Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека



Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека
Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека
Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека
Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека
Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека
Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека
Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека
C12N15/115 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2639238:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России) (RU)
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" (ФИЦ КНЦ СО РАН, КНЦ СО РАН) (RU)

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека, включающий инкубацию образца ткани рака легкого человека с дрожжевой РНК и инкубацию с растворами аптамеров, меченых различными флуоресцентными метками в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+. Окрашенный образец ткани замораживают и делают срезы с помощью криостата. Полученные срезы исследуют с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Опухолеспецифичные мишени идентифицируют с помощью световой микроскопии, для чего часть срезов образца проинкубированной ткани окрашивают гематоксилином и эозином. Способ позволяет выявить в срезе ткани больного раком легкого человека различные виды присутствующих в ней опухолевых элементов, а именно опухолевых клеток, ядер или ядрышек опухолевых клеток, лимфоцитов, несущих опухолевый антиген и модифицированную в результате опухолевого процесса соединительную ткань. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к способам выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека с помощью аптамеров, в частности, к окрашиванию гистологических срезов тканей рака легкого человека аптамерами, меченными флуоресцентной меткой.

Известно, что детекция биомаркеров в опухолевой ткани является важным аспектом для подтверждения диагноза и анализа злокачественности раковой опухоли. В настоящее время для детекции биомаркеров в срезах ткани чаще всего используют метод иммуногистохимии (Zeng, Zihua. Using oligonucleotide aptamer probes for immunostaining of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues/ Zihua Zeng, Peng Zhang, Nianxi Zhao, Andrea M Sheehan, Ching-Hsuan Tung, Chung-Che Chang, Youli Zu// Modern Pathology. - 2010. - №23. P. 1553-1558), т.е. окрашивания срезов моноклональными антителами. Однако, несмотря на эффективность использования антител для анализа опухолевой ткани, применение иммуногистохимических методов исследования для клинической диагностики зачастую является затруднительным из-за высокой стоимости моноклональных антител.

Также для выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей применяют аптамеры - синтетические ДНК- или РНК-олигонуклеотиды, способные к специфическому связыванию с заданными мишенями. В отличие от моноклональных антител аптамеры имеют гораздо более низкую стоимость, поскольку могут быть синтезированы химически, кроме того, они легко модифицируются и обладают низкой иммуногенностью. Различными исследователями было показано, что аптамеры могут быть использованы для эффективного анализа опухолей наряду с коммерчески используемыми моноклональными антителами (Zeng, Zihua. Using oligonucleotide aptamer probes for immunostaining of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues/ Zihua Zeng, Peng Zhang, Nianxi Zhao, Andrea M Sheehan, Ching-Hsuan Tung, Chung-Che Chang, Youli Zu// Modern Pathology. - 2010. - №23. P. 1553-1558; Ying Pu/ Using DNA Aptamer Probe for Immunostaining of Cancer Frozen Tissues/ Ying Pu, Zhenxu Liu, Yi Lu, Peng Yuan, Jun Liu, Bo Yu, Guodong Wang, Chaoyong James Yang, Huixia Liu, Weihong Tan / Analytical Chemistry .- 2015. - V.87 (3). - P. 1919-1924; Zeng, Zihua. Using oligonucleotide aptamer probes for immunostaining of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues/ Zihua Zeng, Peng Zhang, Nianxi Zhao, Andrea M Sheehan, Ching-Hsuan Tung, Chung-Che Chang, Youli Zu// Modern Pathology. - 2010. - №23. P. 1553-1558).

Так, например, известно применение РНК-аптамеров для детекции клеток, экспрессирующих белок CD30 для гистохимических исследований фиксированных тканей лимфомы Ходжкина и анапластической крупноклеточной лимфомы (Zeng, Zihua. Using oligonucleotide aptamer probes for immunostaining of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues/ Zihua Zeng, Peng Zhang, Nianxi Zhao, Andrea M Sheehan, Ching-Hsuan Tung, Chung-Che Chang, Youli Zu// Modern Pathology. - 2010. - №23. P. 1553-1558). Данный способ гистохимических исследований, основанный на использовании аптамеров к белку CD30, имеет ряд преимуществ по сравнению со стандартно используемым иммуногистохимическим методом, поскольку: время инкубации лиганда с мишенью составляет 20 мин, тогда как стандартно для моноклональных антител необходимо 90 мин инкубации; связывание лигандов с клетками ткани можно проводить при 37°С (с антителами - только 95°С), что упрощает условия, необходимые для проведения гистохимических исследований; аптамеры, описанные в статье, не связываются с тканями, которые не экспрессируют белок CD30, и клеточными обломками некротических тканей, в отличие от моноклональных антител к CD30, которые могут неспецифично связываться с некоторыми клетками или их обломками. Срезы анализировались с помощью световой микроскопии.

При этом описанный способ предусматривает использование вторичных антител, коньюгированных с пероксидазой хрена для окраски клеток, связавшихся с аптамерами к белку CD30.

Недостатком способа является его высокая стоимость, поскольку использование вторичных антител делает процедуру описанного исследования более дорогой, по сравнению с методами, в которых используются непосредственно аптамеры.

Известны исследования свойств ДНК-аптамеров, подобранных к клеточной линии HepG2 для диагностики парафинизированных срезов гепатоцеллюлярной карциномы человека (Bin Lu/ Screening and verification of ssDNA aptamers targeting human hepatocellular carcinoma / Jiucun Wang, Jun Zhang, Xiaojiao Zhang, Dongqin Yang, Lijun Wu, Zhongguang Luo, Yanyun Ma, Qi Zhang, Yunfang Ma, Xiaoyu Pei, Hua Yu, Jie Liu/ Acta Biochim Biophys Sin (2013), doi: 10.1093/abbs/gmtl30). Окрашивание срезов осуществляли следующим образом. Фиксированные в формалине и заключенные в парафин срезы ткани депарафинизировались путем нагрева в цитратном буфере (рН 6.0). Неспецифические сайты связывания на срезах блокировали путем инкубации срезов в фосфатном буфере, содержащем 10% бычий сывороточный альбумин, дрожжевую РНК и маскирующую ДНК в конечных концентрациях 1 мг/мл в течении 60 минут при 4°С. После этого срезы окрашивались флуоресцентно меченным аптамером в концентрации 500 нМ и инкубировались 2 часа при 4°С. Срезы анализировались с помощью флуоресцентной микроскопии.

Описанный способ исследования срезов является достаточно трудоемким из-за использования фиксированных в формалине и заключенных в парафин срезов для окрашивания аптамерами, поскольку процедура фикации, парафинизации и депарафинизации срезов занимает несколько дней и является сложной и многоэтапной.

Известен также способ, предусматривающий применение ДНК-аптамера SYL3C к эпителиальному фактору роста (Ying Pu/ Using DNA Aptamer Probe for Immunostaining of Cancer Frozen Tissues/ Ying Pu, Zhenxu Liu, Yi Lu, Peng Yuan, Jun Liu, Bo Yu, Guodong Wang, Chaoyong James Yang, Huixia Liu, Weihong Tan / Analytical Chemistry. - 2015. - V.87 (3). - P. 1919-1924). ДНК-аптамер SYL3C в данном способе использовали для окрашивания замороженных срезов, или срезов, заключенных в парафин. Срезы ткани подвергали депарафинизации с помощью ксилена и последовательных промываний в 100%, 95% и 75% этаноле; кипятили в Трис-EDTA буфере (рН 8.0) и инкубировали в фосфатном буфере, содержащем 20% телячью сыворотку и 1 мМ натриевую соль ДНК из тимуса теленка в течение 15 минут для восстановления антигенов. Для окрашивания замороженных срезов ткани, срезы инкубировали с 1 мкМ различных случайных последовательностей ДНК 5 минут для блокировки неспецифических сайтов связывания, а затем с 250 нМ SYL3C в течение 1 часа. Затем ткани промывали фосфатным буфером, содержащим 25 мМ MgCl2 и 0.045% глюкозу. Ядра клеток окрашивали красителем DAPI. Срезы ткани дополнительно окрашивали красителем Романовского-Гимза для идентификации мишеней с помощью световой микроскопии.

Использованный авторами протокол предусматривает применение только одного аптамера для окрашивания эпителиальных клеток в гистологических срезах ткани опухоли. Достоверность результатов анализа опухоли при окрашивании одной опухолевой структуры с применением одного аптамера недостаточно высока, поскольку у разных пациентов концентрация различных онкомаркеров часто варьируется от нуля до сотен нг/мкл (Mumbarkar, Р.Р. / Significance of tumor markers in lung cancer / P.P. Mumbarkar, A.S. Raste, M.S. Ghadge // Indian Journal of Clinical Biochemistry. - 2006. - V. 21 - №1. - P. 173-176). Поэтому использование аптамеров, специфичных для различных онкобелков, может повысить чувствительность метода диагностики. Кроме того, применение для анализа мишеней с помощью световой микроскопии красителя Романовского-Гимза, окрашивающего все клеточные и тканевые структуры в один цвет, не позволяет получить детальную идентификацию мишеней.

Таким образом, вследствие всех вышеприведенных факторов известный способ не позволяет с достаточной достоверностью выявлять опухолеспецифичные мишени в гистологических срезах опухолей больных раком легкого.

В качестве наиболее близкого аналога к заявляемому способу выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека выбран способ проведения анализа гистологических срезов с помощью аптамеров (Замай Г.С. Экспериментальные подходы к обнаружению опухолеспецифичных молекул в крови онкологических больных с использованием ДНК-аптамеров (на примере рака легкого человека). Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Новосибирск. - 2014. с. 12-13), по которому образцы ткани рака легкого и хондрогемартомы легкого фиксировали в 4% параформальдегиде, после чего помещали в фосфатный буфер, содержащий Са2+ и Mg2+, и резали на микротоме с шагом 40 мкм. Полученные срезы промывали раствором TRITON-X100 (0,2%) и фосфатным буфером, содержащим Са2+ и Mg2+. Для маскировки неспецифических сайтов связывания срезы инкубировали с маскирующей ДНК (Salmon sperm DNA) и с аптамерами, меченными флуоресцентной меткой Су'3, и антителами к цитокератинам 4, 5, 6, 8, 10, 13 и 18, меченными флуоресцентной меткой FITC (Sigma Aldrich, USA). Полученные образцы исследовали с помощью конфокального микроскопа Olympus Fluoview 10vi (Olympus Optical Co., Япония).

Недостатком данного способа также является его недостаточная специфичность для выявления опухолеспецифичных мишеней, вследствие того, что для окрашивания ткани был использован один аптамер, а не их комбинация и, кроме того, в способе отсутствует дополнительное окрашивание срезов красителями, позволяющими осуществлять анализ среза с помощью световой микроскопии для более детальной идентификации мишеней.

Задачей настоящего изобретения является повышение специфичности способа выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого.

Технический результат изобретения выражается в увеличении числа, выявленных в опухолевых тканях видов присутствующих в ней опухолевых элементов, а именно собственно опухолевых клеток, ядер или ядрышек опухолевых клеток, лимфоцитов, несущих опухолевый антиген и модифицированную в результате опухолевого процесса соединительную ткань.

Поставленная задача решается тем, что в способе выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека образец ткани рака легкого человека инкубируют с маскирующей нуклеиновой кислотой и с аптамерами, меченными флуоресцентной меткой, при этом, согласно заявляемому изобретению образец ткани после инкубации с нуклеиновой кислотой последовательно инкубируют с растворами аптамеров в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+, при этом используют аптамеры, меченные различными флуоресцентными метками, инкубацию осуществляют в следующей последовательности - первоначально образец ткани инкубируют с раствором аптамера, меченного флуоресцентной меткой I, затем с раствором второго аптамера, меченного флуоресцентной меткой II, и затем с раствором третьего аптамера, меченого флуоресцентной меткой III, после каждого этапа инкубации, осуществляют трехкратное промывание образца с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+, после чего, окрашенный таким образом, образец ткани замораживают и делают срезы с помощью криостата, полученные срезы исследуют с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, при этом, для инкубации используют аптамеры, специфичные к разным видам опухолевых элементов рака легкого человека, полученные в процессе селекции, и выбранные из установленной нуклеотидной последовательности, отраженной как SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 8, выявленные с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии опухолеспецифичные мишени, идентифицируют с помощью световой микроскопии, для чего часть срезов образца проинкубированной ткани окрашивают гематоксилином и эозином.

В способе могут быть использованы флуоресцентные метки, связанные с аптамерами, применяемыми для последовательной инкубации, имеющие спектры возбуждения и испускания, лежащие в области разных длин волн.

Образец ткани инкубируют с аптамерами в лунках планшета.

Одновременно осуществляют инкубацию нескольких разных образцов ткани рака легкого человека с использованием аптамеров, выбранных из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 8.

Заявляемый способ позволяет одновременно окрашивать различные опухолеспецифичные мишени в образцах ткани рака легкого человека с помощью аптамеров, специфичных к разным видам опухолевых элементов рака легкого человека, и осуществлять визуализацию опухолевых элементов в гистологических срезах ткани рака легкого человека с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, позволяющей идентифицировать флуоресцентные метки. Применение пула (смеси) аптамеров для окрашивания образцов тканей может быть неспецифичным из-за взаимодействия комплементарных цепей разных последовательностей ДНК-аптамеров. В заявляемом же способе применены аптамеры, специфичные к разным опухолеспецифичным мишеням, меченные отличающимися друг от друга флуоресцентными метками, при этом образец ткани инкубируют с аптамерами последовательно, что позволяет выявлять различные онкомаркеры или опухолевые элементы в образце ткани, в зависимости от выбора используемых аптамеров.

При этом точность и достоверность способа может быть повышена за счет использования для окрашивания образца ткани трех аптамеров, меченных различными флуоресцентными метками, спектры возбуждения и испускания которых лежат в области разных длин волн.

Замораживание проинкубированного образца ткани позволяет упростить технологию приготовления срезов с использованием криостата.

Применение стандартного окрашивания срезов гематоксилином и эозином позволяет уточнить и подтвердить выявленные опухолеспецифичные мишени с помощью световой микроскопии и провести детальный анализ структур клеток и тканей.

Инкубирование образца ткани в лунках планшета позволяет сократить расход реагентов.

Способ иллюстрируется схемой, представляющей способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека и фотографиями микроскопии, сделанными при исследовании образцов, полученных при реализации способа.

На фиг. 1 представлена схема, иллюстрирующая способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах рака легкого человека.

На фиг. 2 представлены результаты конфокальной и световой микроскопии гистологического среза ткани больного аденокарциномой легкого, окрашенного аптамерами LC-29, LC-2114, LC-2107, имеющими установленные нуклеотидные последовательности SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, специфичными к ядрам, внутреннему содержимому опухолевых клеток, внутриклеточным компонентам опухолевых клеток и модифицированной в результате опухолевого процесса соединительной ткани альвеол.

На фиг. 3 представлены результаты конфокальной и световой микроскопии гистологического среза ткани больного аденокарциномой легкого, окрашенного аптамерами LC-29, LC-224, LC-2018, имеющими установленные нуклеотидные последовательности SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 8, специфичными к опухолевым клеткам, ядрам или ядрышкам опухолевых клеток, лимфоцитам, несущим опухолевый антиген, и эластическим волокнам опухолевой ткани.

На фиг. 4 представлены результаты конфокальной и световой микроскопии гистологического среза ткани больного аденокарциномой легкого, окрашенного аптамерами LC-118, LC-17, LC-18, имеющими установленные нуклеотидные последовательности SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, специфичными к опухолевым клеткам, лимфоцитам, несущим опухолевый антиген, и ядрам опухолевых клеток.

Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека осуществляют следующим образом.

Для осуществления способа используют следующие расходные материалы и реактивы:

1. Фосфатный буфер, содержащий Са2+ и Mg2+.

2. Дрожжевую РНК.

3. ДНК-аптамеры к раку легкого человека.

4. Полистирол.

5. Предметные и покровные стекла.

6. Планшет.

Образец ткани размером приблизительно 5×5 мм трижды промывают в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+, в лунке планшета с помощью шейкера, таким образом, что каждый цикл отмывки длится в течение 5 минут.

После этого ткань инкубируют с нуклеиновой кислотой в конечной концентрации 1 нг/мкл в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Затем образец ткани трижды промывают фосфатным буфером, содержащим Са2+ и Mg2+, для того чтобы убрать излишки дрожжевой РНК.

Далее образец инкубируют в лунке планшета с первым аптамером меченным флуоресцентной меткой I, разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 60С на шейкере. После чего не связавшиеся последовательности удаляют путем трехкратного промывания с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+. Далее образец снова инкубируют в лунке планшета со вторым аптамером, разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере, меченным флуоресцентной меткой II. Затем не связавшиеся последовательности также удаляют путем трехкратного промывания с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+. В итоге образец инкубируют с третьим аптамером, меченным флуоресцентной меткой III, разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Далее образец снова трижды промывают с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+.

Для получения срезов окрашенный образец ткани фиксируют с помощью охлаждающего геля на металлических пластинах, замораживают с помощью жидкого азота и режут с помощью криостата. Полученные срезы аккуратно помещают на предметные стекла и фиксируют под покровными стеклами с помощью полистирола. Часть полученных срезов окрашивают с помощью гематоксилина и эозина и также фиксируют на предметных стеклах с помощью полистирола, накрывают покровными стеклами.

Полученные образцы исследуют с помощью методов микроскопии, позволяющих регистрировать флуоресцентные метки, в частности флуоресцентной и конфокальной, часть срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, исследуют с помощью световой микроскопии для визуализации и идентификации опухолеспецифичных мишеней с помощью световой микроскопии.

Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах рака легкого человека иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Для осуществления примера использовали послеоперационную ткань больного аденокарциномой легкого человека (с подтвержденным диагнозом).

Образец послеоперационной ткани был предоставлен Красноярским краевым клиническим онкологическим диспансером имени А.И. Крыжановского.

Образец ткани размером приблизительно 5×5 мм трижды промывали в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в лунке планшета с помощью шейкера, таким образом, что каждый цикл отмывки длился в течение 5 минут.

После этого ткань инкубировали с нуклеиновой кислотой, в качестве которой использовали дрожжевую РНК в конечной концентрации 1 нг/мкл, в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Затем образец ткани трижды промывали фосфатным буфером, содержащим Са2+ и Mg2+ для того, чтобы убрать излишки дрожжевой РНК.

Далее образец инкубировали в лунке планшета с аптамером LC-29, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 7, меченным флуоресцентной меткой I (FAM), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. После чего не связавшиеся последовательности удаляли путем трехкратного промывания с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+. Далее образец снова инкубировали в лунке планшета с аптамером LC-2114, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 5, меченным флуоресцентной меткой II (Су3), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Затем не связавшиеся последовательности также удаляли путем трехкратного промывания с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+. В итоге образец инкубировали с аптамером LC-2107, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 6, меченным флуоресцентной меткой III (Су5), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Далее образец снова трижды промывали с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+.

Для получения срезов окрашенный образец ткани фиксировали с помощью охлаждающего геля на металлических пластинах, замораживали с помощью жидкого азота и резали с помощью криостата. Полученные срезы толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла и фиксировали под покровными стеклами с помощью полистирола. Часть полученных срезов окрашивали с помощью гематоксилина и эозина и также фиксировали на предметных стеклах с помощью полистирола и накрывали покровными стеклами.

Полученные срезы исследовали с помощью конфокальной, флуоресцентной и световой микроскопии.

Результаты, полученные с помощью световой микроскопии (квадраты E1, Е2) и конфокальной микроскопии (квадраты A1-D1, A2-D2), представлены на фотографиях, приведенных на фиг. 2. Как видно из фиг. 2, ДНК-аптамеры LC-29, LC-2114, LC-2107 с установленными последовательностями SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 флуоресцировали с разной интенсивностью в разных опухолеспецифиных компонентах ткани рака легкого человека. Световая микроскопия ткани аденокарциномы легкого (фиг. 2, D1) показывает опухолевые клетки, некоторые из которых не имеют внутреннего содержимого, это видно благодаря тому, что цитоплазма вытекла из клеток, поскольку внеклеточное пространство зернистое, что является результатом окрашивания цитоплазмы гематоксилином и эозином. Из фотографий видно, что аптамер LC-2114, имеющий установленную последовательность SEQ ID NO 5, окрасил внутреннее содержимое опухолевых клеток - 2 (фотографиии В1, E1) и также окрасил ядро опухолевой клетки - 1 (фотографии В1, E1, В2, Е2). Аптамер LC-29, имеющий установленную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 7, также окрасил ядро опухолевой клетки - 1 (фотографии A1, E1, А2, Е2) и соединительные ткани альвеол - 4 (фотографии А2, Е2). Аптамер LC-2107, имеющий установленную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 6, окрасил внутриклеточные компоненты опухолевых клеток - 3 (фотографии C1, E1, С2, Е2). Таким образом, аптамеры позволили выявить в срезе ткани больного аденокарциномой легкого человека следующие виды присутствующих в ней опухолевых элементов, а именно ядро - 1 и внутреннее содержимое опухолевой клетки - 2, внутриклеточные компоненты опухолевых клеток - 3, модифицированную в результате опухолевого процесса соединительную ткань альвеол - 4. Данные, полученные с помощью микроскопии, показали, что применение заявляемого способа позволяет идентифицировать опухолеспецифичные элементы в срезах больных раком легкого.

Пример 2

Для осуществления примера использовали послеоперационную ткань больного аденокарциномой легкого человека (с подтвержденным диагнозом).

Образец послеоперационной ткани был предоставлен Красноярским краевым клиническим онкологическим диспансером имени А.И. Крыжановского.

Образец ткани размером приблизительно 5×5 мм трижды промывали в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в лунке планшета с помощью шейкера, таким образом, что каждый цикл отмывки длился в течение 5 минут.

После этого ткань инкубировали с дрожжевой РНК в конечной концентрации 1 нг/мкл в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Затем образец ткани трижды промывали фосфатным буфером, содержащим Са2+ и Mg2+, для того чтобы убрать излишки дрожжевой РНК.

Далее образец инкубировали в лунке планшета с аптамером LC-29, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 7, меченным флуоресцентной меткой I (FAM), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. После чего не связавшиеся последовательности удаляли путем трехкратного промывания с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+. Далее образец снова инкубировали в лунке планшета с аптамером 224, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 4, меченным флуоресцентной меткой II (Су3), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Затем не связавшиеся последовательности также удаляли путем трехкратного промывания с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+. В итоге образец инкубировали с аптамером LC-2108, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 8, меченным флуоресцентной меткой III (Су5), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Далее образец снова трижды промывали с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+.

Для получения срезов окрашенный образец ткани фиксировали с помощью охлаждающего геля на металлических пластинах, замораживали с помощью жидкого азота и резали с помощью криостата. Полученные срезы толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла и фиксировали под покровными стеклами с помощью полистирола. Часть полученных срезов окрашивали с помощью гематоксилина и также фиксировали на предметных стеклах с помощью полистирола и накрывали покровными стеклами.

Полученные срезы исследовали с помощью конфокальной, флуоресцентной и световой микроскопии.

Результаты, полученные с помощью световой микроскопии (квадраты E1, Е2) и конфокальной микроскопии (квадраты A1-D1, A2-D2), представлены на фотографиях, приведенных на фиг. 3.

Как видно из фотографий, представленных на фиг. 3, аптамеры LC-29, LC-224 и LC-2108 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 8 связались с эластическими волокнами в срезе ткани - 5 (фотографии Al, В1, C1, E1, А2, В2, Е2). И, кроме того, окрасили некоторые лимфоциты, по всей видимости несущие опухолевые антигены, поскольку они связались с аптамерами, специфичными для ткани рака легкого - 6 (фотографии A1, В1, C1, E1). Аптамеры LC-224 и LC-2108 окрасили также ядра или ядрышки опухолевых клеток - 1 (фотографии В1, C1, E1, В2, С2, Е2). Аптамеры LC-29, LC-224 окрасили также опухолевую клетку в срезе ткани - 7 (фотографии А2, В2, Е2). Таким образом, аптамеры позволили выявить в срезе ткани больного аденокарциномой легкого человека следующие виды присутствующих в ней опухолевых элементов, а именно опухолевую клетку - 7, ядра или ядрышки опухолевых клеток - 1, лимфоциты, несущие опухолевый антиген, - 6 и эластические волокна опухолевой ткани - 6. Данные, полученные с помощью микроскопии, показали, что применение заявляемого способа позволяет идентифицировать опухолеспецифичные элементы в срезах больных раком легкого.

Пример 3

Для осуществления примера использовали послеоперационную ткань больного аденокарциномой легкого человека (с подтвержденным диагнозом).

Образец послеоперационной ткани был предоставлен Красноярским краевым клиническим онкологическим диспансером имени А.И. Крыжановского.

Образец ткани размером приблизительно 5×5 мм трижды промывали в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в лунке планшета с помощью шейкера, таким образом, что каждый цикл отмывки длился в течение 5 минут.

После этого ткань инкубировали с дрожжевой РНК в конечной концентрации 1 нг/мкл в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Затем образец ткани трижды промывали фосфатным буфером, содержащим Са2+ и Mg2+, для того чтобы убрать излишки дрожжевой РНК.

Далее образец инкубировали в лунке планшета с аптамером LC-118, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 3, меченным флуоресцентной меткой I (FAM), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. После чего не связавшиеся последовательности удаляли путем трехкратного промывания с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+. Далее образец снова инкубировали в лунке планшета с аптамером LC-18, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 2, меченным флуоресцентной меткой II (Су3), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Затем не связавшиеся последовательности также удаляли путем трехкратного промывания с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+. В итоге образец инкубировали с аптамером LC-17, имеющим установленную последовательность SEQ ID NO 1, меченным флуоресцентной меткой III (Су5), разведенным в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+ в конечной концентрации 50 нМ в течение 2 часов при температуре 6°С на шейкере. Далее образец снова трижды промывали с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+.

Для получения срезов окрашенный образец ткани фиксировали с помощью охлаждающего геля на металлических пластинах, замораживали с помощью жидкого азота и резали с помощью криостата. Полученные срезы толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла и фиксировали под покровными стеклами с помощью полистирола. Часть полученных срезов окрашивали с помощью гематоксилина и также фиксировали на предметных стеклах с помощью полистирола и накрывали покровными стеклами.

Результаты, полученные с помощью световой микроскопии (квадраты E1, Е2) и конфокальной микроскопии (квадраты A1-D1, A2-D2), представлены на фотографиях, приведенных на фиг. 4.

На фиг. 4 A1-E1 позицией 1 обозначены ядра опухолевых клеток, окрасившихся аптамерами LC-118, LC-18, LC-17. Позицией 6 обозначены лимфоциты, несущие опухолевый антиген, окрасившиеся аптамерами LC-118, LC-18, LC-17 (фотографии А1-Е1). Позицией 7 обозначены опухолевые клетки, окрасившиеся аптамерами LC-18, LC-17.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выявить в срезе ткани больного аденокарциномой легкого человека следующие виды присутствующих в ней опухолевых элементов, а именно опухолевые клетки - 7, лимфоциты, несущие опухолевый антиген, - 6 и ядра опухолевых клеток - 1, то есть увидеть и идентифицировать все опухолеспецифичные элементы, присутствующие в срезах образцов ткани больных раком легкого.

1. Способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека, включающий инкубацию образца ткани рака легкого человека с маскирующей нуклеиновой кислотой и с аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой, отличающийся тем, что образец ткани инкубируют с дрожжевой РНК, после чего последовательно инкубируют с растворами аптамеров в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+, при этом, используют аптамеры, меченые различными флуоресцентными метками, при этом, для инкубации используют аптамеры, специфичные к разным видам опухолевых элементов рака легкого человека, полученные в процессе селекции и выбранные из установленной нуклеотидной последовательности, отраженной как SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 8, а инкубацию осуществляют в следующей последовательности - первоначально образец ткани инкубируют с раствором аптамера, выбранного из SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 8, меченого флуоресцентной меткой I, затем с раствором другого аптамера, выбранного из SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 8, меченого флуоресцентной меткой II, и затем с раствором третьего аптамера, выбранного из SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 8, меченого флуоресцентной меткой III, после каждого этапа инкубации осуществляют трехкратное промывание образца с помощью фосфатного буфера, содержащего Са2+ и Mg2+, после чего, окрашенный таким образом образец ткани замораживают и делают срезы с помощью криостата, полученные срезы исследуют с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, выявленные с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии опухолеспецифичные мишени идентифицируют с помощью световой микроскопии, для чего часть срезов образца проинкубированной ткани окрашивают гематоксилином и эозином.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что флуоресцентные метки, связанные с аптамерами, применяемыми для последовательной инкубации, имеют спектры возбуждения и испускания, лежащие в области разных длин волн.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец ткани инкубируют с аптамерами в лунках планшета.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что одновременно осуществляют инкубацию нескольких разных образцов ткани рака легкого человека с использованием аптамеров, выбранных из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 8.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения маркеров наличия опухолевых В-лимфобластов для установления первичной структуры мажорных генов тяжелой цепи иммуноглобулинов.

Изобретение относится к области медицины, в частности к хирургической гепатологии. Предложен способ дооперационной оценки риска развития прогрессии заболевания после радиочастотной термоаблации метастазов колоректального рака в печени при циторедуктивных операциях.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для ех vivo определения чувствительности клеток пациента к лекарственным препаратам.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложены способ и набор для прогнозирования высокой вероятности положительного эффекта от лечения антагонистами VEGF у пациента с метастатическим раком молочной железы, где такой эффект определяют у пациента с генотипом VEGF (-1154АА).

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике онкологических заболеваний. Предложено применение аддукта нуклеосома-белок в качестве биомаркера в образце крови, сыворотки или плазмы для диагностики рака, где белок, связанный с нуклеосомой, содержит фактор транскрипции или модифицирующий хроматин фермент.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа измерения антитела против WT1 в образце, где способ включает выполнение иммуноанализа с использованием полипептида с антигенностью в отношении антитела против WT1, выбранного из i) полипептида, содержащего последовательность с аминокислотами в положениях 294-449 последовательности SEQ ID NO: 1, и ii) полипептида, включающего аминокислотную последовательность с делецией, заменой или добавлением от одной до нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, составляющей полипептид i).

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для диагностики злокачественных опухолей. Способы по изобретению включают приведение образца мочи, полученного от индивидуума, в контакт с антителом, которое связывает FRα, чем осуществляется определение уровня FRα, который не связан с клеткой, в указанном образце мочи, сравнение уровня FRα, который не связан с клеткой, в указанном образце мочи, полученном от указанного индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, установление повышения уровня FRα в указанном образце мочи, полученном от указанного индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце, и определение того, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, на основании указанного повышения.

Изобретение относится к медицине в области онкологии и представляет собой способ прогнозирования резистентности опухоли к таргетной терапии цетуксимабом у больных плоскоклеточным раком языка и слизистой дна полости рта, включающий исследование крови, отличающийся тем, что за два дня до начала полихимиотерапевтического лечения с включением таргетной терапии цетуксимабом, у больного плоскоклеточным раком языка и слизистой дна определяют EGF, sEGFR, затем рассчитывают соотношение EGF/sEGFR и при значении этого соотношения в пределах 55,3-66,9 прогнозируют отсутствие резистентности опухоли к терапии цетуксимабом, а при значении этого показателя в пределах 92,6-117,8 прогнозируют наличие резистентности опухоли к терапии цетуксимабом.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и предназначено для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы.

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии, в частности к генетически модифицированным животным семейства мышиных, а именно к мышам и крысам, которые экспрессируют IL-6 человека и дополнительно могут экспрессировать гуманизированный IL-6Rα.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтический белок или антитело, структуру «стебель-петля» гистонов, и последовательность поли(А) или сигнал полиаденилирования, набор и фармацевтическая композиция, содержащие одну или более указанную нуклеиновую кислоту, для использования в генной терапии, а также способ повышения экспрессии кодируемого белка и применение указанных нуклеиновой кислоты, набора или композиции для повышения экспрессии кодируемого белка.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и касается генетической конструкции для осуществления способа генетического контроля экзоцитоза. Представленная конструкция имеет последовательность SEQ ID NO:4 и получена с использованием лентивирусного вектора на основе ВИЧ-1 модифицированного последовательностями, кодирующими пост-транскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE), генетически кодируемый кальциевый индикатор (GCaMP3) и клеточно-специфический промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к аптамеру, специфически связывающемуся с фактором роста нервов (NGF), и может быть использовано в медицине как противовоспалительное или обезболивающее средство.

Изобретение относится к области биотехнологии и рыбоводства и касается способа получения ДНК из яйцеклеток рыб. Представленный способ включает пробоподготовку и выделение ДНК.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1. Изобретение обеспечивает получение и тестирование безмаркерных растений каланхоэ с повышенными антибиотическими свойствами за короткий промежуток времени для использования в фармакологии и медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью.

Изобретение относится к биохимии. Описана двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена АРОС3, где указанная дцРНК содержит (а) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GcuuAAAAGGGAcAGuAuudTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAuACUGUCCCUUUuAAGCdTsdT; (b) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GCUUAAAAGGGACAGUAUUdTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAUACUGUCCCUUUUAAGCdTsdT, (c) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GfcUfuAfaAfaGfgGfaCfaGfuAfuUfdTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности aAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfcdTsdT, или (d) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GcuuAAAAGGGAcAGuAuudTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAuACuGUCCCuuuuAagcdTsdT, где нуклеотиды, обозначенные строчными буквами, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды; Gf, Af, Uf и Cf представляют собой 2'-фторнуклеотиды; и s представляет собой фосфоротиоатную связь.

Изобретение относится к области биохимии и генетики растений. Предлагается способ молекулярно-генетической идентификации растений ивы на основе микросателлитных (SSR) маркеров, который включает в себя выделение ДНК из исследуемых образцов, проведение ПЦР, электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК, документирование результатов ПЦР, определение длин амплифицированных фрагментов ДНК путем сравнения со стандартами молекулярной массы, получение таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам и сравнение полученных генотипов с генотипами исходных растений.

Изобретение относится к медицине. Изобретение представляет собой способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов, при котором используют химическое соединение, обладающее активностью стимуляции и образования нервной ткани и/или ингибирования дегенерации нейронов, где разрабатывают генетические конструкции на основе лентивирусного вектора для специфической трансфекции астроцитов и нейронов, приведенных на фиг.

Изобретение относится к области медицины. Изобретение представляет собой способ оценки суммарного показателя анеуплоидии и пролиферативной активности опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого и рака яичников с использованием специфического красителя ДНК нового поколения DRAQ7, включающий приготовление одноклеточной суспензии из фиксированных в 4% растворе формальдегида образцов опухолей, окраску специфическим красителем ДНК DRAQ7, проведение анализа на проточном цитофлуориметре, построение гистограмм распределения клеток по интенсивности окрашивания ДНК в программе WinMDI 2.9, расстановку маркеров, отделяющих пик, соответствующий диплоидным клеткам в G0/G1 фазах клеточного цикла от анеуплоидных и клеток в М, S и G2 фазах цикла, а также суммарное число клеток, расчет интегрального показателя клеток по формуле:I=М2/М1×100%,где I - интегральный показатель анеуплоидии и пролиферативной активности клеток, M1 - суммарное количество опухолевых клеток, М2 - количество клеток в фазах М, S и G2 фазах цикла независимо от плоидности, при этом превышение интегральным показателем 30% указывает на неблагоприятный прогноз заболевания и резистентность опухоли к химиотерапии, значение суммарного показателя менее 30% указывает на благоприятный прогноз и чувствительность к химиотерапии. Изобретение позволяет оценить прогноз течения заболевания и чувствительность опухоли к химиотерапии. 4 ил.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ выявления опухолеспецифичных мишеней в гистологических срезах тканей больных раком легкого человека, включающий инкубацию образца ткани рака легкого человека с дрожжевой РНК и инкубацию с растворами аптамеров, меченых различными флуоресцентными метками в фосфатном буфере, содержащем Са2+ и Mg2+. Окрашенный образец ткани замораживают и делают срезы с помощью криостата. Полученные срезы исследуют с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Опухолеспецифичные мишени идентифицируют с помощью световой микроскопии, для чего часть срезов образца проинкубированной ткани окрашивают гематоксилином и эозином. Способ позволяет выявить в срезе ткани больного раком легкого человека различные виды присутствующих в ней опухолевых элементов, а именно опухолевых клеток, ядер или ядрышек опухолевых клеток, лимфоцитов, несущих опухолевый антиген и модифицированную в результате опухолевого процесса соединительную ткань. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

Наверх