Способ детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода барретта



Способ детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода барретта
Способ детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода барретта
Способ детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода барретта

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2635964:

федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет) (ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)) (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта. В образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР. При обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз. Изобретение обеспечивает повышение точности при диагностике риска малигнизации эпителия пищевода. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может найти применение в диагностике аденокарциномы пищевода (АКП) и прогнозе развития пищевода Барретта (ПБ).

В основе развития ПБ лежат процессы метаплазии эпителия пищевода, при которых вследствие рефлюкса желудочного сока и желчных кислот, нормальный плоскоклеточный эпителий пищевода замещается цилиндрическим эпителием кишечного типа, и затем ПБ прогрессирует до дисплазии и аденокарциномы (АК) пищевода. Прогрессия от предраковых состояний до опухоли связана с появлением в клетках нарушений генома, которые ассоциированы со злокачественной трансформацией. Генетические и эпигенетические изменения, обусловливающие опухолевый рост, могут служить маркерами прогноза клинического течения заболевания.

KazA. М. и соавт. в 2011 году опубликовали результаты полногеномных исследований профилей метилирования ДНК при ПБ и АК пищевода, в которых показали значительные различия в профилях метилирования этих процессов, а также позволили идентифицировать десятки генов, метилирование которых различается при этих состояниях [Kaz A.M., Wong C. J., LuoY., Virgin J.B., et al. DNA methylation profiling in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma reveals unique methylation signatures and molecular subclasses. Epigenetics. 2011; (6:12): 1403-1412]. Однако чтобы собрать метилированные гены в системы, которые можно использовать в практической медицине, необходимо проводить их исследование на различных выборках больных с получением статистически значимых ассоциаций.

Smith E. и соавт. (2008) определяли метилирование 9 генов (АРС, CDKN2A, ID4, MGMT, RBP1, RUNX3, SFRP1, TIMP3 и TMEFF2) в образцах пациентов с ПБ, АК пищевода и нормальном эпителии установили, что частота метилирования для CDKN2A и RUNX3 была значительно выше для АК по сравнению с образцами пациентов с ПБ [Smith E., De Young N.J., Pavey S.J., Hayward N.K., Nancarrow D.J., Whiteman D.C., et al. Similarity of aberrant DNA methylation in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Mol. Cancer. 2008; 7: 75].

ZheJinetal. (2009) в двойном-слепом мультицентровом исследовании изучили аномальное метилирование панели генов (р16, RUNX3, НРР1, NELL1, ТАС1, SST, AKAP12 и CDH13) в 195 образцах биопсий эпителия пищевода у больных пищеводом Барретта с целью использования данных маркеров для оценки риска прогрессии заболевания [Zhe Jin, Yulan Cheng, Wen Gu et al. А multicenter, double-blinded validation study of methylation biomarkers for progression prediction in Barrett's esophagus. Cancer Res. 2009; 69(10): 4112-4115]. Было показано, что метилирование генов НРР1, p16 и RUNX3 выявляется достоверно чаще при прогрессировании ПБ до дисплазии высокой степени и АК пищевода, (р=0.0025, 0.0066 и 0.0002 соответственно) в сравнении с остальными 5 маркерами из исследованной панели. Использование всей панели из 8 генов позволило выявить более 50% больных ПБ с прогрессией до дисплазии высокой степени и АК пищевода, которые не смогли выявить на столь раннем этапе диагностики без применения биомаркеров. Специфичность панели по данным авторов достигала 90%, а чувствительность достигала 50%.

Timmer M.R. et al. исследовали систему маркеров, в которую входили структурные изменения локусов 8q24 (MYC), 9р21 (CDKN2A/p16), 17q12 (erbB2/HER-2/Neu), и 20q13.2 (ZNF217). В материале, полученном от 181 пациентов с ПБ, у которых проводилось консервативное лечение с применением эндоскопической резекции слизистой в сочетании с медикаментозной терапией, исследовали структурные изменения локусов 8q24 (MYC), 9р21 (CDKN2A/p16), 17q12 (erbB2/HER-2/Neu), и 20q13.2 (ZNF217) [Timmer M.R., Brankley S.M., et al. Prediction of Response to Endoscopic Therapy of Barrett's Dysplasia using Genetic Biomarkers. Gastrointest Endosc. 2014; 80(6): 984-991]. Авторы наблюдали полную регрессию изменений слизистой у 72% больных и прогрессию у 16% пациентов. Изменения копийности исследуемых локусов изучаемой панели авторы наблюдали у 88/181 (44%) больных.

На сегодняшний день сертифицированных тест-систем и способов ДНК-диагностики не существует.

Задачей изобретения является ранняя диагностика аденокарциномы пищевода.

Поставленная задача решается способом детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта, заключающимся в том, что в образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР и при обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз.

Выделение геномной ДНК из опухолевого материала

Для получения ДНК ткани опухоли использовали следующий метод выделения ДНК.

Ткань опухоли или материал, полученный с помощью эндоскопии, отмывали 1 mlPBS, измельчали и затем гомогенизировали, растирая со стеклом.

Гомогенат переносили в пробирку, затем добавляли экстракционный буфер (10 мМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCl, рН=8,0) и протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0,5%.

Инкубировали 2 часа при 37°С до получения прозрачного раствора. Далее проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом с последующим центрифугированием и отбором верхней фазы.

Полученный в результате раствор ДНК перемешивали с 1/10 объема 5 М ацетата натрия, рН 5,3 и ДНК осаждали с помощью 2,5 объемов холодного 96% этанола, выдерживали образец 30 мин при температуре -70°С.

Пробу центрифугировали при 0°С 15 мин с ускорением 12000 g. Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8,0.

Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1 г ткани, в случае эндоскопического материала выход ДНК соответствовал примерно 5 мкг на образец.

После полного растворения ДНК измеряли ее концентрацию на спектрофлюориметре фирмы «Hoefer» (Германия) и снимали спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм с целью определения чистоты ДНК.

При этом проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах волн 230 нм/260 нм<0,5, 260 нм/280 нм>1,8. Максимум поглощения наблюдался в районе 260 нм.

Рестрикционный анализ

Для определения аномального метилирования проводилась обработка опухолевой ДНК соответствующей метилчувствительной рестриктазой HpaII по следующей схеме: к 1000 нг геномной ДНК добавляли 10 е.а. фермента и 2 мкл соответствующего 10×буфера, доводили до 20 мкл дистиллированной водой и оставляли на 10 часов в термостате при температуре, оптимальной для используемой рестриктазы.

Определение аномального метилирования промоторных областей генов-супрессоров опухолевого роста генов МGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3

Метилирование CpG-островков промоторных областей генов определяли при помощи метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин.

В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК гидролизованную метилчувствительными рестриктазами HpaII (CCGG) или HhaI (CGCG). Геномную ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед активной рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение ночи.

Для амплификации использовали 150 нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, который содержал не менее трех-четырех HpaII или HhaI сайтов. Количество сайтов указано в таблице 1.

В случае модификации цитозинов в метилцитозин ДНК не гидролизуется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования сайтов узнавания для используемых рестриктаз ДНК полностью гидролизуется и продукт ПЦР не образуется.

Для исключения ложноотрицательных результатов проводили мультилокусные ПЦР с двумя парами праймеров: один фрагмент принадлежал изучаемому гену {MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3), другой служил внутренним контролем ПЦР, фрагмент гена НВВ или фрагмент гена CUX1, не содержащие сайтов узнавания указанных рестриктаз (таблица 1).

ПЦР проводили по следующей схеме:

- к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 5 мМ MgCl2, 10% диметилсульфоксида;

- затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95°С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95°С - 30 с, отжиг и элонгация при 58-62°С - 2 мин 30 с.

Разделение продуктов ПЦР в 8%-ном полиакриламидном геле методом вертикального электрофореза.

Разделение ПЦР-продуктов по молекулярной массе при анализе метилирования проводили с помощью вертикального электрофореза в 8%-ном ПААГ следующего состава: 8.4 мл 30%-го раствора акриламида, 0.6 мл 10%-го персульфата аммония, 26 мкл ТЕМЕД, до 30 мл разведенного буфера ТВЕ. Персульфат аммония и ТЕМЕД вносят после всех остальных компонентов и тщательно перемешивают полученную смесь. Электрофорез проводят при напряжении 400 В с использованием камеры для вертикального фореза («Хеликон», Москва) в течение 2.0-3.0 часов.

В качестве контроля молекулярной массы ДНК используют ДНК стандартного молекулярного веса pUC19/Msp1. Визуальный контроль пробега проб ДНК проводят по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Окрашивание геля нитратом серебра для визуализации продуктов ПЦР проводят по приведенной ниже методике.

Ультратонкое окрашивание нитратом серебра

Окрашивание гелей проводят по усовершенствованной методике Liberman. После электрофореза гель инкубируют в растворе 0,011 М AgNO3 в течение 10-15 минут, затем трижды промывают в дистиллированной воде. Проявление проводят в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75 М NaOH; 0,5 М НСНО; 2,3 mM Na(BH4) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля.

Оптимальные критерии интерпретация результатов исследования

Если в ДНК, полученной из биопсийного материала или опухоли, присутствует аномальное метилирование промоторов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3, то цитозины в составе CpG-динуклеотидов заменены на 5-метилцитозины, в том числе в сайтах узнавания HpaII. В этом случае рестриктаза HpaII не в состоянии гидролизовать геномную ДНК в сайтах узнавания, матрица для МЧ-ПЦР остается интактной. В результате в окрашенном ПААГ видны фрагменты, соответствующие промоторным районам MGMT, CDH1, p16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 (рис. 1). В тех образцах, где метилирование генов отсутствует, происходит гидролиз геномной ДНК в сайтах узнавания HpaII. При первой денатурации матрица для ПЦР разрушается и ПЦР-продукт, соответствующий промотору гена, отсутствует в ПААГ. Внутренний контроль МЧ-ПЦР, не содержащий сайтов узнавания HpaII, должен присутствовать во всех анализируемых образцах. Отрицательный контроль не должен содержать фрагментов, соответствующих ПЦР-продуктам, в положительном контроле должны присутствовать ПЦР-продукты внутреннего контроля и промоторов исследуемых генов.

На фиг. 1 представлены примеры определения метилирования генов MGMT, CDH1, pl6/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом МЧ-ПЦР.

Цифрами обозначены ДНК пациентов с ПБ; положительный сигнал показан стрелкой и в положительных дорожках обозначен звездочками. На геле имеется фрагмент, соответствующий метилированной форме гена, и внутренний контроль ПЦР.

Способ обеспечивает повышение точности ранней ДНК-диагностики риска малигнизации эпителия пищевода. Специфичность предложенной и исследованной нами панели генетических маркеров составила 60%, а чувствительность 86%. У больных с аномальным метилированием вероятность прогрессии заболевания почти в 10 раз выше (OR=9,559).

У 60 больных, проходивших оперативное лечение в клинике факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по поводу рефлюкс-эзофагита, осложненного пищеводом Барретта, до и после операционного лечения выполняли исследование метилирования генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3. Из 60 пациентов с ПБ у 32 определяли метаплазию эпителия пищевода, у 28 - дисплазию эпителия. Также аномальное метилирование генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 исследовали в операционных образцах у 34 больных с аденокарциномой пищевода.

Было выявлено достоверное возрастание частоты метилирования генетических маркеров по мере прогрессирования стадии опухолевого процесса от IA и IIA до IIIC и IV (р=0,0084).

Аномальное метилирование исследуемой генетической панели у больных ПБ до хирургического лечения достоверно чаще наблюдали в измененном эпителии по сравнению с неизмененным (р<0,0001), при дисплазии, при сравнении с метаплазией (р=0,0358) и при наличии длинных (>3 см) сегментов измененного эпителия, выявленных в результате эндоскопического исследования, по сравнению с короткими (<3 см) (р=0,0068). В нормальном эпителии до операции аномальное метилирование панели генов определяли у 7/60(12%) пациентов. В измененном эпителии наблюдали статистически значимое снижение частоты метилирования после лечения (р=0,0024).

Гены, используемые нами в системе, характеризуются высокой частотой метилирования и клинически значимыми ассоциациями. В нашем исследовании мы не стремились определить частоты метилирования отдельных генов, а использовали все гены в панели, чтобы сделать различия более достоверными.

Специфичность предложенной и исследованной нами панели генетических маркеров {MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3) составила 60%, а чувствительность 86%. Таким образом, у больных группы мет + вероятность прогрессии заболевания почти в 10 раз выше (OR=9,559). При этом в нашем исследовании мы тестировали результаты проведенной антирефлюксной операции и соотносили его с показаниями эндоскопического исследования.

Анализируя полученные результаты, можно сказать, что использование предложенной нами системы молекулярно-генетических маркеров у больных пищеводом Барретта позволяет на раннем этапе диагностировать и осуществлять мониторинг данной группы пациентов с целью формирования группы риска развития АК пищевода.

Способ детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта, заключающийся в том, что в образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР и при обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии и микробиологии, и представляет собой способ прогнозирования развития атопического дерматита у младенцев путем определения гистидиндекарбоксилазной активности бактерий.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования развития рецидивов у больных раком слизистой оболочки полости рта.
Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования раннего рецидивирования поверхностного рака мочевого пузыря, включающего иммуноферментное исследование мочи и иммуногистохимическое исследование ткани опухоли, где у больных поверхностным раком мочевого пузыря в утренней порции мочи, собранной до операции, определяют уровень матриксной металлопротеиназы-2, рассчитывают соотношение фермента к уровню экскретируемого креатинина, а также в ткани опухоли, удаленной во время операции, определяют уровень экспрессии матриксной металлопротеиназы-2.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для лечения рака у пациента, обладающего мутацией AKT1 в положении L52 или D323. Определяют присутствие мутации L52 или D323 в гене AKT1 у пациента.

Изобретение относится к медицине, а именно к судебной медицине, и может быть использовано для определения причин летального исхода при тяжелом алкогольном отравлении по форме поражения печени.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для определения состояния здоровья женщины в периоде климактерия. Определяют степень тяжести симптомов приливов и степень тяжести симптомов потливости по 10-балльной визуально-аналоговой шкале.

Изобретение относится к медицине и, в частности, к вирусологии и инфекционным заболеваниям. Предложен способ выявления вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке путем определения в биопробе ДНК вируса методом ПЦР с дальнейшим секвенированием фрагментов.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК3) в вегетативных органах растений яблони, винограда, озимой пшеницы.

Изобретение относится к области медицины, а именно спортивной медицины, и предназначено для оптимизации дифференцированного преподавания физической культуры студентам с учетом их физической работоспособности и тренированности.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложены способ и набор для прогнозирования высокой вероятности положительного эффекта от лечения антагонистами VEGF у пациента с метастатическим раком молочной железы, где такой эффект определяют у пациента с генотипом VEGF (-1154АА).

Изобретение относится к сельскохозяйственной области биотехнологии и животноводству и касается способа оценки плодовитости свиней пород ландрас и крупная белая. Способ включает выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена LIF с использованием праймеров 5'-ATGTGGATGTGGCCTACGG-3' и 5'GGGAACAAGGTGGTGATGG-3', рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LIF эндонуклеазой рестрикции DraIII, определение генотипов и отбор животных с генотипом AA/LIF, причем один фрагмент размером 407 п.

Изобретение относится к молекулярной генетике. Описан способ определения полиморфизма генов, ассоциированных с летальным рецессивным генетическим дефектом крупного рогатого скота.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера.

Изобретение относится к области диагностической медицины. Образец цельной крови, собранный в антисвертывающий раствор, центрифугируют.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен суспензионный микрочип для мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, содержащий набор праймеров для выявления Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi, Bartonella, вируса энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, бабезиоза и эрлихиоза.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способ определения устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам второго ряда - фторхинолонам, аминогликозидам и капреомицину, наборы зондов детекции и праймеров амплификации и применение способа для подтверждения клинического диагноза туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью.

Изобретение относится к зонду для детекции полиморфизма V600 в гене BRAF. Изобретение представляет собой флуоресцентно меченый олигонуклеотид (Р1), который, по меньшей мере, на 80% идентичен последовательности оснований длиной от 10 до 50 оснований, включающей основания 228-237 последовательности оснований, указанной в SEQ ID NO:1, в котором основание, соответствующее основанию 237, представляет собой цитозин, меченный флуоресцентным красителем, причем олигонуклеотид распознает полиморфизм, по меньшей мере, в одном из оснований 228-230 последовательности оснований, указанной в SEQ ID NO:1, при условии, что олигонуклеотид отличается от олигонуклеотида, указанного в SEQ ID NO:7 или 19.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы.

Настоящее изобретение относится к биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путём амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S рРНК.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ прогнозирования чувствительности роста опухолевых клеток к подавлению ингибитором Wnt, набор для анализа, предназначенный для отбора больного раком, у которого согласно прогнозу может быть достигнут или не достигнут благоприятный результат от терапевтического введения ингибитора Wnt. Способ прогнозирования включает в себя стадии: определения в полученном у субъекта образце опухолевых клеток уровня биомаркера; сравнения уровня биомаркера в образце опухолевых клеток с контрольным уровнем биомаркера; отбора субъекта, у которого согласно прогнозу должен быть достигнут благоприятный результат от терапевтического введения ингибитора Wnt. Изобретение расширяет арсенал способов прогнозирования роста опухолевых клеток. 2 н. и 23 з.п. ф-лы, 8 ил., 10 табл., 4 пр.
Наверх