Фармацевтические композиции на основе shk и способы их получения и использования

Группа изобретений относится к области медицины и предназначена для лечения аутоиммунных нарушений. Фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемую соль полипептида ShK, состоящего из последовательности SEQ ID №1, прикрепленной к химической частице посредством аминоэтилоксиэтилоксиацетилового (АЕЕАс) линкера. Указанная химическая частица выбрана из группы, состоящей из AEEAc-L-Pmp(ОН₂); АЕЕАс-D-Pmp(ОН₂); АЕЕАс-D-Pmp(ОН, Et); АЕЕАс-L-Pmp(Et₂); АЕЕАс-D-Pmp(Et₂); АЕЕАс-L-Tyr; АЕЕАс-L-Tyr(PO₃H₂); АЕЕАс-L-Phe(p-NH₂); АЕЕАс-L-Phe(р-CO₂H); АЕЕАс-L-аспартата; AEEAc-D-аспартата; АЕЕАс-L-глутамата; и AEEAc-D-глутамата, и С-конец полипептида представляет собой кислоту или амид. Также композиция содержит поверхностно-активное вещество в количестве, эффективном для того, чтобы растворять указанный полипептид ShK в водном носителе. рН указанной фармацевтической композиции составляет 5-7. Кроме того, обеспечиваются изделия для лечения аутоиммунных заболеваний, включающие указанную композицию, и способ изготовления указанной фармацевтической композиции. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 7 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивают приоритет предварительных заявок США №№ 61/493,868, которая подана 6 июня 2011 года, и 61/625,578, которая подана 17 апреля 2012 года, обе они включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ РАСКРЫТИЯ

Композиции и способы, описанные в настоящем документе, относятся в целом к использованию фармацевтических композиций на основе SHK для того, чтобы лечить, предотвращать и/или облегчать симптомы, связанные с заболеваниями и нарушениями, в которых T-клетки памяти играют определенную роль, включая аутоиммунные заболевания и метаболические нарушения.

СООБЩЕНИЕ ОБ ИНТЕРЕСАХ ПРАВИТЕЛЬСТВА

Правительство Соединенных Штатов имеет права на настоящее раскрытие в соответствии с грантами National Institutes of Health National Institute of Allergy and Infectious Diseases R43AI085691 и NIH R01 NS48252.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ РАСКРЫТИЯ

Многие связанные с иммунитетом заболевания и метаболические нарушения человека приписывают действию T-клеток памяти. Такие связанные с иммунитетом заболевания включают, среди прочих, аутоиммунные заболевания, такие как рассеянный склероз, сахарный диабет 1 типа, ревматоидный артрит и псориаз. Примеры метаболических нарушений включают ожирение, диабет 2 типа, гиперхолестеринемию, заболевания коронарных артерий, метаболический синдром, метаболический синдром X, резистентность к инсулину, гиперлипидемию, липодистрофию, дислипидемию, гипертриглицеридемию, нарушение толерантности к глюкозе и гипертензию.

Известны две категории T-клеток памяти: центральные T-клетки памяти (TCM) и эффекторные T-клетки памяти (TEM). При активации, TEM клетки осуществляют повышающую регуляцию ионных каналов Kv1.3 K+. Направляемая антигенами пролиферация TEM клеток чувствительна к блокаторам ионных каналов Kv1.3 K+ (Wulff et al., J. Clin. Invest. 111:1703-1713, 2003), и полипептид ShK, который исходно выделен из анемоны Stichodactyla helianthus, обитающей в Карибском море, служит в качестве такого блокатора. Блокируя каналы Kv1.3, ShK подавляет пролиферацию TEM клеток в пикомолярных концентрациях.

Один из вариантов осуществления, описанный в настоящем документе, включает фармацевтическую композицию, которая содержит полипептид ShK, который имеет последовательность Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SEQ ID № 1, где Xaa представляет собой Met или Nle).

Другой вариант осуществления включает фармацевтическую композицию, которая содержит полипептид ShK, который имеет формулу Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂.

Другой вариант осуществления включает фармацевтическую композицию, которая содержит полипептид ShK, который имеет формулу п-фосфо-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂ (ShK-186).

Другой вариант осуществления включает фармацевтическую композицию, которая содержит полипептид ShK, который имеет формулу L-цистеинамид, 4-фосфоно-L-фенилаланил-2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]ацетил-L-аргинил-L-серил-L-цистеинил-L-изолейцил-L-α-аспартил-L-треонил-L-изолейцил-L-пролил-L-лизил-L-серил-L-аргинил-L-цистеинил-L-треонил-L-аланил-L-фенилаланил-L-глутамил-L-цистеинил-L-лизил-L-гистидил-L-серил-L-норлейцил-L-лизил-L-тирозил-L-аргинил-L-лейцил-L-серил-L-фенилаланил-L-цистеинил-L-аргинил-L-лизил-L-треонил-L-цистеинилглицил-L-треонил-, циклический (537),(14→30),(19→34)-трис(дисульфид) (в настоящем документе обозначают как ShK-192, регистрационный номер CAS 1159528-26-3), где полипептид ShK-192 прикрепляют к органической или неорганической химической частице, которая имеет анионный заряд, и C-конец представляет собой кислоту или амид.

Другой вариант осуществления включает фармацевтическую композицию, которая содержит полипептид ShK, который имеет формулу Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂ (ShK-198).

В другом варианте осуществления полипептиды ShK прикрепляют к органической или неорганической химической частице, которая имеет анионный заряд. В другом варианте осуществления C-конец представляет собой кислоту или амид. В другом варианте осуществления полипептиды ShK прикрепляют к органической или неорганической химической частице, которая имеет анионный заряд, и C-конец представляет собой кислоту или амид.

В другом варианте осуществления одну или более химических частиц прикрепляют к N-концу полипептида ShK. В другом варианте осуществления химическую частицу можно прикреплять к N-концу полипептида ShK через связывающую молекулу или линкерную группу. В другом варианте осуществления химическую частицу прикрепляют N-концу полипептида ShK посредством аминоэтилоксиэтилоксиацетилового линкера.

В другом варианте осуществления химические частицы выбирают из группы, состоящей из L-Pmp(OH₂); D-Pmp(OH₂); D-Pmp(OHEt); L-Pmp(Et₂); D-Pmp(Et₂); L-Tyr; L-Tyr(PO₃H₂); L-Phe(p-NH₂); L-Phe(p-CO₂H); L-аспартата; D-аспартата; L-глутамата; и D-глутамата.

В другом варианте осуществления комбинации химической частицы/линкера выбирают из группы, состоящей из AEEAc-L-Pmp(OH₂); AEEAc-D-Pmp(OH₂); AEEAc-D-Pmp(OHEt); AEEAc-L-Pmp(Et₂); AEEAc-D-Pmp(Et₂); AEE Ac-L-Tyr; AEEAc-L-Tyr(PO₃H₂); AEEAc-L-Phe(p-NH₂); AEEAc-L-Phe(p-CO₂H); AEEAc-L-аспартата; AEEAc-D-аспартата; AEEAc-L-глутамата; и AEEAc-D-глутамата.

В другом варианте осуществления полипептид ShK предоставляют в фармацевтической композиции в виде его фармацевтически приемлемой соли. В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль представляет собой ацетат. В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль представляет собой ацетат калия или ацетат натрия.

В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию предоставляют в водном носителе.

В другом варианте осуществления pH фармацевтической композиции составляет между 5 и 7. В другом варианте осуществления pH фармацевтической композиции составляет 6,0.

В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество в количестве, эффективном для того, чтобы растворять полипептид ShK в водном носителе. В другом варианте осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20. В другом варианте осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации 0,05 масс./об.%.

В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит 10 мМ фосфат натрия. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит 150 мМ NaCl.

В другом варианте осуществления полипептид ShK присутствует в количестве от 0,01 мг/мл до 500 мг/мл. В дополнительных вариантах осуществления полипептид ShK можно предоставлять в количестве 0,01, 0,1, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мг/мл.

В другом варианте осуществления полипептид ShK получают из природного источника. В другом варианте осуществления полипептид ShK является синтетическим. В другом варианте осуществления полипептиды ShK включают смесь природных и синтетических полипептидов ShK.

Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, также включают лиофилизированные фармацевтические композиции, которые получают, в начале используя композицию, описанную в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит ацетат 8-12% по массе. В другом варианте осуществления лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит ацетат 10-11% по массе.

В другом варианте осуществления лиофилизированных фармацевтических композиций содержание воды в фармацевтической композиции составляет меньше чем 5%. В другом варианте осуществления лиофилизированных фармацевтических композиций содержание воды составляет меньше чем 4,0%. В другом варианте осуществления лиофилизированных фармацевтических композиций содержание воды составляет меньше чем 3,5%.

В другом варианте осуществления фармацевтические композиции предоставляют в упаковочном материале. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции формулируют для длительного хранения. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции содержатся в стерильном стеклянном сосуде, и их следует хранить при -70°C.

В другом варианте осуществления фармацевтические композиции формулируют для подкожного введения. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции содержатся в стерильном шприце.

Один из вариантов осуществления включает фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемую соль полипептида ShK, который имеет последовательность Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SEQ ID № 1, где Xaa представляет собой Met или Nle); 10 мМ фосфат натрия; 150 мМ NaCl; и полисорбат 20 в концентрации 0,05 масс./об.%, где полипептид ShK прикрепляют к органической или неорганической химической частице, которая имеет анионный заряд, C-конец представляет собой кислоту или амид и композиция имеет pH 6,0.

Другой вариант осуществления включает фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемую соль полипептида ShK, который имеет формулу Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂ (SEQ ID № 1, где Xaa представляет собой Met); 10 мМ фосфат натрия; 150 мМ NaCl; и полисорбат 20 в концентрации 0,05 масс./об.%, где полипептид ShK прикрепляют к органической или неорганической химической частице, которая имеет анионный заряд и композиция имеет pH 6,0.

Другой вариант осуществления включает фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемую соль полипептида ShK, который имеет формулу п-фосфо-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂ (ShK-186); 10 мМ фосфат натрия; 150 мМ NaCl; и полисорбат 20 в концентрации 0,05 масс./об.%, и где композиция имеет pH 6,0.

Другой вариант осуществления включает фармацевтическую композицию, которая содержит полипептид ShK, который имеет формулу Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂ (ShK-198); 10 мМ фосфат натрия; 150 мМ NaCl; и полисорбат 20 в концентрации 0,05 масс./об.%, и где композиция имеет pH 6,0.

Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, также включают изделия для фармацевтического использования. Один из вариантов осуществления такого изделия содержит по меньшей мере один стеклянный сосуд, получаемый в стерильных условиях, который содержит фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция в стеклянном сосуде стабильна в течение по меньшей мере шести месяцев при -70°C. В другом варианте осуществления изделие дополнительно содержит инструкции по разведению и получению фармацевтической композиции для введения человеку.

В другом варианте осуществления изделие для фармацевтического использования содержит по меньшей мере один стерильный шприц, который содержит фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе. В другом варианте осуществления изделие дополнительно содержит инструкции для введения фармацевтической композиции человеку.

Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, также способы изготовления описанных фармацевтических композиций. Один такой вариант осуществления включает способ изготовления фармацевтической композиции, который включает: (a) получение раствора 0,05% полисорбата 20 в водном носителе в предварительно определяемой концентрации; (b) добавление в раствор со стадии (a) предварительно определяемого количества полипептида, который имеет SEQ ID № 1, или его фармацевтически приемлемой соли, где C-конец представляет собой кислоту или амид, и где полипептид прикрепляют к органической или неорганической химической частице, которая имеет анионный заряд; (c) корректировку pH раствора со стадии (b) до тех пор, пока полипептид не растворится в растворе; и (d) в случае необходимости, корректировку pH раствора со стадии (c) до pH 5-7, чтобы тем самым изготавливать фармацевтическу5 композицию.

Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, также включают способы предотвращения, лечения или облегчения симптомов аутоиммунного или метаболического нарушения. Один из вариантов осуществления включает введение фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, человеку, который нуждается в таком предотвращении, лечении или облегчении аутоиммунного или метаболического нарушения в количестве, которое эффективно для того, чтобы предотвращать, лечить или облегчать симптомы.

В другом варианте осуществления нарушение представляет собой аутоиммунное нарушение, выбранное из группы, состоящей из рассеянного склероза, сахарного диабета 1 типа, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, контактного дерматита, псориатического артрита, астмы, аллергии, рестеноза, системного склероза, фиброза, склеродермии, гломерулонефрита, синдрома Шегрена, воспалительной резорбции кости, отторжения трансплантата, реакции «трансплантат против хозяина» и красной волчанки.

В другом варианте осуществления нарушение представляет собой метаболическое нарушение, выбранное из группы, состоящей из ожирения, диабета 2 типа, гиперхолестеринемии, заболевания коронарных артерий, метаболического синдрома, метаболического синдрома X, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, липодистрофии, дислипидемии, гипертриглицеридемии, нарушения толерантности к глюкозе, гипертензии, избыточной массы тела и нарушений энергетического метаболизма.

В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят раз в сутки, раз в неделю, раз в месяц, раз в два месяца, раз в три месяца или раз в шесть месяцев.

В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят подкожно.

В дополнительном варианте осуществления полипептид ShK является радиоактивно меченным.

В одном из вариантов осуществления полипептид ShK метят с использованием ¹¹¹In.

В дополнительном варианте осуществления полипептид ShK представляет собой меченный ¹¹¹In ShK-221.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 проиллюстрированы исследования биораспределения с использованием радиоактивно меченного ShK у крыс и беличьих обезьян. ¹¹¹In-меченный ShK-221 вводили крысам Sprague Dawley (100 г/кг; 0,7 мКи) и беличьим обезьянам (35 г/кг; 0,84 мКи) в виде одной подкожной инъекции в лопаточную область каждого животного. SPECT и CT сканирование осуществляли непрерывно в течение первого часа (интервалы 4×15 мин) и через 4, 8, 24, 48, 72, 120 и 160 часов после дозы. Показаны плоские двухмерные изображения трехмерных реконструкций для моментов времени 4, 24, 72 и 160 часов для обезьян (A) и моментов времени 1, 8 и 24 часов для крыс (C). И те и другие животные демонстрируют медленную абсорбцию лекарственного средства из места инъекции и значительное ранее и длительное распределение в почках и в меньшей степени в печени. Изображения для крыс выявляют значительную радиоактивность в мочевом пузыре через 1 ч, двенадцатиперстной и тонкой кишке через 4 и 8 часов и надпочечниках через 8 и 24 ч. Ассоциированную с почками радиоактивность у обоих видов главным образом идентифицировали в коре (B и D). Количественное определение ¹¹¹In-ShK-221 в месте инъекции у обезьян (вверху) и крыс (внизу) выявляло двухфазный спад с начальным периодом полувыведения приблизительно 1-1,5 часа и конечным периодом полувыведения >48 часов (E). Концентрации лекарственного средства в цельной крови обезьян (вверху) и крыс (внизу) придерживались схожего двухфазного спада с начальным периодом полувыведения приблизительно 1,5 часа и конечным периодом полувыведения > 64 часа (F). Концентрации в крови оставались выше K_d для Kv1.3 на всем протяжении всего периода исследования и выше 80% концентрации насыщения (233 пМ) через первые 120 часов в соответствии с медленным непрерывным распределением из места инъекции на всем протяжении периода исследования.

На фиг.2 проиллюстрирована разработка радиоактивно меченного аналога ShK-186. Радиоактивное мечение ShK-186 осуществляли посредством твердофазного связывания DOTA с аминоконцом ShK-198 через линкер для того, чтобы формировать ShK-221 (A). Встраивание индия в кольцо DOTA осуществляли посредством инкубации при 95°C в ацетате натрия pH 5. Меченный индием ShK-221 давал отчетливый паттерн миграции в ионообменной хроматографии (B), причем получаемые хелаты имели ожидаемую массу (C).

На фиг.3 представлено сравнение блокирующей канал Kv1.3 активности ShK-186 и двух меченных аналогов, ShK-221-гадолиний (ShK-221-Gd) и ShK-221-индий (ShK-221-In): (A) Репрезентативные токи Kv1.3 в целых клетках в отсутствие и в присутствии ShK-221-Gd; (B) Кривая доза-эффект, показывающая эффект ShK-186, ShK-221-Gd и ShK-221-In, оказываемый на токи Kv1.3. Стабильные Kv1.3-трансфицированные клеточные линии использовали для этого исследования (Beeton, et al. Mol Pharmacol 67:1369-1381 (2005), в настоящий документ включены по ссылке положения, касающиеся этого). В способе пэтч-кламп электрофизиологическую регистрацию осуществляли в конфигурации с целыми клетками, как описано (Beeton, et al. 2005 и Wolff, H, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:8151-6 (2000), в настоящий документ включены по ссылке положения, касающиеся этого). Внешний раствор представлял собой натриевый раствор Рингера, а раствор в капилляре представлял собой KF (300 мОсм). Токи Kv1.3 вызывали посредством 200 мс деполяризующих импульсов от исходного потенциала -80 до 40 мВ. Каждый из ShK-186, ShK-221-Gd и ShK-221-In тестировали в различных концентрациях. Снижение пикового тока при 40 мВ для каждой концентрации использовали для того, чтобы генерировать кривую доза-эффект с использованием программного обеспечения Origin (OriginLab Corp., Northampton, MA). Значения IC₅₀ составляли: ShK-186=68,99±4,01 пМ (n=5), ShK-221-Gd=58,23±1,38 пМ (n=5) и ShK-221-In=63,80±2,25 пМ (n=3).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее раскрытие предоставляет фармацевтические композиции на основе SHK и способы их изготовления и использования. Как используют в настоящем документе, термин «полипептид ShK» относится ко всем природным и синтетическим полипептидам ShK и их производным, аналогам и модификациям, как рассмотрено в настоящем документе. Такие модификации и аналоги включают полипептид SEQ ID № 1, к которому органическую или неорганическую химическую частицу, которая имеет анионный заряд, прикрепляют через аминоэтилоксиэтилоксиацетиловый линкер. Как используют в настоящем документе, «фармацевтическая композиция» содержит по меньшей мере один полипептид ShK, описанный в настоящем документе вместе, с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или разбавителями, соответствующими выбранному способу введения. «По меньшей мере один полипептид ShK» может включать как природные, так и синтетические полипептиды ShK.

Как изложено, многие связанные с иммунитетом заболевания и метаболические нарушения человека связывают с действием T-клеток памяти. Известны две категории T-клеток памяти: центральные T-клетки памяти (TCM) и эффекторные T-клетки памяти (TEM). При активации, TEM клетки осуществляют повышающую регуляцию ионных каналов Kv1.3 K+. Направляемая антигеном пролиферация TEM клеток чувствительна к блокаторам ионных каналов Kv1.3 K+ (Wulff et al., J. Clin. Invest. 111:1703-1713, 2003), и полипептид ShK, исходно выделенный из анемоны Stichodactyla helianthus, обитающей в Карибском море, служит в качестве блокатора. Блокируя каналы Kv1.3, ShK подавляет пролиферацию TEM клеток в пикомолярных концентрациях.

Миелин-специфические аутореактивные T-клетки у пациентов с рассеянным склерозом преимущественно представляют собой активированные TEM клетки (Wulff et al., J. Clin. Invest. 111:1703-1713, 2003), так что, несмотря на то, что композиции, описанные в настоящем документе, не связаны конкретным механизмом, имеет место основание для получения блокаторов Kv1.3 в качестве фармацевтических композиций для того, чтобы снижать или устранять активацию TEM клеток при лечении, предотвращении или облегчении симптомов у пациентов с рассеянным склерозом.

Нативный полипептид ShK описан, например, в Pennington, M.W. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 46:354-358 (1995), положения которой, касающиеся этого, включены в настоящий документ посредством ссылки. Образцовые структуры ShK, которые входят в объем настоящего раскрытия, также опубликованы в Beeton, C. et al., Targeting Effector Memory T Cells with a Selective Peptide Inhibitor of Kv1.3 Channels for Therapy of Autoimmune Diseases, Molecular Pharmacology, Vol. 67:1369 (2005) и в патенте США № 8080523 (публикация патента США 20080221024), положения которых, касающиеся этого, включены в настоящий документ посредством ссылки.

Образцовый полипептид, который образует основу для полипептидов, используемых в композициях в настоящем документе, представлен в SEQ ID № 1. В конкретных вариантах осуществления C-конец представляет собой кислоту (например, COOH) или амид (например, CONH₂), и полипептид прикрепляют к органической или неорганической химической частице, которая имеет анионный заряд. Под «амидом» понимают замещение C-концевой гидроксильной группы (OH) кислоты на NH₂. Такое замещение обозначают в настоящем документе, используя термин «амид» или C-концевая аминокислота-NH₂, как в «-Cys-NH₂».

Исследовали безопасность, активность и специфичность ShK и было показано, что прикрепление полипептида к органической или неорганической химической частице, которая имеет анионный заряд, улучшает пригодность ShK для использования в фармацевтических композициях.

Специалисты в данной области знают способы разработки полипептидов ShK с расширенными свойствами, такие как аланиновый сканирующий мутагенез, рациональное конструирование на основе мутагенеза, опосредованного выравниванием, с использованием известных последовательностей полипептида ShK и/или молекулярное моделирование. Например, полипептиды ShK можно разрабатывать для того, чтобы удалять сайты расщепления протеазами (например, сайты расщепления трипсином в остатках K или R и/или сайты расщепления химотрипсином в остатках F, Y, или W) в содержащей полипептид ShK композиции.

Подходят различные модификации полипептида SEQ ID № 1. Полипептид может иметь какую-либо комбинацию модификаций, описанных в настоящем документе. Для того, чтобы улучшать фармакокинетические и фармакодинамические (ФК/ФД) свойства структуры ShK, остатки, которые чувствительны к ухудшению свойств, можно заменять или замещать. Например, остаток Met в положении 21 можно заменять для того, чтобы вызывать стабилизирующий эффект против окисления. В одном из вариантов осуществления Met в положении 21 заменяют на Nle. Замена C-концевой кислотной функции на амид также может придавать стабильность. Эти две замены в первичной структуре ShK можно комбинировать с анионным фрагментом на N-конце для того, чтобы получать стабильный и избирательный блокатор Kv1.3. Соответственно, один из вариантов осуществления, описанный в настоящем документе, включает SEQ ID № 1, где метионин в положении 21 заменяют на Nle, амид присутствует на C-конце и/или анионный фрагмент присутствует на N-конце.

Негидролизуемые фосфатные замены также дают стабилизирующий эффект, оказываемый на фосфатные группы, а также стабильность против ферментов фосфатаз.

Как изложено, определенные варианты осуществления включают прикрепление органической или неорганической химической частицы. Сайт прикрепления может представлять собой N-конец (первый Arg в SEQ ID № 1), но модификации не ограничены прикреплением в этом сайте. Образцовые химические частицы можно прикреплять посредством линкера, такого как аминоэтилоксиэтилоксиацетиловый линкер (который обозначают в настоящем документе взаимозаменяемо как Aeea или AEEAc), или посредством какого-либо другого подходящего средства.

Неограничивающие примеры подходящих химических частиц включают L-Pmp(OH₂); D-Pmp(OH₂); D-Pmp(OHEt); Pmp(Et₂); D-Pmp(Et₂); L-Tyr; L-Tyr(PO₃H₂) (п-фосфо-тирозин); L-Phe(p-NH₂); L-Phe(p-CO₂H); L-аспартат; D-аспартат; L-глутамат; и D-глутамат. Используемые сокращения определяют следующим образом: Pmp (п-фосфонометилфенилаланин п-фосфонометилфенилаланин); и Ppa (п-фосфатидилфенилаланин). Альтернативы для PmP и Ppa включают, без ограничения, Pfp (п-фосфоно(дифторметил)фенилаланин) (Pfp) и Pkp (п-фосфонометилкетофенилаланин).

Неограничивающие примеры комбинаций химической частицы/линкера включают AEEAc-L-Pmp(OH₂); AEEAc-D-Pmp(OH₂); AEEAc-D-Pmp(OHEt); AEEAc-L-Pmp(Et₂); AEEAc-D-Pmp(Et₂); AEEAc-L-Tyr; AEEAc-L-Tyr(PO₃H₂); AEEAc-L-Phe(p-NH₂); AEEAc-L-Phe(p-CO₂H); AEEAc-L-аспартат; AEEAc-D-аспартат; AEEAc-L-глутамат; и AEEAc-D-глутамат. В химических частицах, где аминокислотный остаток имеет хиральный центр, в целом можно использовать D и/или L энантиомер аминокислотного остатка.

Для использования в раскрытых фармацевтических композициях, полипептид ShK может представлять собой встречающийся в природе или синтетический или может быть предоставлен в виде смеси встречающихся в природе и синтетических ShK.

Полипептид ShK можно получать в виде соли. В образцовой соли в настоящем документе повторно уложенный полипептид, получаемый на стадии ОФ-ВЭЖХ (пример 1), можно возвращать в колонку и элюировать. Перед сушкой ацетат натрия или калия в концентрации 50 мМ можно добавлять в раствор белка. Эта стадия дает солевую форму белка, которая легко растворима при восстановлении из высушенной формы. В образцовый состав, используемый в примерах (ShK-186), добавляли ацетат натрия, и содержание ацетата в составе составляло 10,4% по массе, согласно химическому анализу. ShK-186 представляет собой синтетическое производное пептида из 37 аминокислот из токсина Stichodactyla. В литературе ShK-186 также обозначают как SL5 и идентифицируют с помощью регистрационного номера CAS 1081110-69-1.

Чтобы содержащая полипептид композиция нашла применение в качестве фармацевтической композиции, она должна отвечать нескольким критериям в отношении стабильности, растворимости и pH, и предпочтительно только содержать материалы, соответствующие введению животным, включая, без ограничения, млекопитающих и, в частности, человека. Композиция может варьировать в зависимости от способа введения, такого как подкожный, внутривенный и т.д.

Несмотря на то, что некоторые составы терапевтических полипептидов ShK известны в данной области (например, Beeton, C. et al., упомянутая выше; и патент США № 7833979), ни один не обладает стабильностью и растворимостью фармацевтических композиций на основе SHK, описанных в настоящем документе. Стабильные и растворимые фармацевтические композиции на основе ShK, описанные в настоящем документе, получали, варьируя множество факторов, включая концентрации поверхностно-активных веществ, pH, удаление компонентов, используемых в предшествующих составах, и другие параметры, описанные более полно далее в примерах.

Один конкретный состав с оптимальной стабильностью и растворимостью содержит:

Таблица 1
Фармацевтическая композиция состава P6N
Компонент	Концентрация	Назначение
Полипептид ShK-186	До 500 мг/мл	Активное средство
Фосфат натрия	10 мМ	Буферное средство
NaCl	150 мМ	Модификатор тоничности
Полисорбат 20	0,05% (масс./об.)	Поверхностно-активное вещество
pH 6,0

Терапевтически и профилактически эффективные количества раскрытых фармацевтических композиций, а также схемы дозирования для лечения, предотвращения и/или облегчения симптомов аутоиммунного нарушения или метаболического нарушения может определять посредством лечащий врач, с учетом различных факторов, таких как возраст, состояние, масса тела, пол и диета пациента, тяжесть состояния, подлежащего лечению, время введения и другие клинические факторы. В целом, ежесуточное количество или схема должна находиться в диапазоне от 1 до 10000 микрограммов (мкг) полипептида ShK на килограмм (кг) массы тела, в диапазоне от 1 до 5000 мкг на килограмм массы тела, в диапазоне от 1 до 1000 мкг на килограмм массы тела или в диапазоне от 1 до 100 мкг на килограмм массы тела.

Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, можно использовать для того, чтобы лечить аутоиммунные нарушения, такие как рассеянный склероз, сахарный диабет 1 типа, ревматоидный артрит, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, контактный дерматит, псориатический артрит, астма, аллергия, рестеноз, системный склероз, фиброз, склеродермия, гломерулонефрит, синдром Шегрена, воспалительная резорбция кости, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина» и красная волчанка, и метаболические нарушения, такие как ожирение, диабет 2 типа, гиперхолестеринемия, заболевание коронарных артерий, метаболический синдром, метаболический синдром X, резистентность к инсулину, гиперлипидемия, липодистрофия, дислипидемия, гипертриглицеридемия, нарушение толерантности к глюкозе, гипертензия, избыточный вес и нарушения энергетического метаболизма.

Для длительного хранения фармацевтических композиций может быть полезным хранить их в лиофилизированной форме. Настоящее раскрытие охватывает такие лиофилизированные фармацевтические композиции, включая в качестве неограничивающих примеров те, что получают посредством способов, описанных ниже.

Один способ лиофилизации может включать стадии: (a) снижение температуры фармацевтической композиции до -40°C; (b) удержание температуры при -40°C в течение предварительно определяемого времени; (c) повышение температуры раствора до 20°C; (d) удержание температуры при 2°C в течение предварительно определяемого времени; и e) снижение давления на стадии (d) до давления, подходящего для лиофилизации, и удержание температуры при 20°C в течение предварительно определяемого времени, тем самым лиофилизируя фармацевтическую композицию.

В этом способе лиофилизации стадию (a) можно осуществлять в пределах 2 часов; стадию (b) можно осуществлять в пределах 3 часов; стадию (c) можно осуществлять в пределах 13 часов и при давлении 110 бар; стадию (d) можно осуществлять в пределах 13 часов и при давлении 110 бар; и стадию (e) можно осуществлять за 5 часов и при давлении, сниженном до 10 бар.

Способ лиофилизации фармацевтической композиции также может включать стадии: (a) снижение температуры фармацевтической композиции до -45°C; (b) удержание температуры при -45°C в течение предварительно определяемого времени; (c) повышение температуры раствора до -20°C; (d) повышение температуры раствора до 25°C; и (e) удержание температуры при 25°C в течение предварительно определяемого времени, тем самым лиофилизируя фармацевтическую композицию.

В этом способе стадию (a) можно осуществлять в пределах 6 часов; стадию (b) можно осуществлять в пределах 3 часов; стадию (c) можно осуществлять за 19 часов и при давлении 150 бар; стадию (d) можно осуществлять в пределах 13 часов и при давлении 150 бар; и стадию (e) можно осуществлять за 8 часов и при давлении 150 бар.

Лиофилизированная фармацевтическая композиция может содержаться внутри упаковочного материала, и упаковка дополнительно может содержать инструкции для восстановления фармацевтической композиции для конечного использования профессиональным медиком, пациентом или исследователем.

Лиофилизированная фармацевтическая композиция может иметь содержание воды меньше чем 5%, меньше чем 4% или меньше чем 3,5%.

Как показано ниже в примерах, фармацевтические композиции можно хранить в течение нескольких месяцев при -70°C, -20°C или 4°C, например, в стерильном стеклянном сосуде. Сосуд может содержать 1 мл композиции P6N (см. таблицу 1) или другой фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, так что сосуд физически будет содержать раствор 50 мг полипептида ShK (в одном из вариантов осуществления в виде ацетатной соли), растворенного в 10 мМ фосфате натрия и 150 мМ NaCl, с 0,05% (масс./об.) полисорбата 20 и с конечным pH, скорректированным до 6,0.

Сосуд дополнительно можно получать в виде единицы фармацевтического продукта, с одним или более сосудами в упаковке, которая также может содержать или на которую печатным способом может быть нанесены инструкции по хранению, разведению и введению фармацевтической композиции, для конечного использования профессиональным медиком, пациентом или исследователем. Подходящий режим разведения включает использование воды для инъекций, обозначаемой в настоящем документе ВДИ. Подходящее количество разбавителя может представлять собой часть изделия, например, в своем собственном стерильном контейнере с необязательными инструкциями для использования.

Фармацевтическая композиция может содержать 0,1, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 или 55 или вплоть до 500 мг/мл полипептида ShK или его фармацевтически приемлемой соли согласно этому раскрытию. Точная концентрация зависит от факторов, контролируемых производителем и/или конечным пользователем, в зависимости от желаемой дозы и планируемого терапевтического или исследовательского использования. Концентрация также охватывает какие-либо и все промежуточные значения в указанном выше диапазоне, такие как 1,5 мг/мл, 2,5 мг/мл и т.д.

Для введения фармацевтической композиции, подходящим путем является подкожная инъекция. Практикующий медик знаком со способами введения, которые зависят от пациента и способа лечения, такого как подкожное, внутривенное и т.д. В патенте США № 7918824 раскрыты шприцы, подходящие для использования пациентом, и по ссылке в настоящий документ включены его положения, касающиеся этого. Также предусмотрено внутривенное введение. Например, можно использовать предварительно заполненные безыгольные шприцы, такие как стеклянные шприцы, для использования с системами безыгольного внутривенного доступа. Также теоретически возможны имплантируемые устройства для регулируемого по времени высвобождения фармацевтических композиций. Не предполагают, что композиции ограничены каким-либо конкретным выбором введения.

Раскрытие, например, охватывает набирание фармацевтической композиции в жидкой форме, например, 0,5 см³, в шприц, такой как шприц Becton Dickinson (BD) Slip-Tip Sub-Q 1 cc, оснащенный иглой 26G×5/8 дюйма (номер изделия BD 309597). Один или более шприцов можно включать в изделие, которое включает упаковку и необязательные инструкции для конечного использования профессиональным медиком, пациентом или исследователем.

Фармацевтические композиции можно получать, без ограничения, в твердой форме (включая гранулы, порошки или суппозитории) или в жидкой форме (например, растворы, суспензии или эмульсии). Фармацевтические композиции можно подвергать стандартным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или они могут содержать стандартные вспомогательные средства, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажняющие средства, эмульсификаторы, буферы и т.д.

Твердые лекарственные формы для перорального введения могут включать капсулы, таблетки, драже, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активный полипептид ShK можно смешивать с по меньшей мере одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы также могут содержать, как в нормальной практике, дополнительные вещества, отличные от инертных разбавителей, например, смазки, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и драже, лекарственные формы также могут содержать буферные средства. Дополнительно можно получать таблетки и драже с энтеросолюбильными покрытиями.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, широко используемые в данной области, такие как вода. Такие композиции также могут содержать вспомогательные средства, такие как увлажняющие, подслащивающие, вкусовые и ароматизирующие средства. Фармацевтическая композиция может содержать больше чем один из вариантов осуществления по настоящему раскрытию. Препараты для перорального введения можно соответствующим образом формулировать для того, чтобы добиться контролируемого высвобождения активного полипептида ShK.

Композиции для буккального введения могут принимать форму таблеток или пастилок, формулируемых стандартным образом.

Полипептиды ShK можно формулировать для парентерального введения посредством инъекции, например, посредством болюсной инъекции или инфузии. Составы для инъекции можно представлять в стандартной дозированной форме, например, в стеклянной ампуле или контейнерах с несколькими дозами, например в стеклянных сосудах. Композиции для инъекции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных наполнителях, и могут содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие, консервирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может быть в порошкообразной форме для разбавления подходящим наполнителем, например стерильной апирогенной водой, перед использованием.

В дополнение к составам, описанным выше, полипептиды ShK также можно формулировать в виде препарата-депо. Такие долгодействующие составы можно вводить посредством имплантации или посредством внутримышечной инъекции.

Для назального или легочного введения или какого-либо другого введения посредством ингаляции, полипептиды ShK для использования согласно настоящему раскрытию, удобным образом доставляют в форме препарата распыляемого аэрозоля для упаковки под давлением или небулайзера, с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа или смеси газов.

В неограничивающем примере полипептид ShK, описанный в настоящем документе, можно метить с использованием хелата индия 111 (In¹¹¹) и 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA) или другого радиоактивно меченного металла, конъюгированного с фрагментом тирозинома или фосфотирозина в полипептиде. Такие способы описаны, например, в Schultz, M.K. et al., «Synthesis of a DOTA-Biotin Conjugate for Radionuclide Chelation via Cu-Free Click Chemistry», Organic Letters 72:2398-2401 (2010), положения которой, касающиеся этого, включены в настоящий документ посредством ссылки. В примере, подходящем для диагноза, например, посредством MRI, полипептид ShK, описанный в настоящем документе можно метить с использованием DOTA-хелата индия (In), гадолиния (Gd) или другого парамагнитного иона. Другие реакции хелирования или конъюгации также можно использовать.

Как описано в примере 6 и проиллюстрировано на фиг.1-3, радиоактивно меченный аналог ShK (ShK-221) использовали для того, чтобы измерять общую концентрацию лекарственного средства (несвязанного плюс связанного) в цельной крови. Предыдущие исследования приводят к тому, что только 10% лекарственного средства доступно несвязанным в плазме (Chi et al., Toxicon 59:529-46, 2011). Это находится в соответствии с наблюдением того, что через 1 час после введения радиоактивно меченного ShK-221 в дозе 35 пг/кг беличьей обезьяне, в цельной крови измеряли приблизительно 15 нМ лекарственного средства, что означает, что согласно этому способу несвязанная фракция составляет ~7%. Фактически свободная фракция лекарственного средства может быть ниже у крыс по сравнению с не являющимися человеком приматами. Через 1 час после дозы 100 пг/кг у крыс, в цельной крови наблюдали приблизительно 14 нМ ShK-221. Это может быть обусловлено связыванием лекарственного средства с другими компонентами крови, таким как тромбоциты, которые экспрессируют Kv1.3 на своей поверхности и присутствие которых обнаружено чрезвычайно высоких количества в цельной крови крыс (5-10×Human) (McCloskey et al., J. Physiol. 588:1399-406, 2010; Trowbridge et al., Clin. Phys. Physiol. Meas. 5:145-70, 1984).

Способ чувствительного радиоактивного мечения делает возможным обнаружение двухфазного профиля терминальной элиминации для ShK у крыс и беличьих обезьян, который отличается быстрой начальной фазой и очень длинной терминальной фазой. Конечный период полувыведения, вычисляемое с использованием ¹¹¹In-ShK-221, составляло >64 часов у обезьян с поддерживающимися уровнями в крови выше K_d в течение 7 суток. Концентрации в крови имитируют двухфазную (быструю, затем медленную) абсорбцию из места инъекции. Вкратце, биораспределение радиоактивно меченного ShK-221 у крыс и беличьих обезьян отличается очень медленным распределением из места инъекции, значительными концентрациями лекарственного средства периферически в местах инъекции, почках и печени и длительная фаза элиминации в цельной крови. Уровни лекарственного средства оставались выше ~200 пМ в крови в течение приблизительно 7 суток у обезьян и 3 суток у крыс. Данные в примере 1 обеспечивают один из вариантов осуществления использования радиоактивно меченного полипептида ShK для исследования распределения лекарственного средства in vivo. Соединение DOTA приведено в качестве примера в настоящем документе, но можно использовать другие хелаторы металлов, такие как DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота). Таким образом, в дополнение к терапевтическому использованию, полипептиды ShK, описанные в настоящем документе, также можно использовать для диагностирования или мониторинга заболеваний, отличающихся нарушением функций связанных с ними белков, представляющих интерес. В одном из вариантов осуществления предоставлен способ для обнаружения белка, представляющего интерес, в биологическом образце, таком как рецептор или ионный канал, на который может быть оказано влияние, включающий стадии: (a) приведение образца в контакт с полипептидом ShK; и (b) обнаружение оказываемого пептидом эффекта на белок, представляющий интерес. Биологические образцы включают образцы ткани, интактные клетки или их экстракты. Композиции, описанные в настоящем документе, можно использовать в качестве части диагностического набора для того, чтобы обнаруживать присутствие связанных с ними белков, представляющих интерес, в биологическом образце. В таких наборах можно использовать композицию, описанную в настоящем документе и имеющую прикрепленную метку для того, чтобы сделать возможным обнаружение. Пептиды можно использовать для идентификации нормальных и аномальных белков, представляющих интерес.

Ниже в примерах описана оптимизация способов, описанных в настоящем документе. Приведенные ниже примеры включены для того, чтобы демонстрировать конкретные варианты осуществления раскрытия. Средние специалисты в данной области должны осознавать в свете настоящего раскрытия, что многие изменения можно выполнять в конкретных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, и все еще достигать схожих или подобных результатов, не отступая от сущности и объема раскрытия.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Синтез (pTyr)-AEEA-Arg-35-Cys-NH₂ (ShK-186)

Синтез предшественника линейного полипептида осуществляли следующим образом. Линейный пептид собирали на амиде Ринка (MBHA) Rx (sub: 0,4 ммоль/г) и следующие защитные группы использовали для реакции с Fmoc: Arg (Pbf), Ser (tBu), Cys (Trt), Asp (OtBu), Thr (tBu), Lys (Boc), Arg (Pbf), Gln (Trt), His (Trt), Tyr (tBu) и Tyr (P(OH)O₂Bzl). Все аминокислоты связывали посредством DIC/HOBt активации в масштабе 2 ммоль с использованием автоматизированного синтезатора CS536. Эти параметры масштабировали вплоть до 200 ммоль.

Для стадии отщепления DeFmoc пептид в конечном счете отщепляли от смолы посредством 4-часовой обработки реактивом «K» [TFA/TIS/1,2-этандитиол (EDT)/H₂O/фенол (89/2/2/2/5)] при комнатной температуре при перемешивании (TIS относится к триизопропилсилану). Отношение можно варьировать до тех пор, пока осуществляют отщепление, а фенол можно необязательно устранять. При получении без фенола отношение TFA/TIS/EDT/H₂O составляло, например, 47/1/1/1. Неочищенный пептид отделяли от смолы посредством фильтрования через трубку для SPE и смолу споласкивали последовательно с использованием TFA, который объединяли с начальным фильтратом.

Затем, после испарения TFA растворителей из фильтрата (до 1/5 объема от исходной смеси для отщепления), неочищенный пептид преципитировали посредством добавления холодного этилового эфира и сушили в вакууме для того, чтобы получить линейный полипептид для дальнейшего окисления.

После того как линейный неочищенный полипептид растворяли в воде до концентрации 0,3 мг/мл (слегка изменяли на основе производства), добавляли NH₄OH для того, чтобы выполнять окисление при pH 8 (регистрация более поздней партии демонстрирует более низкий pH (7-7,5)) в течение 30 часов. Завершение окисления проверяли посредством массовой спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Дополнительно, анализ ВЭЖХ показывал превращение линейного пептида в окисленную форму. Окисление подкисляли с использованием TFA (или уксусной кислоты) до pH (2-)3. Окисление воздухом представляет собой один способ достижения образования дисульфидного мостика. Ниже в примере 2 показан альтернативный путь получения полипептида с дисульфидными связями.

Для очистки окисленный пептид непосредственно загружали и очищали посредством ОФ-ВЭЖХ на препаративной колонке C-18 с использованием ацетонитрила в качестве подвижной фазы. Фракции с достаточной чистотой комбинировали и необязательно лиофилизировали для того, чтобы получать порошок белого цвета (ShK-186), 1,5 г (соль TFA).

Далее следовала стадия солевого обмена. Повторно растворенный пептид (соль TFA) загружали на препаративную колонку C-18, уравновешенную с использованием TEAP (триэтиламинфосфат) 20 мМ. После промывания 3× свободным объемом с использованием TEAP, буфер заменяли на NH₄OAc (50 мМ). После промывания 3× свободным объемом NH₄OAc и проверки pH (pH 6-7), буфер заменяли на HOAc (0,5%). После промывания 3× свободным объемом HOAc (0,5%) и проверки pH (pH 2-3), начинали резкий градиент для того, чтобы получать конечный полипептид с ацетатной солью, 500 мг.

Можно осуществлять необязательную стадию очистки. Полипептид можно очищать непосредственно с использованием системы с уксусной кислотой, чтобы получить конечный полипептид с более высоким выходом. Все отдельные стадии в приведенном выше способе можно осуществлять порциями для того, чтобы достигать более крупного общего масштаба. Конечный продукт можно лиофилизировать или сохранять в растворе.

Пример 2. Получение полипептидов ShK

Анионные аминокислотные остатки можно прикреплять к N-концу природного или синтетического полипептида ShK посредством линкера, такого как аминоэтилоксиэтилоксиацетиловый линкер (Aeea), или посредством какого-либо другого подходящего средства. Изначально, Fmoc-Aeea-OH связывают с N-концом природного или синтетического токсина ShK, например, посредством способа по Beeton, C. et al., 2005.

Затем любой из Fmoc-Tyr(PO₄Bzl)-OH, Fmoc-d-Tyr(PO₄Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(PO₄Me₂)-OH, Fmoc-Pmp-OH, Fmoc-d-Pmp-OH, Fmoc-Pmp(Et)-OH, Fmoc-Pmp(Et)₂-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH или Fmoc-Amp(Boc)-OH связывают с использованием DIC и HOBT.

Затем деблокированную пептидную смолу отщепляют и снимают с нее защитные группы с использованием реактива K, содержащего 5% триизопропилсилана, в течение 2 часов при КТ, как описано в King, D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990, положения которой, касающиеся этого, включены в настоящий документ посредством ссылки. Met(O) восстанавливают посредством добавления твердого NH₄I в смесь для отщепления в момент t-15 мин (Nicolas, E. et al., Tetrahedron 51:5701-5710, 1995, ее положения, касающиеся этого, включены в настоящий документ посредством ссылки). Для пептида, содержащего Tyr(PO₄Me₂)-OH, используют смесь для отщепления, которая содержит 1M TMSBr в TFA, содержащей тиоанизол в качестве поглотителя, в течение 18 ч при 4°C (Tian, Z. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 42:155-158, 1993 положения которой, касающиеся этого, включены в настоящий документ посредством ссылки). Неполное удаление метиловых защитных групп является обыкновенным, когда используют этот способ, и две частицы (Tyr(PO₄) и Tyr(PO₄Me₂)) легко очищают посредством ОФ-ВЭЖХ.

Tyr(PO₄Me₂)-содержащий полипептид отщепляют через стандартное отщепление реактивом K, который сохраняет обе Me группы интактными. В каждом случае смесь для отщепления фильтруют и неочищенный пептид преципитируют в ледяном диэтиловом эфире. Преципитат собирали, что давало приблизительно 75 мг пептида из 200 мг смолы. Неочищенный продукт растворяют в 20 мл 50% водного AcOH и разводят в 0,75 л H₂O. pH раствора корректировали с использованием NH₄OH до 8,2, и его оставляли укладываться в течение ночи с добавлением глутатиона (2 мМ:1 мМ) (восстановленный:окисленный).

Все полипептиды очищали с использованием ОФ-ВЭЖХ, как описано в Pennington, M. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 546:354-358,1995; Pennington, M. et al., Biochemistry 35: 16407-16411, 1996a; и Pennington, M. et al., Biochem. Biophys. Commun. 219:696-701, 1996b, положения каждой из которых, касающиеся этого, включены в настоящий документ посредством ссылки. Чистые фракции объединяли и лиофилизировали. Каждый образец подтверждали посредством ОФ-ВЭЖХ, AAA (анализ аминокислот) и MALDI-TOF MS и корректировали с учетом содержания пептидов перед биологическим анализом.

В приведенных ниже примерах полипептид ShK, идентифицируемый как ShK-186 ((фосфо-Tyr)-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂, с амидом на C-конце и с дисульфидными связями между Cys3-Cys35, Cys12-Cys28 и Cys17-Cys32) (SEQ ID № 2), получали и выбирали для идентификации компонентов подходящей фармацевтической композиции; эти компоненты можно использовать для получения фармацевтических композиций, содержащих другие полипептиды ShK, включая в качестве неограничивающих примеров ShK-198 и ShK-192 (регистрационный номер CAS 1159528-26-3).

Пример 3. Скрининг поверхностно-активных веществ

Для того чтобы идентифицировать поверхностно-активное вещество(а) для возможного включения в фармацевтические композиции, полипептид формулируют в буфере, в который тестовые поверхностно-активные вещества добавляют по отдельности, и сравнивают с образцами, которые не содержат поверхностно-активное вещество. Тестовые поверхностно-активные вещества включают полисорбат 20, полисорбат 80 и плюроник F68 в концентрациях, начинающихся с 0,01%.

Для того чтобы определять эффект поверхностно-активного вещества, тестовые образцы и контроли подвергают или не подвергают перемешиванию. Затем тестовые образцы и контроли анализируют посредством эксклюзионной ВЭЖХ для того, чтобы осуществлять мониторинг изменений характеристик, включая агрегирование растворимых веществ и потерю при отгонке мономера.

Используя этот способ, препараты полипептида ShK-186 подвергали постоянному перемешиванию в течение вплоть до четырех часов при pH 5,8, в присутствии полисорбата 20 (0,01%), полисорбата 80 (0,01%) или плюроника F68 (0,10%) (Sigma-Aldrich). К удивлению, все образцы демонстрировали замутненность с повышенной мутностью, с использованием поверхностно-активного вещества или без него. Это показывает, что ShK-186 восприимчив к вызываемой перемешиванием преципитации.

Дополнительные эксперименты показывали, что нетипичная концентрация поверхностно-активного вещества защищала белок, и для последующих экспериментов использовали полисорбат 20 в концентрации 0,05%. В дополнение к повышению концентрации поверхностно-активного вещества, снижение pH от 5,8 до 5,1 дополнительно повышало стабильность ShK-186. Отсутствие агрегирования растворимых веществ подтверждали посредством эксклюзионной ВЭЖХ.

Пример 4. Стабильность во время хранения

Тестируют некоторые параметры для того, чтобы выбирать компоненты фармацевтических композиций, которые защищают стабильность полипептида. Согласно данному способу, этими параметрами являются pH (4,0-7,0), буфер/растворитель (10 мМ ацетат натрия или 10 мМ фосфат натрия), стабилизатор/солюбилизатор (NaCl 0,8%; сорбит 5,0%; L-аргинин 3,0%), поверхностно-активное вещество, условия хранения и стрессовые условия (температура, перемешивание, заморозка/оттаивание, усиленное окисление). Для того, чтобы исследовать эти параметры, образцы ShK-186 растворяли в ацетате натрия или фосфате натрия, и индивидуальные составы получали, как описано выше. Затем пептиды анализировали в нулевой момент времени с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), ионообменной ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. Дополнительный анализ осуществляли в моменты времени через две недели, четыре недели и восемь недель. Оценка составов включала мониторинг концентрации лекарственного средства, визуальный осмотр/мутность и проверку pH с течением времени в концентрации 10 и 25 мг/мл.

В нулевой момент времени образцы показывали схожие эксклюзионные ВЭЖХ хроматограммы, за исключением образца, полученного в фосфатном буфере с аргинином, pH 7.

Через две недели состав, содержащий аргинин, демонстрировал мутный раствор с преципитатами. Этот результат не был ожидаемым, поскольку аргинин использовали для того, чтобы увеличивать растворимость других белковых продуктов. Схожие проблемы с растворимостью наблюдали при других температурах, так что аргинин-содержащий состав исключали из дальнейших анализов. Через четыре недели эксклюзионный ВЭЖХ анализ показывал, что все остающиеся составы не демонстрировали признаки агрегации растворимых веществ или расщепления при температурах ниже 25°C.

Через восемь недель, все составы, кроме одного, демонстрировали хорошую стабильность во время хранения при -70°C.

Результаты полного анализа через восемь недель вели к выбору состава, обозначаемого в настоящем документе как «P6N», для обеспечения наилучшей стабильности в отношении извлечении и распада, как наблюдали посредством ОФ-ВЭЖХ, ионообменной ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. Этот состав, при pH 6, содержит 10 мМ ацетат натрия в качестве буфера; 0,8% NaCl в качестве стабилизатора/модификатора тоничности; 0,05% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества; и концентрацию белка 11,2 мг/мл, как определяют посредством ОФ-ВЭЖХ. Концентрацию белка можно повышать до 50 мг/мл.

Состав P6N не демонстрировал признаки изменения после пяти циклов замораживания-оттаивания, как определяют посредством ОФ-ВЭЖХ и ионообменной ВЭЖХ. После трех часов энергичного стресса на вортексе этот состав оставался прозрачным и не демонстрировал признаки распада, как определяют с использованием ОФ-ВЭЖХ и ионообменной ВЭЖХ.

Пример 5. Стабильность клинического состава

Краткосрочную стабильность ShK-186, сформулированного в P6N, изучали при трех наборах условий, разработанных для того, чтобы копировать клиническое использование: хранение в течение 72 часов при различных температурах и хранение в течение 24 часов в стерильных пластмассовых шприцах. Длительную стабильность тестировали в течение 1, 3, 6 и 12 месяцев хранения при температурах охлаждения (например, 5°C) и заморозки (например, -70°C, -20°C).

Для краткосрочных исследований ShK-186 разводят до конечной концентрации 1 мг/мл с использованием или 5% (масс./об.) декстрозы или 0,9% (масс./об.) физиологического раствора или растворов в ВДИ. Исследование краткосрочной стабильности охватывает 72 часа хранения при температурах охлаждения (например, 5°C) и повышенных температурах (например, 40°C) в каждом разбавителе. ShK-186, разведенный в ВДИ, без консервантов, служил в качестве контроля. Для исследований долгосрочного хранения ShK-186 формулировали в P6N в концентрации 25 или 50 мг/мл, затем аликвоты использовали для того, чтобы получать образцы, которые имеют конечную концентрацию, как указано, в мг/мл. Экспериментальные параметры представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2
Исследование стабильности разбавителя, краткосрочное
Конечная концентрация ShK-186, мг/мл	Разбавитель	Температура хранения, °С	Моменты времени, ч
1	5% (масс./об.) декстроза в ВДИ	5, 25, 40	0, 24, 72
1	0,9% (масс./об.) NaCl в ВДИ
1	ВДИ (контроль)

Таблица 3
Исследование стабильности разбавителя, долгосрочное
Конечная концентрация ShK-186, мг/мл	pH	Буфер, 10 мМ	Стабилизатор, масс./об.	Температура хранения, °С	Моменты времени, мес
25	6,0	Фосфат натрия	0,8% NaCl	-70, -20, +5	0, 1, 3, 6, 12
10	6,0	Фосфат натрия	0,8% NaCl

Исследование стабильности, которое осуществляли шесть месяцев, как показано в таблице 3, давало следующие результаты на основе эксклюзионной ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. Через 6 месяцев отсутствовало значительное изменение pH или концентрации, по сравнению с более ранними моментами времени. Общие результаты показывали, что концентрации пептидов не демонстрировали какое-либо значимое влияние на стабильность составов. Стабильность при 5°C демонстрировала очень пологое снижение по сравнению с -20°C и -70°C. Такие результаты находились в соответствии с промышленным стандартом хранения полипептидных фармацевтических композиций при низких температурах, по меньшей мере, ниже заморозки.

Определяли характеристики стабильности в устройстве доставки, таком как стерильный пластмассовый шприц 1 см³. Такое устройство подходит для подкожной доставки. Образцовое неограничивающее устройство представляет собой шприц Becton Dickinson (BD) Slip-Tip Sub-Q 1 cc, оборудованный иглой 26G×5/8 дюйма (номер изделия BD 309597). 0,5 мл аликвоты состава ShK-186 в разбавителях и концентрации, представленных в таблице 2, набирали и инкубировали в шприце в условиях окружающей среды. Стабильность тестируют в течение времени, отражающего клиническое использование, например, четыре часа.

Определяли стабильность ShK-186 в трех концентрациях, 10, 25 и 50 мг/мл, при температурах охлаждения и хранения в заморозке. Лиофилизированный ShK-186 растворяли в составе P6N для того, чтобы достигать этих конечных концентраций ShK-186. Каждый сформулированный раствор стерилизовали с использованием 0,2 мкм фильтров и переносили в подходящие стерильные сосуды, такие как сосуды 3 см³ из боросиликатного стекла I типа, при объеме заполнения 0,5 мл на сосуд, в стерильных условиях. Сосуды хранили при 5°C, -20°C и -70°C для тестирования в моменты времени ноль, три и шесть месяцев.

Образцы тестировали в обозначенные моменты времени с использованием параметров, представленных в таблице 4.

Таблица 4
Аналитические способы того, чтобы осуществлять мониторинг стабильности ShK-186
Аналитический способ	Результат оценки
Визуальный осмотр	Внешний вид
pH	Значение pH
Осмоляльность	Значение осмоляльности
Спектрофотометрия в УФ и видимом спектре	Концентрация (погл. 280 нм) Мутность (погл. 500-700 нм)
Эксклюзионная ВЭЖХ	Чистота, агрегаты, расщепление
Обращенно-фазовая ВЭЖХ	Чистота, химические модификации
Биологический анализ	Активность/сила полипептида

Резюме. Приведенные выше примеры предоставляют способы определения подходящих компонентов и состояний для получения фармацевтически приемлемых композиций, содержащих полипептид ShK для терапевтического использования. Достоверность способов демонстрировали с помощью успешного получения ShK-186 в составе, который обеспечивает хорошую растворимость, длительное хранение (шесть месяцев) и стабильность.

Пример 6. Изучение стабильности в течение двенадцати месяцев

SkH-186 формулировали в концентрации 10 мг/мл и 25 мг/мл в 10 мМ фосфате натрия, pH 6,0, содержащем 0,8% NaCl и 0,05% полисорбата 20, и инкубировали в течение 12 месяцев при 5°C, -20°C и -70°C. Эксклюзионный ВЭЖХ анализ показывал, что концентрация в составах не оказывала какого-либо видимого влияния на их стабильность. Температура инкубации имела небольшое влияние на стабильность обоих составов. Образцы, которые инкубировали при 5°C, показывали небольшое повышение в % высокомолекулярных соединений (1,19%) по сравнению с замороженными образцами (0,95%). Процентная доля низкомолекулярных частиц оставалась относительно неизмененной для обоих составов при всех температурах. Основываясь на результатах эксклюзионной ВЭЖХ, общая процентная доля мономера для обоих составов в конце исследования составляла приблизительно 98%.

ОФ-ВЭЖХ анализ образцов также показывал, что концентрация составов не оказывает какого-либо видимого влияния на стабильность составов. Образцы, которые инкубировали при 5°C, демонстрировали небольшое повышение распада до и после пика (0,8-0,9%) по сравнению с замороженными составами (0,3-0,7%). Данные указывали на то, что более высокие температуры инкубации вели к более высокой процентной доле распада после пика по сравнению с распадом до пика. Основываясь на результатах ОФ-ВЭЖХ, общая чистота обоих составов в конце исследования составляла приблизительно 99%.

В таблице 5 кратко изложены данные о pH и концентрации, которые собирали на всем протяжении временных рамок 12-месячного исследования. В нулевой момент времени имели следующие значения: для 10P6N (ShK-186 в концентрации 10 мг/мл), pH 6,1, концентрация (конц., мг/мл) 9,9 мг/мл, и Осмоляльность в мОсм составляла 317. Для 25P6N (ShK-186 в концентрации 25 мг/мл), pH составлял 6,0, концентрация составляла 25,1 мг/мл и осмоляльность составляла 293. Основываясь на результатах, pH и концентрация образцов оставались относительно неизменными на всем протяжении исследования, независимо от температуры инкубации.

Таблица 5
pH и концентрация составов через 1, 3, 6 и 12 месяцев
ИД образца	Температура инкубации	1 месяц	3 месяца	6 месяцев	12 месяцев
pH	Кон-цент-рация	pH	Концентрация	pH	Концентрация	pH	Концентрация
10P6N	5°C	6,03	9,63	6,03	9,63	6,06	9,85	6,07	10,2
10P6N	-20°C	6,03	9,54	6,03	9,54	6,07	9,94	6,10	9,96
10P6N	-70°C	6,05	9,85	6,05	9,85	6,09	9,77	6,09	10,1
25P6N	5°C	6,00	24,72	6,00	25,78	6,04	25,08	6,06	25,8
25P6N	-20°C	6,00	24,76	6,00	25,31	6,05	24,34	6,05	24,97
25P6N	-70°C	5,98	24,35	5,98	25,53	6,05	24,85	6,09	23,71

Пример 7. Биораспределение радиоактивно меченного ShK-221

Введение. Для того чтобы повышать чувствительность исследований in vivo, измерять биораспределение ShK-186 и оценивать общую концентрацию лекарственного средства (связанного плюс несвязанного) в цельной крови, радиоактивно меченный аналог ShK-186 получали и исследовали в двух животных моделях in vivo, на крысах и беличьих обезьянах. В этом примере термин «ADME» относится к абсорбции, распределению, метаболизму, экскреции.

Способы

Животные. Крыс Sprague Dawley [Crl:CD®SD] (в возрасте 6-9 недель) приобретали в Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) и содержали помещении с контролируемой температурой (64-79°C) и влажностью (30-70%). Корм и еду давали ad libitum.

Ненаивные беличьи обезьяны (Saimiri boliviensis) имели возраст между 2 и 5 годами и их получали из стоковой колонии в MPI Research (Mattawan, Ml, USA). Беличьи обезьяны имели боливийское происхождение и их предоставлял University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX USA). Животных содержали по отдельности в клетках из нержавеющей стали в помещении с контролируемой окружающей средой. Обезьянам обеспечивали обогащение среды; люминесцентное освещение предоставляли 12 часов в сутки. Температуру поддерживали между 64 и 84°C; влажность составляла 30-70%. Животным предоставляли Certified Primate Diet (PMI Nutrition International, Inc., St. Louis, MO, USA) два раза раз в сутки. Primatreats® и другие обогащенные корма предоставляли на регулярной основе. Воду предоставляли ad libitum.

DOTA-конъюгат ShK-186 (ShK-221). «DOTA» относится к 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоте. ShK-221 (MW 4442) синтезировали с использованием твердофазной стратегии Fmoc-tBu. В кратком изложении, пептид собирали с использованием амидной смолы Chem-Matrix в масштабе 0,2 ммоль. Все стадии связывания опосредовали 6-Cl-HOBt (N-гидроксибензотриазол) в присутствии диизопропилкарбодиимида. Удаление Fmoc облегчали, используя 20% пиперидин в DMF (диметилформамид), содержащем 0,1M HOBt, для того, чтобы забуферить пиперидин и минимизировать возможную рацемизацию остатков 6 Cys. DOTA(tBu)3-OH связывали с N-концом с использованием того же приведенного выше протокола связывания. После сборки пептид отщепляли от смолы и одновременно снимали защитные группы с использованием реактива K, смеси для отщепления с TFA (трифторуксусной кислотой), содержащей ароматические катионные поглотители, в течение 2 ч при комнатной температуре. Неочищенный пептид фильтровали из отработавшей смолы и впоследствии выделяли посредством преципитации в ледяном диэтиловом эфире. Неочищенный пептид растворяли в 50% уксусной кислоте и впоследствии разбавляли в 3 л H₂O, содержащей 0,1 мМ GSSG и 0,2 мМ GSH. pH этого раствора пептида корректировали до 8,0 с использованием NH₄OH и медленно перемешивали в течение ночи. ShK самопроизвольно укладывается в основной термодинамически выгодный изомер, который представляет собой биологически активную форму пептида. Уложенный пептид загружали на колонку для препаративной ОФ-ВЭЖХ и очищали с использованием градиента MeCN в воде H₂O, содержащей 0,05% TFA. Фракции, содержащие пептид желаемой чистоты, объединяли вместе и лиофилизировали. Конечный выход составлял 35 мг из 0,2 ммоль синтеза; исходя из начальной смолы, это составляет выход 8%.

SPECT/CT сканирование радиоактивно меченного ShK-221. Осуществляли радиоактивное мечение ShK-221 (100 мкг) с использованием 2 мКи хлорида ¹¹¹индия (GE Healthcare, Arlington Heights, IL USA) в 300 мкл реакции, содержащей 50 мМ ацетат натрия, pH 5,0 в течение 30 мин при 95°C. Реакцию гасили посредством добавления ЭДТА до конечной концентрации 50 мМ, и эффективность радиоактивного мечения оценивали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка Luna 5μ C18(2) 100A 250×4,6 мм, Phenomenex, Torrance, CA USA) на системе Agilent 1100 с использованием радио-ВЭЖХ детектора IN/US Systems Gamma RAM Model 4 (LabLogic Systems, Brandon, FL USA). Эффективность мечения этим способом варьировала от 89 до 98%. SPECT/CT сканирование (NanoSPECT/CT Preclinical Imager, Mediso, Budapest, Hungary) осуществляли на анестезированных животных в четырех сканированиях по 15 минут в течение первого часа и по одному сканированию через 4, 8, 24, 48, 72, 120 и 160 часов после дозы. Индивидуальное время проецирования кадра для каждого спирального SPECT задавали так, что каждое сканирование будет длиться в течение приблизительно от 15 до 45 минут (варьирует в зависимости от момента времени, чтобы учесть изотопный распад) и допускать значительное накопление статистики в каждом кадре. Характеристические пики, обнаруживаемые в спектрах для ¹¹¹In, составляли 245 и 171 кэВ (первичный и вторичный, соответственно). Получаемые проекционные данные реконструировали после каждого сканирования с использованием итеративной модели, которая имеет преимущества точечной апертуры, чтобы достичь разрешения приблизительно 2 мм.

Приблизительно 10 мкл образцы крови собирали после каждого сканирования и количество радиоактивности в образце измеряли с использованием сцинтилляционного счетчика Wallac Wizard 1470 (Perkin Elmer, Waltham, MA USA). Концентрации лекарственного средства вычисляли с учетом удельной активности введенной дозы, периода полувыведения ¹¹¹In (67,3 часа) и эффективности счета у прибора.

Статистический и вычислительный анализ. Статистический анализ осуществляли с использованием двустороннего критерия Стьюдента. Адекватность выбора модели определяли с использованием статистики R². Фармакокинетические вычисления осуществляли следующим образом: C_max и T_max наблюдали в массиве данных. AUC вычисляли с использованием способа линейных трапеций. Конечный элиминационный период полувыведения вычисляли по наклону линии регрессии с использованием лучшего скорректированного значения R². AUCt вычисляли посредством деления последней наблюдаемой концентрации лекарственного средства на наклон конечной элиминации.

Результаты исследований ADME с радиоактивно меченным аналогом ShK-186. ShK-186 содержит один иодируемый тирозин в положении 23. Однако встраивание иода в кольцо, для которого предсказано взаимодействие с областью поры канала Kv1.3 (Pennington et al., Biochemistry 35:16407-16411, 1996), ведет к разрушению свойств связывания с каналом у лекарственного средства. Следовательно, аминоконец ShK-198 модифицировали шестиуглеродным линкером, прикрепленным через пептидную связь к одной из карбоновых кислот DOTA-хелата (фиг.2A). DOTA-конъюгат, обозначаемый ShK-221, легко координировался с индием или гадолинием (фиг.2B-C) и сохранял полную активность исходной молекулы (фиг.3). ¹¹¹In-меченный ShK-221 получали и вводили посредством подкожной инъекции крысам Sprague Dawley (1,0 мКи, 100 пг/кг) и беличьим обезьянам (0,83 мКи, 35 пг/кг). Эффективность радиоактивного мечения варьировала от 89 до 98% в серии экспериментов, как определяли посредством ВЭЖХ. Биораспределение радиоактивно меченного ShK-221 оценивали посредством SPECT визуализации непрерывно в течение первого часа после дозы и затем через 4, 8, 24, 48, 72, 120 и 160 ч. Фоновые уровни в системе обнаружения составляли приблизительно 0,1 мКи/м³ (~5 нг/м³ ShK-221 в начальный момент времени и 26 нг/м³ в последний момент времени). Образцы крови собирали после каждого сканирования и измеряли общую радиоактивность в цельной крови посредством счета сцинтилляций. Компьютерную томографию осуществляли в каждый момент времени сделать возможной колокализацию радиоактивной метки и ключевых анатомических структур.

Биораспределение ¹¹¹In-ShK-221 у беличьих обезьян принципиально отличалось медленной абсорбцией из места инъекции в течение всего 160-часового периода (фиг.1A и 1E). Количество лекарственного средства, присутствующего в месте инъекции, повторяло двухфазное экспоненциальное затухание (R²=0,95) с начальным периодом полувыведения приблизительно 1-1,5 часа и конечным периодом полувыведения > 48 часов (фиг.1E). В течение первого часа значительную радиоактивность можно было наблюдать в почках, с возрастающей интенсивностью через 1 час (~1% инъецированной дозы (ИД)/г, таблица 1) и медленным снижением приблизительно до базового уровня через 48 часов. Радиоактивность в почках обезьян в первую очередь наблюдали в кортикальной и медуллярной областях во все моменты времени и в сравнении с этим она отсутствовала в почечных лоханках, за исключением первого часа (фиг.1B). Значительную радиоактивность, ассоциированную с мочевым пузырем (T_max = 0,75-1 ч, 0,34% ИД/г), наблюдали только в течение первых четырех часов, после чего в мочевом пузыре обнаруживали относительно небольшое количество радиоактивной метки. Никакие другие органы не демонстрировали значительные уровни радиоактивности, за исключением печени, которая показывала пиковые значения через 0,75-1 час после введения дозы (0,166% ИД/г). Мышцы, сердце и головной мозг имели <0,1% ИД/г во все моменты времени (таблица 6).

Таблица 6
Максимальная концентрация 111In-ShK-221 в конкретных тканях беличьих обезьян после подкожной инъекции 35 пг/кг
Ткань	Максимальный период сканирования (ч)	Максимум (% инъецированной дозы/г)
Место инъекции	0–0,25	17,3
Почки	0,75–1,0	0,976
Мочевой пузырь	0,75–1,0	0,338
Печень	0,75–1,0	0,166
Сердце	0,75–1,0	0,093
Мышцы	0,5–0,75	0,039
Головной мозг	0,75–1,0	0,020

Биораспределение ¹¹¹In-ShK-221 у крыс схоже с обезьянами и отличается слегка более быстрой абсорбцией из места инъекции и экскрецией через мочу в первые 24 часа (фиг.1C и 1E). Значительную радиоактивную метку наблюдали в мочевом пузыре (9,4% ИД/г), почках (2,9% ИД/г) и печени (0,4% ИД/г) крыс в течение первого часа (фиг.1C). Несмотря на то, что небольшое количество метки идентифицировали в мочевом пузыре в более поздние моменты времени, количество лекарственного средства в печени и почках было относительно постоянным в первые 24 ч. Вид в поперечном разрезе почки крысы показывал, что, за исключением первого часа, радиоактивность концентрировалась в первую очередь в кортикальных областях, подобно обезьянам (фиг.1D).

Оценка ассоциированной с кровью радиоактивности у обезьян в каждый момент времени также демонстрировала двухфазное экспоненциальное затухание (R²=0,99) с начальным периодом полувыведения приблизительно 1 час и конечным периодом полувыведения >64 часов (фиг.1F). У обезьян значительную часть фазы конечной элиминации отражают концентрации в крови ниже уровня количественного определения у предыдущих способов, но значительно выше K_d для ShK-186. Ожидают, что 80% каналов Kv1.3 в цельной крови будет связано лекарственным средством через приблизительно 5 суток после дозы, а концентрации остаются выше K_d в течение всего 160-часового периода.

Ассоциированная с цельной кровью радиоактивность у крыс также демонстрировала двухфазное экспоненциальное затухание (R²=0,99) с начальным периодом полувыведения приблизительно 1,7 часа и конечным периодом полувыведения >72 часов (фиг.1F). Концентрации лекарственного средства, как у обезьян, значительно выше K_d для ShK-186 до 5 суток после дозы. Ожидают, что 80% каналов Kv1.3 в цельной крови будет связано лекарственным средством приблизительно 3-5 суток после дозы.

Данные показывают, что биораспределение радиоактивно меченного ShK-221 у крыс и беличьих обезьян отличается посредством очень медленным распределением из места инъекции, значительными концентрациями лекарственного средства периферически в месте инъекции, почках и печени и длительной фазой терминальной элиминации в цельной крови. Уровни лекарственного средства оставались выше ~200 пМ в крови в течение приблизительно 7 суток у обезьян и 3 суток у крыс.

Значительные количества радиоактивности наблюдали в мочевом пузыре как крыс (~17% инъецированной дозы), так и обезьян (~1% инъецированной дозы) в ранние моменты времени после введения ¹¹¹In-ShK-221, что указывает на то, что клубочковая фильтрация представляет собой главный путь элиминации для пептида вскоре после инъекции. Большое количество лекарственного средства, экскретируемого крысами в первый час, наиболее вероятно отражает повышенный метаболизм у крыс по сравнению с обезьянами. После 1 часа у крыс и приблизительно 4 часов у обезьян небольшую радиоактивность наблюдали в мочевом пузыре, тогда как значительные количества радиоактивности все еще наблюдали в коре почек. О накоплении в коре сообщалось для многих радиоактивно меченных версий пептидных лекарственных средств, включая октреотид, бомбезин, экзендин и гастрин (Gotthardt et al., J. Nucl. Med. 48:596-601, 2007). Механизм удержания в коре наиболее тщательно описан для октреотида. Канальцевая реабсорбция катионного октапептида опосредована мегалином, скэвенджер-рецептором, экспрессируемым в проксимальных канальцах почки (de Jong et al., J. Nucl. Med. 46:1696-1700, 2005). У мышей с разрушением рецептора конкретно в почках отсутствует удержание радиоактивно меченного октреотида в коре, которое наблюдали у мышей дикого типа. Почечное накопление октреотида частично опосредовано зарядом и может быть нарушено посредством совместной инфузии положительно заряженных аминокислот L-лизин и L-аргинин (Bodei et al., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 30:207-216, 2003). ShK-186 несет суммарный заряд +6 ри физиологическом pH, и, таким образом, его удержание в почках может быть опосредовано схожим механизмом.

Вкратце, исследования ADME с использованием радиоактивно меченного ShK указывают на то, что однократная доза лекарственного средства может обеспечивать терапевтически значимые концентрации в крови в течение вплоть до 5 суток у крыс и 7 суток у обезьян. Эти наблюдения имеют отношение к клинической разработке терапевтических средств на основе пептида ShK, включая ShK-186, поскольку оптимизированная частота доз обеспечит терапевтическую эффективность, повысит соблюдение пациентом схемы лечения и снизит потенциал для накопления лекарственного средства при хроническом введении.

Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакции и так далее, используемые в описании и формуле изобретения, во всех случаях следует понимать как модифицированные термином «приблизительно». Соответственно, пока не указано иное, числовые параметры, изложенные в описании и прилагаемой формуле изобретения, представляют собой приближение, которое может варьировать в зависимости от желаемых свойств, которые стремятся достичь посредством настоящего изобретения. По меньшей мере, и не в качестве попытки ограничить применение принципа эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый числовой параметр следует толковать по меньшей мере в свете числа приведенных значимых цифр и применяя обычные способы округления.

Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, задающие широкий объем изобретения, представляют собой приближения, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, приведены настолько точно, насколько это возможно. Однако любое числовое значение неотъемлемо содержит определенные ошибки, неизбежно следующие из стандартного отклонения, найденного при соответствующих ему тестовых измерениях.

Формы единственного числа и их аналоги, используемые в контексте описания изобретения (в частности, в контексте нижеследующей формулы изобретения), следует толковать как охватывающие единственную и множественную форму, если не указано иное в настоящем документе или ясно не продиктовано контекстом. Перечисление диапазонов значений в настоящем документе лишь предназначено для того, чтобы служить в качестве способа сокращения перечисления по отдельности каждого отдельного значения, попадающего в диапазон. Если не указано иное в настоящем документе, каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно перечислено в настоящем документе. Все способы, описанные в настоящем документе, можно осуществлять в любом подходящем порядке, если не указано иное в настоящем документе или иным образом явно не продиктовано контекстом. Использование каких-либо и всех примеров или поясняющих оборотов (например, «такой как»), предоставленных в настоящем документе, предназначено только для того, чтобы лучше осветить изобретение, и не накладывает ограничение на объем изобретения, заявленный иным образом. Обороты в описании не следует толковать в качестве указания на какой-либо не заявленный элемент, который важен для практического осуществления изобретения.

Группировки альтернативных элементов или вариантов осуществления изобретения, описанные в настоящем документе, не следует толковать в качестве ограничений. На каждый элемент группы можно ссылаться и заявлять его по отдельности или в какой-либо комбинации с другими элементами группы или другими элементами, найденными в настоящем документе. Предполагают, что один или более элементов группы можно включать в группу или удалять из нее по причинам удобства и/или патентоспособности. Когда происходит какое-либо такое включение или удаление, то полагают, что описание содержит модифицированную группу, таким образом, отвечая приведенному описанию всех групп Маркуша, используемых в приложенной формуле изобретения.

В настоящем документе описаны определенные варианты осуществления данного изобретения, включая лучший вариант, известный авторам изобретения, для осуществления изобретения. Конечно, вариации в этих описанных вариантах осуществления будут очевидны специалистам в данной области после прочтения приведенного выше описания. Авторы изобретения ожидают, что специалисты в данной области используют такие вариации соответствующим образом, и авторы изобретения предполагают для изобретения иное практическое осуществление, нежели конкретно описанное в настоящем документе. Соответственно, это изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, перечисленные в формуле изобретения, приложенные к нему, как допускает применяемое право. Кроме того, изобретение охватывает какие-либо комбинации описанных выше элементов во всех возможных их вариациях, если не указано иное в настоящем документе или иным образом явно не продиктовано контекстом.

Конкретные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, дополнительно можно ограничивать в формуле изобретения, используя обороты «состоит из» или «по существу состоит из». Когда используют в формуле изобретения, как подано или добавлено посредством исправления, переходный термин «состоит из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не определенный конкретно в формуле изобретения. Переходный термин «по существу состоит из» ограничивает объем пункта формулы изобретения конкретно определенными материалами или стадиями и тем, что не оказывает существенного влияния на основные и новые характеристики. Варианты осуществления изобретения, заявленные таким образом, неотъемлемо или в явной форме описаны и разрешены в настоящем документе.

В заключение следует понимать, что варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем документе, являются иллюстрациями принципов настоящего изобретения. Другие модификации, которые можно использовать, входят в объем изобретения. Таким образом, в качестве примера, но не ограничения, альтернативные конфигурации настоящего изобретения можно использовать в соответствии с положениями настоящего документа. Соответственно, настоящее изобретение не ограничено тем, что точно показано и описано.

1. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунных нарушений, которая содержит

фармацевтически приемлемую соль полипептида ShK, состоящего из последовательности SEQ ID №1, прикрепленной к химической частице посредством аминоэтилоксиэтилоксиацетилового (АЕЕАс) линкера, где указанная химическая частица выбрана из группы, состоящей из AEEAc-L-Pmp(ОН₂); АЕЕАс-D-Pmp(ОН₂); АЕЕАс-D-Pmp(ОН, Et); АЕЕАс-L-Pmp(Et₂); АЕЕАс-D-Pmp(Et₂); АЕЕАс-L-Tyr; АЕЕАс-L-Tyr(PO₃H₂); АЕЕАс-L-Phe(p-NH₂); АЕЕАс-L-Phe(р-CO₂H); АЕЕАс-L-аспартата; AEEAc-D-аспартата; АЕЕАс-L-глутамата; и AEEAc-D-глутамата, и С-конец полипептида представляет собой кислоту или амид; и

поверхностно-активное вещество в количестве, эффективном для того, чтобы растворять указанный полипептид ShK в водном носителе;

где рН указанной фармацевтической композиции составляет 5-7.

2. Композиция по п. 1, где указанный полипептид представляет собой

a) Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂; или

(b) п-фосфо-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, где композиция содержится в стерильном стеклянном сосуде и ее следует хранить при -70°С.

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, составленная для подкожного введения.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, где композиция содержится в стерильном шприце.

6. Изделие для лечения аутоиммунных заболеваний, содержащее:

фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемую соль полипептида ShK, состоящего из последовательности SEQ ID №1, прикрепленной к химической частице посредством линкера АЕЕАс, где указанная химическая частица выбрана из группы, состоящей из АЕЕАс-L-Pmp(ОН₂); АЕЕАс-D-Pmp(OH₂); АЕЕАс-D-Pmp(ОН, Et); АЕЕАс-L-Pmp(Et₂); АЕЕАс-D-Pmp(Et₂); АЕЕАс-L-Tyr; АЕЕАс-L-Tyr (PO₃H₂); АЕЕАс-L-Phe (p-NH₂); АЕЕАс-L-Phe(р-CO₂H); AEEAc-L-аспартата; AEEAc-D-аспартата; АЕЕАс-L-глутамата; и АЕЕАс-D-глутамата, и С-конец полипептида представляет собой кислоту или амид; и поверхностно-активное вещество в количестве, эффективном для того, чтобы растворять указанный полипептид ShK в водном носителе; где рН указанной фармацевтической композиции составляет 5-7, где указанная фармацевтическая композиция содержится в, по меньшей мере, одном стеклянном сосуде, полученном в стерильных условиях, так что указанная фармацевтическая композиция стабильна в течение, по меньшей мере, шести месяцев при -70°С, и

инструкции для разведения и приготовления указанной фармацевтической композиции для введения человеку.

7. Изделие по п. 6, где указанный полипептид представляет собой

a) Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂; или

(b) п-фосфо-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂.

8. Изделие для лечения аутоиммунных заболеваний, содержащее:

фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемую соль полипептида ShK, состоящего из последовательности SEQ ID №1, прикрепленной к химической частице посредством линкера АЕЕАс, где указанная химическая частица выбрана из группы, состоящей из АЕЕАс-L-Pmp(OH₂); АЕЕАс-D-Pmp(OH₂); АЕЕАс-D-Pmp(ОН, Et); АЕЕАс-L-Pmp(Et₂); АЕЕАс-D-Pmp(Et₂); АЕЕАс-L-Tyr; АЕЕАс-L-Tyr (PO₃H₂); АЕЕАс-L-Phe (p-NH₂); АЕЕАс-L-Phe(р-CO₂H); AEEAc-L-аспартата; АЕЕАс-D-аспартата; АЕЕАс-L-глутамата; и АЕЕАс-D-глутамата, и С-конец полипептида представляет собой кислоту или амид; и поверхностно-активное вещество в количестве, эффективном для того, чтобы растворять указанный полипептид ShK в водном носителе; где рН указанной фармацевтической композиции составляет 5-7, где указанная фармацевтическая композиция содержится в, по меньшей мере, одном стерильном шприце, и

инструкции для введения указанной фармацевтической композиции человеку.

9. Изделие по п. 8, где указанный полипептид представляет собой

a) Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂; или

(b) п-фосфо-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂.

10. Способ изготовления фармацевтической композиции, который включает:

(a) приготовление раствора 0,05 масс./об. % полисорбата 20 в водном носителе;

(b) добавление в раствор со стадии (а) фармацевтически приемлемой соли полипептида ShK, состоящего из последовательности SEQ ID №1, прикрепленной к химической частице посредством линкера АЕЕАс, где указанная химическая частица выбрана из группы, состоящей из АЕЕАс-L-Pmp(ОН₂); АЕЕАс-D-Pmp(OH₂); АЕЕАс-D-Pmp(ОН, Et); АЕЕАс-L-Pmp(Et₂); АЕЕАс-D-Pmp(Et₂); АЕЕАс-L-Tyr; AEEAc-L-Tyr(PO₃H₂); АЕЕАс-L-Phe(p-NH₂); АЕЕАс-L-Phe(р-CO₂H); AEEAc-L-аспартата; AEEAc-D-аспартата; АЕЕАс-L-глутамата; и AEEAc-D-глутамата, и С-конец полипептида представляет собой кислоту или амид, в концентрации 10 или 25 мг/мл в 10 мМ фосфате натрия;

(c) корректирование рН раствора со стадии (b) до тех пор, пока полипептид не растворится в растворе; и

(d) в случае необходимости, корректировку рН раствора со стадии (с) до рН 5-7,

посредством чего получают фармацевтическую композицию.

11. Способ по п. 10, где указанный полипептид представляет собой

a) Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂; или

(b) п-фосфо-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH₂.