Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условия in vitro



Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условия in vitro
Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условия in vitro
Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условия in vitro

 


Владельцы патента RU 2636030:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия имени Я.И. Потапенко" (RU)

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для ввода меристем винограда в условия in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар, воду при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 350-450; калий азотнокислый 1000-1200; кальций азотнокислый 400-500; кальций хлористый 50-70; магний сернокислый 300-350; натрий фосфорнокислый 150-200; железо сернокислое 27,8-30,0; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3-40,0; борная кислота 6,0-6,4; марганец сернокислый 22,0-22,6; цинк сернокислый 8,0-9,2; калий йодистый 0,40-0,80; натрий молибденовокислый 0,2-0,3; медь сернокислая 0,02-0,03; кобальт хлористый 0,02-0,03; миоинозит 50-100; тиамин 0,2-0,5; пиридоксин 0,2-0,5; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза 20000-30000; агар 5000-6000; вода остальное до 1,0 л. Изобретение обеспечивает повышение приживаемости и регенерации меристем, способствует пропорциональному уменьшению расходования минеральных солей. 1 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в питомниководстве при получении оздоровленного посадочного материала винограда при помощи методов клонального микроразмножения.

Известны питательные среды различного минерального состава, предназначенные для культивирования ягодных и плодовых растений in vitro (Шипунова А.А. Подбор минеральной основы питательных сред для клонального микроразмножения жимолости в производственных условиях / А.А. Шипунова, В.А. Высоцкий / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. нуч. работ / ВСТИСП. - М., 2001. Т. VII. С. 158-163). При этом наиболее часто для введения и оздоровления плодовых и ягодных культур при помощи метода апикальных меристем в культуре in vitro исследователи используют пропись, разработанную Мурасиге и Скуга (МС) [Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5., 95 - P. 473-497). Для эффективного применения минеральной основы (МС) оптимизируют состав среды, изменяя гормональный фон, а также вводя различные добавки в виде аминокислот, витаминов, полисахаридов (патент РФ №2063682), препаратов нового поколения (патент РФ №2265319). Значительно реже изменяют минеральный состав. При этом минеральный состав среды Мурасиге и Скуга (МС) для ввода меристем растений в культуру in vitro обладает рядом недостатков, так как разрабатывался для культивирования каллусов и каллусных клеток и учитывает, прежде всего, условия для их развития. Концентрация минеральных солей в данной среде 4,5 г/л, при этом для поглощения растворенных в ней элементов растению требуется преодолевать осмотическое давление порядка 2,5 атмосфер. В нашем случае это не растение, а предельно малый участок апикальной меристемы. Соотношение и концентрации макроэлементов в среде не учитывают потребности в них растений винограда, что в короткий отрезок времени при неравномерном их поглощении растением приводит к сдвигу рН и, как следствие, требует частых пересадок конгломератов растений на свежую питательную среду.

Наиболее близким к предлагаемому решению является питательная среда Ml, разработанная для ввода растений винограда в культуру in vitro П.Я. Галодригой и др. (Голодрига П.Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / П.Я. Голодрига и др. / Ялта: Издательская группа ВНИИ ВиПП «Магарач», 1986 - 56 с.). Минеральной основой, которой является среда (МС), к составу которой добавлено 170 мг/л NaH2PO4, остальные макро- и микроэлементы по прописи, витамины: мезоинозит 75 мг, парааминобензойная кислота 5 мг/л, тиамин 10 мг/л, пиридоксин 5 мг/л, никотиновая кислота 4 мг/л, аминокислоты: глутамин 50 мг/л, глицин 10 мг/л, 6-бензиладенин 1 мг/л, аденин сернокислый 80 мг/л, сахароза 30 г/л.

Недостатком данной среды для ввода является высокое осмотическое давление раствора из-за большой концентрации макроэлементов - 4,7 г/л, что при введении меристем предельно малых размеров (для винограда 0,1÷0,2 мм) негативно сказывается на их регенерации. Кроме того, высокое содержание аммиачной формы азота, хлора, несбалансированное содержания макроэлементов часто провоцирует рост каллусной ткани, преждевременный некроз и старение эксплантов.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является создание питательной среды для ввода меристем винограда в условия in vitro, способствующей повышению приживаемости и надежности регенерации меристем у различных сортов винограда, уменьшению расходования минеральных солей, снижению себестоимости технологии на этапе ввода и оздоровления в культуре in vitro.

Задача решается с помощью оптимизации концентраций и соотношения макросолей. Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условия in vitro содержит аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар, воду при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 350-450; калий азотнокислый 1000-1200; кальций азотнокислый 400-500; кальций хлористый 50-70; магний сернокислый 300-350; натрий фосфорнокислый 150-200; железо сернокислое 27,8-30,0; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3-40,0; борная кислота 6,0-6,4; марганец сернокислый 22,0-22,6; цинк сернокислый 8,0-9,2; калий йодистый 0,40-0,80; натрий молибденовокислый 0,2-0,3; медь сернокислая 0,02-0,03; кобальт хлористый 0,02-0,03; миоинозит 50-100; тиамин 0,2-0,5; пиридоксин 0,2-0,5; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза 20000-30000; агар 5000-6000; вода остальное до 1,0 л.

Заявленное решение отличается от прототипа тем, что в 1,8-2 раза снижена концентрация солей в питательной среде, при этом изменено и сбалансировано соотношение этих солей с учетом потребностей виноградного растения. Так изменено соотношение азота и калия, содержание хлора уменьшено в 9 раз, изменено соотношение фосфора и магния до оптимальных величин. В качестве источника фосфора используется только NaH2PO4, что способствует повышению буферных свойств питательной среды, предотвращая снижение значений рН, которое происходит после стерилизации среды в автоклаве и культивирования пробирочных растений. Кроме того, в среде применяются два источника кальция CaCl2 и Ca(NO3)2⋅4H2O, что положительно влияет на приживаемость и регенерацию меристем предельно малых размеров, при этом сниженная концентрация CaCl2 является дополнительным источником Са и Cl для растений винограда, а также помогает предотвратить повышение значений рН выше оптимальных значений. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявленного решения критерию "новизна".

Заявленное решение обладает изобретательским уровнем, так как не является очевидным для специалистов питомниководов и биотехнологов, а является продуктом творческой деятельности автора изобретения.

Заявленное техническое решение соответствует и другому требуемому критерию изобретения - промышленному применению, что подтверждено экспериментальными данными, полученными при реализации способа.

На Фиг. 1 представлены сравнительные характеристики разработанной питательной среды и прототипа по соотношению макроэлементов относительно азота (А) и концентрации макроэлементов по действующему веществу (Б).

Предлагаемое снижение концентрации макросолей и оптимизация их соотношения пропорционально уменьшают высокое осмотическое давление в питательной среде и способствуют более сбалансированному поступлению питательных элементов в ткани меристем, что положительно сказывается на их развитии после высадки в условия in vitro.

Пример осуществления способа.

В питательную среду вносят следующие компоненты (концентрации в мг), макроэлементы: NH4NO3 - 350-450; KNO3 - 1000-1200; NaH2PO4 - 150-200; MgSO4⋅7H2O - 320-340, Ca(NO3)2⋅4H2O - 400-500; CaCl2 50-80; мезоэлементы: FeSO4⋅7H2O - 27,8-30,0; Na2 ЭДТА⋅2H2O - 37,3-40,0; микроэлементы: H3BO3 - 6,0-6,4; MnSO4⋅4H2O - 22,0-22,6; ZnSO4⋅7H2O - 8,0-9,2; KJ - 0,40-0,80; Na2MoO4 - 0,2-0,3; CuSO4⋅5H2O - 0,02-0,03; CoCl2⋅6H2O - 0,02-0,03; витамины: миоинозит - 50-100; тиамин и пиридоксин, по 0,2-0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза - 20000-30000; агар - 5500-6500; остальное бидистиллированная вода до 1000,0.

В начале объем раствора доводят до 0,5 л, устанавливают pH 5,6-5,7 и добавляют 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения, для полного расплавления и растворения агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,7-1,0 атм (температура 119-121°C) в течение 20-25 мин. После остывания среды осуществляют высадку эксплантов.

Испытание разработанной прописи макроэлементов показало эффективность ее применения на большинстве сортов. При этом наибольший эффект получен на сортах Илья и Магия. Таким образом, установлено, что оптимизация концентраций и соотношения в питательной среде: NH4 и NO3, общего N и K, K и Ca, P и Mg, и уменьшение содержания Cl, а также добавление оптимальной концентрации Na - способствует повышению адаптивности растений винограда к условиям культивирования in vitro до 40% (в зависимости от сорта).

Из приведенных данных в Табл. 1 видно, что кратное уменьшение стандартной прописи Мурасиге и Скуга для большинства сортов недостаточно. При снижении общей концентрации макросолей среды до 1/2 такие макроэлементы, как фосфор и магний, оказываются в питательной среде в недостаточном количестве для полноценного развития меристем. При этом все еще достаточно высокая концентрация аммиачной формы азота в нитрате аммония (NH4HO3) способствует развитию некрозов и каллусной ткани.

Испытание разработанной прописи макроэлементов на фоне прототипа (Табл. 2) показало эффективность ее применения на различных сортах винограда. В вариантах с предложенной средой была лучше приживаемость меристем, стабильно увеличивалось число хорошо развитых меристем, а также снижалось число отбракованных эксплантов из-за некроза или отсутствия развития. При этом наибольший эффект получен на сортах Илья и Магия, которые при использовании прототипа регенерировали слабо, проявляя сортовую специфичность к культивированию in vitro.

Таким образом, предложена новая рецептура макроэлементов для питательной среды на этапе ввода растений винограда в культуру in vitro с учетом потребностей виноградного растения. Оптимизированы концентрации и соотношения в питательной среде: NH4 и NO3, общего N и K, K и Ca, P и Mg, уменьшено содержание Cl в 9 раз, все это способствует повышению адаптивности растений винограда к условиям культивирования in vitro в среднем по сортам на 20-25%.

Использование предложенной питательной среды для ввода и регенерации меристем винограда в условия in vitro обеспечивает по сравнению с существующей следующие преимущества:

1. Повышается приживаемость и качество меристем при вводе в культуру in vitro.

2. Снижается проявление сортовой специфичности к культуре in vitro, предложенная среда дает стабильные результаты на большинстве сортов.

3. Снижается количество отбракованных меристем из-за некроза и отсутствия развития.

4. Снижается себестоимость технологии за счет уменьшения концентраций применяемых минеральных солей в питательной среде в 1,8-2 раза.

Питательная среда для ввода меристем винограда в условия in vitro, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар, воду при следующем соотношении компонентов, мг/л:

Аммоний азотнокислый 350-450
Калий азотнокислый 1000-1200
Кальций азотнокислый 400-500
Кальций хлористый 50-70
Магний сернокислый 300-350
Натрий фосфорнокислый 150-200
Железо сернокислое 27,8-30,0
Этилендиаминотетраацетат натрия 37,3-40,0
Борная кислота 6,0-6,4
Марганец сернокислый 22,0-22,6
Цинк сернокислый 8,0-9,2
Калий йодистый 0,40-0,80
Натрий молибденовокислый 0,2-0,3
Медь сернокислая 0,02-0,03
Кобальт хлористый 0,02-0,03
Миоинозит 50-100
Тиамин 0,2-0,5
Пиридоксин 0,2-0,5
6-Бензиламинопурин 0,2-0,5
Сахароза 20000-30000
Агар 5000-6000
Вода остальное до 1,0 л



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства, в частности к растениеводству. В способе клональное размножение оздоровленных растений осуществляют путем черенкования.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к растениеводству и питомниководству. Способ включает использование в качестве исходных эксплантов одно- и двухузловых сегментов весенних или летних побегов, их стерилизацию, выгонку пазушных побегов, мультипликацию и укоренение, которое осуществляется на питательной среде 1/2 WPM, перевод растений к нестерильным условиям и высаживание в грунт.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения микрорастений березы в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов на питательной среде MS без гормонов с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты 2,0 мг/л, с добавлением агар-агара 6 г/л при хранении пробирочных растений при температуре +4…+7°С в темноте.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Способ включает культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту и сахарозу, получение растений-регенерантов и получение микроклубней картофеля.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения растений сем.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности культивирования in vitro березы повислой, лимонника китайского, рододендрона и сирени, включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах в течение трех недель в сочетании с микрочеренкованием побегов, допуская на экспланте не более двух пазушных почек.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro путем введения в культуру клеток семян с целью каллусообразования и последующей регенерации растений, заключающийся в том, что стерилизованные семена помещают на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 0,7% агар-агара, 1 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-1 мг/л индолил-3-уксусной кислоты, доведенную до 1 л стерильной дистиллированной водой, культивируют в течение одного пассажа до появления каллуса, не более 26 суток, затем каллусы пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга с половинной концентрацией всех компонентов и 0,7% агар-агара, добавляют 0,2-1 мг/л 6-бензиламинопурина и культивируют 2-4 пассажа до появления растений-регенерантов.
Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Изобретение представляет собой способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике, в котором клональное размножение растений осуществляют путем черенкования регенерантов и укоренения черенков на питательной среде, где укоренение черенков проводят в автотрофных условиях на гидропонике с использованием жидких питательных сред, содержащих только минеральные элементы, культивирование растений осуществляют при нормальных, либо повышенных концентрация СО2 в посеве, при интенсивности облучения посева не менее 60 Вт ФАР/м2, орошение и аэрация оснований черенков и корневой системы растений производят путем периодического подтопления их питательным раствором.

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, включающий выделение почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2.0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового и помещение их на агаризованную питательную среду Гамборга В5, где вначале отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывают в проточной водопроводной воде (10 мин) и после поверхностной стерилизации при встряхивании отделенные пазушные почки культивируют на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями являются растения-регенеранты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ адаптации растений-регенерантов земляники, включающий этап адаптации, где растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания кремнийсодержащего механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой.
Наверх