Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона н1.3


 


Владельцы патента RU 2634408:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к способу получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3. Настоящий способ предусматривает культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок, разрушение биомассы дезинтегратором, экстракцию целевого белка перхлорной кислотой и последующую очистку целевого белка. Указанный способ отличается тем, что очистка белка включает очистку методом катионообменной хроматографии с использованием промывки сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины и очистку методом ВЭЖХ. Настоящий способ также включает концентрирование очищенного бисметионилгистона ультрафильтрацией и лиофилизацию с получением порошка очищенного бисметионилгистона фармакопейного качества с чистотой 98,5%. Настоящее изобретение позволяет получать бисметионилгистон Н1.3 фармакопейного качества. 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3, являющегося производным человеческого гистона Н1.3. Природный гистон Н1.3 - это высококонсервативный белок с выраженными антипролиферативными свойствами в отношении раковых клеток различного происхождения. Бисметионилгистон - молекула гистона, имеющая на N-концевой части дополнительные два остатка аминокислоты метионина, является производным природного гистона и проявляет аналогичные биологические свойства. В связи с этим рекомбинантный бисметионилгистон является аналогом лекарственного средства Ритуксимаб для изготовления лекарственных препаратов, применяемых для терапевтического лечения злокачественных опухолевых образований лимфоидного и миелоидного происхождения.

В Российской Федерации терапевтическое лечение злокачественных опухолей лимфоидного и миелоидного происхождения, рецидивирующих и часто устойчивых к химиотерапии, осуществляется за счет импортных коммерческих препаратов Ритуксимаба. Однако в некоторых случаях препараты Ритуксимаба могут не вызывать должного терапевтического эффекта, причины чего изучены плохо (Cartron, G., et al. Blood. 2002. V. 99(3). P. 754-758). Кроме того, терапия Ритуксимабом может приводить к образованию в организме больного антиидиотипических антител, приводя к аутоиммунному ответу (Smith, М. Oncogene. 2003. V. 22(47). Р. 7359-7368). Известно, что аналоги Ритуксимаба на основе линкерньгх или ядерных гистонов или их производных лишены подобных недостатков. В связи с этим разработка способа получения активной фармацевтической субстанции гистонов или их производных является актуальной задачей.

Известен способ получения рекомбинантного гистона H1.5, состоящий в культивировании штамма-продуцента E. coli B121(DE3), продуцирующего гистон H1.5. Способ заключается в разрушении бактериальных клеток, выделении целевого компонента с помощью катионообменной хроматографии, очистки выделенного белка последовательно на гидроксиапатитной и катионообменной хроматографии, доочистки от бактериальных эндотоксинов тангенциальной фильтрацией и лиофилизацией до получения активной фармацевтической субстанции (Руо, S.-H., et al. Prot. Exp. Purif. 2001. V. 23. P. 38-44).

К недостаткам данного способа следует отнести большое количество стадий очистки и, следовательно, крайне низкий суммарный выход процесса (около 16%).

Известен способ получения рекомбинантного гистона HI, состоящий в культивировании дрожжевого штамма S. cerevisiae ENY.WA-4D, продуцирующего ряд подтипов гистона HI. Способ заключается в лизировании бактериальных клеток ферментом зимолиазой Т20, выделении целевого компонента с помощью экстракции перхлорной кислотой, очистке выделенного белка многостадийным осаждением с помощью ацетона с последующим перерастворением осадка и повторным осаждением с помощью сульфата аммония (Albig, W., et al. FEBS lett. 1998. V. 435. P. 245-250).

К недостаткам данного способа следует отнести большое количество стадий осаждения и перерастворения, а также недостаточную чистоту получаемого раствора, содержащего ряд подтипов гистона H1.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения производного гистона Н1.3, бисметионилгистона Н1.3, описанный в европейской патентной заявке (European Patent Application ЕР 1985628), в международной патентной заявке (International Patent Application WO 2008/122434) и патенте Российской Федерации RU 2498997. Способ заключается в:

1) культивировании штамм-продуцент E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок;

2) разрушении биомассы дезинтегратором;

3) экстракции целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой;

4) денатурации белка мочевиной до финальной концентрации 8 М;

5) очистке методом анионообменной хроматографии на сорбенте Q-Sepharose в денатурирующих условиях;

6) очистке методом катионнообменной хроматографии на сорбенте Macro-prep High S в денатурирующих условиях;

7) концентрировании диафильтрацией с одновременной сменой буферной системы раствора белка;

8) финишной стерильной фильтрации с получением раствора очищенного бисметионилгистона Н1.3 в качестве фармацевтической субстанции.

К недостаткам описанного способа следует отнести несоответствие получаемой активной фармацевтической субстанции фармакопейным требованиям по чистоте действующего компонента (требования составляют не менее 97%), что отмечено в комментариях авторов (Gross, P., et al. World Intellectual Property Organization Patent Application, WO 2008/122434 A1, 2008; European Patent Application EP 1985628).

Техническим результатом изобретения является повышение чистоты конечного продукта не менее 98,5%, сокращение стадий производства благодаря исключению процесса денатурации целевого белка и неочевидному снижениб бактериальных эндотоксинов на стадии катионообменной хроматографии, что дополнительно приводит увеличению срока службы ВЭЖХ-сорбента Kromasil и, соответственно, к экономической выгоде.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 используют штамм-продуцент E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S. (Штамм депонирован в коллекции штаммов-продуцентов ИБХ РАН, № MSP-H1.3.)

Биосинтез продуцента проводят культивированием.

При культивировании клеток штамма-продуцента для получения инокулята питательную среду на основе экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в колбах, который используют для засева ферментера. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 10 ОЕ, с последующей индукцией синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. После окончания ферментации клетки штамма-продуцента целевого белка (биомассу) отделяют центрифугированием и разрушают на дезинтеграторе Гаулин. Выделение целевого бисметионилгистона Н1.3 проводят с помощью экстракции 2,5% перхлорной кислотой в течение 1 ч, в результате чего осаждают балластные белки, а надосадочную жидкость, содержащую бисметионилгистон Н1.3, отделяют центрифугированием, доводят рН до 2,0-4,0 с помощью 4 М гидроксида натрия и отфильтровывают через фильтр 0,45 микрон.

Полученный белковый раствор наносят на предварительно уравновешенную колонну, упакованную катионообменным сорбентом. Проводят промывку сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины, что приводит к неочевидному снижению бактериальных эндотоксинов, за счет их частичного высвобождения из комплекса бисметионилгистон Н1.3 - эндотоксин (как сильно положительно и сильно отрицательно заряженных молекул). Проводят очистку, элюируя с увеличением ионной силы подвижной фазы. Собирают основную фракцию, прибавляют к ней пропиловый спирт до его концентрации 10% об. и наносят полученный раствор на предварительно уравновешенную колонну, упакованную ВЭЖХ сорбентом. Проводят очистку, элюируя с увеличением содержания органического модификатора в подвижной фазе и/или с понижением рН подвижной фазы. Собирают основную фракцию. При этом использование промывки раствором 4 М мочевины на предыдущей стадии помимо неочевидного снижения количества бактериальных эндотоксинов, связанных с бисметионилгистоном Н1.3, позволяет реже проводить регенерацию ВЭЖХ-сорбента и в менее жестких условиях, что продлевает срок его службы. Полученный белковый раствор подвергают ультрафильтрации с использованием системы для тангенциальной ультрафильтрации, что приводит к доочистке и уменьшению объема раствора бисметионилгистона Н1.3. Полученный раствор подвергают лиофильной сушке под вакуумом до получения активной фармацевтической субстанции.

Таким образом, проводят следующие стадии очистки:

1) культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок;

2) разрушение биомассы дезинтеграцией;

3) экстракцию целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой;

4) очистку методом катионообменной хроматографии на сорбенте с использованием промывки сорбента 4 М мочевиной;

5) очистку методом ВЭЖХ;

6) концентрирование ультрафильтрацией с одновременной сменой буферной системы раствора белка;

7) лиофильную сушку с получением порошка очищенного бисметионилгистона Н1.3 в качестве фармацевтической субстанции.

Таким образом, техническим результатом изобретения является

- уменьшение стадий технологического процесса;

- проведение стадий очистки без применения денатурирующих условий;

- повышение чистоты конечного продукта до 98,5%;

- получение фармацевтической субстанции бисметионилгистона Н1.3 в качестве лиофильно высушенного порошка, более стабильного при хранении.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1

Культивирование клеток штамм-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание посевной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и канамицин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания рН 7,0, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 10 ОЕ (измерение проводят при длине волны 550 нм) проводят индукцию синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. Последующий биосинтез рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 проводят в течение 2 ч.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента в виде суспензии собирают на сепараторе. Клетки разрушают дезинтеграцией.

Из полученной суспензии разрушенных клеток выделяют целевой компонент с помощью экстракции 2,5%-ным водным раствором перхлорной кислоты в течение 1 ч при комнатной температуре. Образованный осадок отделяют от надосадочной жидкости центрифугированием. В надосадочной жидкости доводят рН до 3,0 с помощью 4 М гидроксида натрия. Полученный белковый раствор очищают с помощью катионообменной хроматографии.

Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом BioPro S75 (YMC Со, Германия), колоночный объем (КО) 60 мл. Готовят подвижную фазу «А», содержащую 10 мМ лимонной кислоты в воде для инъекций, рН 3,0. Готовят промывочный раствор «П» на основе фазы «А», содержащий 4 М мочевину, рН 3,0. Готовят подвижную фазу «Б», содержащую 10 мМ лимонной кислоты и 2 М хлорида натрия в воде для инъекций, рН 3,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч, пропуская через колонну не менее 3 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 6 КО/ч. Затем промывают сорбент с нанесенным белком промывочным раствором «П» 1 КО со скорость 6 КО/ч, промывают вновь 1 КО подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч. После этого элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 6 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Б» от 0 до 100% в течение 15 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПАГЭ) и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Фракции с чистотой не менее 95% объединяют, добавляют к ним этиловый спирт до его концентрации 10% об., очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом YMC Butil-15 микрон-30 нм (YMC Со, Германия), колоночный объем (КО) 80 мл. Готовят подвижную фазу «В», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 20% об. этилового спирта в воде для инъекций, рН 4,0. Готовят подвижную фазу «Г», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 50% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 2,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «В» со скоростью 7 КО/ч, пропуская через колонну не менее 1 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 5 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 5 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Г» от 0 до 100% в течение 10 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют. Полученный раствор насосом подают в систему тангенциальной ультрафильтрации, концентрируют до объема 20 мл, затем доливают в систему воды для инъекций (ВДИ) до объема 200 мл, концентрируют до 20 мл и эту операцию повторяют несколько раз. Полученный раствор анализируют на содержание высокомолекулярных примесей (методом Э-ВЭЖХ) и бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест). После раствор подвергают лиофильной сушке до получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3.

Пример 2

Культивирование клеток штамм-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание посевной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 200 л на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и канамицин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания рН 7,0, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 10 ОЕ (измерение проводят при длине волны 550 нм) проводят индукцию синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. Последующий биосинтез рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 проводят в течение 2 ч.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамм-продуцента в виде суспензии собирают на сепараторе до объема 70-80 л. Клетки разрушают на дезинтеграторе Гаулин.

Из полученной суспензии разрушенных клеток выделяют целевой компонент с помощью экстракции 2,5% перхлорной кислотой в течение 1 ч при комнатной температуре. Образованный осадок отделяют от надосадочной жидкости центирфугированием. В надосадочной жидкости доводят рН до 3,0 с помощью 4 М гидроксида натрия. Полученный белковый раствор очищают с помощью катионообменной хроматографии.

Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом Macro-prep HS (Bio-Rad lab., США), КО 5 л. Готовят подвижную фазу «А», содержащую 10 мМ лимонной кислоты в воде для инъекций, рН 3,0. Готовят промывочный раствор «П» на основе фазы «А», содержащий 4 М мочевину, рН 3,0. Готовят подвижную фазу «Б», содержащую 10 мМ лимонной кислоты и 2 М хлорида натрия в воде для инъекций, рН 3,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч, пропуская через колонну не менее 3 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 6 КО/ч. Затем промывают сорбент с нанесенным белком промывочным раствором «П» 1 КО со скорость 6 КО/ч, промывают вновь 1 КО подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 6 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Б» от 0 до 100% в течение 15 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 95% объединяют, добавляют к ним этиловый спирт до его концентрации 10% об., очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом Kromasil С4-16 микрон-30 нм (Eka Chemicals, Швеция), колоночный объем (КО) 3,5 л. Готовят подвижную фазу «В», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 20% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 4,0. Готовят подвижную фазу «Г», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 50% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 2,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «В» со скоростью 2 КО/ч, пропуская через колонну не менее 1 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 2 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 2 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Г» от 0 до 100% в течение 10 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют. Полученный раствор насосом подают в систему тангенциальной ультрафильтрации, концентрируют до объема 0,4 л, затем доливают в систему воды для инъекций (ВДИ) до объема 4 л, концентрируют до 0,4 л и эту операцию повторяют несколько раз. Полученный раствор анализируют на содержание высокомолекулярных примесей (методом Э-ВЭЖХ) и бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест). После раствор подвергают лиофильной сушке до получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 с хроматографической чистотой не ниже 98,5% (по результатам Э-ВЭЖХ) и содержанием эндотоксинов не выше 0,5 EU/мг (по ЛАЛ-тесту).

Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3, включающий культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок; разрушение биомассы дезинтегратором; экстракцию целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой; очистку методом катионообменной хроматографии с использованием промывки сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины; очистку методом ВЭЖХ; концентрирование ультрафильтрацией и лиофилизацию с получением порошка очищенного бисметионилгистона Н1.3 фармакопейного качества c чистотой 98,5%.



 

Похожие патенты:

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению ингибиторов ангиогенеза, и может быть использовано для лечения заболеваний, вызванных ангиогенезом, таких как опухоль или возрастная дегенерация макулы, диабетическая ретинопатия или хориоретинопатия.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения модифицированных молекул фактора VIII со сниженной иммуногенностью.

Представлены способ получения антитела, способ получения фармацевтического препарата, содержащего антитело, полученного указанным способом, молекула нуклеиновой кислоты, применение вектора, содержащего такую молекулу нуклеиновой кислоты, и применение клетки, в которую искусственно ввели указанные молекулу нуклеиновой кислоты или вектор в способе получения антитела.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков, и может быть использовано для получения поверхностно-активных белков.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам белка липокалина, а также к полученным на их основе специфично связывающимся терапевтическим или диагностическим белкам, направленным против гепсидина, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного белка TNFR1-Fc в клетках HEK293.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных пептидов, и может быть использовано в медицине. Способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина - производного модифицированного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, предусматривает культивирование штамма-продуцента Е.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантному получению антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα из лейкоцитов козы Capra hircus, который может найти применение в медицинской и ветеринарной практике в качестве антибиотика широкого спектра действия.

Представлены выделенный пищевой белок, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин и способ получения такого белка.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к выделенному пептиду, обладающему способностью к индукции цитостатических Т-лимфоцитов (CTL) в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC), несущих HLA-A*0201 или HLA-A*2402 антиген.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полипептидам для лечения или предотвращения аллергий на аллергены пыльцы трав Ph1P1, пыльцы березы Betv1 и клеща домашней пыли Derp2, что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способу выделения рекомбинантного белка, содержащего в своем составе последовательности миелопептидов и представленного последовательностью SEQ ID NO:1.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен экспрессионный вектор, содержащий экспрессионную кассету легкой цепи антитела, экспрессионную кассету тяжелой цепи антитела и экспрессионную кассету маркера селекции.

Настоящая группа объектов изобретения относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный мультимерный скаффолд на основе 3 домена FnIII тенасцина (Tn3), который специфически связывается с рецептором 2 TRAIL (TRAIL R2).

Изобретение относится к области биохимии. Предложено выделенное антитело или его функциональная часть, способное специфически связывать респираторно-синцитиальный вирус (РСВ).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков, и может быть использовано для получения поверхностно-активных белков.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к синтетическому конструкту двухцепочечной нуклеиновой кислоты для экспрессии множества гетерологичных генов в растительной клетке, характеризующемуся двунаправленным промотором, состоящему из первой цепи, содержащей элемент минимального корового промотора, и второй цепи, содержащей промотор бациллярного вируса сахарного тростника, а также к способу получения трансгенной растительной клетки или ткани, которые экспрессируют множество гетерологичных генов с его использованием.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен экзотоксин A Pseudomonas (РЕ), имеющий замену одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях L423, F443 и L477.

Представлены выделенный пищевой белок, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин и способ получения такого белка.
Наверх