Способ получения биопрепарата для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии и экологии. Предложен способ получения биопрепарата для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Способ включает смешивание и культивирование штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ-В-3780, Acinetobacter radioresistens BКПM-В-2838, Acinetobacter radioresistens BКПM-B-5064 до достижения оптической плотности суспензии ОD=0,6-0,8, концентрирование до 1-5×10¹¹ клеток/мл, лиофильную сушку при остаточном давлении 30-50 Па, температуре источника теплоты 40°С до остаточной влажности 0,5-1% и упаковку в герметичную тару в среде инертного газа. Изобретение позволяет получить препарат длительного хранения для эффективной утилизации нефтяных загрязнений. 2 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и экологии и может быть использовано для микробиологической очистки почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Экологически перспективными являются микробиологические способы очистки от нефтезагрязнений.

Значительной эффективностью из известных препаратов характеризуются составы на основе микроорганизмов разных таксономических групп, избирательно разлагающих различные углеводородные фракции. Однако включение в состав биопрепарата микроорганизмов различной видовой, родовой принадлежности и даже организмов из разных доменов (бактерии и дрожжи) требует раздельного культивирования, что существенно удорожает процесс получения препарата. Кроме того, между такими организмами может существовать конкуренция за источники питания, в результате чего могут выжить не все виды из заявленных.

Одними из эффективных нефтедеструкторов признаны бактерии рода Acinetobacter. Они используются в качестве монокультуры или в составе биопрепаратов. Однако многие из существующих на сегодняшний день биопрепаратов либо не отличаются высокой эффективностью, либо сложны и дорогостоящи в производстве. Кроме того, часто в состав таких препаратов включаются представители Acinetobacter (А.) с неясным таксономическим положением.

Среди отечественных препаратов для биоразложения нефтепродуктов, содержащих в своем составе представителей рода Acinetobacter, известен биопрепарат «Экойл» [РФ №2191752, МПК C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/26; 1999] на основе бактерий Rhodococcus sp. 56д, Mycobacterium sp. ИЖ 4, Mycobacterium flavescens ВКПМ B-6000, Acinetobacter sp. HB-1. Известен также способ микробиологической очистки объектов от нефтяных загрязнений [РФ №2067993, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10; 1996] на основе штаммов Acinctobacter sp. (bicoccum) ВКПМ В-6445, или Rhodococcus sp. BКПMS -1213, или Arthrobacter sp. S-1212. Согласно формулам вышеуказанных изобретений, данные культуры рекомендованы к раздельному применению, а использование монокультуры менее эффективно из-за специфичности используемого организма к субстрату.

По той же причине малоэффективны известные отдельные штаммы рода Acinetobacter, способные к деструкции углеводородов нефти [РФ №2081910, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, 1997; РФ №2081909, МПК C12N 1/20, 1997; РФ №2081908 МПК C12N 1/20, В09С 1/10, C02F 3/34, 1997; РФ №2081907, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, 1997; РФ №2077579, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, 1997; РФ №2076150, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, 1997; РФ №2064017, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, 1996].

Известен консорциум штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas fluorescens, Alcaligenes faecalis для деструкции нефтепродуктов [РФ №2107722, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, 1998]. Известна биологически активная композиция для очистки поверхностных вод, почв и грунтов от нефтяных загрязнений [РФ №2270808, МПК C02F 3/34, В09С 1/10, 2003], включающая ассоциацию нефтеокисляющих бактериальных культур, торф и комплексное минеральное удобрение. В качестве ассоциации нефтеокисляющих бактериальных культур содержит Pseudoamycolata halophobica ВСБ-753, Kibdelosporangium aridum ВСБ-754, Acinetobacter oleovorum ВСБ-712, Rhodococcus erytropolis HX7 в объемном соотношении между собой 1:1:1:1. Известен препарат "Лессорб-био" [РФ №2193533, МПК C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, 1999] на основе бактерий Mycobacterium flavescens ЕХ-91, Mycobacterium sp ИЖ4, Rhodococcus sp. 56д, Acinetobacter sp. HB-1). Известен способ очистки воды и почвы от нефтепродуктов [РФ №2014286, МПК C02F 3/34, Е02В 15/04, 1994] на основе бактерий Candida tropicalis - Mycococcus lactis или Mycococcus lactis - Mycococcus lactis, или Candida guillermondii - Acinetobacter oleovorum subsp. paraphinicum. Недостатком всех вышеупомянутых способов является то, что все комплексные препараты, содержащие бактерии разных таксономических групп, при подготовке требуют раздельного культивирования, что усложняет и удорожает процесс получения препаратов.

Известен способ очистки объектов окружающей среды от нефтепродуктов [РФ №2053204, МПК C02F 3/34, Е02В 15/04, 1996], основанный на использовании бактерий Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum - ВКПМ-В-6727 H-1; Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum ВКПМ-В-6728 G-1; Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum ВКПМ-В-6726 C-2, входящих в состав одного рода.

Однако в примерах проиллюстрированы опыты только с низкими концентрациями нефтепродуктов в жидкой среде или с загрязненным на 0,5% песком. Недостатком консорциума является низкая окислительная способность. Кроме того, все заявленные виды и подвиды не валидированы.

Известен способ получения и использования биопрепарата на основе консорциума штаммов рода Acinetobacter (В-2838, В-5064 и В-3780) в его составе [http://biomolecula.content/948].

Недостатком способа является отсутствие режимных границ культивирования суспензии, ее концентрирования и лиофильной сушки.

Наиболее близким к заявляемому является консорциум штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas fluorescens, Alcaligenes faecalis для деструкции нефти и нефтепродуктов [РФ №2107722, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, C12R 1/27, C12R 1/01; 1998], в примерах получения которого указана лиофильная его форма.

Однако недостатком известного способа является невозможность получить препарат длительного хранения с высокой концентрацией жизнеспособных микроорганизмов, восстанавливать функциональную активность бактериальных клеток и получать жидкую форму препарата с различной заданной степенью концентрирования, а также обеспечивать необходимые условия для функционирования бактерий нефтедесрукторов в обедненных почвах, что не позволяет эффективно утилизировать нефтяные загрязнения.

Технической задачей изобретения являлось получение препарата длительного хранения с высокой концентрацией жизнеспособных микроорганизмов, возможность восстанавливать функциональную активность бактериальных клеток и получать жидкую форму препарата с различной заданной степенью концентрирования, а также обеспечивать необходимые условия для функционирования бактерий нефтедесрукторов в обедненных почвах, снизить поверхностное и межфазовое натяжения при биоремедиации, а также солюбилизация и эмульгирование углеводородов, что позволяет эффективно утилизировать нефтяные загрязнения.

Техническая задача изобретения достигается тем, что в способе получения биопрепарата для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, включающем в себя смешивание и культивирование штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ-В-3780, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-2838, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-5064, создание на их основе консорциума, новым является то, что культивирование осуществляют до достижения оптической плотности суспензии OD=0,6-0,8, концентрирование до 1-5×10¹¹ клеток/мл, лиофильную сушку при остаточном давлении 30-50 Па, температуре источника теплоты 40°С до остаточной влажности 0,5-1% и упаковку в герметичную тару в среде инертного газа.

Технический результат изобретения заключается в получении препарата длительного хранения с высокой концентрацией жизнеспособных микроорганизмов, возможности восстанавливать функциональную активность бактериальных клеток и получать жидкую форму препарата с различной заданной степенью концентрирования, а также в обеспечении необходимых условий для функционирования бактерий нефтедесрукторов в обедненных почвах, в снижении поверхностного и межфазового натяжения при биоремедиации, а также солюбилизации и эмульгировании углеводородов, что позволяет эффективно утилизировать нефтяные загрязнения.

Ниже приведены Таблица 1 чувствительности штаммов бактерий А. calcoaceticus В-3780, A. radioresistens В-2838, A. radioresistens В-5064 к антибиотикам и Таблица 2 результатов удельной скорости деструкции нефтепродуктов для консорциумов микроорганизмов, полученных различными способами.

Исследованные штаммы способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии следующие углеводороды:

A. calcoaceticus В-3780: декан, гептан, октан, гексадекан, ундекан, циклогексан, ксилол, толуол, бензол, нафталин, фенантрен.

A. radioresistens В-2838: декан, гептан, октан, ундекан, ксилол, толуол, бензол, нафталин, фенантрен, антрацен.

A. radioresistens В-5064: декан, гептан, октан, ундекан, циклогексан, фенантрен, антрацен, ксилол, толуол, бензол, этилбензол.

Чувствительность к антибиотикам изучена с использованием бумажных дисков, содержащих стандартные концентрации: ампициллина, цефокситина, цефтазидима, цефатоксима, стрептомицина, гентамицина, офлоксацина, ципрофлоксацина, цефазолина, эритромицина, фурагина, фурадонина, левомицитина, тетрациклина. Все изученные штаммы оказались резистентны к левомицитину, фурадонину, эритромицину, цефазолину, офлоксацину и чувствительны к тетрациклину, ципрофлоксацину и гентамицину. Отдельные штаммы чувствительны к ампицилину, цефтазидиму и стрептомицину (табл. 1).

Все штаммы обладают биоэмульгирующей активностью. Причем А. calcoaceticus продуцирует внеклеточный высокоактивный сурфактант, который демонстрирует высокую эмульгирующую активность в отношении нефтепродуктов, гексадекана, вазелинового масла. Штаммы A. radioresistans продуцируют биосурфактант аласан - высокомолекулярный комплекс белков и полисахаридов, стабилизирующий различные масляно-водные эмульсии, включающие н-алканы с длиной цепи 10 и более углеродных атомов, алкилароматические углеводороды, жидкий парафин и сырую нефть.

Штаммы не требовательны к составу среды и способны быстро накапливать биомассу.

Штаммы обладают синергизмом в деградации углеводородов нефти. Так, штамм В-2838 преимущественно расщепляет парафины С6-С22, высокую активность он проявлял при деструкции бензина, ДТ; штамм В-5064 - н-парафины, этанол, сырую нефть, а штамм В-3780 способен также к деградации метанола и формальдегида. Синергизм действия подобранных штаммов проявляется также в сочетании высокой эмульгирующей активности штамма В-3780 и значительной нефтеокисляющей способности штаммов В-2838 и В-5064.

Способ получения биопрепарата для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов включает в себя смешивание и культивирование штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ-В-3780, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-2838, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-5064, создание на их основе консорциума. При этом культивирование осуществляют до достижения оптической плотности суспензии OD=0,6-0,8, концентрирование до 1-5×10¹¹ клеток/мл, а затем лиофильную сушку при остаточном давлении 30-50 Па, температуре источника теплоты 40°С до остаточной влажности 0,5-1% и упаковку в герметичную тару в среде инертного газа.

Пример 1

Для получения биомассы консорциума штаммов бактерий ВКПМ-В-7179 штамм 279, ВКПМ-В-7152 штамм 325, ВКПМ-В-7180 штамм 404 их выращивают на жидкой среде N10 следующего состава: (NH₄)₂SO₄ - 3 г/л, KH₂PO₄ - 6,5 г/л, MgSO₄×7H₂O - 0,7 г/л, FeSO₄×7H₂O - 12,5 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 12,5 мг/л, MnSO₄×5H₂O - 12,5 мг/л.

В качестве единственного источника углерода используют н-парафины Грозненского НПЗ, полученные карбамидной депарафинизацией с высоким содержанием ароматических углеводородов в концентрации 1 мас. %. Засев минеральной среды производится по 0,05 единиц оптической плотности каждого штамма в одну качалочную колбу. Культивирование проходит при температуре 3-6°С на качалке с 140 об/мин, рН среды 6,8-7,0.

Пример 2

Штаммы A. calcoaceticus В-3780, A. radioresistens В-5064 и А. radioresistens В-2838 раздельно культивируются на твердой питательной среде в течение 24 часов при температуре 6°С. Состав твердой среды: дрожжевой экстракт - 5,0%; пептон - 15,0%; NaCl - 5,0%; агар-агар - 15%.

Далее культуры пересевают раздельно в жидкую питательную среду состава: дрожжевой экстракт - 5,0%; пептон - 15,0%; NaCl - 5,0%. Культивирование инокулята происходит при 6°С в течение 48 ч при 30°С.

Для изготовления биопрепарата используют питательную среду MS следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 15,0; NaCl - 5,0. Проводят инокуляцию клеточными суспензиями раздельно выращенных штаммов A. calcoaceticus В-3780, A. radioresistens В-5064 и А. radioresistens В-2838. Суспензии вносят в биореактор в соотношении 1:1:1, общим количеством - 5,6% от объема среды. Совместное культивирование проводят при температуре 6°С, постоянном перемешивании и аэрации до достижения оптической плотности суспензии OD=0,6-0,8.

Далее происходит концентрирование до 1-5×10¹¹ клеток/мл путем центрифугирования или ультрафильтрации, лиофильная сушка при остаточном давлении 30-50 Па, температуре источника теплоты 60°С до остаточной влажности 0,5-1% и упаковка в герметичную тару в среде инертного газа.

Пример 3

Штаммы A. calcoaceticus В-3780, A. radioresistens В-5064 и А. radioresistens В-2838 раздельно культивируются на твердой питательной среде в течение 24 часов при температуре 30°С. Состав твердой среды: дрожжевой экстракт - 5,0%; пептон - 15,0%; NaCl - 5,0%; агар-агар - 15%.

Далее культуры пересевают раздельно в жидкую питательную среду состава: дрожжевой экстракт - 5,0%; пептон - 15,0%; NaCl - 5,0%. Культивирование инокулята происходит при 30°С в течение 48 ч при 30°С.

Для изготовления биопрепарата используют питательную среду MS следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 15,0; NaCl - 5,0. Проводят инокуляцию клеточными суспензиями раздельно выращенных штаммов A. calcoaceticus В-3780, A. radioresistens В-5064 и А. radioresistens В-2838. Суспензии вносят в биореактор в соотношении 1:1:1, общим количеством - 5,6% от объема среды. Совместное культивирование проводят при температуре 30°С, постоянном перемешивании и аэрации до достижения оптической плотности суспензии OD=0,6-0,8.

Далее происходит концентрирование до 1-5×10¹¹ клеток/мл путем центрифугирования или ультрафильтрации, лиофильная сушка при остаточном давлении 30-50 Па, температуре источника теплоты 40°С до остаточной влажности 0,5-1% и упаковка в герметичную тару в среде инертного газа.

Результаты удельной скорости деструкции нефтепродуктов согласно примерам приведены в Таблице 2 (табл. 2).

Полученный консорциум микроорганизмов позволяет обеспечить эффективное использование биопрепарата для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов по схеме, которая включает ресуспендирование биопрепарата, внесение в почву консорциума бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ-В-3780, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-2838, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-5064 Ресуспендирование биопрепарата осуществляют водой при температуре 35°С, в течение 8-12 ч, а затем вносят соли азота, фосфора и калия в качестве источников биогенных элементов, после чего почву инокулируют полученной суспензией бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ-В-3780, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-B-2838, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-5064, создавая стартовую концентрацию нефтедеструкторов в диапазоне 10⁸-10¹⁰ кл/г почвы. После внесения микробной суспензии почву дополнительно перемешивают.

При использовании предлагаемого консорциума для очистки от нефти и нефтепродуктов количество и состав водного раствора минеральных компонентов питания подбирается в зависимости от условий применения по концентрациям основных питательных веществ, определяющих развитие предлагаемых штаммов бактерий, а также с учетом имеющихся их в среде очищаемого объекта.

Преимущества способа заключаются в том, что:

- осуществление совместного культивирования до достижения оптической плотности суспензии OD=0,6-0,8, концентрирования до 1-5×10¹¹ клеток/мл, лиофильной сушки при остаточном давлении 30-50 Па, температуре источника теплоты 40°С до остаточной влажности 0,5-1% и упаковку в герметичную тару в среде инертного газа позволяет получить препарат длительного хранения с высокой концентрацией жизнеспособных микроорганизмов.

- получение лиофилизированной формы препарата позволяет путем последующего ресуспендирования биопрепарата водой при температуре 35°С в течение 8-12 ч восстановить функциональную активность бактериальных клеток и получить жидкую форму препарата с различной заданной степенью концентрирования;

- внесение в ресуспендированный биопрепарат солей азота, фосфора и калия в качестве источников биогенных элементов обеспечивает необходимые условия для функционирования бактерий нефтедесрукторов в обеденных почвах;

- возможность создания оптимальной стартовой концентрации нефтедеструкторов в диапазоне 10⁸-10¹⁰ кл/г почвы при дополнительном перемешивании почвы позволяет эффективно утилизировать нефтяные загрязнения.

Способ получения биопрепарата для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, включающий в себя смешивание и культивирование штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ-В-3780, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-2838, Acinetobacter radioresistens ВКПМ-В-5064, создание на их основе консорциума, отличающийся тем, что культивирование осуществляют до достижения оптической плотности суспензии OD=0,6-0,8, концентрирование до 1-5×10¹¹ клеток/мл, лиофильную сушку при остаточном давлении 30-50 Па, температуре источника теплоты 40°C до остаточной влажности 0,5-1% и упаковку в герметичную тару в среде инертного газа.