Способ диагностики полиморфизма аров, обуславливающего летальный генетический дефект голштинского скота hcd - дефицит холестерина



Способ диагностики полиморфизма аров, обуславливающего летальный генетический дефект голштинского скота hcd - дефицит холестерина

 


Владельцы патента RU 2634401:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста" (ВИЖ им. Л.К. Эрнста) (RU)

Изобретение относится к молекулярной генетике. Описан способ определения полиморфизма генов, ассоциированных с летальным рецессивным генетическим дефектом крупного рогатого скота. Конкретно гена аполипротеина В (АРОВ), ассоциированного с гаплотипом HCD. Определяют полиморфизм гена АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, с помощью специфичного однопробирочного метода полимеразной цепной реакции. При этом продукты амплификации аллелей А и N различаются по длине - фрагмент длиной 215 п.о. соответствует аллелю А, фрагмент длиной 327 п.о. соответствует аллелю N, а идентификация генотипов животных осуществляется по результатам электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле. Способ может быть использован в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене АРОВ крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом фертильности HCD, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота. 1 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов, в частности гена аполипротеина В (АРОВ), обуславливающего летальный рецессивный генетический дефект голштинского скота HCD, и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.

Практикуемая в течение последних десятилетий стратегия селекции на быков-лидеров [Лабинов В.В. Модернизация черно-пестрой породы крупного рогатого скота в России на основе использования генофонда голштинов / В.В. Лабинов, П.Н. Прохоренко // Молочное и мясное скотоводство. - 2015. - №1. - С. 2-7; Сермягин А.А. Перспективы использования оценки геномной племенной ценности в селекции молочного скота / А.А. Сермягин, Е.Н. Нарышкина, Т.В. Карпушкина, Н.И. Стрекозов, Н.А. Зиновьева // Молочное и мясное скотоводство. - 2015. - №7. - С. 2-5] привела к существенному росту уровня гомозиготности в большинстве культурных пород крупного рогатого скота. Так, например, в американской и канадской популяциях голштинской породы средний коэффициент инбридинга в настоящее время оценивается, соответственно, на уровне 6,53% [VanRaden P., Null D. Inbreeding Trend for Holstein or Red & White Cows // CDCB, Council on dairy cattle breeding, 2015. URL: https://www.cdcb.us/eval/summary/inbrd.cfm? (дата обращения 27.02.2016)] и 6,81% [Inbreeding Update // CDN, Canadian Dairy Network, Aug. 2015. URL: https://www.cdn.ca/document.php?id=411 (Дата обращения 03.03.2016)]. Рост гомозиготности, в свою очередь, обусловливает возрастание негативного влияния летальных рецессивных генетических дефектов, которые в гомозиготном состоянии приводят к эмбриональной смертности или гибели теленка в ранний постэмбриональный период. В базе данных OMIA [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: http://omia.angis.org.au/home (дата обращения 02.03.2016)] сегодня содержится информация о 213 наследственных заболеваниях и других моногенных признаках, для 116 из которых идентифицированы соответствующие причинные мутации. Моногенные наследственные заболевания идентифицированы практически во всех породах молочного крупного рогатого скота, и постоянно регистрируются случаи появления новых [Зиновьева Н.А. Моногенные наследственные дефекты и их роль в воспроизводстве / Н.А. Зиновьева, Н.И. Стрекозов, Г.В. Ескин, И.С. Турбина, И.Н. Янчуков, А.Н. Ермилов // Животноводство России. - 2015. - №6. - С. 30-31]. Особенное негативное значение имеют дефекты, приводящие к гибели телят в ранний постэмбриональный период. В июле 2015 года на конференции Interbull в Орландо (США) было сообщено о регистрации нового летального гаплотипа голштинского скота, картированного на хромосоме 11 [Kipp, S., D. Segelke, S. Schierenbeck, F. Reinhardt, R. Reents, C. Wurmser, H. Pausch, R. Fries, G. Thaller, J. Tetens, J. Pott, M. Piechotta, and W. . A new Holstein haplotype affecting calf survival. Interbull Bull. 2015. 49: 49-53]. Телята-носители характеризуются нарушением в метаболизме холестерина, что приводит к потере веса, аппетита, физической слабости, диарее, не поддающимся медикаментозному лечению. Следствием является гибель телят в первые недели или месяцы жизни. Было установлено, что гетерозиготные животные имеют пониженное содержание холестерина в крови, в то время как у гомозиготных животных холестерин в крови вообще отсутствует. Новый гаплотип получил название гаплотипа дефицита холестерина - HCD.

Гаплотип HCD локализован на ВТА11 в области экзона 5 гена АРОВ (сборка генома UMD 3.0) [Menzi, F., N. Besuchet-Schmutz, М. , S. Hofstetter, V. Jagannathan, Т. Mock, A Raemy, Е. Studer, K. Mehinagic, N. Regenscheit, M. Meylan, F. Schmitz-Hsu, and C. . 2016. A transposable element insertion in АРОВ causes cholesterol deficiency in Holstein cattle // Anim. Genet., doi:10.1111/age.12410], причиной HCD является инсерция мобильного LTR элемента (ERV2-1) размером 1299 bp после позиции 77 958 994 на ВТА 11, расположенная между нуклеотидами 24 и 25 экзона 5 гена АРОВ. Инсерция обусловливает сдвиг рамки считывания, начиная от аминокислоты 135 АРОВ, и приводит к отсечению 97% соответствующего белка длиной 4567 аминокислот (Gly135ValfsX10). С. Charlier [Charlier С. The role of mobile genetic elements in the bovine genome // Plant Anim. Genome XXIV Conf., 2016. abstr. W636] подтвердил локализацию мутации, при этом указав, что полный размер инсерции эндогенного ретровирусного элемента (BoERV) составляет около 7 kb.

Частота скрытых носителей HCD среди телок канадской популяции 2012 года рождения составляла 17% и оценивается на уровне менее 12% для телок 2016 года рождения [Van Doormaal В., Beavers L. HCD: Haplotype associated with Cholesterol Deficiency // Canadian Dairy Network (CDN), Dec. 2015. URL: https://www.cdn.ca/images/uploaded/file/HCD%020Update%20Article%20-%20December%202015.pdf (Дата обращения 03.03.2016).]. В США частота скрытых носителей HCD, выявленных посредством полногеномного анализа 826948 животных, составляет 6,0%, в том числе 4,4% подтвержденных по родословной и 1,6% - не подтвержденных по родословной [Van Raden P., Null D. Holstein Haplotype for Cholesterol Deficiency, HCD // USDA-AGIL, 2015. URL: https://www.cdcb.us/reference/changes/HCD_inheritance.pdf (дата обращения 05.03.2016 г.)]. Из 264 протестированных быков, используемых в системе искусственного осеменения в Германии, 46 (17,4%) оказались скрытыми носителями HCD, что соответствует частоте встречаемости мутантного аллеля 8,7% [Menzi, F., N. Besuchet-Schmutz, М. , S. Hofstetter, V. Jagannathan, Т. Mock, A Raemy, Е. Studer, K. Mehinagic, N. Regenscheit, M. Meylan, F. Schmitz-Hsu, and C. . 2016. A transposable element insertion in АРОВ causes cholesterol deficiency in Holstein cattle // Anim. Genet, doi:10.1111/age.12410].

Проведенный анализ родословных 584 быков-производителей, используемых в системе искусственного осеменения в РФ, и базы данных скрытых носителей HCD Департамента сельского хозяйства США [Bulls' status for haplotypes impacting fertility on the records of Holstein Association USA // Holstein Association USA, 14.12.2015. URL: www.holsteinusa.com/pdf/haplotype/hapbulcarriers (Дата обращения 05.03.2016)], показал, что у 60 быков (10,3%) отцы являются носителями HCD. Вышеназванные отцы принадлежат к нескольким генеалогическим линиям, имеют различное происхождение (канадское, американское, австрийское) и активно используются в племенной работе.

Анализ научно-технической, патентной и иной информации показал, что единственным применяемым сегодня способом диагностики полиморфизма в АРОВ, ассоциированного с HCD, используемым в качестве аналога, является использование ПЦР-анализа [Menzi, F., N. Besuchet-Schmutz, М. , S. Hofstetter, V. Jagannathan, Т. Mock, A Raemy, E. Studer, K. Mehinagic, N. Regenscheit, M. Meylan, F. Schmitz-Hsu, and C. . 2016. A transposable element insertion in АРОВ causes cholesterol deficiency in Holstein cattle // Anim. Genet., doi:10.1111/age.12410]. Однако проведение ДНК-диагностики данным способом характеризуется тем, что здоровый аллель имеет длину фрагмента меньше 249 п.о., чем дефектный аллель - 436 п.о., тем самым для амплификации здорового аллеля создаются лучшие условия, что, в свою очередь, может привести к ложноотрицательным результатам, обусловленным неспецифической амплификацией.

В качестве прототипа заявленного способа наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату можно считать проведение ПЦР [Menzi, F., N. Besuchet-Schmutz, М. , S. Hofstetter, V. Jagannathan, Т. Mock, A Raemy, Е. Studer, K. Mehinagic, N. Regenscheit, M. Meylan, F. Schmitz-Hsu, and C. . 2016. A transposable element insertion in АРОВ causes cholesterol deficiency in Holstein cattle // Anim. Genet., doi:10.1111/age.12410].

Основной недостаток прототипа заключается в том, что при ПЦР длина фрагмента здорового аллеля существенно меньше по сравнению с мутантным (249 против 436 п.о.), что создает риск получения ложно отрицательных результатов, поскольку для амплификации здорового аллеля созданы предпочтительные условия.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения аллеля А гена АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, с целью идентификации скрытых носителей HCD и разработки программ их использования в селекции без риска получения нежизнеспособных телят.

Задача изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма в гене АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, для использования в селекции крупного рогатого скота.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ определения полиморфизма АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, для использования в селекции крупного рогатого скота, включающий специфичный однопробирочный метод полимеразной цепной реакции, позволяющий проводить идентификацию результатов с помощью метода электрофореза в агарозном геле без использования дорогостоящего оборудования, что обеспечит относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.

Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании двух обратных праймеров, специфичных для здорового и дефектного аллеля и одного общего прямого праймера. При этом мутантному аллелю А, ассоциированному с HCD, соответствует фрагмент меньшей длины, в то время как нормальному (не мутантному аллелю) - фрагмент большей длины, что позволяет дифференцировать мутантные и немутантные аллели гена АРОВ методом электрофореза в агарозном геле.

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможно выявление мутантного аллеля А гена АРОВ, что позволит применить данный метод в селекции животных.

Сущность изобретения - определение полиморфизма гена АРОВ ассоциированного с гаплотипом HCD крупного рогатого скота, методом ПЦР.

Разрабатываемый способ базируется на определении инсерции мобильного LTR элемента (ERV2-1) размером 1299 bp после позиции 77 958 994 на ВТА 11, расположенной между нуклеотидами 24 и 25 экзона 5 гена АРОВ. С этой целью выбран участок гена АРОВ крупного рогатого скота внутри инсерции и за ее пределами.

Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по АРОВ (n=60) были использованы образцы ткани (ушной выщип, n=30) и спермы (n=30) быков и коров голштинской и голштинизированной черно-пестрой породы. ДНК выделяли методом экстракции перхлоратом [Зиновьева Н.А. и др. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных // Дубровицы: ВИЖ, 2002, 112 с.], с использованием магнитных частиц (ООО «Изоген», Россия) и колонок Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Каждым из вышеназванных методов выделяли ДНК из 10 образцов ткани и 10 образцов спермы. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования способа-прототипа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 436 п.о., характерного для мутантного аллеля, и 249 п.о., характерного для здорового аллеля.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа HCD на основе метода ПЦР (А) и результаты генотипирования образцов (Б).

На фиг. 1А представлен дизайн теоретически смоделированной тест-системы.

В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=60), в том числе 5 образцов с генотипом AN (скрытый носитель HCD) и 55 образцов с генотипом NN (неноситель).

Определение полиморфизма АРОВ предложенным способом выполняли следующим образом:

1. Исходя из локализации инсерции были подобраны два обратных аллелеспецифических праймера специфичных для здорового и дефектного аллеля и одного общего прямого праймера:

APOB_Norm_NEW - 5' - GCA GCT GAG ССС ACG АТС СА

APOB_Aff_NEW - 5' - AAA TGC TCG AGA ATA TCC GGG G

APOB_For_NEW - 5' - GCT GCA AAG CCA CCT AGC CT

Продукт амплификации праймеров APOB_Norm_NEW и APOB_For_NEW характерен для «здорового» аллеля и имеет длину 327 п.о., продукт амплификации праймеров APOB_Aff_NEW и APOB_For_NEW характерен для «мутантного» аллеля и имеет длину 215 п.о. Место вставки инсерции помечено звездочкой. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.

2. Выполняли 37 циклов ПЦР в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH4)2SO4, 67.7 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1,5 мМ MgCl2, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 7 мин, 35 циклов последовательно - 94°С - 0,5 мин, 67°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин.

3. Определение аллелей N и А гена АРОВ осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1х ТАЕ буфере 20 мин при 100 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ), при этом генотипу NN (неносителю HCD) соответствует фрагмента длиной 327 п.о., генотипу AN (скрытому носителю HCD) - два фрагмента длиной 327 и 215 п.о. и генотипу АА (летальный, может быть выявлен только среди плодов или новорожденных телят) - фрагмент длиной 215 п.о. (Фиг. 1Б). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия.

4. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.

Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма АРОВ было апробировано на выборке племенного поголовья голштинского и голштинизированного черно-пестрого, в том числе 483 быках-производителях и 487 коровах. Исследование выявило наличие 53 животных с генотипом AN (скрытые носители HCD), в том числе 11 коров и 42 быков, что соответствует частотам встречаемости соответственно 2,26 и 8,70%. Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями инсерции в гене АРОВ, ассоциированной с гаплотипом HCD.

Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене АРОВ крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом HCD, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота.

Способ диагностики полиморфизма АРОВ, обуславливающего летальный генетический дефект голштинского скота HCD - дефицит холестерина, включающий однопробирочную амплификацию (ПЦР) фрагментов гена АРОВ и отличающийся тем, что продукты амплификации «здорового» аллеля N длиной 327 п. о. и «мутантного» аллеля А длиной 215 п. о. в позиции после позиции 77958994 на ВТА 11, расположенной между нуклеотидами 24 и 25 экзона 5 гена АРОВ, различаются по длине, а идентификация полиморфизма АРОВ у животных осуществляется по результатам электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера.

Изобретение относится к области диагностической медицины. Образец цельной крови, собранный в антисвертывающий раствор, центрифугируют.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен суспензионный микрочип для мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, содержащий набор праймеров для выявления Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi, Bartonella, вируса энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, бабезиоза и эрлихиоза.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способ определения устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам второго ряда - фторхинолонам, аминогликозидам и капреомицину, наборы зондов детекции и праймеров амплификации и применение способа для подтверждения клинического диагноза туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью.

Изобретение относится к зонду для детекции полиморфизма V600 в гене BRAF. Изобретение представляет собой флуоресцентно меченый олигонуклеотид (Р1), который, по меньшей мере, на 80% идентичен последовательности оснований длиной от 10 до 50 оснований, включающей основания 228-237 последовательности оснований, указанной в SEQ ID NO:1, в котором основание, соответствующее основанию 237, представляет собой цитозин, меченный флуоресцентным красителем, причем олигонуклеотид распознает полиморфизм, по меньшей мере, в одном из оснований 228-230 последовательности оснований, указанной в SEQ ID NO:1, при условии, что олигонуклеотид отличается от олигонуклеотида, указанного в SEQ ID NO:7 или 19.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы.

Настоящее изобретение относится к биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путём амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S рРНК.
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Заявлен набор для оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР, включающий компоненты для выделения ДНК, видоспецифичные олигонуклеотидные пары праймеров для проведения одностадийной экспресс-идентификации нескольких однонуклеотидных замен в аллелях генов MTHFR, MTR, MTRR и компоненты для детекции результатов гель-электрофорезом.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью.

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике и онкологии, и касается способа выявления генных мутаций BRAF в опухолях человека. Осуществляют амплификацию исследуемого фрагмента гена BRAF посредством асимметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan: BRAF-15-sense – 5'-ROX-aggtgattttggtctagctacagtgaaatc-BHQ2 и BRAF-15-antisense – 5'-Су5-acccactccatcgagatttcactgta-BHQ2 и праймерами: прямой – 5'-gagatctactgttttcctttactt, обратный – 5'-ggccaaaaatttaatcagt.

Изобретение относится к сельскохозяйственной области биотехнологии и животноводству и касается способа оценки плодовитости свиней пород ландрас и крупная белая. Способ включает выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена LIF с использованием праймеров 5'-ATGTGGATGTGGCCTACGG-3' и 5'GGGAACAAGGTGGTGATGG-3', рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LIF эндонуклеазой рестрикции DraIII, определение генотипов и отбор животных с генотипом AA/LIF, причем один фрагмент размером 407 п. н. соответствует генотипу АА, два фрагмента размером 266- и 144 н.п. - генотипу ВВ, три фрагмента 407-, 266- и 144 н.п. - генотипу АВ. Животные с генотипом AA/LIF обладают высокими показателями плодовитости. Изобретение позволяет эффективнее проводить оценку плодовитости свиноматок пород ландрас и крупная белая и отбирать свиней, генетически предрасположенных к более высоким показателям плодовитости. 2 ил., 2 табл., 2 пр.
Наверх