки.

В частности, нанотела и полипептиды изобретения могут использоваться в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями или элементами, которые являются или могут быть использованы для профилактики и/или лечения заболеваний и нарушений, указанных здесь, в результате чего может быть или не может быть получен синергетический эффект. Примеры таких соединений и активных начал, а также пути, способы и фармацевтические составы или композиции для их применения будут ясны специалисту.

Если две или более активных веществ или начал используют как часть комбинированного режима лечения, то они могут применяться посредством тех же путей введения или посредством других путей введения, по существу в одно время или в различные периоды (напр., по существу одновременно, последовательно, или в соответствии с альтернативным режимом). Если субстанции или элементы применяются одновременно посредством аналогичного пути введения, они могут применяться как различные фармацевтические составы или композиции или как часть комбинированной фармацевтического состава или композиции, как будет ясно специалисту.

Также когда два или более активные вещества или начала используют как часть комбинированного режима лечения, то каждое из веществ или начал может вводиться в одинаковом количестве и в соответствии с одинаковым режимом, который используется, если вещество или начало используется само по себе, и такое комбинированное использование может или не может привести к синергетическому эффекту. Тем не менее, если комбинированное использование двух или более активных веществ или начал приведет к синергетическому эффекту, то также является возможным снизить количество одного, более чем одного или всех веществ или начал, которые вводятся, все еще достигая желаемое терапевтическое действие. Это может, например, быть полезным для избегания, ограничения или снижения нежелательных побочных эффектов, которые ассоциированы с применением одного или более веществ или начал, когда они используются в их обычных количествах, все еще достигая желаемый фармацевтический или терапевтический эффект.

Эффективность используемого режима лечения в соответствии с изобретением может определяться и/или отслеживаться любым образом, известным per se, для включенного заболевания или нарушения, что будет ясно для клинициста. Клиницист также сможет, когда это целесообразно или с учетом каждого отдельного случая, изменять или модифицировать конкретный режим лечения, для достижения желаемого терапевтического эффекта, для избегания, ограничения или снижения нежелательных побочных эффектов, и/или для достижения необходимого баланса между достижением желаемого терапевтического эффекта, с одной стороны, и избегания, ограничения или снижения нежелательных побочных эффектов, с другой стороны.

В целом, режим лечения будет отслеживаться до достижения желаемого терапевтического эффекта и/или столько времени, сколько должен поддерживаться желаемый терапевтический эффект. Снова, это может быть определено клиницистом.

Таким образом, в дополнительном аспекте, изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит, по меньшей мере, одно нанотело изобретения или, по меньшей мере, один полипептид изобретения и, по меньшей мере, один пригодный носитель (т.е. носитель, пригодный для применения в ветеринарии), и необязательно одну или более дополнительные активные субстанции.

Изобретение также относится к применению нанотела изобретения и/или полипептида изобретения в приготовлении фармацевтической композиции, в частности, в приготовлении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения (включая, но не ограничивая, облегчение, по меньшей мере, одного симптома) заболевания или нарушения, опосредованного TNF-альфа и/или связанного с TNF-альфа (например, связанного с патологической активностью TNF-альфа, патологическими уровнями TNF-альфа, патологической экспрессии TNF-альфа и/или патологической чувствительностью или реакцией к TNF-альфа), или одного из биологических феноменов, связанных с TNF-альфа), как, например, заболеваний или нарушений, указанных выше.

Изобретение также относится к способу предупреждения и/или лечения (включая, но не ограничиваясь, облегчение, по меньшей мере, одного симптома) заболевания или нарушения, опосредованного TNF-альфа и/или связанного с TNF-альфа (например, связанного с патологической активностью TNF-альфа, патологическими уровнями TNF-альфа, патологической экспрессии TNF-альфа и/или патологической чувствительностью или реакцией к TNF-альфа, или одного из биологических феноменов, связанных с TNF-альфа), как, например, заболеваний или нарушений, указанных выше, при этом способ включает введение нуждающемуся субъекту терапевтически активное количество нанотела изобретения, полипептида изобретения, и/или фармацевтической композиции, как описывается выше.

Настоящее изобретение обеспечивает полипептиды, содержащие одно или более нанотел, направленных к фактору некроза опухоли альфа (TNF-альфа). Настоящее изобретение дополнительно относится к их применению для диагностики и терапии. Такие антитела могут содержать каркасную последовательность с высокой гомологией с человеческими каркасными последовательностями. Описываются композиции, содержащие антитела к фактору некроза опухоли альфа (TNF-альфа) самостоятельно или в комбинации с другими лекарствами.

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), как предполагается, играет важную роль в развитии различных нарушений, например, в воспалительных нарушениях, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и множественный склероз. И TNF-альфа и рецепторы (CD120a, CD120b) изучались подробнейшим образом. TNF-альфа в его биоактивной форме представляет собой тример и углубление, сформированное соседними субъединицами, является важным для цитокин-рецепторного взаимодействия. Некоторые стратегии для антагонизма действию цитокина были разработаны и на сегодняшний день используются для лечения различных болезненных состояний.

Ингибитор TNF-альфа, который обладает значимой специфичностью и селективностью к TNF-альфа, может быть эффективным профилактическим или терапевтическим фармацевтическим соединением для предупреждения или лечения нарушений, в которых TNF-альфа подразумевается как этиологический фактор. Способы лечения токсического шока (ЕР 486526), регресса опухоли, ингибирования цитотоксичности (US 6448380, US 6451983, US 6498237), аутоиммунных заболеваний, таких RA и болезнь Крона (ЕР 663836, US 5672347, US 5656272), реакции "трансплантат против хозяина" (US 5672347), бактериального менингита (ЕР 585705) с помощью антител к TNF-альфа являются желаемыми.

На сегодняшний день не существуют лекарства, полностью эффективные для лечения аутоиммунных заболеваний, и большинство из них имеют ограничения из-за высокой токсичности. В дополнение, это очень сложный и длительный процесс разработки новой химической единицы (NCE) с достаточной способностью и селективностью к такой последовательности-мишени. Лекарственные средства, основанные на антителах, с другой стороны, обладают достаточным потенциалом как лекарства, поскольку они имеют сильную специфичность к своей цели и низкую природную токсичность. В дополнение, время развития может быть снижено значительно, если сравнивать с развитием новых химических единиц (NCE). Однако традиционные антитела с трудом получаются против мультимерных белков, где рецептор-связывающий домен лиганда заключен в бороздку, как имеет место в случае с TNF-альфа. Известно, что антитела, состоящие из тяжелых цепей, описываемые в изобретении, которые поучены из Camelidae, имеют полость-связывающее предрасположенность (WO 97/49805; Lauwereys et al., EMBO J. 17, 5312, 1998)). Следовательно, такие антитела по самой своей природе пригодны для связывания с рецептор-связывающим доменом таких лигандов, как TNF. В дополнение, известно, что такие антитела стабильны в течение долгого периода времени, следовательно, имеют увеличенный срок годности (Perez et al., Biochemistry, 40, 74, 2001). Кроме того, фрагменты таких антител из тяжелых цепей могут продуцироваться в ферментере массово при использовании дешевых экспрессирующих систем по сравнению с ферментацией культур клеток млекопитающих, а также дрожжей или других микроорганизмов (ЕР 0698097).

Применение антител, полученных из источников, таких как мыши, овцы, козы, кролики и т.д., и гуманизированных их производных для лечения состояний, которые требуют модуляции воспаления, является проблематичным по нескольким причинам. Традиционные антитела не стабильны при комнатной температуре, и должны подвергаться охлаждению при приготовлении и хранении, при этом требуется обязательно охлаждающее лабораторное оборудование, хранение и транспорт, что увеличивает затраты времени и средств. Охлаждение иногда невозможно в развивающихся странах. Кроме того, производство или мелкосерийная продукция указанных антител представляет собой дорогой процесс, поскольку клеточные системы млекопитающих, необходимые для экспрессии интактных и активных антител требуют высокие уровни поддержки относительно времени и устройств, а выходы очень низкие. Кроме того, крупный размер традиционных антител будет ограничивать проникновение в ткани, например, на участке воспаленной ткани. Кроме того, традиционные антитела имеют "связывающую активность, которая зависит от pH, и следовательно, являются непригодными для применения в средах, отличающихся по физиологическому уровню pH, таких как, например, для лечения желудочных кровотечений, в желудочной хирургии. Кроме того, традиционные антитела нестабильны при низких и высоких pH и, следовательно, не пригодны для перорального применения. Однако было продемонстрировано, что антитела Camelidae выдерживают суровые условия, такие как экстремальный pH, денатурирующие агенты и высокие температуры (Dumoulin et al, Protein Science 11, 500, 2002), что делает их пригодными для перорального применения. Кроме того, традиционные антитела имеют связывающую способность, которая зависит от температуры, и, следовательно, они непригодны для применения в анализах и наборах, выполняемых при температурах, выходящих за пределы биологически активных температур (напр., 37±20°C).

Полипептидные средства и, в частности, лекарственные средства, основанные на антителах, имеют значительный потенциал как лекарственные средства, поскольку они обладают специфичностью к своей мишени и низкой токсичностью. Однако для специалиста известно, что антитело, которое получено для терапевтического применения, требует дополнительной модификации для приготовления его для лечения человека, для избегания нежелательной иммунологической реакции у человека после его применения. Процесс модификации общепринято называть "гуманизацией". Известно для специалиста, что антитела, полученные в видах, отличных от человека, требуют гуманизации для их терапевтического использования для человека ((1) CDR grafting: Protein Design Labs: US 6180370, US 5693761; Genentech US 6054297; Celltech: 460167, EP 626390, US 5859205; (2) Veneering: Xoma: US 5869619, US 5766886, US 5821123). Существует потребность в способах выработки антител, которые избегают необходимости существенной гуманизации или которые совершенно не требуют проведения гуманизации. Существует потребность в новом классе антител, которые имеют определенные каркасные области или аминокислотные остатки и которые могут применяться для человека без необходимости в проведении существенной гуманизации, или вообще без необходимости гуманизации.

Другой значимый недостаток традиционных антител заключается в том, что они являются сложными большими молекулами и, следовательно, относительно нестабильны, и они чувствительны к расщеплению протеазами. Это означает, что традиционные лекарственные средства на основе таких антител могут применяться перорально, сублингвально, местно, назально, вагинально, ректально или путем ингаляций, поскольку они не устойчивы к низким pH в этих сайтах, действию протеаз в этих сайтах и в крови и/или из-за их большого размера. Их нужно применять инъекционно (внутривенно, подкожно и т.д.) для преодоления некоторых этих проблем. Введение посредством инъекции требует специального обучения для использования шприца для подкожных инъекций или иголки корректно и безопасно. Это дополнительно требует стерильности оборудования, жидкого состава терапевтического полипептида. Кроме того, субъекты обычно испытывают физический или психологический стресс до и после получения инъекции. Следовательно, существует потребность в способе доставки терапевтического полипептида, который бы помог избежать потребность в инъекции, что не только является экономичным в отношении времени и стоимости, но и который будет более удобен и комфортен для субъекта.

Одно воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа нанотела, при этом нанотела представляет собой предпочтительно, как дополнительно определено выше.

Одно воплощение настоящего изобретения представляет анти-NF-альфа полипептид, содержащий, по меньшей мере, одно анти-TNF-альфа нанотело, где полипептид представляет собой предпочтительно, как дополнительно определено выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, дополнительно содержащий, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного белка.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, в котором указанный сывороточный белок представляет собой любой из сывороточного альбумина, сывороточных иммуноглобулинов, тироксин-связывающий белок, трансферрин, или фибриноген.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, дополнительно содержащий, по меньшей мере, одно нанотело, выбранное из группы, состоящей из анти-IFN-гамма нанотела, нанотело против рецептора TNF-альфа, нанотело против рецептора IFN-гамма.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, где число нанотел, направленных против TNF-альфа составляет, по меньшей мере, два.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, где, по меньшей мере, одно нанотело представляет собой гуманизированные VHH Camelidae.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой композицию, содержащую анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше и, по меньшей мере, одно нанотело из группы, состоящей из анти-IFN-гамма нанотела, нанотело против рецептора TNF-альфа и нанотело против рецептора IFN-гамма, для одновременного, раздельного или последовательного применения субъекту.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, где указанное нанотел представляет собой гомологичную последовательность, функциональную часть, или функциональную часть гомологичной последовательности полноразмерного нанотела.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, где указанное нанотел представляет собой гомологичную последовательность, функциональную часть, или функциональную часть гомологичной последовательности полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию как описывается выше где, по меньшей мере, одно нанотело представляет собой VHH Camelidae.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет способ идентификации агента, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с фактором некроза опухоли-альфа, включающий стадии:

(а) взаимодействие анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с мишенью, которая представляет собой фактором некроза опухоли-альфа, в присутствии или отсутствии кандидата-модулятора при условиях, допускающих связывание между указанным полипептидом и мишенью, и

(b) измерение связывания между полипептидом и мишенью по стадии (а), где уменьшение в связывании в присутствии указанного кандидата-модулятора, относительно связывании в отсутствии указанного кандидата-модулятора, идентифицирует указанный кандидат-модулятор как агента, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше и фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ идентификации агента, который модулирует заболевания, опосредованные фактором некроза опухоли-альфа, через связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с фактором некроза опухоли-альфа, включающий:

(a) взаимодействие анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с мишенью, которая представляет собой фактор некроза опухоли-альфа, в присутствии или отсутствии кандидата-модулятора при условиях, допускающих связывание между указанным полипептидом и мишенью, и

(b) измерение связывания между полипептидом и мишенью по стадии (а), где уменьшение в связывании в присутствии указанного кандидата-модулятора, относительно связывании в отсутствии указанного кандидата-модулятора, идентифицирует указанный кандидат-модулятор как агент, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, и фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ идентификации агента, который модулирует связывание фактора некроза опухоли-альфа с его рецептором через связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с фактора некроза опухоли-альфа, включающий:

взаимодействие анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с мишенью, которая представляет собой фактор некроза опухоли-альфа, в присутствии или отсутствии кандидата-модулятора при условиях, допускающих связывание между указанным полипептидом и мишенью, и

(b) измерение связывания между полипептидом и мишенью по стадии (а), где уменьшение в связывании в присутствии указанного кандидата-модулятора, относительно связывании в отсутствии указанного кандидата-модулятора, идентифицирует указанный кандидат-модулятор как агент, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, и фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет набор для скрининга агентов, которые модулируют нарушения, опосредованные фактором некроза опухоли-альфа, содержащий анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, и фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет неизвестный агент, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с фактором некроза опухоли-альфа, идентифицируемый в соответствии со способом, который описан выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет неизвестный агент, который модулирует нарушения, опосредованные фактором некроза опухоли-альфа, идентифицируемый в соответствии со способом, который описан выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет неизвестный агент, как описывается выше, где указанными нарушениями являются одно или более из воспаления, ревматоидного артрита, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника и множественного склероза.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или нуклеиновую кислоту, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, или агент, как описывается выше для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, связанных с воспалительными процессами.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или нуклеиновой кислоты, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, или агента, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения, и/или предупреждения, и/или облегчения нарушений, связанных с воспалительными реакциями.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен проходить через желудочную среду без инактивации субстанции.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен проходить через желудочную среду без инактивации субстанции.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в вагинальный и/или ректальный тракт.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в вагинальный и/или ректальный тракт.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в нос, верхние дыхательные пути и/или легкие.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в нос, верхние дыхательные пути и/или легкие.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в слизистую оболочку кишки, где указанные нарушения повышают проницаемость слизистой оболочки кишечника.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в слизистую оболочку кишки, где указанные нарушения повышают проницаемость слизистой оболочки кишечника.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проходит через ткани, расположенные ниже языка.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проходит через ткани, расположенные ниже языка.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проникать через кожу.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проникать через кожу.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ, как описывается выше, набор, как описывается выше, нуклеиновую кислоту или агент, как описывается выше, применение нуклеиновой кислоты или агента, как описывается выше, композицию, как описывается выше, применение композиции, как описывается выше, анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, где указанными нарушениями являются любые из воспаления, ревматоидного артрита, ХОБЛ, астмы, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника, множественного склероза, болезни Аддисона, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного паротита, диабета I типа, эпидидимита, гломерулонефрита, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, тиреоидита Хашимото, гемолитической анемии, системной красной волчанки, мужского бесплодия, множественного склероза, злокачественной миастении, пузырчатки, псориаза, ревматического полиартрита, ревматоидного артрита, саркоидоза, склеродермии, синдрома Шегрена, спондилоартропатии, тиреоидита и васкулита.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет композицию, содержащую нуклеиновую кислоту или агент, как описывается выше, анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, и пригодный фармацевтический носитель.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ диагностики нарушения, характеризующегося дисфункцией фактора некроза опухоли-альфа, содержащий:

(a) контактирование образца с анти-TNF-альфа полипептидом, как описывается выше,

(b) обнаружение связывания указанного полипептида с указанным образцом, и

(c) сравнение связывания, детектируемого в стадии (b), со стандартным, где различия в связывании относительно указанного образца является диагностическим для выявления нарушения, характеризующегося дисфункцией фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет набор для скрининга нарушения, как указано выше, при использовании способа, как описывается выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет набор для скрининга нарушения, как указано выше, содержащий выделенный анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, для очистки указанного фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, для ингибирования взаимосвязи между фактором некроза опухоли-альфа и одним или более рецепторами фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ приготовления анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, содержащий стадии:

(a) получение двухцепочечной ДНК, кодирующей VHh Camelidae, направленный против фактора некроза опухоли-альфа,

(b) клонирование и экспрессия ДНК, выбранной в стадии (b). Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ приготовления анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, содержащий:

(a) культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, способную кодировать анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, при условиях, позволяющих осуществление экспрессии полипептида, и,

(b) извлечение выработанного полипептида из культуры.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ, как описывается выше, где указанные клетки-хозяева являются бактериальными или дрожжевыми.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет набор для скрининга любого из воспаления, ревматоидног артрита, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника или множественного склероза, содержащий анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше.

VHH, в соответствии с настоящим изобретением, и как известно специалисту, представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, полученные из иммуноглобулинов, естественным образом лишенных легких цепей, а также тех, которые получены из Camelidae, как описывается в WO 94/04678 (и относится здесь к VHH доменам или нанотелам). VHH молекулы примерно в 10 раз меньше, чем молекулы IgG. Они являются единичными полипептидами и очень стабильны, устойчивы к экстремальным pH и температурным условиям. Кроме того, они устойчивы к действию протеаз, что не характерно для традиционных антител. Кроме того, экспрессия VHH in vitro продуцирует высокопродуктивное, правильно сложенные функциональные VHH. В дополнение, антитела, генерированные в верблюжьих, будут узнавать иные эпитопы, чем те, которые узнаются антителами, образованными in vitro при применении библиотек антител или посредством иммунизации млекопитающих, отличных от верблюжьих (WO 9749805). По существу, анти-TNF-альфа VHH могут связываться более эффективно с TNF-альфа, чем традиционные антитела, вследствие более эффективного блокирования их взаимодействия с TNF-альфа рецептором.

TNF-альфа также является фрагментом TNF-альфа, способным вызывать иммунную реакцию. TNF-альфа представляет собой также фрагмент TNP-альфа, способный к связыванию с нанотелом, индуцированным против полноразмерного TNF-альфа.

Нанотело, направленное против TNF-альфа, означает нанотело, которое способно к связыванию с TNF-альфа со сродством более 10-6 М.

Одним воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-полипептид, в котором нанотел содержит VHH Camelidae, направленный против TNF-альфа.

Одно или более нанотел анти-TNF-полипептида, которые направлены против TNF-альфа, могут являться одинаковыми последовательностями. Альтернативно они могут не все иметь одинаковые последовательности. В объем изобретения включается то, что анти-TNF-полипептид содержит анти-TNF-альфа нанотела, которые не все имеют ту же последовательность, но которые направлены против одинаковой мишени, одного или более ее антигенов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к анти-TNF-альфа полипептиду, в котором указанные нанотела представляет собой VHH, направленные против TNF-альфа, где VHH принадлежит к классу, имеющему последовательности, подобные человеческим. Класс характеризуется в том, что VHH содержат аминокислоту из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, метионина, серина, треонина, аспарагина, или шлутамина в положении 45, как, например, L45 и триптофан в положении 103, по номенклатуре Кабата. Другой человекоподобный класс нанотел Camelidae описывается в WO 03035694 и содержит гидрофобные FR2 остатки, типично найденные в традиционных антителах человеческого происхождения или из других видов, но компенсирующих эту потерю гидрофильности с помощью заряженного аргининового остатка в положении 103, который замещает консервированный триптофановой остаток, имеющийся в VH из двухцепочечных антител. По существу, пептиды, принадлежащие к этим двум классам, показывают высокую гомологию аминокислотной последовательности с человеческими VH каркасными областями и указанные пептиды могут применяться для человека непосредственно без вероятности развития нежелательной иммунной реакции, и без обременения проведения дополнительной гуманизации. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, способным кодировать указанные полипептиды.

Любые VHH, как используются изобретением, могут являться традиционным классом или классами человекоподобных антител Camelidae. Указанные антитела могут быть направлены против всего TNF-альфа или его фрагмента, или фрагмента его гомологичной последовательности. Эти полипептиды включают полноразмерные антитела Camelidae, а именно Fc и VHH домены, химерные варианты антител Camelidae тяжелой цепи с человеческим Fc доменом или VHH сами по себе или полученные фрагменты.

VHH против сывороточного альбумина может связываться более эффективным путем с сывороточным альбумином, чем традиционные антитела, которые известны как несущие белки. Как несущий, некоторые эпитопы сывороточного альбумина могут быть недоступны связывающим белкам, пептидам и мелким химическим соединениям. Поскольку известно, что VHH связываются с «необычными» или нетрадиционными эпитопами, а также полостями (WO 97/49805), сродство таких VHH к циркулирующему альбумину может быть повышено.

Настоящее изобретение также относится к тому, что анти-TNF-полипептид, как описывается здесь, дополнительно содержащий одно или более нанотел, направленных против одного или более сывороточных белков субъекта, неожиданно имеет значительно пролонгированное время полужизни в системе кровообращения указанного субъекта по сравнению со временем полужизни анти-TNF-альфа нанотела, когда оно не является частью указанной конструкции. Кроме того, было обнаружено, что указанные полипептиды проявляют те же полезные свойства нанотел, такие как высокая стабильность, остающаяся интактной у мышей, устойчивость к экстремальному pH, стабильность при высоких температурах и высокое сродство к мишени.

Сывороточный белок может являться любым походящим белком, обнаруженным в сыворотке субъекта. В одном аспекте изобретения, сывороточный белок представляет собой сывороточный альбумин, сывороточные иммуноглобулины, тироксин-связывающий белок, трансферрин или фибриноген. В зависимости от предполагаемого применения, а также от требующегося времени полужизни для эффективного лечения и/или компартментализации целевого антигена, VHH-партнер может быть направленным против одного из вышеуказанных сывороточных белков.

В соответствии со специфичным, но неограничивающим, аспектом изобретения, нанотело против сывороточного альбумина человека состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4 соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3 соответственно), в котором:

(iv) CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SFGMS [SEQIDNO:36]
LNLMG [SEQ ID NO: 37]
INLLG [SEQ ID NO: 38]
NYWMY [SEQ ID NO: 39]

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями;

и в котором:

(v) CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SISGSGSDTLYADSVKG [SEQ ID NO: 40]
TITVGDSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 41]
TITVGDSTSYADSVKG [SEQ ID NO: 42]
SINGRGDDTRYADSVKG [SEQ ID NO: 43]
AISADSSTKNYADSVKG [SEQ ID NO: 44]
AISADSSDKRYADSVKG [SEQ ID NO: 45]
RISTGGGYSYYADSVKG [SEQ ID NO: 46]

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей; где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями;

и в котором:

(vi) CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

DREAQVDTLDFDY [SEQ ID NO: 47]

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей; в котором:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями;

или из группы, состоящей из:

GGSLSR [SEQ ID NO: 48]
RRTWHSEL [SEQ ID NO: 49]
GRSVSRS [SEQ ID NO: 50]
GRGSP [SEQ ID NO: 51]

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями.

В другом аспекте, изобретение относится к нанотелу против сывороточного альбумина человека, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4 соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3 соответственно), которое выбирается из группы, состоящей из доменных антител и/или однодоменных антител с одной из следующих комбинаций CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно:

- CDR1 SFGMS; CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG; CDR3: GGSLSR;

- CDR1 LNLMG; CDR2: TITVGDSTNYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL;

- CDR1 INLLG; CDR2: TITVGDSTSYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL;

- CDR1 SFGMS; CDR2: SINGRGDDTRYADSVKG; CDR3: GRSVSRS;

- CDR1 SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;

- CDR1 SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;

- CDR1 NYWMY; CDR2: RISTGGGYSYYADSVKG; CDR3: DREAQVDTLDFDY.

В нанотелах изобретения, которые содержат комбинации CDR, указанные выше, каждый CDR может быть заменен CDR, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанными CDR; где

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями;

и/или выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 (как указано в предыдущем параграфе) "аминокислотное(ых) отличие(я)" (как определено здесь) с указанными CDR одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями.

Однако из нанотел изобретения, которые содержат комбинации CDR, указанные выше, нанотела, содержащие один или более CDR, перечисленные выше, являются особенно предпочтительными; нанотела, содержащие два или более CDR, перечисленные выше, являются более особенно предпочтительными; и нанотела, содержащие три из CDR, CDR, перечисленные выше, являются наиболее особенно предпочтительными.

В этих нанотелах против сывороточного альбумина человека, каркасные области FR1-FR4 предпочтительны, как определено здесь выше, для нанотел изобретения.

Особенно предпочтительные нанотела против сывороточного альбумина человека выбираются из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61-67, SEQ ID NO 87-89 и SEQ ID NO 100-104. Предпочтительные комбинации CDR и каркасных областей, имеющиеся в этих нанотелах, также приведены в таблице II.

Другой аспект изобретения представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как здесь описывается, дополнительно содержащий, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из анти-1ГМ-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма.

В соответствии с одним аспектом изобретения, нанотело направлено против рецептора TNF-альфа. Указанное нанотело может быть VHH Camelidae.

В соответствии с одним аспектом изобретения, нанотело направлено против рецептора IFN-гамма. Указанное нанотело может быть VHH Camelidae.

Другой аспект изобретения представляет собой способ лечения аутоиммунного заболевания или состояния, как указано здесь, включающий введение пациенту эффективного количества анти-TNF-альфа полипептида, дополнительно содержащего, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма, причем такие полипептиды объединены друг с другом, как описывается ниже.

Такие мультиспецифичные конструкции могут обладать улучшенной активностью как воспалительное терапевтическое соединение по сравнению с моноспецифичными конструкциями.

Один аспект изобретения представляет композицию, содержащую анти-TNF-альфа полипептид, как здесь описывается, и, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма, для совместного, раздельного или последовательного введения субъекту.

Один аспект изобретения представляет способ лечения аутоиммунного заболевания, включающий введение индивидууму эффективного количества анти-TNF-альфа полипептида и, по меньшей мере, одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма, одновременно, раздельно или последовательно.

Другой аспект изобретения представляет набор, включающий анти-TNF-альфа полипептид и, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма, для одновременного, раздельного или последовательного введения субъекту. В аспект изобретения включается то, что набор может использоваться в соответствии с изобретением. В аспект изобретения включается то, что набор может использоваться для лечения заболеваний, указанных здесь.

Под совместным применением понимается, что полипептиды вводятся пациенту одновременно. Например, как смесь полипептидов или композиция, содержащая указанные полипептиды. Примеры включают, но не ограничиваются, раствор, вводимый внутривенно, таблетка, жидкость, крем для местного использования и т.д., где каждое лекарственное средство содержит интересующие полипептиды.

Под раздельным применением понимается, что полипептиды вводятся пациенту в одно и то же время или почти в одно и тоже время. Полипептиды присутствуют в наборе как отдельные, несмешанные лекарственные средства. Например, различные полипептиды могут присутствовать в наборе, как отдельные таблетки. Таблетки могут употребляться субъектом путем глотания обеих таблеток одновременно, и одной таблетки непосредственно за другой.

Под последовательным применением понимается, что полипептиды вводятся пациенту последовательно. Полипептиды, присутствующие в наборе как отдельные, несмешанные лекарственные средства. Существует временной интервал между дозами. Например, один полипептид может применяться через 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120,96, 72, 48,24,20, 16, 12, 8,4, 2,1, или 0,5 часа после другого компонента.

В последовательном применении, один полипептид может применяться однократно или любое количество раз и в различных дозах перед и/или после применения другого полипептида. Последовательное применение может сочетаться с совместным или раздельным применением.

Медицинские применения анти-TNF-альфа полипептида, описываемые ниже, также применимы для композиции, содержащей анти-TNF-альфа полипептид, который здесь описывается, и, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма для одновременного, раздельного или последовательного введения субъекту, как здесь описывается.

В соответствии с одним аспектом изобретения, анти-IFN-гамма полипептид анти-TNF-альфа нанотела направлен против IFN-гамма. Указанное нанотело может быть VHH Camelidae.

В соответствии с одним аспектом изобретения, полипептид против рецептора TNF-альфа, анти-TNF-альфа нанотела направлен против рецептора TNF-альфа. Указанное нанотело может быть VHH Camelidae.

В соответствии с одним аспектом изобретения, полипептид против рецептора IFN-гамма анти-TNF-альфа нанотела направлен е против IFN-гаммарецептора. Указанное нанотело может быть VHH Camelidae.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается здесь, где число нанотел, направленных против TNF-альфа, составляет два или более. Такие многовалентные анти-TNF-альфа полипептиды имеют преимущество, заключающееся в необычно высоком функциональном сродстве с мишенью, проявляя более высокие, чем ожидалось, ингибиторные свойства сравнительно с его моновалентными прототипами.

Многовалентные анти-TNF-альфа полипептиды имеют функциональное сродство, которое на несколько порядков выше, чем у моновалентных исходных анти-TNF-альфа полипептидов. Изобретатели обнаружили, что функциональное сродство этих многовалентных полипептидов намного выше, чем таковое для указанных в уровне технике бивалентных и многовалентных антител. Удивительно, анти-TNF-альфа полипептиды настоящего изобретения, связанные друг с другом непосредственно или посредством короткой линкерной последовательностью, показывали высокое функциональное сродство, ожидаемые теоретически для многовалентных традиционных 4-цепочечных антител.

Изобретатели обнаружили, что такие высокие увеличенные функциональные активности могут обнаруживаться предпочтительно с антигенами, состоящими из мультидоменных и мультимерных белков, как в прямых анализах связывания, так и в функциональных анализах, напр., анализах цитотоксичности.

Нанотела могут объединяться с формированием любых полипептидов, здесь описываемых, содержащих более чем одно нанотело, при использовании способов, известных из уровня техники, или любыми будущими способами. Например, они могут быть слиты путем химического перекрестного сшивания путем взаимодействия аминокислотных остатков с органическим дериватизирующим агентом, который описан Blattler et al., Biochemistry 24,1517-1524; EP294703. Альтернативно, нанотела могут быть слиты генетически на уровне ДНК, т.е. образуется полинуклеотидная конструкция, которая кодирует всю полипептидную конструкцию, содержащая одно или более нанотел против мишени и одно или более нанотел против сывороточного белка. Способ продуцирования бивалентных или многовалентных полипептидных конструкций VHH описывается в патентной заявке РСТ WO 96/34103. Один способ соединения сложного нанотела осуществляется посредством генетического пути путем связывания кодирующей последовательности нанотела либо непосредственно, либо через пептидный линкер. Например, C-концевая область первого нанотела может быть связана с N-концевой областью следующего нанотела. Этот способ связывания может расширяться для связывания с дополнительным нанотелом для конструкции и продукции три-, тетра-, и т.д. функциональных конструкций.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, нанотела связаны друг с другом непосредственно, без использования линкер. В отличие от соединения крупных традиционных антител, где линкерная последовательность нужна для поддержки активности связывания в двух субъединицах, полипептиды изобретения могут быть связаны непосредственно, тем самым устраняются потенциальные проблемы, связанные с линкерной последовательностью, такие как антигенность, при применении человеку, нестабильность линкерной последовательности, ведущая к диссоциации субъединиц.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, нанотела связаны друг с другом посредством пептидной линкерной последовательности. Такая линкерная последовательность может являться природной последовательностью или не природной последовательностью. Ожидается, что линкерная последовательность не является иммуногенной для субъекта, которому вводится анти-TNF-альфа полипептид. Линкерная последовательность может обеспечивать достаточную гибкость многовалентному анти-TNF-альфа полипептиду, одновременно являясь устойчивой к протеолитической деградации. Неограничивающим примером линкерных последовательностей является тот, который может быть получен из шарнирной области VHH, описываемый в WO 96/34103.

В соответствии с другим аспектом изобретения, многовалентные нанотела, содержащие более чем два нанотела, могут быть связанными друг с другом либо непосредственно или посредством линкерной последовательности. Такие конструкции трудно получить в случае традиционных антител, и вследствие стерических затруднений несоответствия объемных субъединиц функциональность будет утрачена или резко снижена, вместо значительного повышения, как наблюдается с VHH изобретения по сравнению с моновалентной конструкцией.

Полипептидные конструкции, здесь описываемые, могут быть созданы опытным специалистом в соответствии со способами, известными из уровня техники, или любыми будущими способами. Например, VHH могут быть получены при использовании способов, известных из уровня техники, таких как иммунизация верблюда и получение из него гибридомы, или путем клонирования библиотеки нанотел при использовании способов молекулярной биологии, известных из уровня техники, и последующего отбора при использовании фагового дисплея.

В соответствии с аспектом изобретения анти-TNF-альфа полипептид может быть гомологичной последовательностью полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида. В соответствии с другим аспектом изобретения, анти-TNF-альфа полипептид может быть функциональной частью полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида. В соответствии с другим аспектом изобретения, анти-TNF-альфа полипептид может быть гомологичной последовательностью полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида. В соответствии с другим аспектом изобретения, анти-TNF-альфа полипептид может быть функциональной частью гомологичной последовательности полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида. В соответствии с аспектом изобретения, анти-TNF-альфа полипептид может содержать последовательность анти-TNF-альфа полипептида.

В соответствии с аспектом изобретения, нанотело, применяемое для формирования анти-TNF-альфа полипептида, может быть целым нанотелом (напр., VHH) или его гомологичной последовательностью. В соответствии с другим аспектом изобретения, нанотело, применяемое для формирования полипептидной конструкции, может быть функциональной частью целого нанотела. В соответствии с другим аспектом изобретения, Нанотело, применяемое для формирования полипептидной конструкции, может быть гомологичной последовательностью целого нанотела. В соответствии с другим аспектом изобретения, нанотело, применяемое для формирования полипептидной конструкции, может быть функциональной частью гомологичной последовательности целого нанотела.

В используемом здесь значении, гомологичная последовательность настоящего изобретение может содержать дополнения, делеции или замены одной или более аминокислот, которые по существу не изменяют функциональные характеристики полипептидов изобретения. Число аминокислотных делеции или замена соответствует предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70 аминокислот.

Гомологичная последовательность в соответствии с настоящим изобретением может быть модифицирована путем дополнения, делеции или замены аминокислот, при этом указанная модификация по существу не изменяет функциональные характеристики сравнительно с немодифицированным полипептидом.

Гомологичная последовательность в соответствии с настоящим изобретением может быть модифицирована путем дополнения, делеции или замены аминокислот, при этом указанная модификация по существу не изменяет функциональные характеристики сравнительно с немодифицированным полипептидом.

Гомологичной последовательностью в соответствии с настоящим изобретением может быть последовательность, которая имеется у других видов Camelidae, таких как, например, верблюд, дромадер, лама, альпака, гунако и т.д.

Где гомологичная последовательность указывает идентичность последовательности, это означает последовательность, которая представляет высокую идентичность последовательности (более чем 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность последовательности) с исходной последовательностью и предпочтительно характеризуется теми же свойствами, что и исходная последовательность, а именно, сродством, где указанную идентичность рассчитывают с использованием известных способов.

Альтернативно, гомологичная последовательность может также быть любой аминокислотной последовательностью, полученной в результате осуществления замен в любых положениях исходной последовательности в соответствии с нижеуказанной формулой:

Ser заменяется Ser, Thr, Gly и Asn;

Arg заменяется одним из Arg, His, Gln, Lys и Glu;

Leu заменяется одним из Leu, He, Phe, Tyr, Met и Val;

Pro заменяется одним из Pro, Gly, Ala и Thr;

Thr заменяется одним из Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His и Gin;

Ala заменяется одним из Ala, Gly, Thr и Pro;

Val заменяется одним из Val, Met, Tyr, Phe, Ile и Leu;

Gly заменяется одним из Gly, Ala, Thr, Pro и Ser;

He заменяется одним из He, Met, Tyr, Phe, Val и Leu;

Phe заменяется одним из Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val и Leu;

Tyr заменяется одним из Tyr, Trp, Met, Phe, Ile, Val и Leu;

His заменяется одним из His, Glu, Lys, Gin, Thr и Arg;

Gin заменяется одним из Gin, Glu, Lys, Asn, His, Thr и Arg;

Asn заменяется одним из Asn, Glu, Asp, Gin и Ser;

Lys заменяется одним из Lys, Glu, Gin, His и Arg;

Asp заменяется одним из Asp, Glu и Asn;

Glu заменяется одним из Glu, Asp, Lys, Asn, Gin, His и Arg;

Met заменяется одним из Met, Phe, He, Val, Leu и Tyr.

Гомологичная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением может относиться к нуклеотидным последовательностям из более чем 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 или 1000 нуклеотидов, способным гибридизоваться с обратным комплементом нуклеотидной последовательности, обеспечивающий кодирование исходной последовательности, при строгих условиях гибридизации (которые описываются в Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York).

В используемом здесь значении, функциональная часть относится к последовательности нанотела, которая составляет достаточный размер, чтобы интересующее связывание поддерживалось со сродством 1⋅10-6 М или лучше.

Альтернативно, функциональная часть содержит частичные делении целой аминокислотной последовательности и еще поддерживает сайт(ы) связывания и белковый(ые) домен (ы), необходимый для связывания и взаимодействия с мишенью.

В используемом здесь значении, функциональная часть относится к менее 100% всей последовательности (напр., 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% и т.д.), но содержит 5 или более аминокислот или 15 или более нуклеотидов.

Мишени, как указано здесь, такие как TNF-альфа, TNF-альфа рецептор, сывороточные белки (напр., сывороточный альбумин, сывороточные иммуноглобулины, тироксин связывающий белок, трансферрин, фибриноген) и IFN-гамма, рецептор IFN-гамма могут быть фрагментами указанных мишеней. Таким образом, мишень представляет собой также фрагмент указанной мишени, способный вызывать иммунную реакцию. Мишень представляет собой также фрагмент указанной мишени, способный к связыванию нанотела, индуцированного против полноразмерной мишени.

Фрагмент, в используемом здесь значении, относится к менее 100% последовательности (напр., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% и т.д.), но содержащий 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более аминокислот. Фрагмент представляет достаточную длину, что интересующее взаимодействие поддерживается со сродством 1⋅10-6 М или лучше.

Фрагмент, в используемом здесь значении, также относится к необязательным инсерциям, делециям и заменам одной или более аминокислоты, что по сути не изменяет способность мишени связываться с нанотелом, индуцированным против мишени дикого типа. Число аминокислотных инсерций, делеций или замен составляет предпочтительно до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70 аминокислот.

Гомологичная последовательность настоящего изобретение может включать анти-TNF-альфа полипептид, который гуманизирован. Гуманизация антител новым классом VHH позволит дополнительно снизить возможность развития нежелательных иммунологических реакций у человека после применения.

Одно воплощение настоящего изобретения относится к способу приготовления модифицированных полипептидов на основании антител ламы путем определения аминокислотных остатков вариабельного домена (VHH) антител, которые могут быть модифицированы без утраты исходного сродства домена к антигену и при его сниженной иммуногенности относительно гетерологичных видов; применению VHH, имеющего модификации в идентифицированных остатках, которые полезны для использования гетерологичных видов; и к VHH, таким образом модифицированному.

А именно, изобретение относится к приготовлению модифицированных VHH, которые модифицируется для введения людям, полученным VHH как таковым, и применению таких "гуманизированных" VHH для лечения заболеваний у людей. Под гуманизированным понимается мутированный таким образом, что иммуногенность после применения у пациентов минимальная или отсутствует. Гуманизация полипептидов, в соответствии с настоящим изобретением, содержит стадию замещения одной или более аминокислот из Camelidae их человеческим прототипом, который найден в человеческой консенсусной последовательности, без потери полипептидом его типичной характеристики, т.е. гуманизация не оказывает существенного действия на способность к антигенному связыванию конечного полипептида. Такие способы известны для специалиста.

Гуманизация нанотела Camelidae требует введения и мутагенеза ограниченного числа аминокислот в одной полипептидной цепи. Это в отличие от гуманизации scFv, Fab, (Fab)2 и IgG, что требует введение аминокислотных замен в две цепи, легкую и тяжелую цепи, и сохранение сборки обеих цепей.

Как описывается в WO 04/041862, анти-TNF нанотела могут быть гуманизированными. Гуманизация может например, включать мутагенез остатков в FR1 в положении 1 и 5, которое были введены праймером, использующимся для репертуарного клонирования, и не являются природными в последовательности ламы. Мутагенез этих остатков не приводит к потере связывания и/или ингибиторной активности. Гуманизация может также включать мутагенез остатков в FR3 в положении 74, 76, 83, 84, 93. Мутагенез этих остатков не приводит к резкой потери связывания и/или ингибиторной активности. Комбинирование мутаций FR1 и FR3 не оказывает влияния на связывание и/или ингибиторную активность. Гуманизация может также включать мутагенез остатков в FR4 в положении 108. Мутагенез Q108L приводит к более слабому уровню продукции в Escherichia coli. Положение 108 экспонировано растворителю в VHH верблюжьих, тогда как для человеческих антител это положение замаскировано на границе VH-VL (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). В выделенных VH положение 108 экспонировано растворителю. Введение неполярного гидрофобного Leu вместо полярного незаряженного Gln может оказывать существенный эффект на естественные фолдинг/стабильность молекулы. Также замещение гидрофильных остатков человеческими гидрофобными остатками в положениях 44 и 45 (E44G и R45L), не оказывает влияния на связывание и/или ингибирование. Однако потеря связывания и/или ингибиторной активности наблюдалась, если F37V и F47W были введены. Модельные данные подтверждают, что критический остаток 37 сохраняет целостность конформации CDR3 петли и, следовательно, активность (вся нумерация соответствует нумерации Кабата).

В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения, гуманизация включает замещение любых из следующих остатков либо одних либо в комбинации:

- FR1 положение 1, 5, 28 и 30,

- характеристическая аминокислота в положении 44 и 45 в FR2,

- FR3 остатки 74, 75, 76, 83, 84, 93 и 94,

- и положения 103, 104, 108 и 111 в FR4;

- нумерация по номенклатуре Кабата.

Одним воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-альфа полипептид, или нуклеиновая кислота, способная кодировать указанный полипептид, для применения в лечении, предупреждении и/или ослаблении симптомов нарушений, относящихся к воспалительному процессу. TNF-альфа включается в воспалительный процесс и блокирование действия TNF-альфа может оказывать противовоспалительный эффект, что является сильно желаемым в некоторых болезненных состояниях, таких как, например, болезнь Крона. Примеры демонстрируют, что VHH в соответствии с изобретением связывается с TNF-альфа, кроме того, блокирует его связывание с рецептором TNF-альфа.

Анти-TNF-альфа полипептиды настоящего изобретения применимы для аутоиммунных заболеваний, таких как болезнь Аддисона (надпочечник), аутоиммунные заболевания уха (уши), аутоиммунных заболеваний глаз (глаза), аутоиммунный гепатит (печень), аутоиммунный паротит (околоушная железа), болезнь Крона (кишечник), диабет I типа (поджелудочная железа), эпидидимит (эпидимис), гломерулонефрит (почки), болезнь Грейвса (щитовидная железа), синдром Гийена-Барре (нервные клетки), тиреоидит Хашимото (щитовидная железа), гемолитическая анемия (красные клетки крови), системная красная волчанка (многие ткани), мужское бесплодие (сперма), множественный склероз (нервные клетки), злокачественная миастения (нейромышечные узлы), пузырчатка (кожа), псориаз (кожа), ревматический полиартрит (сердце и суставы), ревматоидный артрит (суставы), саркоидоз (множественные ткани и органы), склеродермия (кожа и соединительная ткань), синдром Шегрена (экзокринные железы, и другие ткани), спондилоартропатия (осевой скелет, и другие ткани), тиреоидит (щитовидная железа), васкулит (сосуды).

В скобках представлены ткани, затронутые заболеванием. Предполагается, что этот список аутоиммунных заболеваний является примерным, нежели охватывающим все.

Аутоиммунные состояния, для которых анти-TNF-альфа полипептиды настоящего изобретения применимы, включают, например, СПИД, атопическую аллергию, бронхиальную астму, экзему, лепру, шизофрению, наследственную депрессию, трансплантацию тканей и органов, синдром хронической усталости, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, инфаркт миокарда, инсульт, аутизм, эпилепсию, феномен Артюса, анафилаксию, и алкогольное и лекарственное привыкание. В вышеуказанных заболеваниях, аутоиммунные состояния, затронутые ткани являются первичной мишенью, в других случаях вторичной мишенью. Эти состояния являются частью или большинства аутоиммунных синдромов. Следовательно, для лечения их, предоставляется возможность применять эти способы, или аспекты этих способов, которые здесь описываются, иногда в сочетании с другими способами.

Другим воплощением настоящее изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида в соответствии с изобретением, или нуклеиновой кислоты, способной кодировать указанный полипептид для производства лекарственного средства для лечения нарушений, связанных с воспалительными процессами. Примеры нарушений включают ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника и d множественный склероз.

Полипептиды и нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться субъекту традиционными путями, а также внутривенно. Однако специальное свойство анти-TNF-альфа полипептидов изобретения, которое заключается в том, что они могут проходить барьеры, такие как мембраны тканей и/или опухолей, и их местное действие, и то, что они являются достаточно стабильными для того, чтобы выдерживать экстремальные условия среды, такой как в желудке. Следовательно, другим аспектом настоящего изобретения является доставка анти-TNF-альфа полипептидов.

Если нанотела и/или полипептиды изобретения используются для, или предполагается их использование для, профилактики или лечения заболеваний и нарушений желудочно-кишечного тракта, в частности путем перорального применения или другое введение в желудочно-кишечный тракт, то не будет являться необходимым, как правило, применение тех полипептидов изобретения, которые имеют повышенное время полужизни в сыворотке (т.е. которые пегилированы или которые содержат нанотела, направленные против сывороточного белка). Таким образом, для таких целей могут использоваться такие полипептиды изобретения, которые только содержат нанотела изобретения. В частности, было обнаружено, что пероральное применение для профилактики и лечения заболеваний или нарушений желудочно-кишечного тракта, связанных с и/или опосредованных TNF-альфа (а также IBD и другие заболевания и нарушения желудочно-кишечного тракта, указанные выше), с применением моновалентного нанотела изобретения или полипептида изобретения, который по существу состоит из моновалентного нанотела изобретения, может быть предпочтительным. В других обстоятельствах, например, для лечения ревматоидного артрита (RA), применение бивалентного нанотела изобретения может быть предпочтительным. Если содержание таких нанотел увеличивается в кровяном русле, то применение полипептида изобретения, который имеет повышенное время полужизни в сыворотке, может быть предпочтительным.

Субъектом в соответствии с изобретением может быть любое млекопитающее, чувствительное к лечению терапевтическими полипептидами.

Пероральная доставка анти-TNF-альфа полипептидов изобретения приводит к доставке таких молекул в их активной форме в кишечник к местным участкам, которые поражены нарушением. Эти участки могут быть сильно воспаленными и содержать TNF-альфа-продуцирующие клетки. Анти-TNF-альфа полипептиды изобретения, которые связываются с TNF-альфа, могут нейтрализовать TNF-альфа местно, избегая распределения по всему организму и таким образом ограничивая негативные побочные эффекты. Генетически модифицированные микроорганизмы, такие как Micrococcus lactis, способны секретировать антитела или их функциональные части. Такие модифицированные микроорганизмы используются как носители для местной продукции и доставки антител или их функциональных частей в кишечник. При использовании штамма, который продуцирует анти-TNF-альфа полипептид, воспалительные заболевания кишечника могут лечиться.

Другой аспект изобретения включает доставку анти-TNF-полипептидов путем использования поверхностной экспрессии на или секреции из неинвазивных бактерий, таких как грамположительные организмы-хозяева, подобные Lactococcus spec., при использовании вектора, такого как описанный в WO 00/23471.

Одно воплощение настоящего изобретения включает анти-TNF-альфа полипептид, который здесь описывается, для применения в лечении, предупреждении и/или ослаблении симптомов нарушений, допускающих модуляцию нанотела или полипептида изобретения, который способен проходить через желудочную среду без потери активности вещества.

Примеры нарушений включают любые, причиной которых является воспаления, включая, но не ограничиваясь, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, и множественный склероз. Как известно для специалиста, как только внесен в указанную полипептидную конструкцию, технология состава может применяться для высвобождения максимального количества полипептида в нужном местоположении (в желудке, в кишке и т.д.). Такой способ доставки важен для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чьи мишени расположены в системе кишечника.

Аспект изобретения представляет способ лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных для модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен проходить через желудочную среду без потери активности, путем перорального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Другим воплощением настоящего изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь, для производства лекарственного средства для лечени